Informácie

Kde je DNA počas procesu extrakcie RNA pomocou Trisure?

Kde je DNA počas procesu extrakcie RNA pomocou Trisure?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kde je DNA počas procesu extrakcie RNA pomocou Trisure, ktorý je tu opísaný? Vzhľadom na to, že DNA je tiež nukleová kyselina, mám očakávať, že izolovaná RNA bude obsahovať aj DNA? Bioline však tvrdí, že RNA je „prakticky bez kontaminácie genómovou DNA“.


Očakáva sa, že vám v skutočnosti nechcú povedať, čo je TRIsure. Hovorí sa, že DNA sa nachádza v organickej alebo interfáze po extrakcii, zatiaľ čo RNA sa rozdeľuje do vodnej fázy. Toto je takmer určite nejaký variant extrakcie kyslým fenolom. Ako potvrdenie MSDS uvádza ako zložky fenol, tiokyanát amónny, guanidíniumtiokyanát, glycerol a kyselinu citrónovú.


Purifikácia DNA a RNA

Extrakcia DNA a RNA je základná metóda používaná v molekulárnej biológii. Potreba vysoko kvalitnej, vysoko čistej nukleovej kyseliny je dôležitá pre široké spektrum výskumných a klinických aplikácií. Purifikácia nukleových kyselín je počiatočným krokom v mnohých pracovných postupoch molekulárnej biológie a genómu.

Vzorky DNA a RNA sa často získavajú zo surových prípravkov. Genomickú DNA, plazmidovú DNA a celkovú RNA možno extrahovať a purifikovať z rôznych zdrojov vrátane bakteriálnych a cicavčích buniek, rastlinného tkaniva, plesňového tkaniva, tkaniva cicavcov, krvi, plazmy, séra, vírusov, bukálnych a nazálnych výterov, gélových matríc, PCR a iné enzymatické reakcie. Izolácia nukleovej kyseliny z týchto vzoriek často zahŕňa lýzu bunkových membrán alebo homogenizáciu vzorky, po ktorej nasleduje odstránenie proteínov, enzýmov, detergentov, solí a lipidov.

Bežné prístupy zahŕňajú:

  • Alkalická extrakcia
  • Extrakcia fenol-chloroform
  • Odstreďovanie s hustotným gradientom chloridu cézneho (CsCl).
  • Oligo(dT)-celulózová chromatografia
  • Kremíková matrica
  • Sklenené koráliky
  • Kremelina
  • Aniónová výmenná chromatografia
  • Veľkostne vylučovacia chromatografia


Konečná aplikácia určí najlepší spôsob čistenia. Následné aplikácie zahŕňajú PCR, qPCR, reštrikčné štiepenie, ligáciu, klonovanie, genotypizáciu, analýzu génovej expresie, sekvenovanie novej generácie (NGS) a Northern a Southern blotting.


Obsah

Táto metóda spočíva v oddelení fáz odstredením zmesi vodnej vzorky a roztoku obsahujúceho vodou nasýtený fenol a chloroform, výsledkom čoho je horná vodná fáza a spodná organická fáza (hlavne fenol). Guanidíniumtiokyanát, chaotropné činidlo, sa pridáva do organickej fázy na pomoc pri denaturácii proteínov (ako sú tie, ktoré silne viažu nukleové kyseliny alebo tie, ktoré degradujú RNA). Nukleové kyseliny (RNA a/alebo DNA) sa rozdelia do vodnej fázy, zatiaľ čo proteín sa rozdelí do organickej fázy. pH zmesi určuje, ktoré nukleové kyseliny sa prečistia. [4] V kyslých podmienkach (pH 4-6) sa DNA rozdelí do organickej fázy, zatiaľ čo RNA zostáva vo vodnej fáze. V neutrálnych podmienkach (pH 7-8) sa DNA aj RNA rozdelia do vodnej fázy. V poslednom kroku sa nukleové kyseliny izolujú z vodnej fázy zrážaním 2-propanolom. 2-Propanol sa potom premyje etanolom a peleta sa krátko vysuší na vzduchu a rozpustí v TE pufri alebo vode bez RNázy.

Guanidíniumtiokyanát denaturuje proteíny vrátane RNáz a oddeľuje rRNA od ribozomálnych proteínov, zatiaľ čo fenol, izopropanol a voda sú rozpúšťadlá so slabou rozpustnosťou. V prítomnosti chloroformu alebo BCP (brómchlórpropánu) sa tieto rozpúšťadlá úplne rozdelia na dve fázy, ktoré sú rozpoznateľné podľa ich farby: číra, horná vodná fáza (obsahujúca nukleové kyseliny) a spodná fáza (obsahujúca proteíny rozpustené vo fenole a lipidy rozpustené v chloroforme). Môžu sa použiť aj iné denaturačné chemikálie, ako je 2-merkaptoetanol a sarkozín. Hlavnou nevýhodou je, že fenol a chloroform sú nebezpečné a nepohodlné materiály a extrakcia je často namáhavá, takže v posledných rokoch mnoho spoločností ponúka alternatívne spôsoby izolácie RNA.


3 hlavné kroky zapojené do extrakcie DNA

Spočiatku bola izolácia DNA dlhým a náročným procesom s veľkým množstvom chladenej DNA. Extrakcia DNA z rastlín, zvierat a baktérií si vyžaduje uvoľnenie bunkových zložiek do roztoku. Keďže baktérie sú jednobunkové a neobsahujú kosť, tuk, chrupavku atď., DNA sa dá relatívne ľahko extrahovať.

