Informácie

Ako má zníženie voľného Ca2+ za následok nervovú/svalovú nadmernú excitabilitu?

Ako má zníženie voľného Ca2+ za následok nervovú/svalovú nadmernú excitabilitu?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

V poznámkach mám, že pokles voľného Ca2+ zvyšuje priepustnosť membrány pre Na+, takže sa približuje k prahu, ale žiadne ďalšie podrobnosti. Ako to teda funguje?


Ide o to, že napäťové hradlové kanály sú v pokojovom stave zatvorené, pretože je na ne viazaný Ca2+. Takže v pokojovom štádiu Ca2+ trochu blokuje Na+ - K+ kanál. Ale keďže je tam málo Ca2+, nebude veľa Ca2+ na stráženie kanálov a tak to povedie k zvýšeniu priepustnosti.Pozrite si fotografiu a predstavte si, že brána je strážená Ca2+. Dúfam, že to pomôže.


Jack bean ureáza moduluje uvoľňovanie neurotransmiterov na neuromuskulárnych spojeniach hmyzu

Pozadie: Rastliny si vyvinuli širokú škálu mechanizmov na súťaž s fytofágnym hmyzom, vrátane entomotoxických proteínov, ako sú ureázy. Strukovina Canavalia ensiformis produkuje niekoľko izoforiem ureázy, z ktorých najrozšírenejšia sa nazýva Jack Bean Urease (JBU). Ukážková práca preukázala potenciálne insekticídne účinky JBU mechanizmami, ktoré doteraz nie sú úplne objasnené. V tejto práci sme skúmali mechanizmy zapojené do aktivity indukovanej JBU po uvoľnení neurotransmitera na neuromuskulárnych spojeniach hmyzu.

Metódy: Použili sa elektrofyziologické záznamy akčných potenciálov nervov a svalov a biotesty na zobrazovanie vápnika.

Výsledky a záver: JBU (0,28 mg/zviera/deň) v Locusta migratoria 2. instar prostredníctvom kŕmenia a injekcie neindukoval letalitu, hoci viedol k zníženiu prírastku hmotnosti o 20 % na konci 168 h (n = 9, p ≤ 0,05). JBU (0,014 a 0,14 mg) injikovaný priamo do zadnej nohy kobylky vyvolal od dávky a času závislý pokles amplitúdy svalových akčných potenciálov s maximálnym poklesom amplitúdy o 70 % pri najvyššej dávke (n = 5, p ≤ 0,05). Pri rovnakých dávkach JBU nezmenil amplitúdu akčných potenciálov vyvolaných motorickými neurónmi. Použitím neuromuskulárnych prípravkov lariev Drosophila v 3. instare JBU (10 -7 M) zvýšil výskyt miniatúrnych excitačných junkčných potenciálov (mEJP) v prítomnosti 1 mM CaCl.2 (n = 5, p < 0,05). V testoch s nízkym obsahom vápnika (0,4 mM) JBU (10-7 M) nebol schopný modulovať výskyt udalostí. V podmienkach bez Ca2+, s EGTA alebo CoCl2JBU vyvolal významný pokles výskytu mEPJ (n = 5, p ≤ 0,05). Injikovaný do 3. brušného ganglia švábov Nauphoeta cinerea, JBU (1 μM) vyvolal významné zvýšenie prítoku Ca2+ (n = 7, p ≤ 0,01), podobné tomu, ktoré bolo pozorované pri vysokom KCl (35 mM) stave. Celkovo výsledky potvrdzujú priame pôsobenie JBU na neuromuskulárne spojenia hmyzu a možno aj centrálne synapsie, pravdepodobne narušením vápnikového mechanizmu v presynaptickej oblasti neurónov.

Kľúčové slová: Prílev vápnika Hmyz Neuromuskulárne spojenie Neurotoxicita Rastlinné ureázy.


Úvod

Spinálna svalová atrofia (SMA), hlavná genetická príčina detskej úmrtnosti (Crawford a Pardo, 1996), je autozomálne recesívne degeneratívne ochorenie nižších motorických neurónov. Symptómy zahŕňajú svalovú slabosť a atrofiu svalov končatín a trupu. SMA je spôsobená mutáciami alebo stratou SMN1 génu a retencia SMN2 (Lefebvre et al., 1995) oba gény kódujú proteín motorického neurónu prežitia (SMN). Najlepšie charakterizovanou funkciou SMN je jej účasť na zostavovaní malých jadrových ribonukleoproteínov (Fischer a kol., 1997 Liu a kol., 1997 Meister a kol., 2001 Pellizzoni a kol., 2002). Pri absencii funkčného SMN1 génu, závažnosť ochorenia závisí od množstva SMN s plnou dĺžkou (SMN-FL) produkovaného SMN2. Väčšina prepisov z SMN2 génu chýba exón 7 (SMNA7), ale malé množstvo transkriptu je SMN-FL (Gennarelli a kol., 1995 Lorson a kol., 1999 Monani a kol., 1999). Hoci SMN je všadeprítomný proteín, nedostatočné hladiny SMN poškodzujú prevažne nižšie motorické neuróny (Monani et al., 2000). Predpokladalo sa, že SMA je axonopatia „odumierajúcej“ motorických neurónov, čo je podporené zistením, že pri SMA dochádza k značnej akumulácii neurofilamentov v terminálnych axónoch, po ktorej nasleduje veľká strata motorických neurónov (Cifuentes-Diaz et al., 2002 Kariya a kol., 2008). Tiež sa predpokladalo, že redukcia SMN spôsobuje motorickú neurónovú synaptopatiu prejavujúcu sa zastavením postnatálneho vývoja neuromuskulárneho spojenia (NMJ) a funkčným deficitom (Kariya a kol., 2008 Kong a kol., 2009). Elektrofyziologická analýza v prednom holennom svale (TA) relatívne závažného myšacieho modelu SMA (Le a kol., 2005 Butchbach a kol., 2007 Murray a kol., 2008 Kong a kol., 2009) ukazuje, že počet synaptických vezikúl že uvoľňovanie neurotransmitera počas akčného potenciálu je znížené (Kong et al., 2009).

Snažili sme sa zaoberať bunkovým mechanizmom patogenézy SMA ďalším štúdiom elektrofyziologických vlastností neuromuskulárneho synaptického prenosu v myšacom mutante SMNA7 SMA. Študovali sme dva proximálne svaly, čistý rýchly zášklbový sval [Levator auris longus (LAL), umiestnený na dorzálnom povrchu hlavy a inervovaný tvárovým nervom] a prevažne pomalý zášklbový sval [Transversus abdominis (TVA), posturálny sval z prednej brušnej steny inervovaný dolnými medzirebrovými nervami]. Nervovosvalový prenos sme skúmali v dvoch štádiách, v ranom veku [poporodné dni 7–8 (P7–8)], kde je už motorická dysfunkcia evidentná (Le et al., 2005), a v neskoršom veku (P14–15 ), ktorý sa zhoduje s koncom obdobia života myši. Predpokladali sme, že pri SMA existuje skorá synaptická dysfunkcia v zakončeniach motorických nervov. Najprv sme študovali schopnosť mutantných svalových vlákien spúšťať akčné potenciály po stimulácii z presynaptického terminálu. Ďalej sme skúmali funkčnosť viacerých nervových zakončení inervujúcich rovnaké svalové vlákno.

Nakoniec sme skúmali schopnosť presynaptických zakončení uvoľňovať neurotransmitery v troch režimoch: (1) v pokoji (spontánne uvoľnenie), (2) pri jedinom akčnom potenciáli (synchrónne vyvolané uvoľnenie) a (3) počas intraterminálnej akumulácie Ca2+ vyplývajúce z predĺženej elektrickej stimulácie (asynchrónne uvoľňovanie). Pri SMA sme zistili, že okrem závažných evokovaných defektov neurotransmisie došlo k abnormálnemu zvýšeniu množstva asynchrónneho uvoľňovania závislého od Ca2+ počas predĺžených stimulácií, čo naznačuje zmenenú intraterminálnu objemovú koncentráciu Ca2+ v synapsiách SMA.


