Informácie

Validácia liečby na myšacích modeloch

Validácia liečby na myšacích modeloch



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Snažím sa zostaviť návrh projektu na validáciu známej liečby metastatického kolorektálneho karcinómu na myších modeloch. Chcem vidieť, ako SNP u pacientov prispievajú k ich liekovej rezistencii a / alebo toxicite. Na validáciu týchto SNP ako prediktívnych biomarkerov použijem bunkové línie a myšacie modely. Ale ako mám „vyvolať“ tieto špecifické SNP u myší? CRISPR/Cas9 je možné použiť na úpravu väčších dielov. Akýkoľvek nápad je užitočný nápad!


Metastatické modely mozgových nádorov a analýza penetrácie liekov do mozgu

3.3.3 Výhoda GEMM

Boli vytvorené a charakterizované GEMM mozgových nádorov so špecifickými genetickými zmenami pozorovanými u ľudských mozgových nádorov. Pretože vytvorené mutácie v GEMM sú podobné tým, ktoré boli pozorované u ľudských pacientov, GEMM vernejšie odrážajú dôležité genómové charakteristiky klinických mozgových nádorov. V mnohých prípadoch mali GEMM podobné histopatologické a biologické vlastnosti ako nádory ľudského mozgu. Preto sa tieto GEMM môžu použiť na skúmanie vývoja mozgového nádoru, progresie, genetických zmien a terapeutickej stratégie. Jednou z najdôležitejších výhod GEMM v porovnaní s xenograftovými modelmi je to, že použitie GEMM by mohlo riešiť, či je špecifická molekulárna zmena zodpovedná za vývoj a progresiu mozgového nádoru. Okrem toho GEMM poskytujú informácie o sekvenčných udalostiach alebo zmenách po špecifických génových mutáciách. Okrem toho GEMM poskytujú aj nástroj na skúmanie interakcií nádoru a strómy počas navádzania, invázie a progresie metastatického mozgového nádoru. GEMM sú dobrými modelmi na skúmanie biologických vlastností geneticky zmenených rakovín u imunokompetentných zvierat. Môže sa použiť aj v štúdiách prenikania liečiva do mozgu cez BBB.


Pozadie

Rakovina je heterogénne ochorenie s intra- a internádorovou genómovou diverzitou, ktorá určuje iniciáciu, progresiu a liečbu rakoviny. Pochopeniu biológie rakoviny a vývoju terapeutík výrazne napomohli rôzne modely myších nádorov, vrátane xenoimplantátov odvodených z bunkovej línie (CDX), xenoimplantátov odvodených od pacienta (PDX), geneticky upravených myších modelov (GEMM), bunkovej línie. - alebo homografty odvodené od primárneho nádoru u syngénnych myší a tak ďalej (prehľad [1,2,3,4]). Tieto modely sa líšia svojou generáciou, genomikou a biológiou hostiteľa a nádoru, dostupnosťou a výskumným využitím. Napríklad imunoterapie sa testujú na imunokompetentných modeloch, ako sú GEMM a syngénne modely.

Posledné desaťročia boli svedkami zrýchleného vytvárania, distribúcie, profilovania a charakterizácie modelov myších nádorov [5,6,7,8,9,10]. Bohaté zbierky umožnili vykonávať takzvané „myšie klinické štúdie (MCT)“, v ktorých sa panel myších modelov, desiatky až stovky, používa na vyhodnotenie terapeutickej účinnosti, objavenie/overenie biomarkerov, štúdium biológie nádorov atď. na. MCT preukázali verné klinické predpovede vo viacerých štúdiách [6, 11,12,13,14,15]. Zatiaľ čo väčšina hlásených MCT používala PDX, MCT používajúce iné myšacie modely, ako sú syngénne modely, sa teraz tiež bežne vykonávajú.

Kvôli svojej podobnosti s klinickými skúškami sa MCT často analyzujú metódami pre klinické skúšky. Napríklad celkové prežívanie (OS) a prežívanie bez progresie (PFS) sa odhaduje zvýšením objemu nádoru, na analýzu prežitia sa používajú modely proporcionálnych rizík Cox, kategórie odpovedí sú definované zmenou objemu nádoru a vypočíta sa miera objektívnej odpovede (ORR). [6, 13, 16]. MCT sa však v mnohých smeroch líšia od klinických štúdií. (1) V onkologickej klinickej štúdii je pacient zaradený len do jedného ramena, zatiaľ čo v MCT sa vytvorí viacero myší s nádorom z rovnakého myšacieho modelu, takže myši môžu byť umiestnené do všetkých ramien. Myši z rovnakého myšacieho modelu zachytávajú vnútronádorovú heterogenitu pre rast nádoru a odpoveď na liek a myši z rôznych myšacích modelov zachytávajú medzinádorovú heterogenitu. Chybu merania možno kvantifikovať, keď sa v každom ramene použije viacero myší. Okrem toho, keďže v oboch ramenách sú myši s rovnakými myšacími modelmi, samotné môžu slúžiť ako kontrola naprieč ramenami na lepšie meranie účinnosti lieku. (2) objemy nádorov sa rutinne merajú každých pár dní (3) myšacie modely sú zvyčajne charakterizované genómovými/farmakologickými/histopatologickými anotáciami (4) MCT sa robia v laboratóriách, ktoré znižujú/odstraňujú rôzny hluk a nepohodlie, s ktorými sa stretávame pri klinických skúškach, ako napríklad výpadky , dlhý skúšobný čas a súbežná medikácia.