Na rozdiel od toho, vzorky zo zvierat a rastlín sa musia pred pokračovaním často rozdrviť na malé fragmenty. Keďže rastlinné bunky majú veľmi tuhé bunkové steny, výskumník musí bunky mechanicky rozbiť v mixéri alebo pridať špeciálne degradačné enzýmy na strávenie zložiek bunkovej steny.

Podobne na extrakciu DNA z myšieho chvosta sa pridávajú enzýmy na degradáciu spojivového tkaniva a rozptýlenie buniek. Zďaleka najjednoduchší spôsob, ako získať DNA, je extrahovať ju z baktérií. Niekoľko kvapiek bakteriálnej kultúry poskytne dostatok DNA na väčšinu účelov. Po prvé, bakteriálna bunková stena je ľahko stráviteľná lyzozýmom, enzýmom, ktorý degraduje peptidoglykánovú vrstvu bunkovej steny.

Následné ošetrenie detergentom rozpúšťa lipidy bunkovej membrány. Chelatačné činidlá, ako je EDTA (etyléndiamíntetraacetát), sa tiež používajú, najmä pri gramnegatívnych baktériách, na odstránenie kovových iónov, ktoré viažu zložky vonkajšieho mem­branu. Vo všetkých týchto vzorkách sa potom bunkový obsah, vrátane DNA, uvoľní do roztoku a purifikuje sa sériou ďalších krokov.

Extrakcia DNA: Krok 2.

Purifikácia DNA:

Na čistenie DNA sa používajú dva všeobecné typy postupov:

Princíp odstreďovania je nasledujúci:

Vzorka sa točí pri vysokej rýchlosti a censhytrifugal sila spôsobí, že väčšie alebo ťažšie zložky sa usadia na dne skúmavky. Napríklad zničenie bunkovej steny bacte­ria lyzozýmom a detergentmi zanecháva roztok obsahujúci fragmenty bunkovej steny, ktoré sú malé, a DNA. Keď sa vzorka odstredí, DNA a niektoré ďalšie veľké zložky sedimentujú na dne skúmavky.

Fragmenty bunkovej steny spolu s mnohými ďalšími rozpustnými zložkami zostávajú v roztoku a sú znehodnotené. Sedimentovaná DNA sa potom znovu rozpustí vo vhodnom tlmivom roztoku. Stále má veľa bielkovín a RNA zmiešaných s ním.

Tie sa vo všeobecnosti odstraňujú chemickými prostriedkami. Jedným krokom používaným pri mnohých purifikáciách DNA je extrakcia fe­nolom. Fenol, tiež známy ako kyselina car­bolic, je veľmi žieravý a extrémne stydlivý, pretože rozpúšťa a denaturuje bielkoviny, ktoré tvoria 60 až 70 percent všetkých živých látok. V dôsledku toho môže byť fenol použitý na rozpustenie a odstránenie všetkých proteínov zo vzorky DNA.

Keď sa do vody pridá fenol, tieto dve kvapaliny sa nezmiešajú a nevytvoria namiesto toho jediný roztok, hustejší fenol vytvorí pod vodou samostatnú vrstvu. Po pretrepaní sa obe vrstvy dočasne premiešajú a proteíny sa rozpustia vo fenole.

Keď sa pretrepávanie zastaví, roztok DNA a proteíny obsahujúce fenol sa rozdelia do dvoch vrstiev (obr. 3.1). Aby sa zabezpečilo, že sa v DNA nezachytí žiadny fenol, vzorka sa krátko odstredí. Potom sa voda obsahujúca DNA a RNA odsaje a uchováva. Vo všeobecnosti sa na purifikáciu proteínov z DNA uskutočňuje niekoľko postupných extrakcií fenolom.

Boli vyvinuté rôzne novšie techniky, ktoré zabraňujú extrakcii fenolu. Väčšina z nich zahŕňa čistenie DNA jej prechodom cez kolónu obsahujúcu živicu, ktorá viaže DNA, ale nie iné bunkové zložky.

Techniky v tomto smere sú dvoch typov

1. Afinitná chromatografia:

Toto používa kremičité živice. Kremičité živice viažu nukleové kyseliny rýchlo a špecificky pri nízkom pH a vysokých koncentráciách solí. Nukleové kyseliny sa uvoľňujú pri vyššom pH a nízkej koncentrácii solí.

2. Iónovo-výmenná chromatografia:

Výmenné živice, ako je dietylaminoetylcelulóza, sú pozitívne nabité a viažu DNA prostredníctvom svojich negatívne nabitých fosfátových skupín. V tomto prípade dochádza k väzbe pri nízkych koncentráciách solí a nukleové kyseliny sú eluované vysokými koncentráciami soli, ktoré narušujú iónovú väzbu.

Extrakcia DNA: Krok č. 3.

Odstránenie nežiaducej RNA:

Špeciálne enzýmy odstraňujú kontaminujúcu RNA zo vzorky DNA. Enzýmová stuha clease degraduje RNA na krátke oligonukleo­tidy, ale ponecháva obrovskú makromolekulu DNA nezmenenú. Zmes DNA a RNA sa najprv inkubuje s ribonukleázou pri optimálnej teplote pre aktivitu enzýmu.