VÝSLEDKY

Účinnosť, spoľahlivosť a párová pulzná modulácia synaptického prenosu v spojeniach medzi pyramídovými bunkami L2/3 a interneurónmi

Experimenty sa uskutočňovali na pároch alebo trojiciach neurónov (obrA), ktoré tvoria malé lokálne okruhy vo vrstve 2/3 neokortexu potkanov (Reyes a kol. 1998). Presynaptické neuróny boli vždy pyramídové bunky, identifikované tvarom soma a vzorom frekvenčného prispôsobenia AP vyvíjajúcim sa po injekcii depolarizujúceho somatického prúdu. Cieľové neuróny boli nepyramídové, bituftované neuróny a/alebo multipolárne neuróny. Aj oni boli identifikovaní svojím tvarom soma a charakteristickým vzorom AP, ktorý sa vyvinul po súčasnej injekcii (Reyes a kol. 1998). Špičková amplitúda unitárneho EPSP, vyvolaná jedným presynaptickým AP (prvý AP vo vlaku Obr. 1B) bol braný ako index účinnosti, percento porúch ako miera spoľahlivosti konkrétneho spojenia. Rovnako ako v predchádzajúcich experimentoch (Reyes a kol. 1998 ) vyrobené pri 35 °C, naše experimenty uskutočnené pri 22-24 °C, zistili veľké rozdiely medzi týmito dvoma typmi spojenia (obr. 1B). Unitárne EPSP zaznamenané v bituftovaných bunkách boli menšie a zvýšené po opakovanej stimulácii (obr. 1B, vľavo), zatiaľ čo unitárne EPSP v multipolárnych bunkách boli väčšie a ich amplitúda znížená (obr. 1B, správny).

Simultánne, trojité celobunkové zaznamenávanie napätia z pyramídových neurónov a dvoch tried interneurónov

A, schematický nákres konfigurácie záznamu. Presynaptický L2/3 pyramídový neurón (P) bol stimulovaný krátkymi pulzmi injekcie intracelulárneho prúdu. Simultánne záznamy celobunkového napätia boli urobené z unitárnych EPSP z bituftovaného (B) a multipolárneho (M) neurónu. B, simultánne záznamy presynaptických AP vyvolaných v pyramídovom neuróne (hore) a unitárnych EPSP v bituftovanom a multipolárnom neuróne. Je znázornených päť po sebe idúcich stôp zaznamenaných v bituftovanom (ľavom) a multipolárnom (pravom) neuróne. Riadky nad záznamami označujú čas presynaptických AP vo vlaku. Najspodnejšie stopy predstavujú priemery zo 100 pohybov. Pomer vrcholových amplitúd druhého a prvého stredného EPSP (EPSP2/EPSP1) bol 1,43 v bituftovanom neuróne a 0,67 v multipolárnom neuróne.

Účinnosť.

Priemerná amplitúda unitárnych EPSP bola podstatne menšia v bituftovaných bunkách v porovnaní s amplitúdou zaznamenanou v multipolárnych bunkách. Obrázok 2A ukazuje, že amplitúdová distribúcia v bituftovaných bunkách bola úzka, pričom priemer bol 0,92 ± 0,49 mV (n = 66). Naopak, v multipolárnych bunkách bola amplitúda EPSP väčšia a ich distribúcia širšia, s priemernou amplitúdou 3,3 ± 1,9 mV (n = 41). Distribúcie amplitúd zaznamenané v dvoch triedach cieľových buniek vykazujú malé prekrytie v oblasti 0,5-2 mV (obr. 2A).

Účinnosť, spoľahlivosť a pomer párových impulzov synapsií vytvorených pyramídovými neurónmi s bituftovanými alebo multipolárnymi bunkami

A, účinnosť synaptického prenosu. Distribúcia priemerných unitárnych amplitúd EPSP zaznamenaných v bituftovaných (vľavo, n= 66) a multipolárne (vpravo, n= 41) neuróny po stimulácii presynaptickej pyramídovej bunky. Bspoľahlivosť spojení meraná percentom porúch. Rozdelenie porúch pre nahrávky z bituftovaných (vľavo, n= 72) a multipolárne (vpravo, n= 56) neuróny. C, PPR merané pomerom EPSP2/EPSP1 zaznamenaným v bituftovaní (vľavo, n= 76) a multipolárne (vpravo, n= 56) neuróny.

Spoľahlivosť.

Ďalším jasným rozdielom medzi týmito dvoma typmi spojenia je ich spoľahlivosť meraná percentom zlyhaní presynaptického AP na vyvolanie EPSP. Obrázok 2B ukazuje rozdelenie percenta zlyhaní v pyramídových-bitufovaných a pyramídových-multipolárnych spojeniach. Zatiaľ čo presynaptický AP často nedokázal vyvolať EPSP v bituftovaných neurónoch, čo naznačuje nespoľahlivé synaptické spojenie, AP zriedkavo zlyhali pri vyvolaní EPSP v multipolárnych neurónoch. Priemerná miera zlyhania bola 42 ± 18 %(n = 72) pre pyramídové spojenie a 1,63 ± 3,5 %(n = 56) pre pyramídovo-multipolárne spojenie (obr. 2B). Dve distribúcie opäť vykazovali len veľmi malé prekrytie.

Pomer párových impulzov.

Ďalšia vlastnosť synapsií, o ktorej sa predpokladá, že je určená väčšinou presynaptickými mechanizmami, frekvenčne závislá zmena účinnosti, tiež ukázala jasný rozdiel medzi týmito dvoma typmi spojenia. Obrázok 2C ilustruje distribúciu pomerov párových impulzov (PPR) EPSP v spojeniach medzi pyramídovými bunkami a bituftovanými alebo multipolárnymi bunkami. Amplitúdy EPSP boli normalizované na amplitúdu prvého EPSP (EPSP1) vo vlaku. Zatiaľ čo v pyramídových spojeniach sa veľkosť druhého (EPSP2) a tretieho EPSP (EPSP3) vyvolaných sledom presynaptických AP zväčšila, v pyramídovom spojení s multipolárnym sa zmenšila. Priemerné PPR boli 195 ± 59 %(n = 76) v bituftových článkoch a 53 ± 12 %(n = 56) v multipolárnych bunkách.

Rozdiely v účinnosti pyramídových bituftovaných a pyramídových multipolárnych spojení môžu odrážať presynaptické aj postsynaptické faktory, zatiaľ čo rozdiely v spoľahlivosti a modulácii párových impulzov sú pravdepodobne presynaptického pôvodu. Keďže príliv Ca2+ do boutonov vyvolával uvoľňovanie, skúmali sme účinky manipulácie s dynamikou Ca2+ v dvoch triedach nervových zakončení.

Podtypy vápnikových kanálov

Rozdiely v podtypoch Ca2+ kanálov, ktoré sú prítomné v dvoch triedach nervových zakončení, by mohli zodpovedať za rôznu účinnosť spojenia medzi prítokom Ca2+ a uvoľňovaním vysielača (Wu a kol. 1998, 1999). Stanovili sme príspevok rôznych podtypov Ca2+ kanálov k uvoľňovaniu aplikáciou blokátorov Ca2+ kanálov, ktoré sú podtypovo špecifické.

V kontrolných podmienkach, keď sa do pyramídových buniek nenaplnil žiadny exogénny pufor, boli EPSP v oboch typoch cieľových buniek úplne blokované pridaním Cd2+ (100 μm) do roztoku kúpeľa. Aplikácia blokátora kalciových kanálov typu P/Q ω-agatoxín IVA (Aga, 100 n m ) tiež znížila amplitúdu EPSP, ale len na približne 40 % kontrolnej hodnoty (obr. 3A). Tento toxín blokuje kanály typu P s a KD asi 1 nm a kanály typu Q s a KD 100 nm.

Účinok toxínov blokujúcich vápnikový kanál na synaptickú účinnosť

A, časový priebeh účinku blokátora kalciového kanála co-agatoxínu IVA na jednotkovú vrcholovú amplitúdu EPSP meranú v multipolárnom neuróne počas aplikácie extracelulárneho toxínu, ako ukazuje stĺpec. Každý bod predstavuje priemer 10 odpovedí. Búčinky toxínov špecifických pre vápnikové kanály Cd2+, Q/P, N a P/Q/N na unitárne EPSP v bituftovaných (□) a multipolárnych ( ) neurónoch. Ordináta predstavuje (v %) pomer strednej amplitúdy EPSP v rovnovážnom stave počas a pred aplikáciou toxínu (prerušované čiary v A).