V tejto štúdii kombinujeme empirickú analýzu údajov, štatistické modelovanie a výpočtové simulácie na riešenie niektorých kľúčových problémov pre MCT, vrátane určenia počtu zvierat (počet myších modelov a počet myší na myšací model), štatistického výpočtu sily, kvantifikácie účinnosti. rozdiel medzi myšami/myšími modelmi/liekami, analýza prežitia, objavenie/overenie biomarkerov s jednoduchými odčítaniami účinnosti a mimo nich, zaobchádzanie s vypadnutými myšami, chýbajúce údaje a rozdiel v rýchlosti rastu nádorov, štúdium mechanizmov účinku (MoA) pre lieky. Ukážeme tiež, že MCT môžu vysvetliť rozdielne výsledky klinických štúdií.


Ľahko použiteľný, lacný model

Je zrejmé, že hlavnou črtou syngénnych modelov je to, že sú imunokompetentné, vyznačujúce sa plnou myšacou imunitou a komplexnou strómou. Ďalším kľúčovým faktorom pri ich zvýšenom používaní je ich relatívna jednoduchosť v porovnaní s inými imunokompetentnými modelmi (napr. GEMM, humanizované myši).

Syngeneics je imunokompetentný model, ktorý sa najviac podobá štandardnej štúdii xenoimplantátu. Syngénne bunkové línie sa dajú ľahko kultivovať a expandovať v akomkoľvek laboratóriu. Modely majú 100% penetranciu a subkutánne injekcie môžu byť starostlivo načasované, aby sa synchronizoval vývoj nádoru a napodobnili dizajn štúdie xenoimplantátu. Výsledkom sú krátke štúdie účinnosti (potenciálne 2 až 4 týždne) uskutočnené so štatisticky významným počtom myší na skupinu, ktoré sú lacné a primerane jednoduché na spustenie.


Cellular Housekeeping: Ako môžu autofágne modely u myší viesť k liečbe u ľudí

V tejto modernej ére medicíny a výskumu sa kladie zvýšený dôraz na to, ako starneme a ako sa u nás vyvíjajú choroby súvisiace s vekom. V tomto duchu laboratórium Levine na UT Southwestern uskutočnilo štúdie o procese autofágie. Autofágia je vysoko regulovaný prirodzený proces, prostredníctvom ktorého bunky degradujú a recyklujú dysfunkčné bunkové zložky, ktoré sú rozhodujúce pri ochrane pred chorobami a hladovaním. Vieme, že naša schopnosť vykonávať autofágiu s pribúdajúcim vekom klesá a že zníženie schopnosti zvierat vykonávať autofágiu výrazne znižuje ich životnosť. Okrem toho však účinok autofágie na dlhovekosť nie je dobre pochopený.

V najbežnejšej forme autofágie sú komponenty označené na recykláciu pohltené, aby vytvorili štruktúru nazývanú autofagozóm. Potom sa zložky prenesú do veľmi kyslého lyzozómu a nakoniec sa degradujú prostredníctvom špecializovaných enzýmov. Výskumníci môžu využiť tieto procesy na zmenu toho, koľko autofágie môže organizmus vykonať.

S cieľom študovať autofágiu vedci vytvorili myšací model, ktorý má zvýšené úrovne autofágie. Toto sa vykonáva mutáciou zložky toho, čo sa nazýva regulačný komplex beclin 1-BCL2. Keď BCL2 viaže beclin 1, autofágia sa vypne. Skonštruovaná mutácia v becline 1 bráni BCL2 vo väzbe a umožňuje beclinu 1 pokračovať v podpore tvorby autofagozómu, čo vedie k neustále vyšším úrovniam autofágie u myší.

Výsledky tejto štúdie ukazujú, že myši so zvýšenými hladinami autofágie majú výrazne dlhšiu životnosť. Štúdie ukázali, že tieto mutantné myši beclin 1 žijú nielen dlhšie, ale aj zdravšie, majú lepšiu funkciu obličiek a srdca, ako aj menej spontánnej tvorby nádorov. Navyše je zachránená ich predčasná letalita a neplodnosť. Tieto výsledky naznačujú, že podpora autofágie týmto spôsobom môže podporiť zdravie a dĺžku života cicavcov a mala by sa ďalej študovať.

Vedci sa potom pýtali, či by známe zlúčeniny proti starnutiu mohli produkovať svoje účinky cestou podobnou ich genetickému myšaciemu modelu. Klotho, membránový proteín, bol jednou z takýchto zlúčenín, ktoré skúmali. Už skôr sa ukázalo, že zvieratá geneticky upravené na nedostatok klotho majú skrátenú životnosť a že podávanie klotho by mohlo predĺžiť život. Okrem toho sa pozorovalo, že podávanie klotho podporovalo viac autofágie. Laboratórium Levine vzalo klotho-deficientné myši a pozorovalo výrazné zvýšenie väzby beclin 1 - BCL2, čo viedlo k menšej autofágii. Tým, že vzali tieto myši s deficitom klotho a zmutovali beclin 1, dokázali zachrániť účinky nedostatku klotho a vrátiť autofágiu do normálu. Okrem toho, podávaním klotho ľudským HeLa bunkám boli schopné znížiť väzbu beclinu 1-BCL2, čo ukazuje, že tento účinok nie je izolovaný u myší, ale je aplikovateľný aj na ľudí.