Potom sa pridá rovnaký objem alkoholu. Alkohol z roztoku vyzráža veľké makromolekuly, vrátane dlhých reťazcov DNA. Malé fragmenty RNA však zostávajú rozpustené.

Treba poznamenať, že liečba alkoholom nie je veľmi špecifická a vyzráža väčšinu veľkých uhľohydrátov a mnoho proteínov, ako aj neporušené makromolekuly DNA aj RNA. Alkoholové zrážanie sa teda môže použiť až po odstránení týchto zložiek z DNA odstredením a extrakciou fenolom.

Potom sa DNA sedimentuje na dne skúmavky centrifugáciou a roztok supernatantu obsahujúci fragmenty RNA sa zlikviduje (obr. 3.2). Drobná peleta DNA, ktorá zostala na dne skúmavky, je často sotva viditeľná. Napriek tomu obsahuje bilióny molekúl DNA, ktoré sú dostatočné na väčšinu vyšetrení.


Purifikácia RNA pomocou TRIzol (TRI činidlo)

Solubilizácia a extrakcia TRIzolu je relatívne nedávno vyvinutá všeobecná metóda deproteinizácie RNA. Tento spôsob je obzvlášť výhodný v situáciách, keď sú bunky alebo tkanivá obohatené o endogénne RNázy, alebo keď je separácia cytoplazmatickej RNA od jadrovej RNA nepraktická. TRIzol (alebo TRI Reagent) je jednofázový roztok fenolu a guanidínium izotiokyanátu, ktorý súčasne solubilizuje biologický materiál a denaturuje proteín. Po solubilizácii spôsobí pridanie chloroformu fázovú separáciu (podobne ako extrakcia zmesou fenol:chloroform:izoamylalkohol), kde sa proteín extrahuje do organickej fázy, DNA sa rozloží na rozhraní a RNA zostane vo vodnej fáze. Preto je možné RNA, DNA a proteín purifikovať z jednej vzorky (odtiaľ názov TRIzol). Extrakcia TRIzolu je tiež účinnou metódou na izoláciu malých RNA, ako sú mikroRNA, RNA spojené s piwi alebo endogénne malé interferujúce RNA. Avšak TRIzol je drahý a RNA pelety môže byť ťažké resuspendovať. Preto sa použitie TRIzolu neodporúča, keď je praktická pravidelná extrakcia fenolu.


Kroky pracovného toku NGS

Pracovný postup sekvenovania novej generácie obsahuje tri základné kroky: príprava knižnice, sekvenovanie a analýza údajov. Naučte sa základy každého kroku a zistite, ako si naplánovať pracovný postup NGS.

Príprava na pracovný postup NGS

Pred spustením pracovného postupu sekvenovania novej generácie izolujte a vyčistite svoju nukleovú kyselinu. Niektoré metódy extrakcie DNA môžu zaviesť inhibítory, ktoré môžu negatívne ovplyvniť enzymatické reakcie, ktoré sa vyskytujú v pracovnom toku NGS. Najlepšie výsledky dosiahnete použitím extrakčného protokolu optimalizovaného pre váš typ vzorky. Pre experimenty so sekvenovaním RNA konvertujte RNA na cDNA reverznou transkripciou.

Po extrakcii väčšina pracovných postupov NGS vyžaduje krok kontroly kvality. Odporúčame použiť UV spektrofotometriu na hodnotenie čistoty a fluorometrické metódy na kvantifikáciu nukleových kyselín.

Krok 1 v NGS Workflow: Príprava knižnice

Príprava knižnice je rozhodujúca pre úspech vášho pracovného toku NGS. Tento krok pripraví vzorky DNA alebo RNA tak, aby boli kompatibilné so sekvenátorom. Sekvenčné knižnice sa zvyčajne vytvárajú fragmentáciou DNA a pridaním špecializovaných adaptérov na oba konce. V pracovnom postupe sekvenovania Illumina tieto adaptéry obsahujú komplementárne sekvencie, ktoré umožňujú fragmentom DNA naviazať sa na prietokovú bunku. Fragmenty sa potom môžu amplifikovať a čistiť.

Aby sa ušetrili zdroje, viaceré knižnice môžu byť združené a sekvenované v rovnakom behu – proces známy ako multiplexovanie. Počas ligácie adaptéra sa do každej knižnice pridajú jedinečné indexové sekvencie alebo „čiarové kódy“. Tieto čiarové kódy sa používajú na rozlíšenie medzi knižnicami počas analýzy údajov.

Prostriedky na prípravu knižnice

Nájdite návod na kvantifikáciu knižnice a kontrolu kvality.

Zistite, ako sa vyhnúť kontaminácii pri čistení DNA/RNA.

Krok 2 v NGS Workflow: Sekvenovanie

Počas kroku sekvenovania pracovného toku NGS sa knižnice načítajú do prietokovej bunky a umiestnia sa na sekvenátor. Zhluky fragmentov DNA sa amplifikujú v procese nazývanom generovanie zhlukov, výsledkom čoho sú milióny kópií jednovláknovej DNA. Na väčšine sekvenčných prístrojov Illumina dochádza k zhlukovaniu automaticky.

V procese nazývanom sekvenovanie syntézou (SBS) sa chemicky modifikované nukleotidy viažu na vlákno templátu DNA prostredníctvom prirodzenej komplementarity. Každý nukleotid obsahuje fluorescenčnú značku a reverzibilný terminátor, ktorý blokuje začlenenie ďalšej bázy. Fluorescenčný signál indikuje, ktorý nukleotid bol pridaný, a terminátor sa odštiepi, aby sa mohla naviazať ďalšia báza.