Aplikácia ω-konotoxínu MVIIC (MVIIC), blokátora kanálov typu P/Q a N (Wu a kol. 1999), tiež veľmi účinne znížila amplitúdu EPSP. Pri 1 μm MVIIC sa unitárne amplitúdy EPSP znížili na < 3 % kontrolnej hodnoty v uľahčujúcich aj stláčajúcich svorkách (obr. 3B). Tento toxín blokuje kanály typu P s a KD asi 500 nm a kanály typu Q s a KD približne 5 n m (Zhang a kol. 1993), čo naznačuje, že kanály typu Q významne prispievajú k uvoľňovaniu. EPSP, ktorý zostal po pridaní nasýtených koncentrácií toxínu, bol blokovaný 50 μm Cd2+ v uľahčujúcich aj depresívnych termináloch. Toto zvyškové uvoľňovanie je pravdepodobne spôsobené prílevom Ca2+ cez vápnikové kanály typu R (Wu a kol. 1998), pretože bol blokovaný Ni2+ (100 μm, nezobrazené).

Aplikácia ω-konotoxínu GVIA (Ctx), ktorý je špecifický pre kanály typu N, blokovala uvoľňovanie na približne 20 % kontrolnej hodnoty v oboch typoch terminálov, čo naznačuje, že kanály typu N silne prispievajú k evokovanému uvoľňovaniu z terminálov pyramidálnych buniek (obr. 3B). Väčšinou teda vápnikové kanály typu P/N/Q sprostredkovávajú uvoľňovanie v oboch triedach zakončenia pyramídových buniek. Všimnite si, že uľahčujúce terminály boli v priemere mierne, ale nie výrazne (P > 0,1, študentské t test) citlivejšie na akýkoľvek toxín.

Závislosť účinnosti od koncentrácie vápnika

Ďalej sme merali závislosť amplitúdy EPSP od [Ca2+]o identifikovať možné rozdiely vo vzťahu medzi facilitačnými a depresívnymi terminálmi. Takéto rozdiely môžu odrážať rôzne stupne saturácie Ca2+ senzorov alebo iné limitujúce faktory. Obrázok 4 ukazuje, že uvoľňovanie bolo veľmi rozdielne závislé od [Ca2+]o v rozsahu medzi 1 a 4 m m. Pri uľahčení terminálov vzťah medzi amplitúdou EPSP a [Ca2+]o bola veľmi strmá a vykazovala iba miernu saturáciu, zatiaľ čo v depresívnych termináloch bola amplitúda EPSP blízka saturácii pri normálnej [Ca2+]o 2 m m . Dátové body na uľahčenie a potlačenie synapsií by mohli byť uspokojivo vybavené Hillovou rovnicou s exponentom 4 a polovične účinných koncentrácií (a1/2) 2,79 a 1,09 m m, v tomto poradí. Menšie exponenty alebo modelové rovnice pre nezávislú väzbu na niekoľko miest nemohli súčasne zodpovedať (s rovnakým exponentom) strmému vzťahu krivky pre facilitačné terminály a saturačnému charakteru krivky pre depresívne terminály, v súlade s Reidom a kol. (1998). Nižšie budeme diskutovať o rozdieloch medzi týmito dvoma typmi terminálov, pokiaľ ide o rozdiely v saturácii snímačov Ca 2+, aj keď je potrebné mať na pamäti, že za obmedzenie uvoľňovania môžu byť zodpovedné iné mechanizmy ako saturácia snímačov.

Účinok [Ca 2+ ]o o synaptickej účinnosti

Relatívna zmena jednotkovej amplitúdy EPSP po zmenách [Ca2+]o v spojeniach pyramídových buniek s bituftovanými bunkami (•) a multipolárnymi bunkami (•) vynesenými na dvojitej logaritmickej stupnici. V každom experimente [Ca 2+ ]o bola buď zvýšená alebo znížená oproti kontrole (2 m m ). [Mg 2+]o sa udržiavala konštantná na 1 m m. EPSP merané pri rôznych [Ca 2+ ]o boli normalizované na hodnoty získané pri 2 m m [Ca2+]o v rovnakom experimente. Údaje zodpovedajú Hillovým izotermám metódou najmenších štvorcov nH= 4, podľa:s rmax a K1/2 ako voľné parametre. K1/2 hodnoty boli 2,79 a 1,09 m m pre údaje o spojeniach pyramídových buniek s bituftovanými bunkami (vykazujúce facilitáciu) a multipolárnymi bunkami (vykazujúcimi depresiu).

Latencia EPSC a asynchrónne uvoľňovanie

Nižší stupeň nasýtenia senzora Ca2+ v termináloch na bituftovaných bunkách možno vysvetliť buď nižšou afinitou senzora alebo dlhšou difúznou vzdialenosťou medzi miestami uvoľňovania a kanálmi Ca2+. Ak je pravda prvá, dalo by sa očakávať, že uvoľnenie z facilitujúcej synapsie bude synchronizovanejšie ako uvoľnenie z depresívnej synapsie. Zdôvodnenie tejto predpovede je, že [Ca 2+ ]RSkoncentrácia Ca2+ v mieste uvoľňovania klesne pod vysokú prahovú úroveň v kratšom čase. Preto sme merali latenciu unitárnych EPSC vyvolaných stimuláciou pyramídových buniek v dvoch typoch interneurónu. Latencia EPSC zaznamenaná v bituftovaných a multipolárnych bunkách bola 2,97 ± 0,42 (n = 4) a 1,17 ± 0,19 ms (n = 4), resp. V tejto analýze sme považovali prvé EPSC vyvolané v časovom okne 5 ms po vrchole AP za fázovú odpoveď. Distribúcia latencií bola tiež oveľa širšia pre odozvy merané z bituftovaných buniek ako pre multipolárne bunky (obr. 5A), čo je v súlade s dlhšou difúznou vzdialenosťou v boutónoch kontaktujúcich bituftované bunky.Okrem toho sme pozorovali výrazné asynchrónne alebo oneskorené uvoľňovanie z facilitačných aj depresívnych koncoviek (obr. 5B, udalosti merané v intervale od 5 do 20 ms po AP) trvajúce desiatky milisekúnd po AP. V bituftovaných interneurónoch je možné evokované oneskorené EPSC skúmať s minimálnou interferenciou spontánnych EPSC, ktoré sa vyskytujú pri veľmi nízkej frekvencii. V multipolárnych bunkách, ktoré majú relatívne vysokú mieru spontánnej aktivity, sme porovnali počet spontánnych EPSC pred AP s počtom asynchrónnych udalostí po AP, počítaných v rovnakom časovom okne (15 ms). Vo všetkých prípadoch boli asynchrónne udalosti častejšie ako spontánne EPSC. Napríklad v experimente znázornenom na obrBAnalýza 100 pohybov odhalila 16 spontánnych EPSC, ku ktorým došlo pred stimuláciou presynaptickej pyramidálnej bunky, a 183 asynchrónnych reakcií po iniciácii AP. Tento pomer medzi rýchlosťami fázového a asynchrónneho uvoľňovania je oveľa menší ako pomer v mnohých iných typoch synapsií (Borst & Sakmann, 1996 Ravin a kol. 1999). To naznačuje, že zvýšenie [Ca 2+ ]RS hnacie fázové uvoľňovanie nemusí byť také veľké ako v iných synapsiách.

Latencia EPSC a asynchrónne uvoľňovanie z terminálov pyramídových buniek kontaktujúcich bituftované alebo multipolárne bunky

Areprezentatívne distribúcie latencií fázových EPSC merané počas prvých 5 ms po iniciácii AP v bituftovanej bunke (vľavo) a multipolárnej bunke (vpravo). Nepretržité čiary predstavujú Gaussove zhody. B, časové rozloženie vyvolaného (fázového a oneskoreného) uvoľnenia z uľahčujúceho (horný panel) a stláčacieho (dolný panel) terminálu merané v rovnakých pároch buniek ako v A. Každý stĺpec predstavuje počet EPSC zaznamenaných v danom časovom bode po iniciácii AP.

Exogénne ca 2+ pufre ovplyvňujú účinnosť

Ďalším spôsobom, ako interferovať s presynaptickou dynamikou Ca2+, je naplniť terminály Ca2+ tlmivými roztokmi s rôznymi rýchlosťami viazania Ca2+, ako sú EGTA a BAPTA, ktoré súťažia s endogénnym Ca2+ tlmivým roztokom.