1.2. BEHAVIORÁLNE TESTY

Najprevládajúcim a najvýraznejším znakom u pacientov s AD je progresívny pokles kognície, primárne v dôsledku straty neurónov a synapsií v hipokampálnej formácii a súvisiacich oblastiach [18]. Ako taká musí mať “m vlastnosť platného AD-transgénneho modelu schopnosť modelu presne odrážať zmeny správania pozorované u ľudských pacientov s AD. Na presnú interpretáciu behaviorálnych výsledkov z transgénnych myších modelov AD je dôležité dôkladne pochopiť behaviorálne úlohy, ktoré sa najčastejšie používajú na testovanie kognitívnych zmien u myší, ako aj to, čo každý kognitívny test skutočne meria. Pri skúmaní kognície u zvierat sa behaviorálne úlohy zvyčajne delia buď na asociatívne alebo operantné vzdelávacie úlohy. Asociatívne učebné úlohy využívajú podnety v prostredí na podmieňovanie špecifickej reakcie u zvieraťa. Operačné vzdelávacie úlohy vyžadujú, aby zviera reagovalo na konkrétny stimul, aby získalo výsledok. Kognitívne úlohy sa ďalej delia do skupín podľa typu testovanej pamäte. Nasledujú niektoré z najčastejšie používaných úloh na určenie kognitívnych zmien v myšacích modeloch, transgénnych alebo iných.

1.2.1. Úlohy priestorovej pamäte

1.2.1.1. Morrisovo vodné bludisko

Morrisovo vodné bludisko (MWM) je obzvlášť citlivou úlohou na skúmanie deficitov súvisiacich s vekom/AD, pretože je vysoko špecifické pre hipokampálnu funkciu, jednu z prvých a najviac postihnutých oblastí mozgu pri AD [18]. Výsledkom je, že test MWM je jednou z najbežnejších behaviorálnych úloh používaných na určenie deficitov priestorovej pamäte hipokampu [19]. Test spočíva v umiestnení hlodavca do kruhovej nádrže naplnenej zakalenou vodou, ktorá sa používa na motiváciu zvieraťa uniknúť z vody plávaním na skrytú plošinu umiestnenú priamo pod hladinou vody. Počas niekoľkých dní sa hlodavec naučí nájsť skrytú platformu pomocou priestorových podnetov, ako sú plagáty alebo nalepené predmety strategicky umiestnené na stenách mimo vodného bludiska v testovacej miestnosti. Preplávaná vzdialenosť, latencia dosiahnutia plošiny a rýchlosť plávania, najčastejšie zaznamenané na videu, sú bežné miery tohto testu. Schopnosť zvieraťa získať a uchovať naučené informácie alebo flexibilitu očistiť a znovu sa naučiť nové stratégie možno určiť pomocou pokusu so sondou a pokusu o zvrátenie. Pri skúške sondy sa plošina vyberie a zvieratá sa nechajú plávať v bazéne. Meria sa čas strávený v oblasti, ktorá predtým obsahovala nástupište, prejazdy cez oblasť nástupišťa a čas potrebný na dosiahnutie miesta nástupišťa. Reverzná skúška je identická s tréningovou skúškou, ale v tomto prípade je platforma prepnutá do opačnej oblasti bazéna, čím sa testuje kognitívna flexibilita zvieraťa, ktorá je potrebná na opätovné naučenie sa novej polohy. Upravená verzia tejto úlohy, ktorá zviditeľňuje platformu, sa môže použiť aj na meranie nepriestorových stratégií, ako aj zrakovej ostrosti [20]. Variácie zahŕňajú vodné bludisko s radiálnym ramenom (RAWM) alebo vodné bludisko v tvare plus [21].

Jedným z žiaducich aspektov tejto úlohy je, že motivačný stimul, t. j. únik z vody, nevyžaduje nedostatok potravy alebo vody, ktorý je bežný pri iných úlohách priestorovej pamäte. Má však aj určité obmedzenia, jedným z nich je skutočnosť, že rôzne zložky pamäte, teda referenčné a pracovné pamäte, nemožno testovať súčasne.