Po prečítaní dopredného reťazca DNA sa načítané hodnoty vymyjú a proces sa opakuje pre spätný reťazec. Táto metóda sa nazýva sekvenovanie na párovom konci.

Sekvenovanie technológiou syntézy

Krok 3 v NGS Workflow: Analýza údajov

Po sekvenovaní softvér prístroja identifikuje nukleotidy (proces nazývaný volania báz) a predpokladanú presnosť týchto volaní báz. Počas analýzy údajov môžete importovať svoje sekvenčné údaje do štandardného analytického nástroja alebo si vytvoriť svoj vlastný kanál.

Dnes môžete použiť intuitívne aplikácie na analýzu údajov na analýzu údajov NGS bez školenia v oblasti bioinformatiky alebo ďalšieho laboratórneho personálu. Tieto nástroje poskytujú zarovnanie sekvencií, volanie variantov, vizualizáciu údajov alebo interpretáciu.

Prečítajte si viac o analýze údajov

Naštartujte svoj pracovný postup NGS

Chcete začať rýchlejšie? Poraďte sa s odborníkmi na experimentálny dizajn prostredníctvom našej služby Workflow Design and Evaluation Service.* Pomôžeme vám navrhnúť pracovný postup NGS, ktorý je pre vás vhodný, spracujeme vaše vzorky a vygenerujeme váš prvý súbor údajov NGS.

*Nie je k dispozícii v krajinách Ázie a Južného Pacifiku.

Kontaktuj nás

Mikrobiálne sekvenovanie celého genómu

Mikrobiálne sekvenovanie celého genómu sa môže použiť na identifikáciu patogénov, porovnanie genómov a analýzu antimikrobiálnej rezistencie. Náš odporúčaný pracovný postup NGS pre túto aplikáciu popisuje odporúčané kroky. Celý pracovný tok pokračuje od DNA k údajom za menej ako 24 hodín.

Izolácia DNA

Na izoláciu DNA z mikrobiálnych kolónií bez zavedenia inhibítorov použite extrakčnú súpravu. Odporúčame použiť sklenené korálky. Posúďte čistotu pomocou UV spektrofotometrie a kvantifikujte DNA pomocou fluorometrických metód.

Knižničná príprava

Pripravte a kvantifikujte knižnice podľa protokolu uvedeného v Illumina DNA Prep Guide. Môžete tiež vykonať voliteľnú kontrolu kvality knižnice pomocou Agilent 2100 Bioanalyzer alebo Advanced Analytical Fragment Analyzer. Budete potrebovať:

2,5 hodiny
Odhadovaný vstup DNA: 1–500 ng

Sekvenovanie

Knižnice sekvencií v behu 2 × 150 bp podľa protokolu uvedeného v príručke systému iSeq 100. Budete potrebovať:

19,5 hodiny
Odhadovaný výkon: 1,2 Gb na beh 2 × 150 bp
Vzorky na jeden cyklus: 4–5 vzoriek za predpokladu 5 Mb pri 50× pokrytí

Analýza dát

Analyzujte dáta pomocou aplikácie BWA Aligner a vizualizujte dáta pomocou aplikácie Integrative Genomics Viewer v BaseSpace Sequence Hub. Budete potrebovať:


Abstraktné

Materiál nukleových kyselín primeranej kvality je rozhodujúci pre úspešnú analýzu vysokovýkonného sekvenovania (HTS). DNA a RNA izolované z archívneho materiálu FFPE sú často degradované a nie sú ľahko amplifikovateľné v dôsledku chemického poškodenia zavedeného počas fixácie. Na identifikáciu optimálnych súprav na extrakciu nukleových kyselín sa hodnotila kvantita, kvalita a výkon DNA a RNA v aplikáciách HTS. DNA a RNA boli izolované z piatich archívnych blokov FFPE sarkómu pomocou ôsmich extrakčných protokolov zo siedmich súprav od troch rôznych komerčných predajcov. Na extrakciu DNA poskytla súprava truXTRAC FFPE DNA od Covaris vyššie výťažky a lepšie amplifikovateľnú DNA, ale všetky protokoly poskytli porovnateľné výťažky knižnice HTS s použitím Agilent SureSelect XT a fungovali dobre pri volaní variantov po smere. Pre extrakciu RNA všetky protokoly poskytli porovnateľné výťažky a amplifikovateľnú RNA. Na detekciu fúzneho génu pomocou testu Archer FusionPlex Sarcoma Assay však súprava truXTRAC FFPE RNA od spoločnosti Covaris a súprava Agencourt FormaPure od spoločnosti Beckman Coulter vykazovala najvyššie percento jedinečných párov čítania, čo poskytuje vyššiu komplexnosť údajov HTS a častejšiu detekciu rekurentnej fúzie. génov. truXTRAC simultánna extrakcia DNA a RNA poskytla podobné výstupy ako jednotlivé protokoly. Tieto zistenia ukazujú, že aj keď sa vo väčšine prípadov dali vytvoriť úspešné knižnice HTS, rôzne protokoly poskytli variabilné množstvo a kvalitu extrakcie nukleovej kyseliny FFPE. Výber optimálneho postupu je veľmi cenný a môže viesť k výsledkom vo vzorkách s hraničnou kvalitou.