Rozdielne účinky EGTA a BAPTA na uvoľňovanie.

Najprv sme určili účinok zaťaženia pyramidálnych neurónov EGTA alebo BAPTA na synaptickú účinnosť, meranú priemernou amplitúdou prvého unitárneho EPSP vyvolaného počas 10 Hz sledu troch presynaptických AP. Jednotlivé vlaky AP boli oddelené dlhými intervalmi (5-7 s). Protokol použitý na meranie koncentračnej závislosti zníženia amplitúdy EPSP počas zaťaženia pyramídového neurónu pufrom Ca2+ je znázornený na obr. 6. Najprv sa zozbieralo 100 odpovedí s vnútrobunkovým kontrolným roztokom bez pufra, aby sa stanovila základná línia. Následne sa presynaptická pipeta odtiahla a do tej istej pyramídovej bunky sa znova vstúpilo pomocou novej pipety naplnenej intracelulárnym roztokom obsahujúcim pufor (Ohana & Sakmann, 1998). Po 7 až 10 minútach, ktoré sú potrebné na naplnenie pufra do terminálov, sa zaznamenalo ďalších 100 unitárnych EPSP. Relatívna redukcia veľkosti EPSP1 vo vlaku bola odhadnutá ako pomer stredných amplitúd (EPSP1B/EPSP1C v %) merané po nanesení pufra (B) a v kontrolných podmienkach (C).

Účinky zaťaženia BAPTA na uvoľnenie z terminálov pyramídových buniek kontaktujúcich bituftované alebo multipolárne bunky

A, účinok presynaptického zaťaženia BAPTA pyramídovej bunky na unitárne EPSP zaznamenané z bituftovanej bunky. • kontrolujte EPSP •, EPSP po zaťažení pyramídového neurónu 0,1 m m BAPTA. Šípka označuje čas, kedy bola vytvorená nová konfigurácia záznamu celej bunky s pipetou obsahujúcou pufer (P2). Záznamy pod grafom predstavujú spriemerované presynaptické AP (predtým Vm) a jednotní EPSP (post Vm). B, účinok presynaptického BAPTA (0,5 m m ) zaťaženia pyramídového neurónu na unitárne EPSP zaznamenané z multipolárneho neurónu.

Obrázok 6 A ilustruje účinok 0,1 m m BAPTA pri vložení do uľahčujúcich koncoviek pyramídovej bunky. Priemerná amplitúda EPSP zaznamenaná v bitufaktovanom neuróne po naložení BAPTA bola približne 50 % kontroly (spodné stopy). Na rozdiel od toho, EPSP zaznamenané v multipolárnych neurónoch, ktoré boli inervované depresívnymi terminálmi, boli sotva znížené touto koncentráciou BAPTA (nezobrazené). Aby sa dosiahlo 50 % zníženie amplitúdy EPSP v multipolárnych článkoch, musela sa do stláčacích koncoviek naniesť oveľa vyššia koncentrácia BAPTA (0,5 m m ) (obr. 6).B).

Závislosť od koncentrácie pufra.

Obrázok 7 ukazuje na koncentrácii pufra závislé zníženie strednej amplitúdy EPSP normalizované na kontrolnú amplitúdu EPSP (pred zavedením pufra) v bitufted (obr. 7A) a multipolárne neuróny (obr. 7B), keď boli pyramídové bunky naplnené buď BAPTA alebo EGTA. Uvoľňovanie z terminálov na bituftovaných neurónoch bolo výrazne citlivejšie na oba pufre. Poloúčinné koncentrácie (ktoré znížili EPSP v bituftovaných bunkách na polovicu kontrolnej hodnoty) boli 0,1 μm pre BAPTA a 1 μm pre EGTA. Poloúčinné koncentrácie pre terminály na multipolárnych bunkách boli oveľa vyššie, boli 0, 5 m m pre BAPTA a 7 m m pre EGTA.

Účinok vnútorného BAPTA alebo EGTA závislý od koncentrácie na uvoľňovanie z terminálov pyramídových buniek kontaktujúcich bituftované alebo multipolárne bunky

A, graf presynaptického účinku BAPTA a EGTA závislého od koncentrácie na priemernú amplitúdu unitárneho EPSP vyvolaného AP stimuláciou terminálov kontaktujúcich bituftované bunky. Priemerná amplitúda EPSP bola normalizovaná na kontrolné hodnoty stanovené v rovnakom spojení pred naplnením pufrom. Poloúčinné koncentrácie (keď sa priemerná amplitúda EPSP znížila na 50 % kontrolných prerušovaných čiar) boli 0,1 m m BAPTA a 1 m m EGTA. B, graf presynaptického účinku BAPTA a EGTA závislého od koncentrácie na priemernú amplitúdu EPSP vyvolanú AP stimuláciou terminálov kontaktujúcich multipolárne bunky. Poloúčinné koncentrácie (prerušované čiary) boli 0,5 mM BAPTA a 7 mM EGTA. Čiary spájajúce dátové body boli vypočítané dvojitým exponenciálnym preložením.

V synapsiách medzi pyramídovými a bituftovanými neurónmi bola koncentračná závislosť redukcie EPSP zaťažením BAPTA najstrmšia v rozsahu medzi 0,02 a 0,7 m m . Pri 1 m m BAPTA alebo vyššej bola amplitúda EPSP najviac 5-10 % kontrolnej hodnoty. Zvyšná úroveň vyvolaného uvoľnenia postupne klesala s ďalším zvyšovaním koncentrácie BAPTA na 3 m m (obr. 7A). V termináloch na multipolárnych neurónoch bola porovnateľná zvyšková hladina vyvolaného uvoľňovania (< 10 % kontroly) pozorovaná len pri vyšších (≥ 3 m m ) koncentráciách BAPTA.

Výsledok, že BAPTA pri relatívne nízkych koncentráciách znižuje uvoľňovanie vysielača v oboch typoch terminálov, môže naznačovať, že ich koncentrácia endogénneho mobilného pufra je nízka. Priemerná difúzna vzdialenosť pre Ca2+ medzi doménou Ca2+ a senzorom Ca2+ v mieste uvoľňovania vezikúl (RS) je dostatočne dlhá na to, aby exogénne pufre mohli zachytiť Ca2+. Nervové terminály tvoriace synapsie na bituftovaných neurónoch boli citlivejšie na oba exogénne pufre. Vyššia účinnosť buď tlmivého roztoku naplneného do terminálov kontaktujúcich bituftované bunky by mohla naznačovať, že v týchto termináloch je difúzna vzdialenosť medzi Ca2+ kanálmi a vezikulárnym Ca2+ senzorom dlhšia, alebo alternatívne, že afinita senzora pre Ca2+ je nižšie (podrobnú diskusiu nájdete nižšie).

Exogénne ca 2+ pufre ovplyvňujú krátkodobú modifikáciu účinnosti

Synaptická účinnosť je modulovaná v časovom rozsahu desiatok milisekúnd, keď sa postupne vyskytuje niekoľko presynaptických AP. Účinnosť sa môže zvýšiť alebo znížiť. Niektoré z týchto foriem krátkodobej modulácie uvoľňovania sa pripisujú presynaptickým mechanizmom závislým od Ca2+ (Katz a Miledi, 1968 Zucker, 1996 Debanne a kol. 1996 ).

Na rozdiel od účinkov tlmivých roztokov na fázové uvoľňovanie, kde rozdiely v kinetike viazania Ca2+ BAPTA a EGTA spôsobili veľké rozdiely, možno očakávať podobné účinky dvoch tlmivých roztokov na uľahčenie, ku ktorému dochádza v relatívne dlhom časovom meradle. Na druhej strane, synaptická depresia, ktorá je iba nepriamo závislá od intracelulárneho Ca2+ (Elmqvist & Quastel, 1965), môže odrážať účinky pufra na fázové uvoľňovanie. Tieto hypotézy sme testovali kvantifikáciou stupňa facilitácie a depresie, keď sa EGTA alebo BAPTA vložili do dvoch tried terminálov.

Uľahčujúce terminály.