1.2.1.2. Bludisko s radiálnym ramenom

Jednou z úloh, ktorá dokáže prispôsobiť simultánne meranie pamäťových komponentov a ktorá sa tiež široko používa na štúdium výkonnosti priestorovej pamäte u hlodavcov, je radiálne rameno bludisko (RAM). Toto bludisko pozostáva z 8� rovnomerne rozmiestnených ramien vyžarujúcich z centrálnej plošiny, do ktorej musí hlodavec vstúpiť, aby získal odmenu za jedlo alebo vodu umiestnenú v niektorých ramenách. V tejto úlohe sa zvieratá samy vedú pomocou priestorových návestí po miestnosti s cieľom vstúpiť do každého ramena iba raz, aby získali maximálne množstvo odmeny za jedlo alebo vodu v čo najkratšom čase a s čo najmenšou námahou. Toto bludisko vyžaduje použitie pracovnej pamäte na uchovanie informácií, ktoré sú dôležité na krátky čas (v rámci skúšobných informácií), ako aj použitie referenčnej pamäte na uchovanie všeobecných pravidiel úlohy počas dní. Konkrétne si zviera musí vedieť zapamätať, ktoré ramená boli nastražené, ako aj to, do ktorých už vstúpilo (pracovná pamäť), ale tiež musí vedieť, ako sa vyhnúť ramenám bez návnady počas pokusov (referenčná pamäť). schopný úspešne zakódovať priestorové informácie. Aj keď táto úloha umožňuje skúmať referenčnú aj pracovnú pamäť, hlavnými obmedzeniami sú pri tejto úlohe nedostatok potravy alebo vody, ako aj prítomnosť mätúcich pachov [22�].

1.2.1.3. Vodné bludisko s radiálnym ramenom

Relatívne nová úloha priestorovej pamäte, RAWM, bola navrhnutá tak, aby eliminovala obmedzenia vyššie uvedených úloh kombináciou pozitívnych aspektov MWM a RAM. Rozdiel medzi MWM a RAWM je v tom, že výkon v RAWM znamená nájsť platformu, ktorá je ponorená vo vode umiestnenú v jednom z niekoľkých ramien (6𠄸) vo vodnom kúpeli, v porovnaní s klasickým MWM, ktorý má iba otvorené plavecké pole. . To robí úlohu trochu zložitejšou, ale núti zviera používať priestorové náznaky a pracovnú pamäť (sledovanie ramien, ktoré už navštívilo), aby si zapamätalo, kde sa platforma nachádza. Na preskúmanie rozdielov v priestorovej pamäti po farmakologickej liečbe [25,26] a rozdielov medzi druhmi [27], pohlavím [28] a, čo je dôležité, aj modelmi sa použilo niekoľko variácií tejto úlohy s použitím rôznych počtov platforiem a organizácie umiestnenia platforiem. AD [24,29].

1.2.2. Kontextová pamäť

1.2.2.1. Kondicionovanie strachu

Mrazivá reakcia, definovaná ako úplný nedostatok pohybu, je vrodenou reakciou hlodavcov na strach. V paradigme podmieňovania strachu je zviera umiestnené do boxu obsahujúceho mriežku, ktorá poskytuje mierny averzívny stimul počas dvoch minút. V škatuli je zvieraťu prezentovaný tón (zvyčajne 80 dB) (podmienený stimul), ktorý je spárovaný s miernym šokom (nepodmienený stimul) na konci pokusu s výsledkom, že tón vyvoláva mrazivú reakciu. Opakované expozície sú niekedy potrebné v závislosti od použitej námahy alebo časového intervalu medzi tónom a otrasom. Niektorí vedci používajú stopové podmieňovanie strachu, ktoré zvyšuje časový rozdiel medzi tónom a šokom, aby mohli preskúmať prefrontálnu kortikálnu aktivitu. Tu sa zviera vyberie z boxu a vráti sa o 24 hodín neskôr, aby sa vyhodnotila jeho naučená averzia voči prostrediu spojenému s miernym averzívnym stimulom (kontextovo závislým strachom) meraním mrazivého správania v neprítomnosti tónu alebo averzívneho stimulu. Strach závislý od podnetu možno merať umiestnením zvieraťa do novej škatule, ktorá sa líši farbou, tvarom atď., a prezentovať mu tón, keď skúma nové prostredie, pri ktorom sa meria mrazivé správanie spojené s tónom.

Podmieňovanie strachu je široko používaný test na meranie asociatívneho učenia závislého od hipokampu. Predpokladá sa, že tento test je citlivý na učenie spojené s emóciami, a preto je užitočným meradlom amygdalar–hippokampálnej komunikácie. Mnohé z transgénnych myších modelov AD vykazujú poruchy strachu a úzkosti, čo je primárne funkciou amygdaly. Funkcia hipokampu používaná pri podmieňovaní strachu sa môže líšiť od učenia v priestorovej úlohe [30�].

1.2.2.2. Učenie pasívneho vyhýbania sa

V úlohe učenia pasívneho vyhýbania sa zviera musí naučiť vyhýbať sa miernemu averzívnemu podnetu, v tomto prípade tme, tým, že zostane na dobre osvetlenej strane dvojkomorového aparátu a nevstúpi do tmy, kde dostane averzívny stimul. Všimnite si, že keďže hlodavce prirodzene priťahujú tmu, zviera musí túto tendenciu potlačiť spárovaním negatívneho stimulu s požadovaným oddelením. Zvieratá, ktoré si nepamätajú averzívny stimul, prejdú skôr ako zvieratá, ktoré si pamätajú. Závislé merania zahŕňajú strednú latenciu prechodu (latencia prechodu na nebezpečnú stranu) a percento zvierat z každej experimentálnej skupiny, ktoré prekročia prah v pridelenom čase [20,33,34].