Citácia: Kresse SH, Namløs HM, Lorenz S, Berner J-M, Myklebost O, Bjerkehagen B a kol. (2018) Hodnotenie komerčných metód extrakcie DNA a RNA pre vysokovýkonné sekvenovanie vzoriek FFPE. PLoS ONE 13(5): e0197456. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197456

Editor: Ruslan Kalendar, Univerzita v Helsinkách, FÍNSKO

Prijaté: 2. augusta 2017 Prijatý: 2. mája 2018 Publikovaný: 17. mája 2018

Copyright: © 2018 Kresse a kol. Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný za podmienok licencie Creative Commons Attribution License, ktorá umožňuje neobmedzené používanie, distribúciu a reprodukciu na akomkoľvek médiu za predpokladu, že je uvedený pôvodný autor a zdroj.

Dostupnosť údajov: Údaje nie sú dostupné z dôvodu etických a právnych obmedzení, uložených smernicou Európskeho parlamentu a Rady 95/46/ES z 24. októbra 1995 o ochrane fyzických osôb pri spracúvaní osobných údajov a o voľnom pohybe takýchto údajov. Nariadenia o osobných údajoch § 7-12 Poverenec pre ochranu údajov v súlade s vyššie uvedenými zákonmi nesprístupnil údaje verejnosti z dôvodu ochrany súkromia a etiky. V prípade potreby je možné prijať opatrenia na kontrolu údajov, pokiaľ sú údaje pod kontrolou nemocnice, keďže Univerzitná nemocnica v Oslo je zodpovedná za prevádzkovateľa údajov. Otázky týkajúce sa dostupnosti údajov je možné smerovať na úradníka pre ochranu údajov na adrese [email protected] a na príslušného autora na adrese [email protected]

Financovanie: Tento projekt bol podporený grantmi Nórskej onkologickej spoločnosti (PR-2007-0163) pre Leonarda A. Meza-Zepedu, Norges Forskningsråd (221580) pre Ola Myklebost a programom génovej terapie v Univerzitnej nemocnici v Osle pre Leonarda A. Meza-Zepedu . Investori nemali žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu.

Konkurenčné záujmy: Autori vyhlásili, že neexistujú žiadne konkurenčné záujmy.


Praktická aplikácia extrakcie fenolom/chloroformom

Aj keď existuje oveľa viac metód na vyčistenie vašej RNA alebo DNA, ako tomu bolo v minulosti, niekedy je stále najlepším spôsobom extrakcia fenolom/chloroformom. Tu budem diskutovať o niektorých praktických aspektoch používania tejto techniky.

Nick predstavil tému extrakcie fenolom/chloroformom v predchádzajúcom článku, pričom sa dotkol niektorých myšlienok o tom, ako organická extrakcia odstráni proteíny z vodného roztoku. Stručne povedané, proteíny pozostávajú z hydrofóbnych aj hydrofilných zvyškov a prostredníctvom skladania proteínov dosahujú kompromis s vodou, aby zostali rozpustné. Keď však dostanú príležitosť prejsť do prostredia, ktoré môže prijať polárne aj nepolárne zvyšky (tj – fenol alebo fenol/chloroform) bez nutnosti kompromisov (tj – skladanie), s radosťou prejdú do tohto prostredia. fáza. Polárnejšie molekuly, ako sú uhľohydráty a nukleové kyseliny, sú „šťastnejšie“ vo vodnej fáze (s niektorými výnimkami uvedenými nižšie) a zostávajú tam. Teraz k tomu namyslenému.

Fenol verzus fenol/chloroform verzus chloroform
Jednou z najčastejších otázok, ktorú dostávam pri školení niekoho, je, aké sú rozdiely medzi rôznymi organickými fázami používanými pri extrakcii. Tu je rozpis, ako im najlepšie rozumiem.

Fenol – V skutočnosti tu hovoríme o fenole nasýtenom pufrom, ktorý pozostáva z roztoku, ktorý je v skutočnosti asi 72 % fenolu a 28 % vody. Keďže fenol je slabá kyselina, roztoky, ktoré používame, boli ekvilibrované pufrom, aby sa pH dostalo na konkrétny cieľ – buď kyslé na čistenie RNA alebo mierne alkalické na čistenie DNA. Okrem určitého množstva vody rozpustenej vo fenole existuje určité množstvo fenolu, ktorý sa rozpúšťa vo vode – pri ekvilibrácii bude vodná fáza obsahovať asi 7 % fenolu. Predpokladá sa, že to pomáha pri extrakcii, pretože tento rozpustený fenol pomáha denaturovať proteíny, kým sú stále vo vodnom roztoku. Tlmivý roztok nasýtený fenol má hustotu len o málo vyššiu ako hustota vody.

Fenol/chloroform – Ide o zmes fenolu a chloroformu nasýteného pufrom, zvyčajne blízko 1:1 na čistenie DNA s inými pomermi, ktoré sa niekedy používajú na čistenie RNA. Izoamylalkohol je niekedy zahrnutý ako činidlo proti peneniu, ale všeobecne sa považuje za inertný a voliteľný prídavok. Tento roztok sa bežne používa namiesto fenolu nasýteného pufrom z niekoľkých dôvodov. Ako som uviedol vyššie, hustota fenolu nasýteného pufrom je len o málo vyššia ako hustota vody. Takže ak vaša vodná fáza obsahuje dostatok soli alebo akýchkoľvek iných rozpustených látok, ktoré by zvýšili jej hustotu, potom by ste mohli skončiť s fázovou inverziou počas extrakcie, kde je vaša vodná fáza pod fenolom, a nie nad ním. Chloroform je výrazne hustejší ako voda, takže jeho pridanie do organickej fázy zvyšuje celkovú hustotu tejto fázy, čím pomáha predchádzať inverzii fáz.