Účinok EGTA (0,5 m m ) vloženého do pyramídového neurónu na uľahčenie EPSP v bituftovaných bunkách je znázornený na obr.A. V tomto experimente bol stupeň facilitácie, meraný ako pomer EPSP2/EPSP1, 2,15 v kontrolných podmienkach. V prítomnosti EGTA (0,5 m m ) bola EPSP1 v priemere znížená na 60 % kontrolnej hodnoty, t.j. EGTA spôsobila relatívne mierne zníženie účinnosti, zatiaľ čo facilitácia bola úplne zablokovaná (EPSP2/EPSP1 = 1,02). Účinok EGTA na facilitáciu bol závislý od koncentrácie. Úplný blok bol pozorovaný pri koncentráciách EGTA 0,2 m m alebo vyšších (obr. 8B), čo naznačuje, že akumulácia zvyškového Ca2+ prispieva k uľahčeniu.

Vplyv vnútorného EGTA na facilitáciu a depresiu závislý od koncentrácie

A, unitárne EPSP boli zaznamenané v bituftovaných bunkách pred (kontrola) a po naplnení presynaptických pyramídových buniek EGTA počas opakovanej stimulácie pyramídových buniek vyvolávajúcich série 3 AP (10 Hz). Riadky nad záznamami označujú čas výskytu presynaptických AP vo vlaku. Horná stopa, presynaptický neurón naplnený kontrolným roztokom. Dolná stopa, rovnaký neurón po zaťažení EGTA (0,5 m m ). B, koncentračne závislý účinok vnútorného EGTA v presynaptickej pyramídovej bunke na uľahčenie EPSP zaznamenaný z bituftovaných buniek. Amplitúda druhého EPSP vzhľadom k amplitúde prvého (EPSP2/EPSP1) je vynesená do grafu pre rôzne koncentrácie EGTA (⋄). Pomer pre kontrolný roztok pipety (bez Ca 2+ pufra) je tiež zobrazený (◆). C, koncentračne závislý účinok vnútorného EGTA v presynaptickej pyramidálnej bunke na depresiu EPSP zaznamenanú z multipolárnych buniek. Pomer EPSP2/EPSP1 je uvedený pre rôzne koncentrácie EGTA (•). Uvedený je aj pomer pre kontrolný roztok pipety (bez Ca 2+ pufra) (•).

Naplnenie pyramídovej bunky BAPTA (0,5 m m ) silne znížilo amplitúdu prvého EPSP na 25 % kontroly. Na rozdiel od zaťaženia EGTA však uľahčenie nebolo takmer ovplyvnené, pretože pomer EPSP2/EPSP1 bol 2,3 v kontrole proti 2.2 po zaťažení (obr. 9A). Účinok BAPTA bol závislý od koncentrácie a BAPTA blokovala facilitáciu len pri koncentráciách 1 m m alebo väčších (obr. 9B). Na rozdiel od očakávaní, že dva tlmiče by mali byť ekvivalentné pri znižovaní uľahčenia, rýchlejšie pôsobiaci tlmivý roztok BAPTA bol oveľa menej účinný.

Účinok vnútorného BAPTA závislý od koncentrácie na facilitáciu a depresiu

A, unitárne EPSP zaznamenané z bituftovaných buniek pred (kontrola) a po naplnení presynaptických pyramídových buniek BAPTA. Čiary nad záznamami označujú čas výskytu presynaptických AP. Horná stopa, kontrola EPSP pred zavedením BAPTA. Dolná stopa, EPSP po zaťažení 0,5 m BAPTA. B, koncentračne závislý účinok presynaptického BAPTA na uľahčenie EPSP zaznamenaný v bituftovaných bunkách. Pomer EPSP2/EPSP1 je vynesený do grafu ako funkcia koncentrácie BAPTA v zázname pipety z presynaptickej pyramidálnej bunky (◆). Pomer pre kontrolný roztok pipety (bez Ca 2+ pufra) je tiež zobrazený (⋄). C, koncentračne závislé účinky presynaptického BAPTA na depresiu EPSP zaznamenanú v multipolárnych bunkách (•). Uvedený je aj pomer pre kontrolný roztok pipety (bez Ca 2+ pufra) (•).

Depresívne svorky.

Depresia sa v prítomnosti EGTA výrazne neznížila (obr. 8C), a to aj pri vysokých koncentráciách (10 m m ). Keď sa BAPTA vložil do pyramídovej bunky, depresia EPSP v multipolárnych bunkách sa tiež neznížila pri koncentráciách, ktoré silne znižovali účinnosť (obr. 9C). S vyššími koncentráciami BAPTA (> 0,5 m m ) sa depresia zmenšila súčasne so znížením účinnosti. Nad 2 m m, keď bola účinnosť znížená na < 10 % kontroly, bolo v niektorých experimentoch pozorované malé uľahčenie. To jasne naznačuje, že v depresívnych termináloch bolo hlavným účinkom Ca2+ pufrov na depresiu zníženie frakcie vezikúl, ktoré sa uvoľňujú prvým AP, a následne zvýšenie zásoby zostávajúcich vezikúl „pripravených na uvoľnenie“.

Zmesi BAPTA a EGTA.

Blokujúci účinok EGTA na uľahčenie EPSP zaznamenaných z bituftovaných buniek je v súlade s názorom, že základom tohto procesu je akumulácia voľného Ca2+ (Hochner a kol. 1991 Kamiya & Zucker, 1994). Na druhej strane, BAPTA viaže Ca2+ rovnako efektívne ako EGTA, ale pri nízkych koncentráciách BAPTA (0,02-0,7 m m ) bolo uľahčenie stále prítomné alebo dokonca zosilnené. Kľúčom k pochopeniu rôznych účinkov dvoch tlmivých roztokov môže byť zistenie, že BAPTA v tomto koncentračnom rozsahu silne redukuje EPSP1, ale EGTA nie. Pravdepodobne BAPTA účinne chelátoval Ca2+ v blízkosti senzora Ca2+ a časť BAPTA zostala naviazaná na Ca2+ po objavení sa prvého AP (ako uvádza Winslow a kol. 1994). Preto by pri ďalšom AP bolo k dispozícii menej voľného BAPTA a koncentrácia voľného Ca2+ dosahujúceho senzor Ca2+ by stúpla na vyššie hodnoty. V dôsledku toho by sa EPSP v reakcii na druhý a tretí AP zvýšil. Niekto by sa mohol opýtať, či uľahčenie v nerušených termináloch môže byť spôsobené nasýtením endogénneho pufra.

Na testovanie tejto hypotézy sme porovnali uľahčenie v termináloch zaťažených 0,2 m m BAPTA samotným s tým v termináloch zaťažených zmesou 0,2 m m BAPTA a 0,2 m m EGTA. Facilitácia bola v oboch prípadoch podobná (229 ± 68 %(n = 5) a 228 ± 4 %(n = 3), čo naznačuje, že v prítomnosti BAPTA pridanie EGTA neblokovalo uľahčenie (obr. 10).A). Keď boli terminály zaťažené 0,2 m m EGTA a nižšími koncentráciami BAPTA (0,05 a 0,02 m m ), uľahčenie bolo znížené EGTA len vtedy, keď BAPTA bol 0,02 m m . V tomto prípade bola facilitácia asi polovica kontrolnej hodnoty (obr. 10A). Preto so zmesou rýchlo a pomaly pôsobiaceho tlmivého roztoku ten rýchlejší určoval, či došlo k uľahčeniu alebo nie, ak jeho koncentrácia bola dostatočne vysoká na to, aby výrazne znížila prvý EPSP v rade AP. Možno teda dospieť k záveru, že mechanizmus endogénnej facilitácie citlivej na EGTA je odlišný od mechanizmu vyvolaného čiastočnou saturáciou rýchlo pôsobiaceho mobilného pufra, ako je BAPTA. Hypotéza „čiastočnej saturácie Ca 2+ pufra“ ako mechanizmus uľahčenia by sa však mohla vzťahovať aj na natívne terminály, ak obsahovali rýchlo saturovateľný endogénny pufor. Zdá sa však, že uľahčujúce terminály pyramídových buniek, ktoré sa tu študujú, majú nízku koncentráciu endogénneho mobilného pufra.