1.2.3. Pracovná pamäť/novinka/aktivita

1.2.3.1. Y-bludisko

Tento test je založený na vrodenej preferencii myší striedať ruky pri skúmaní nového prostredia. Dostupné sú rôzne modifikácie s rôznou úrovňou náročnosti a rôznymi nárokmi na špecifické typy kognície. Jedna verzia, ktorá je obzvlášť populárna na štúdium kognitívnych zmien v AD transgénnych modeloch, je verzia so spontánnou alternáciou Y-bludiska. V tomto prípade sa testované zvieratá umiestnia do bludiska v tvare Y na 6𠄸 minút a zaznamená sa počet zadaných ramien, ako aj postupnosť vstupov a vypočíta sa skóre na určenie miery striedania (stupeň vstupov ramien bez opakovaní). Vysoká miera striedania svedčí o trvalej kognícii, pretože zvieratá si musia pamätať, do ktorej ruky vstúpili ako posledné, aby do nej znova nevstúpili [35].

Môže sa vykonať aj verzia s krátkodobou pamäťou, v ktorej je jedno rameno Y-bludiska zablokované a subjekt môže skúmať obe ramená 15� min. Zviera sa potom vyberie z bludiska na niekoľko minút alebo až niekoľko hodín, v závislosti od experimentálnej manipulácie, a potom sa umiestni späť do bludiska, tentoraz so všetkými otvorenými ramenami, aby preskúmalo na 5 minút. Zvieratá so zachovanou kognitívnou funkciou si zapamätajú predtým zablokované rameno a vstúpia doň ako prvé pri druhom pokuse. Tento test možno zopakovať aj týždeň po poslednom pokuse s časovým oneskorením iba 2 minúty medzi pokusmi, aby sa otestovala dlhodobá pamäť a čas, ktorý zviera potrebuje na opätovné naučenie sa úlohy. Typicky merané parametre zahŕňajú prvé zadané rameno, množstvo času stráveného v každom ramene a celkový počet vstupov do ramena [35].

1.2.3.2. T-bludisko

Úlohy v T-bludisku sú neuveriteľne dobre charakterizované a široko sa používajú na testovanie kognitívneho správania u myší aj potkanov. Zvieratá začínajú na základni T a je im umožnené vybrať si jedno z cieľových ramien priliehajúcich na druhý koniec stonky. Ak sa uskutočnia dva pokusy v rýchlom slede, pri druhom pokuse má hlodavec tendenciu vybrať si rameno, ktoré predtým nenavštívil, čo odráža spomienku na prvú voľbu. Toto sa nazýva “spontánne striedanie.” Táto tendencia môže byť posilnená tým, že zviera bude hladné a ak sa bude striedať, odmeníme ho preferovaným jedlom. Spontánne aj odmenené alternácie sú veľmi citlivé na dysfunkciu hipokampu, a preto sú citlivé na symptómy podobné AD, ale zapojené sú aj iné mozgové štruktúry. Každá skúška by mala byť dokončená za menej ako 2 minúty, ale celkový počet požadovaných pokusov sa bude líšiť v závislosti od štatistických a vedeckých požiadaviek [36].

1.2.3.3. Rozpoznávanie objektov

Test rozpoznávania objektov je založený na prirodzenej tendencii hlodavcov skúmať nový objekt namiesto známeho, ako aj na ich vrodenej tendencii znovu objavovať, keď sa im dostane nové prostredie. Voľba preskúmať nový objekt, ako aj opätovná aktivácia prieskumu po premiestnení objektu, odráža použitie pamäťových procesov učenia a rozpoznávania. Dostupné úlohy rozpoznávania objektov na testovanie kognície u hlodavcov využívajú rôzny počet dostupných objektov a prostredí, v ktorých sa zvieratá testujú, ako aj typy konfigurácií zameraných okrem iného na testovanie priestorového rozpoznávania a novosti. Jedna konkrétna úloha rozpoznávania objektov, ktorá je citlivá na deficity súvisiace s vekom, je veľmi vhodná na testovanie deficitov súvisiacich s AD [37�]. Pri tejto úlohe sa hlodavec umiestni na 6 minút do kruhového otvoreného poľa vyplneného rôznymi predmetmi (t. j. rôznymi plastovými hračkami rôznych veľkostí a tvarov). Po sérii pokusov, počas ktorých si zviera zvyklo na konfiguráciu a vlastnosti rôznych objektov, sa niektoré objekty prepínajú z jedného miesta na druhé, aby sa posúdilo priestorové rozpoznávanie. Následne sú niektoré objekty nahradené novými, aby sa vyhodnotilo nové rozpoznávanie objektov. Vypočíta sa čas strávený skúmaním otvoreného poľa (pohyb/nečinnosť), ako aj počet krát a časová dĺžka kontroly každého objektu počas rôznych pokusov.