Okrem toho chloroform (a niektorí hovoria, že izoamylalkohol) pomáhajú redukovať medzifázu – fuzzy hranicu medzi dvoma fázami obývanými molekulami, ktoré sa nevedia rozhodnúť, kam chcú ísť. Môžu to byť čiastočne denaturované proteíny, DNA (v závislosti od pH) a/alebo čiastočne denaturované proteíny viažuce DNA, ktoré stále lipnú na DNA, a to je skutočná bolesť v zadku. Ak pri odstraňovaní vodnej fázy odpipetujete časť tohto materiálu, znížite tým čistotu vzorky. Ak ste pri pipetovaní príliš bojazliví, škodíte svojmu výťažku. Ak máte moje šťastie, potom čokoľvek, čo ste si chceli nechať najviac, sedí v ňom. Pridanie chloroformu do zmesi to pomáha znížiť. (Mám však ešte lepšie riešenie tohto problému, o ktorom vám poviem nižšie.)

Chloroform – normálne sa používa po extrakcii fenolom alebo fenolom/chloroformom. Zatiaľ čo čistý chloroform nefunguje tak dobre ako organické roztoky uvedené vyššie na extrakciu bielkovín, funguje dobre na extrakciu fenolu z vodných roztokov. Pamätajte si, keď som povedal, že vodná fáza obsahovala

7% fenolu po ekvilibrácii? Tiež si pamätáte, keď som povedal, že fenol rád denaturuje bielkoviny? Ak sa nezbavíte (alebo aspoň výrazne neobmedzíte) fenolu vo svojom teraz bezproteínovom roztoku nukleovej kyseliny, môže sa vám to vrátiť čiastočnou alebo úplnou inhibíciou enzýmov, ktorými pôsobíte na DNA alebo RNA. riadok. Prezentovaný s pekným chloroformovým domovom sa však fenol oddelí od vašich nukleových kyselín. Samotný chloroform je asi 10x menej rozpustný vo vode ako fenol (

0,8 %) a menej denaturuje bielkoviny. Dávno mi tiež povedali, že je menej pravdepodobné ako fenol tvoriť pelety s DNA počas zrážania etanolom kedysi, ale nemôžem nájsť odkaz, ktorý by to podporil.

Éter – možno ho použiť aj na extrakciu fenolu späť z vodnej fázy. Avšak kvôli výbušnému potenciálu éteru a tendencii biologických typov mať vo svojich laboratóriách Bunsenove horáky a úderníky, bol z veľkej časti nahradený chloroformom.

Nie tak pekná v ružovej
Upozornenie: nepoužívajte fenol alebo fenol/chloroform, ak je roztok ružový. Oxidáciou fenolu vzniká ružovo-hnedá zlúčenina a táto zlúčenina spôsobí poškriabanie vašej DNA a degradáciu vašej RNA. Väčšina komerčných fenolových roztokov obsahuje antioxidant, ktorý inhibuje túto oxidáciu, a fenol pufrovaný pri kyslom pH sa zdá byť odolný voči oxidácii, ale nie je zlý nápad presunúť časť pufra nasýteného fenolom (z hnedej fľaše, ktorá pravdepodobne prišiel) do priehľadnej fľaše alebo skúmavky, aby ste ju pred začatím extrakcie skontrolovali.

Na pH záleží – veľa
Občas niekto urobí extrakciu fenolom a nezíska žiadnu DNA vo vzorke. Ak sa to stane vám alebo niekomu vo vašom laboratóriu, vaša prvá otázka by mala byť „Aký fenol ste použili?“ Laboratóriá, ktoré vykonávajú prácu s DNA aj RNA, budú mať pravdepodobne kyslé aj zásadité pufrované fenolové roztoky, alebo si niekto kúpi novú fľašu fenolu bez toho, aby venoval pozornosť pH. Extrakcia vzoriek obsahujúcich DNA kyslým fenolom vedie k denaturácii DNA a po denaturácii sa DNA rozdelí do organickej fázy. Toto je kľúčová vlastnosť mnohých protokolov purifikácie RNA, čo je jeden z dôvodov, prečo sa používa fenol nasýtený kyslým pufrom.

Teraz niekedy laboratórne extrakcie DNA fenolom začnú zlyhávať (potom sa DNA neobnoví) a pH fenolu je spochybnené. Ak sa ocitnete na tomto mieste, nemôžete doň jednoducho ponoriť svoj pH meter a nemôžete použiť pH papierik, pretože indikátor pH na papieriku bol charakterizovaný vo vodných roztokoch. Metóda, ktorú som použil, je zriedenie 1 ml fenolu nasýteného tlmivým roztokom s 9 ml 45% metanolu, premiešanie a potom meranie pH pomocou štandardného pH metra. Najbezpečnejším spôsobom úpravy pH je nahradenie vodnej fázy na vrchu fenolového roztoku čerstvým alikvotom

100 mM pufrovanej vody (zvyčajne Tris pH 7,9 pre prácu s DNA), dobre premiešajte fázy a potom nechajte fľaštičku usadiť, kým sa fázy opäť dobre neoddelia. Potom znova pH.