Endogénna facilitácia a pseudofacilitácia v termináloch na bituftovaných bunkách sú poháňané rôznymi mechanizmami

APomery EPSP2/EPSP1 merané v bituftovaných bunkách po naplnení presynaptických pyramídových buniek samotným BAPTA, zmesou BAPTA a EGTA a samotným EGTA. Všimnite si, že pri kombinácii BAPTA a EGTA nemá EGTA žiadny alebo len malý vplyv na uľahčenie vyvolané mechanizmom „čiastočnej saturácie pufra“. B, vplyv zmien [Ca 2+ ]o na facilitačný pomer, keď sa BAPTA (0,2 m m ) vložil do presynaptickej pyramídovej bunky. Zníženie [Ca 2+]o ruší facilitáciu, zatiaľ čo zvýšenie [Ca 2+ ]o zvyšuje facilitáciu. C, vplyv zmien [Ca 2+ ]o na pomer uľahčenia EPSP zaznamenaný v bituftovaných bunkách. Presynaptické zakončenia boli dialyzované kontrolným roztokom bez pridaného vápenatého pufra. Nárast [Ca 2+]o znížená facilitácia, zníženie [Ca2+]o zvýšená facilitácia.

Účinky [Ca 2+ ]o na termináloch naplnených exogénnymi Ca2+ puframi.

Hypotéza čiastočnej saturácie pufra Ca2+ tiež predpovedá, že zníženie saturácie pufra znížením [Ca2+]o by malo za následok menšie uľahčenie. Pri vyššom [Ca 2+]o frakcia tlmivého roztoku naviazaná na vápnik sa zvýši po prvom AP, čo vedie k zvýšenému uľahčeniu. Proti tomu však môže pôsobiť depresia, ktorá sa môže vyvinúť, keď sa frakcia uvoľnených vezikúl zvýši zvýšeným prílevom Ca2+. Aby sme otestovali tieto nápady, porovnali sme uľahčenie kontroly a terminálov naplnených vyrovnávacou pamäťou pri rôznych [Ca2+]o.

Uľahčenie v termináloch zaťažených 0,2 m m BAPTA bolo vyššie ako v kontrole (pri 2 m m [Ca 2+ ]o) a zníženie [Ca 2+ ]o na 1,5 m m znížená facilitácia, zatiaľ čo zvýšenie [Ca 2+ ]o do 3 m m zvýšená facilitácia (obr. 10B). Tento výsledok sa dá ľahko vysvetliť konceptom čiastočného nasýtenia pufra. Predpovedá, že saturácia BAPTA spôsobená prítokom Ca2+ počas prvého AP je vyššia pri vysokej [Ca2+]o. Keď sa do terminálov nevložili žiadne exogénne tlmivé roztoky, uľahčenie sa postupne znižovalo ako [Ca2+]o bola zvýšená (3 a 4 m m ). Zníženie [Ca 2+]o na 1,5 a 1 m m viedlo k zvýšenému uľahčeniu v porovnaní s kontrolou (2 m m [Ca2+]o10. ObrC). Tento výsledok je v rozpore s hypotézou čiastočného nasýtenia pufra Ca2+ a bude diskutovaný nižšie.

Ukázať špecifickosť účinkov zmeny [Ca 2+ ]o na uľahčujúcich termináloch zaťažených BAPTA sme urobili podobné merania so stlačenými terminálmi na multipolárnych článkoch. Zníženie uvoľňovania zaťažením terminálu 0,2 m BAPTA bolo nasledované poklesom [Ca2+]o od 2 do 1,5 m m. To viedlo k zníženiu amplitúdy prvého EPSP a menšej depresii (nezobrazené). Tieto výsledky sú v súlade s názorom, že deplécia vezikúl zo zásoby pripravenej na uvoľnenie alebo deplécia miest uvoľňovania je hlavným mechanizmom, ktorý je základom depresie (Zucker, 1994).


Úvod

Zmeny koncentrácie Ca2+ v cytosóle ([Ca2+]c) poskytujú signály na kontrolu kľúčových udalostí, ako je svalová kontrakcia, uvoľňovanie neurotransmiterov, zmeny v transkripcii génov a bunková smrť (Berridge a kol., 2003 Bootman a kol., 2001 Orrenius a kol., 2003). Ca 2+ signály, fyziologické a patologické, sú modulované aktivitou mitochondrií (Berridge, 2002 Hajnoczky et al., 2000 Jacobson a Duchen, 2004).Tieto organely akumulujú Ca2+ prostredníctvom elektrogénneho uniportéra, keď [Ca2+]c presahuje ~100 nM pri použití potenciálu ΔΨm, generovaný cez vnútornú mitochondriálnu membránu aktivitou elektrónového transportného reťazca (Becker a kol., 1980 Nicholls a Crompton, 1980). Mitochondrie uvoľňujú Ca2+ pomalšie späť do cytosólu cez Na+- alebo H+-antiporter (Crompton et al., 1978 Rottenberg a Marbach, 1990). Týmto spôsobom mitochondrie pôsobia ako lokalizované [Ca2+]c pufrovacie jednotky a môžu modulovať Ca2+ spätnoväzbové inhibičné alebo aktivačné mechanizmy (Collins a kol., 2000 Hajnoczky a kol., 1999 Mackenzie a kol., 2004). Napríklad mitochondriálna akumulácia Ca2+ môže určiť, či je alebo nie je lokalizovaný Signalizačná udalosť Ca2+, ako je „puf“ (Parker a Ivorra, 1990) alebo „iskra“ (Cheng et al., 1993), pokračuje do globálnej [Ca2+]c oscilácia alebo vlna.

Mitochondrie, ktoré sú miestom aeróbnej produkcie ATP, tiež ovplyvňujú bunkovú signalizáciu moduláciou pomeru cytosolického ATP:ADP (Nicholls a Ferguson, 2002). Samotná produkcia ATP je stimulovaná vychytávaním Ca2+. Aktivita enzýmov pyruvátdehydrogenázy, oxoglutarátdehydrogenázy a NAD+-izocitrátdehydrogenázy (McCormack a Denton, 1980) v mitochondriálnom cykle enzýmov kyseliny citrónovej (Krebs), ako aj aktivity F1F0-ATP syntázy sú stimulované Ca2+ (Territo et al., 2000). Naopak, pokles ΔΨm, ktorý poskytuje hnaciu silu pre ATP syntázu, inhibuje produkciu ATP (Leyssens et al., 1996). Príjem kladne nabitých iónov Ca2+ by mal depolarizovať ΔΨm do určitej miery a tak môže obmedziť produkciu ATP. Signály Ca2+ preto môžu obmedziť produkciu bunkovej energie.

V niektorých bunkách sa mitochondrie nachádzajú blízko miest iniciácie [Ca2+]c signálov, ako sú napäťovo riadené Ca2+ kanály na plazmaleme (Barstow et al., 2004) alebo inozitol 1,4,5-trifosfát [Ins(1,4,5)P3] receptory [Ins(1,4,5)P3Rs] na endoplazmatickom/sarkoplazmatickom retikule (ER/SR) (Csordas a Hajnoczky, 2003 Hajnoczky a kol., 1999 Rizzuto a kol., 1998). Mitochondrie môžu byť skutočne uviazané tak, aby boli v rámci 10 nm od Ins (1,4,5)P3Rs (Csordas a kol., 2006). Na týchto miestach sú mitochondrie vystavené lokálnemu [Ca2+]c ktorý presahuje objemové priemerné hodnoty (Rizzuto et al., 1998), a preto možno očakávať, že obe budú mať väčší vplyv na [Ca2+]c samotný signál (kvôli ich nízkej afinite k Ca 2+ ) a naopak s väčšou pravdepodobnosťou vykazujú zníženie ΔΨm v dôsledku väčšieho mitochondriálneho prúdu Ca2+ generovaného počas týchto lokálnych [Ca2+]c prechodné javy.

Hoci prechodné poklesy ΔΨm boli pozorované v izolovaných mitochondriách, ktoré boli vystavené náhlemu zvýšeniu [Ca2+] (Brustovetsky a Dubinsky, 2000 Huser et al., 1998), je menej jasné, či k tomu dochádza počas [Ca2+].c signalizácia v intaktných bunkách. Prechodné alebo „blikanie“, ΔΨm u niektorých boli pozorované zmeny (Buckman a Reynolds, 2001 Drummond a kol., 2000 Duchen a kol., 1998 Haak a kol., 2002 Jacobson a Duchen, 2002 Kaftan a kol., 2000 O'Reilly a kol., Petronilli 2004 et al., 2001), ale nie všetky (Collins et al., 2001 Csordas a Hajnoczky, 2003) intaktné typy buniek, hoci ich vzťah k [Ca 2+ ]c zmeny sú neisté. Či je alebo nie je prechodný ΔΨm depolarizácie pozorované počas bunkových signálov Ca2+ môžu závisieť od typu bunky, pôvodu a charakteristík signálu Ca2+. Napríklad inhibícia uvoľňovania Ca2+ zo SR inhibuje prechodný ΔΨm depolarizácie za určitých okolností (Jacobson a Duchen, 2002), ale nie za iných (O'Reilly et al., 2004).