1.2.3.4. Otvorené pole

Test lokomocie v otvorenom poli sa používa predovšetkým na vyšetrenie motorickej funkcie pomocou merania spontánnej aktivity v otvorenom poli. Kruhové alebo štvorcové otvorené polia sa líšia veľkosťou v závislosti od experimentu a sú rozdelené do samostatných kvadrantov alebo sekcií. Zviera je umiestnené na otvorenom poli a pohyby zvieraťa sú buď nahrávané na video alebo monitorované automatizovanými počítačovými programami. Chov, kríženie línií, čistenie, všeobecný pohyb, počet prekrížených línií, preferencia konkrétnych sekcií a/alebo pohyby výkalov, to všetko sa dá vypočítať na vyšetrenie správania a úzkosti [40,41].


5. BUDÚCE SMERY

5.1. Personalizovaná medicína: Terapia založená na neoantigénoch nádorov

Použitie sekvenčných technológií novej generácie na štúdium mutačnej krajiny nádorov umožňuje identifikáciu nádorových neoantigénov. Tieto neoantigény, ktoré vznikajú pre nádorovo špecifické mutácie, predstavujú ideálne ciele pre personalizovanú imunoterapiu rakoviny, pretože by nemali chýbať v normálnych tkanivách a imunitné bunky by ich mohli rozpoznať ako ne-vlastný antigén. Aj keď sa modely HIS dnes nepoužívajú na štúdium stratégií očkovania pomocou neoantigénov, môžu byť užitočné na in vivo validáciu kandidátskych neoantigénov predpovedaných silico v adoptívnych prístupoch prenosu T buniek. Napríklad ľudské CD8+ T bunky obohatené o predpovedané neoantigény rakoviny prsníka boli schopné chrániť myši pred stimuláciou nádoru autológnymi PDX (Zhang et al. 2017) a neoantigénovo špecifické TCR-transdukované T bunky vykazovali protinádorovú účinnosť u myší NSG s implantovaným bunková línia akútnej myeloidnej leukémie exprimujúca neoantigén (Van Der Lee et al. 2019).

5.2. Personalizovaná medicína: Modely avatarov

HIS myši s naštepenými autológnymi ľudskými imunitnými bunkami a PDX tvoria takzvané ideálne modely avatarov, keďže môžu byť použité na predpovedanie odpovede pacienta na imunoterapiu a môžu pomôcť prispôsobiť personalizovanú liečbu pri relapse. Napriek tomu relatívne nízky počet pacientov s pokročilou rakovinou prežije dostatočne dlho na to, aby mali úžitok zo skúšky avatara vykonanej s jeho vlastným PDX. Nastavenie modelu avatara si skutočne vyžaduje tri časovo náročné kroky: vytvorenie PDX (vo všeobecnosti platí, že čím rýchlejšie sa prihojuje PDX, tým agresívnejší je nádor u pacienta), jeho in vivo expanzia na získanie dostatočného množstva nádorového tkaniva a predklinické hodnotenie štandardných verzus nových terapeutických stratégií. Niektorým štúdiám sa už podarilo vytvoriť modely PBL-HIS pomocou autológnych PBMC a PDX. V takýchto podmienkach anti-kontrolné mAb oneskorili rast nádoru žalúdka (Sanmamed et al. 2015) a bišpecifická Ab inhibovala HER2 + nádor prsníka s lepšou účinnosťou, keď myši dostali autológne PBMC, než keď dostali nezhodné PBMC (Rius Ruiz et al. 2018). Je zaujímavé, že niektoré štúdie preukázali koreláciu medzi terapeutickými výsledkami u myší avatara a u pacientov. V súlade s tým adoptívny prenos autológnych TIL inhiboval rast melanómu PDX u hIL2-NOG myší podľa analogického vzoru odpovedajúceho/neodpovedajúceho u pacienta podobne liečeného ACT (Jespersen et al. 2017). Okrem toho odpoveď anti-PD1 pozorovaná v modeli avatara s použitím pacientovho vlastného melanómového PDX a TIL podporila terapeutické rozhodnutie pre tohto pacienta (Ny et al. 2020). Avatarský prístup využívajúci modely HIS je ešte potrebné overiť, ale mohol by nakoniec viesť k budúcemu použitiu imunoterapie ako presnej medicíny a pomôcť identifikovať prediktívne biomarkery klinických odpovedí.


Ďakujeme Hayley Donnella a Attila Gabor za užitočnú diskusiu a spätnú väzbu k rukopisu. Ďakujeme Diane Panayotovej Dimitrovovej a Márii Feoktistovej za konštruktívnu diskusiu o dráhe apoptózy. FE ďakuje European Molecular Biology Interdisciplinary Post-Docs (EMBL EIPOD) a Marie Curie Actions (COFUND) za financovanie a JRC za počítačovú biomedicínu, ktorá bola čiastočne financovaná spoločnosťou Bayer AG.

JS-R a CAM vymysleli projekt. JS-R a FE navrhli projekt. FE vykonal analýzu pod dohľadom JS-R. PJ, MJG, JW a TC vykonali experimentálnu validáciu a pomohli s interpretáciou výsledkov. Rukopis napísali FE a JS-R. PJ prispel k finalizácii rukopisu. Všetci autori schválili konečný rukopis.