Miešanie fáz
Extrakcie fenolom/chloroformom sú úžasne účinné – menej ako 1 % priemerného proteínu zostáva vo vodnej fáze po tom, čo sa prvá extrakcia dostane do rovnováhy. Trik je samozrejme dostať extrakciu do rovnováhy. Čím väčšia plocha je medzi dvoma fázami, tým rýchlejšie sa to stane a táto plocha je tým väčšia, čím jemnejšiu emulziu vytvoríte. To sa dá dosiahnuť vortexovaním fáz počas niekoľkých minút, ako to vyžadujú mnohé protokoly, ale nie všetky vzorky je možné vortexovať. Ak čistíte veľmi veľkú DNA, napríklad genómovú DNA, možno budete musieť vzorku premiešať oveľa jemnejšie, a preto každú extrakciu vykonávať oveľa dlhšie. Takže v tomto bode dodržujte svoj protokol a buďte veľmi opatrní pri pokuse o oholenie tohto kroku.

Účinky denaturácie a trávenia
Niektoré protokoly vyžadujú denaturáciu proteínu a prípadne štiepenie s Protinasou K pred extrakciou. Oba tieto kroky sú pokusmi znížiť množstvo materiálu, ktorý je zachytený v interfáze, a preto zlepšiť výťažok získanej DNA alebo RNA. Nikdy som nevidel žiadny negatívny efekt denaturácie proteínov pomocou SDS pred extrakciou. Na druhej strane, trávenie proteínu môže znížiť čistotu nukleovej kyseliny, ktorú získavate. Zatiaľ čo celé proteíny sú takmer zaručené, že sa rozdelia do organickej fázy, akonáhle sa proteín rozštiepi na malé peptidy, nie všetky tieto peptidy budú mať rovnaký chemický „charakter“ celého proteínu a každý bude mať svoje vlastné číslo rozdelenia. V závislosti od vašej následnej aplikácie nemusí veľmi záležať na tom, či máte nejaké peptidy vo svojej nukleovej kyseline, ale je formálne možné, že tieto kontaminanty by mohli ovplyvniť vašu budúcu kvantifikáciu vzorky. Objavil som však lepší spôsob, ako eliminovať obávanú medzifázu…

Gél Phase Lock®
Zdá sa, že toto je jedna z vecí, ktoré sa vyskytujú v 50 % laboratórií, no menej ako 10 % ľudí, s ktorými som hovoril, vie, čo to je alebo ako to funguje. Zistil som to v kritickom bode môjho výskumu a zachránilo to moju diplomovú prácu. Stručne povedané, Phase-lock gél je mazľavý gél podobný vazolíne, ktorý má hustotu o niečo väčšiu ako voda. Ak pridáte extrakciu na ňu v centrifugačnej skúmavke a potom ju odstredíte, gél Phase Lock sa zhromaždí medzi vodnou a organickou fázou, oddelí ich a zabráni vytvoreniu medzifázy hladovej DNA/RNA.

Hľadanie na internete nenašlo žiadne obrázky tohto procesu, o ktorých som si myslel, že sú dosť dobré, a tak som si vzal nejaké svoje. V tejto malej ukážke červené farbivo nahrádza našu vzácnu nukleovú kyselinu a modré farbivo nahrádza proteín.

A) Phase Lock gel® peletovaný na dno 1,5 ml skúmavky Eppendorf.
B) Po pridaní fenolu/chloroformu a vodnej fázy doplňte umelú DNA (červená) a umelú bielkovinu (modrá) vo vodnej fáze.
C) Po jemnom pretrepaní po dobu 5 minút.
D) Po odstredení. Všimnite si, že gél teraz oddeľuje organickú fázu od vodnej fázy.
E) Po druhom pridaní fenolu/chloroformu a miernom trepaní počas 5 minút.
F) Po druhom odstredení. Umelá DNA by sa teraz mohla extrahovať chloroformom (v rovnakej skúmavke, ak to priestor dovoľuje), aby sa odstránil zvyškový fenol.

Ako vidíte, gél tvorí stabilnú prepážku medzi dvoma fázami a ak chcete vzorku extrahovať druhýkrát a v skúmavke je stále miesto, môžete to urobiť pomocou dvoch alebo viacerých rovnakých skúmaviek. krát bez kompromisov v čistote vzorky. Nemôžete vortexom zmiešať dve fázy v skúmavke obsahujúcej toto činidlo, ale môžete miešať v samostatnej skúmavke, potom pridať vzorku do skúmavky s gélom a odstrediť. Majú tento gél v dvoch rôznych príchutiach – jednu pre bežné vzorky (ľahkú) a druhú pre vzorky s vysokou hustotou, ako sú roztoky s vysokou koncentráciou soli alebo bielkovín (ťažké).

Použitie SDS na denaturáciu proteínov v mojej vzorke pred extrakciou a následné použitie gélu Phase Lock® na oddelenie fáz mi konzistentne poskytlo vzorky DNA s pomerom 260/280 1,8 a vyššou ako 98% výťažnosťou. Vážne skvelé veci.

Pri príprave tohto článku som narazil na túto webovú stránku, na ktorej je veľa užitočných informácií. Navštívte ho, ak sa chcete dozvedieť viac o fenole.

Teraz počuť od vás: aké sú vaše triky a tipy na dokonalé extrakcie bielkovín?