Prechodný ΔΨm depolarizácie sa tiež pripisujú zvýšeným hladinám oxidačných druhov generovaných kombináciou intenzívneho excitačného svetla a vysokých koncentrácií určitých mitochondriálnych farbív (Szado et al., 2003), a nie zmenám [Ca2+]c. V ďalších štúdiách ani intenzita excitačného svetla, ani koncentrácia mitochondriálnych farbív neprispeli k vytvoreniu prechodného ΔΨm depolarizácie (Buckman a Reynolds, 2001 O'Reilly a kol., 2004 Vergun a kol., 2003). Je zrejmé, že mechanizmus (mechanizmy) tvoriaci základ ΔΨm depolarizácie, a najmä, či Ca2+ signály vznikajúce buď prílivom alebo uvoľňovaním modulujú ΔΨm je nejasné.

Bunková signalizácia Ca2+ predstavuje pre bunku energetickú záťaž (aby sa vyrovnali pokojové koncentrácie iónov) a paradoxne tiež bráni produkcii ATP mitochondriami, ak signály Ca2+ vedú k ΔΨm depolarizácia. V tejto štúdii sa riešila otázka, či mitochondriálny príjem Ca2+ depolarizuje mitochondrie alebo nie. Skúmať, ako mitochondrie ovplyvňujú signály Ca2+ a či sa zmeny v ΔΨ alebo niem vyskytujú, ΔΨm bola nameraná počas [Ca2+]c prechodné javy vyvolané influxom Ca 2+ cez plazmalemu a po uvoľnení Ca 2+ zo SR lokalizovanou fotolýzou Ins v klietke(1,4,5)P3v napäťovo upnutých jednoduchých bunkách hladkého svalstva. Použila sa napäťová svorka, pretože zmeny v plazmalemálnom potenciáli by mohli ohroziť schopnosť rozlíšiť mitochondriálne ΔΨm zmeny (Ward a kol., 2000). Použitie Ins v klietke (1,4,5)P3 by mal minimalizovať počet systémov druhého posla, ktoré sú v prevádzke a ktoré by inak tiež mohli zmeniť ΔΨm nezávisle od zmien Ca 2+. So zoslabenou intenzitou svetla a nízkou koncentráciou ΔΨm indikátor etylester tetrametylrodamínu (TMRE), len minimálny ΔΨm zmeny boli pozorované v podmienkach pokoja. ΔΨm depolarizácie nenastali, keď [Ca2+]c bol zvýšený prílivom Ca2+ cez napäťovo riadené Ca2+ kanály alebo uvoľnením z Ins(1,4,5)P3Rs, aj keď prebiehal mitochondriálny príjem Ca2+. Avšak, ΔΨm depolarizácie boli pozorované pri zvyšujúcej sa koncentrácii TMRE alebo intenzite svetla, aj keď žiadna zmena [Ca2+]c uskutočnilo sa. Tieto depolarizácie boli blokované antioxidantmi alebo inhibítorom mitochondriálnej permeability prechodových pórov (mPTP) cyklosporínom A (CsA). Veľmi občas, prechodné ΔΨm depolarizácia bola pozorovaná v bunkách, ktoré prešli trvalou, spontánnou [Ca2+]c oscilácie. V tomto prípade ΔΨm depolarizácie neboli synchronizované v mitochondriálnom komplemente ani so zmenami [Ca2+]c. Preto počas fyziologickej signalizácie Ca2+ mitochondriálny príjem Ca2+ modifikuje amplitúdu a trvanie signálov Ca2+ bez významnej zmeny ΔΨm, pokiaľ [Ca 2+ ]c oscilácie sa opakujú a sú trvalé.


Abstraktné

Abstraktné Táto štúdia testovala dve hypotézy: (1) že receptor pre extracelulárny Ca2+ (Ca2+ receptor [CaR]) sa nachádza v perivaskulárnom senzorickom nervovom systéme a (2) že aktivácia tohto receptora fyziologickými koncentráciami extracelulárneho Ca 2+ vedie k uvoľneniu vazodilatačnej látky, ktorá sprostredkúva Ca2+-indukovanú relaxáciu. Reverzná transkripcia-polymerázová reťazová reakcia s použitím primérov odvodených zo sekvencie cDNA CaR potkaních obličiek ukázala, že mRNA kódujúca CaR je prítomná v gangliách dorzálnych koreňov, ale nie v artérii mezenterickej rezistencie. Analýza Western blot s použitím monoklonálnej anti-CaR ukázala, že 140-kD proteín, ktorý spolumigruje s prištítnym telieskom CaR, je prítomný ako v gangliách dorzálnych koreňov, tak aj v intaktnej artérii mezenterickej rezistencie. Imunocytochemická analýza celých preparátov mezenterických rezistentných artérií ukázala, že perivaskulárne nervy zafarbené anti-CaR sa obmedzili na adventiciálnu vrstvu. Biofyzikálna analýza mezenterických rezistentných artérií ukázala, že kumulatívne zvýšenie Ca2+ z 1 na 1,25 mol/l a viac uvoľňuje prekontrahované artérie s ED50 hodnota 2,47±0,17 mmol/l (n=12). Relaxácia je nezávislá od endotelu a nie je ovplyvnená blokádou syntázy oxidu dusnatého, ale je úplne antagonizovaná akútnou a subakútnou fenolickou deštrukciou perivaskulárnych nervov. Biotest ďalej ukázal, že superfúzia Ca2+ cez adventiciálny povrch artérií odporu uvoľňuje difúznu vazodilatačnú látku. Farmakologická analýza ukazuje, že relaxačná látka nie je bežným senzorickým nervovým peptidovým prenášačom, ale je to fosfolipáza A2/hyperpolarizačný faktor odvodený od cytochrómu P450, ktorý sme klasifikovali ako hyperpolarizačný faktor odvodený od nervov. Tieto údaje dokazujú, že CaR je exprimovaný v perivaskulárnej nervovej sieti, ukazujú, že zvýšenie Ca2+ z 1 na 1,25 mol/l a viac spôsobuje nervovo závislú relaxáciu odporových artérií a naznačujú, že aktivácia CaR indukuje uvoľnenie difúzny hyperpolarizujúci vazodilatátor. Navrhujeme, aby tento systém mohol slúžiť ako molekulárne prepojenie medzi rovnováhou Ca2+ celého zvieraťa a arteriálnym tonusom.

Pozorovanie, že ión Ca2+, pôsobiaci na vonkajšku bunky, moduluje vaskulárny tonus a odpor voči prietoku krvi, už dlho zaujímalo fyziológov hladkého svalstva. V roku 1911 Krava 1 ukázala, že zvýšenie Ca2+ nad normálnu úroveň znižuje reaktivitu izolovaných tepien. O viac ako 40 rokov neskôr Holman, 2 s použitím izolovaného morčacieho taenia coli, uviedol, že zvýšenie extracelulárneho Ca2+ prechodne znižuje elektrickú aktivitu morčacieho taenia coli, na rozdiel od predpokladaného augmentácie. Bohr 3 následne ukázal, že zvýšené koncentrácie extracelulárneho Ca2+ potláčajú skorú rýchlu odpoveď potkanej aorty na epinefrín, zatiaľ čo rovnaké hladiny Ca2+ zvyšujú odpoveď v ustálenom stave. Takmer o desať rokov neskôr Holloway a Bohr 4 uviedli spôsob kvantifikácie relaxácie izolovaných tepien indukovanej Ca2+ a navrhli, že Ca2+ indukuje relaxáciu prostredníctvom účinku stabilizujúceho membránu. Následná práca Bohra a kolegov 5 6 ďalej charakterizovala odpoveď ciev na extracelulárny Ca2+.