Vyhlásenie o dostupnosti údajov

Pôvodné príspevky prezentované v štúdii sú verejne dostupné. Tieto údaje možno nájsť tu: Údaje o myšacej RNA seq/microarray boli uložené v databáze NCBI Bioproject pod prístupovým číslom PRJNA690520, ku ktorej je možné pristupovať pomocou nasledujúceho odkazu: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ bioprojekt/690520. Ľudské microarray dáta sú dostupné online cez Mendeley Data repository s DOI odkazom na http://dx.doi.org/10.17632/hzmfshy7hp.1. Údaje RNAseq v myšom GC po liečbe ivermektínom sú k dispozícii od autorov na požiadanie.


Jednobunková metóda by mohla eliminovať potrebu modelov myší na štúdium rezistencie na liečbu rakoviny

NEW YORK – Pri skúmaní toho, ako si rakovinové bunky vyvinú rezistenciu voči liečbe, sa výskumníci do značnej miery obmedzujú na použitie bunkových línií alebo myších modelov získaných od pacienta. Ale takéto metódy, aj keď sú informatívne, nie vždy poskytujú úplný obraz: Napríklad nemôžu ukázať, ako zmutované bunky, ktoré sú schopné vyhnúť sa liečbe, interagujú s mikroprostredím nádoru.

Na štúdium týchto buniek a ich vývoja v ich prirodzenom kontexte potrebujú výskumníci spôsob, ako ich študovať vo vzorkách pacientov. Nová metóda jednobunkovej transkriptomiky vyvinutá výskumníkmi z Weill Cornell Medicine, New York Genome Center a inde môže ponúknuť vyšetrovateľom túto príležitosť.

V štúdii nedávno publikovanej v Príroda, výskumníci opísali svoj vývoj genotypovania transkriptómov (GoT), metódy na integráciu genotypovania s vysokovýkonným kvapôčkovým sekvenovaním jednobunkovej RNA.

Výzvou, ktorú riešili, bolo, ako spojiť genotypy s fenotypmi v jednotlivých bunkách, podľa hlavného autora článku Dana Landaua, výskumníka rakoviny vo Weill Cornell Medicine a kľúčového člena New York Genome Center. Hoci sa uskutočnilo mnoho štúdií zameraných na onkogénne mutácie v jednotlivých bunkách, anotácia somatických mutácií pri vysokej priepustnosti bola problémom.

"Somatické mutácie sú prítomné v transkriptóme jednej bunky, pretože kódujúce mutácie sú často transkribované, " povedal Landau. "V dokumente sme urobili nejakú analýzu, ktorá ukazuje, že veľká väčšina mutácií ovládača je prepísaná, často buď ekvivalentnou rýchlosťou, alebo vyššou rýchlosťou v porovnaní s tým, čo vidíme v exóme."

Ďalej, definovanie transkriptomickej identity malígnych buniek je náročné, keď rakovinovým klonom chýbajú akékoľvek markery bunkového povrchu, ktoré by ich mohli odlíšiť jeden od druhého. Ale zatiaľ čo sekvenovanie založené na kvapôčkach - ako napríklad platforma 10x Genomics, ktorú tím upravil na vytvorenie metódy GoT - umožňuje výskumníkom profilovať transkriptómy tisícok buniek, súčasné metódy poskytujú sekvenčné informácie iba pre krátke fragmenty na konci transkriptu, čo obmedzuje schopnosť týchto techník spoločne genotypovať somatické mutácie.

"Jednobunkové metódy [ako platforma 10x Genomics] používajú digitálne sekvenovanie, čo znamená, že zachovávajú iba malú značku na konci transkriptu na kvantifikáciu počtu transkriptov nájdených v každej bunke, " povedal Landau. "Usúdili sme, že to budeme musieť rozšíriť na lokusy záujmu. Toto je v podstate jadro metódy."

Výskumníci upravili platformu 10x Genomics, aby amplifikovali cielený transkript a lokus záujmu, potom skúmali čítanie amplikónu na mutačný stav a spojili genotyp s profilmi jednobunkovej génovej expresie pomocou zdieľaných bunkových čiarových kódov. Použili GoT na profilovanie 38 290 CD34+ buniek od pacientov s myeloproliferatívnymi novotvarmi s mutáciou CALR, aby študovali, ako môžu somatické mutácie narušiť proces ľudskej hematopoézy.

Zmiešali myšie bunky obsahujúce mutantný ľudský transgén CALR s ľudskými bunkami obsahujúcimi ľudský transgén CALR divokého typu a aplikovali GoT, aby otestovali jeho schopnosť spoločne mapovať jednobunkové genotypy a transkriptómy v kontexte zmiešaných druhov. Zistili, že významná väčšina buniek s transkriptmi zarovnanými s myším genómom vykazovala mutantný CALR, zatiaľ čo bunky s prepismi zarovnanými s ľudským genómom vykazovali CALR divokého typu – celkovo 96,7 percent buniek zodpovedalo ich očakávanému druhu.

"CALR je vyjadrený na úrovni niečoho ako 200 až 300 [transkriptov na milión] v bunkách kostnej drene a genotypizovali sme 90 percent bunky, " povedal Landau. "Myslím si, že to, čo tu ponúkame, je metóda, ktorá zahŕňa schopnosť genotypovať v širokej škále scenárov z hľadiska vysokej účinnosti v celom rozsahu expresie. Je zrejmé, že čím viac je gén exprimovaný, tým ľahšie je zachytiť ho v transkriptóm [a] ak je mutácia veľmi blízko konca transkriptu, je ľahšie ju zachytiť. Ak je ďalej, budete potrebovať metódy, ktoré sme vyvinuli."