Technológia Lab-on-a-Chip a jej aplikácie

Burak Yılmaz , Fazilet Yılmaz , v Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018

8.1.1.2 PCR, qPCR a molekulárna detekcia na zariadeniach LOC

Po extrakcii DNA je najbežnejšou analýzou PCR (polymerázová reťazová reakcia). PCR má veľa aplikácií, ktoré sú priamo a nepriamo podobné sekvenačným technikám. Jednou z priamych aplikácií PCR je samozrejme amplifikácia sekvencií DNA, ktorá pomáha vytvoriť detekovateľné nízke množstvá DNA (napr. na detekciu patogénov, ako sú baktérie alebo vírusy).

Význam PCR v genómovej analýze ovplyvňuje vývoj mnohých zariadení LOC pre PCR. Miniaturizácia objemu a vysoký pomer povrchu k objemu vedie k rýchlemu prenosu tepla pre rýchlu a integrovanú PCR. PCR also requires a post-analysis so that amplicons’ size detection carried out by electrophoresis have been made to integrate PCR and electrophoresis on-chip ( Timothée, 2015a ).

Originally electrophoresis is done by using gels, mainly made using agarose (for longer DNA) and polyacrylamide (for shorter DNA). With the advent of LOCs, DNA electrophoresis was one the first molecular processes that could be integrated on a chip ( Curtis Saunders et al., 2013 ). This miniaturization enabled to increase even more the process time to realize electrophoresis, reduce reagent consumption, and assemble on a chip other DNA process steps as mentioned before ( Fig. 8.1 ).

Figure 8.1 . PCR microfluidic system.

qPCR is another technique that was adapted to LOC devices that present the advantage to be faster (automated detection during PCR), more sensitive, and sustainable.

As an example, using ultra-fast pressure controller and fluorescence reader and based on the ultra-fast temperature control, ultra-fast qPCR microfluidic system had been developed by Elvesys system for the molecular detection of diseases like Anthrax and Ebola in less than 8 minutes with a detection efficiency identical to commercial systems that are 7–15 times slower ( Ramalingam et al., 2010 ).

Another emerged field is digital microfluidics that deals with emulsion and droplets within LOC devices.

Ultra-low amount of DNA can be captured within kvapôčky, and limits can be increased with one copy number detection within LOC droplet qPCR ( Beer et al., 2007 ) ( Fig. 8.2 ).

Figure 8.2 . LOC droplet qPCR.


Metóda¶

  • Pomocou Bleach sterilizujte suchú reagenčnú špachtľu a malé magnetické miešadlo.
  • Pripravte 5-10 % hmotnostných suspenzie Chelex100 Resin (Biorad časť 143-3832, 100-200 mesh Chelex, sodná forma) a UV sterilizovanej vody HPLC. Najúčinnejší spôsob, ako to urobiť, je vziať 50 ml sterilnú skúmavku Falcon, umiestniť ju na váhu do malej kadičky a vynulovať váhu. Potom pridajte 5 gramov Chelexu a doplňte po značku 50 ml vodou.

Presnosť nie je kritická. Sterilná technika je.

  • Vložte sterilné miešadlo do skúmavky a umiestnite na magnetické miešadlo. Chelex sa rýchlo usadzuje, takže ak nie je suspenzia dobre premiešaná, vaše koncentrácie a výsledky budú rôzne. Suspenziu udržiavajte dobre premiešanú, alikvotujte 300-500 mikrolitrov do 0,6 alebo 1,6 ml eppendorfových skúmaviek (opäť sterilných) a ihneď uzavrite. Ak máte prístup k odsávaču s laminárnym prúdením, je to dobré miesto, kde toto všetko môžete urobiť. Možno budete chcieť pred použitím utrieť vodný kameň a miešadlo 10% roztokom bielidla a/alebo sterilizovať UV žiarením.
  • Zapnite vyhrievací blok. Nastavte na 95°C. Naplňte otvory vodou.

  • Pomocou sterilných klieští (na sterilizáciu niekoľkokrát plameňom nad alkoholovým horákom) odstráňte malý kúsok tkaniva zo vzorky. Tento kúsok tkaniva by mal byť dostatočne veľký, aby bol viditeľný, ale nie taký veľký, aby bol ľahko viditeľný. Predstavte si odrezanie 0,2 mm časti štandardnej sponky. Toto je dosť veľké. Príliš veľa tkaniva môže brzdiť vaše reakcie.

Sterilizujte kliešte medzi vzorkami.

  • Po dokončení urobte negatívnu kontrolu Chelex ponorením sterilizovaných klieští do skúmavky so suspenziou Chelex.
  • Vortexujte vzorku a chelexovú kašu 10-15 sekúnd.

Pred začatím sa uistite, že viečka sú pevne zacvaknuté.

* Teplota bloku môže pri vykonávaní tohto kroku mierne klesnúť. Tento pokles je normálny. Počas inkubácie skontrolujte skúmavky, aby ste sa uistili, že viečka neodpadli. *

Buďte opatrní, pretože para môže vyskočiť veko zo skúmavky odstredivky. Držte viečka dole.

Supernatant používajte len na reakcie PCR. Chlex korálka deaktivuje Taq!

Táto metóda je so súhlasom založená na originálnom protokole dostupnom tu.


Pozri si video: Maxwell CSC DNA FFPE Kit Instrument Operation (Jún 2022).