The researchers have also created an analytical platform called Iron Throne that is capable of connecting the single cell transcriptome to the genotype information, while filtering out multiple sources of background noise such as PCR recombination and PCR errors, to provide high-accuracy precision genotyping, Landau noted. They've made both tools available on GitHub.

The potential for being able to perform controlled gene expression analysis experiments is significant, according to Landau. Using this method, a researcher can compare wild-type and mutant cells within the same individual, with the wild-type cells serving as the ultimate controls.

"Everything is the same — the microenvironmental conditions, the technical confounders, the patient's breakfast. The only thing that's different is the genotyping," Landau said. "Now, we can read it out with this very high-precision tool."

In the context of myeloproliferative neoplasms, which the team studied for the Nature paper, the ability to distinguish cells from one another with high fidelity is especially important. "These patients have both normal and mutated bone marrow development coexisting within their marrow, and in this case the cells are phenotypically indistinguishable with current methods. If you look under the microscope, you'll see that there are too many cells, but you can't distinguish between the wild-type and the mutant — the flow markers are the same," Landau said. "Therefore, there was a significant challenge. We also show that in the RNA-seq data alone, again these two processes are intermingled."

Another context to which the researchers applied GoT was clonal growths in normal tissues. "It's been reported by multiple groups that each one of us essentially harbors hundreds of distinct clonal growths in multiple tissues," Landau said. "And this is in normal-appearing tissue — the tissue is morphologically normal, and the cells look the same. And yet somehow, these clones are growing, and they contain somatic mutations."

Studies have described mutations affecting NOTCH1 in the esophagus, NOTCH1 and p53 in the skin, and mutations in various genes affecting the blood, he added. In this context, studying the transcriptome is not likely to provide answers, so there's a need for a method that can annotate cells that look alike and yet may be differentially mutated.

"We need to be able to start reading out what allows these cells to grow better than their wild-type counterparts," Landau said.

Importantly, this method could change the way that treatment resistance is studied. The way researchers currently probe questions on resistance is by using mouse models or cells lines, but to understand how resistance forms in a native context, "if we want to know what's the relation to the immune microenvironment, we need a method that can actually capture this information in patients," Landau said.

By isolating cells that are both wild-type and mutated for a particular subclonal mutation that confers resistance, and studying them within patient samples, researchers can begin to look at the differences between them in a well-controlled way, without the problem of patient-specific confounders.

"Let's say that you have a genotype that you hypothesize is related to therapeutic resistance. Now you're faced with the question of finding the mechanism. Why are these cells more resistant or less resistant?" Landau said. "The cells are not distinguishable by any other means. They don't have different cell surface markers. They're morphologically the same, so you can't sort them."

Therefore, he added, "you need a method that can annotate individual cells by their genotype and, at the same time, capture at high throughput their single-cell transcriptomes. That allows you to develop a hypothesis directly in patients. You take these cells and you ask what's different about them when they are exposed to therapy in the patient's blood or in the patient's tissue."

At this point, he noted, the GoT method is better suited for basic research, though there wouldn't be a limit to the types of cancers it could be used to study. The method could even be used as a drug discovery tool, to help pharmaceutical companies determine treatment efficacy.

"I think that this could be something that would empower a combination therapy design because you can — and we are collecting this sort of data — have a sort of clinical trial where combination therapies are introduced gradually," Landau added. "And again, you have this unique ability to compare wild-type and mutated subclones."

The team is continuing to develop GoT in multiple ways, and is looking at the possibility of adding layers of information to the analysis, such as DNA methylation.


Authors' Contributions

Conception and design: E. Bruckheimer, V.E. Velculescu, D. Sidransky, M. Hidalgo

Development of methodology: K. Paz, P.P. López-Casas, F. López-Rios, F. Sarno, V.E. Velculescu, M. Hidalgo

Acquisition of data (provided animals, acquired and managed patients, provided facilities, etc.): E. Garralda, P.P. López-Casas, A. Katz, F. López-Rios, F. Sarno, D. Vasquez, E. Bruckheimer, A. Calles, D. Sidransky, M. Hidalgo

Analysis and interpretation of data (e.g., statistical analysis, biostatistics, computational analysis): E. Garralda, K. Paz, P.P. López-Casas, S. Jones, F. López-Rios, F. Al-Shahrour, S.V. Angiuoli, L.A. Diaz, V.E. Velculescu, D. Sidransky, M. Hidalgo

Writing, review, and/or revision of the manuscript: E. Garralda, K. Paz, P.P. López-Casas, S. Jones, F. López-Rios, A. Calles, L.A. Diaz, V.E. Velculescu, M. Hidalgo

Administrative, technical, or material support (i.e., reporting or organizing data, constructing databases): E. Garralda, L.M. Kann, F. Sarno, D. Vasquez, E. Bruckheimer, A. Calles

Study supervision: K. Paz, V.E. Velculescu, A. Valencia