Hoci tieto experimenty preukázali skutočnosť, že extracelulárny Ca2+ potláča tvorbu cievnej sily, prijatie tohto javu ako fyziologického regulačného mechanizmu bolo obmedzené z dvoch dôvodov. Jednou je skutočnosť, že sa všeobecne predpokladalo, že koncentrácie Ca2+ potrebné na zmenu vaskulárnej funkcie nemožno dosiahnuť in vivo. Nové dôkazy naznačujú, že to nie je pravda a naznačujú, že v tkanivách zapojených do transcelulárneho pohybu Ca2+ (napr. črevo, obličky a kosť) môže byť koncentrácia Ca2+ v intersticiálnom priestore výrazne vyššia, ako je prítomná v zmiešaná venózna plazma. 7

Druhým dôvodom obmedzeného prijatia je, že nebol preukázaný žiadny životaschopný molekulárny mechanizmus vysvetľujúci relaxáciu indukovanú Ca2+. Identifikácia bunkového mechanizmu pre tento účinok bola zameraná na naše laboratórium, 8 9 a nedávno sme preukázali, že Ca2+-indukovaná relaxácia artérie mezenterickej rezistencie potkana je oslabená blokádou Ca2+-aktivovaných K+ kanálov a je spojená so znížením citlivosti myofilamenta na Ca 2+. 10 Pretože extracelulárny Ca2+ by nemal priamo aktivovať K + kanály a regulácia citlivosti myofilamenta Ca2+ je proces spojený s G proteínom,11 navrhli sme, že extracelulárny Ca2+ indukuje relaxáciu aktiváciou membránového receptora pre extracelulárny Ca2+. ktorý je podobný tomu, ktorý bol hlásený v iných tkanivách, vrátane prištítnych teliesok, štítnej žľazy a obličiek. 12 13 14 15

Naše počiatočné pokusy o identifikáciu CaR v arteriálnom tkanive pomocou RT-PCR amplifikácie CaR mRNA nepreukázali vhodný transkript 16 a potvrdili predchádzajúce správy. 12 13 15 Nedávno sa však preukázalo, že správa pre CaR je exprimovaná v nervovom tkanive. 17 S vedomím, že malé tepny potkana obsahujú hustú perivaskulárnu senzorickú nervovú sieť, ktorá je funkčne spojená s vazodilatáciou 18 19 a že telá buniek senzorických vlákien, ktoré sú miestami spracovania mRNA a syntézy proteínov, sa nachádzajú v DRG, 20 sme predpokladali, že perivaskulárna sieť senzorických nervov obsahuje vaskulárny CaR, ktorý sprostredkováva Ca2+-indukovanú relaxáciu malých artérií. Teraz demonštrujeme, že receptor pre extracelulárny Ca2+ je prítomný v senzorických nervoch steny mezenterickej rezistencie tepny a predstavujeme fyziologický a farmakologický dôkaz, ktorý je v súlade s hypotézou, že Ca2+ moduluje vaskulárnu reaktivitu aktiváciou tohto receptora. Predbežné správy o tejto práci boli publikované v abstraktnej forme. 21 22

Metódy

Materiály

Peptidové antagonisty, vrátane CGRP8–37, Spantide II, galantid, 4Cl-d-Phe, 6 Leu17-VIP a a-helical CRF 9–41, boli zakúpené od Phoenix Pharmaceuticals ani-binaltorfimín bol zakúpený od Research Biochemicals a SR48968 a SR140333 boli veľkoryso dodávané spoločnosťou Sanofi Recerche. Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky ostatné chemikálie použité v týchto štúdiách boli analytickej kvality a boli zakúpené od Sigma Chemical.

Zvieratá

Všetky postupy zahŕňajúce zvieratá sa uskutočňovali v súlade so súhlasom Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť o zvieratá a ich použitie. Samce potkanov Wistar (vo veku 6 až 10 týždňov) boli získané z Harlan-Sprague Dawley a po príchode do nášho zariadenia na starostlivosť o zvieratá boli chované v kolóniách s pevnými cyklami svetlo/tma a konštantnou teplotou a vlhkosťou a boli im poskytnuté krmivo pre hlodavce Purina a voda. podľa chuti. Cievne alebo iné tkanivo sa izolovalo, zatiaľ čo sa potkany anestetizovali zmesou ketamínu a xylazínu (100/5 mg/kg). Subchronická fenolová denervácia mezenterických artérií sa dosiahla aplikáciou 10 % etanolového fenolu na mezenterické artérie vetvy I cez strednú brušnú incíziu, zatiaľ čo zvieratá sú v anestézii. Rana bola potom uzavretá a tepny distálne od miesta aplikácie fenolu boli izolované o 72 hodín neskôr.

RT-PCR

Celková RNA bola izolovaná, ako bolo nedávno opísané, 23 a 2 μg boli reverzne transkribované pomocou AMV reverznej transkriptázy a deoxynukleotidov poskytnutých v súprave od Boehringer-Mannheim Biochemicals, ktorá bola použitá podľa pokynov výrobcu. Výsledná cDNA sa amplifikovala pomocou 35 cyklov Taq DNA polymeráza (Promega) s teplotou žíhania 55 °C a dobou polymerizácie 7 minút pri 72 °C. Produkty boli rozdelené podľa veľkosti na 1,0 % agarózových géloch a zafarbené etídium bromidom. Sekvencie primérov, ktoré boli navrhnuté na amplifikáciu CaR cDNA zodpovedajúcej oblasti 941 až 1993, boli 5'-GAACCTGGACGAGTTCTG-3' pre priamy primér a 5'-CCATGTTGTTGGTGAAG-3' pre reverzný primér. Sekvenčná analýza 1052-bp produktu PCR z DRG aj obličiek sa uskutočnila pomocou sekvenovania cyklu s farbiacim terminátorom (Perkin-Elmer Cetus) a sekvenčným analyzátorom DNA 3703A Applied Biosystems a preukázala úplnú sekvenčnú homológiu s publikovanou sekvenciou obličiek potkana. 15

Western Blot analýza

Proteín sa extrahoval a oddelil podľa veľkosti pomocou 8% SDS-PAGE a potom sa elektroblotoval na nitrocelulózovú membránu, ako bolo nedávno opísané. 23 Membrána sa inkubovala cez noc s monoklonálnou myšou anti-CaR (0,13 μg/ml) proti konzervovanej sekvencii CaR prištítnych teliesok ADDDYGRPGIEKFREEAEERDI (poskytuje NPS Pharmaceuticals v spojení s Drs Allenom Spiegelom a Paulom Goldsmithom, NIDDK). V niektorých experimentoch bola anti-CaR vopred absorbovaná s 50 mg/ml nadbytku antigénu. Membrána sa potom inkubovala s chrenovou peroxidázou spojenou s anti-myším IGG (Amersham) a výsledný komplex proteín/protilátka sa vizualizoval na rôntgenovom filme s použitím vylepšenej chemiluminiscenčnej metódy (ECL Amersham).

Imunocytochémia

Cievy sa očistili od tuku a spojivového tkaniva a luminálna krv sa odstránila prepláchnutím studeným PSS. Po krátkej fixácii v ľadovo studenom metanole sa segmenty opláchli v TBS, vnútorná peroxidázová aktivita sa uhasila pomocou zmesi H2O2 a NaN3 (DAKO) a nešpecifická väzba bola blokovaná pomocou bezsérového blokátora (DAKO). Tkanivá sa potom inkubovali cez noc so samotným TBS (negatívna kontrola) alebo anti-CaR (20 ug/ml). Po premytí sa vnútorný biotín zablokoval pomocou súpravy na blokovanie biotínu (DAKO) a segmenty sa inkubovali so sekundárnou protilátkou konjugovanou s biotínom (1:250) v prítomnosti 2 % séra z príslušných druhov. Segmenty sa potom zafarbili pomocou avidínu konjugovaného s chrenovou peroxidázou (Vector Labs) s použitím 3–3'-diaminobenzénu (Sigma) ako substrátu, kontrastne sa zafarbili hematoxylínom, dehydratovali sa sekvenčným etanolom a xylénom a natrvalo sa namontovali. Prípravky sa potom vizuálne preskúmali pomocou výskumného mikroskopu Nikon Microphot FXA a urobili sa fotografie so zameraním buď na adventiu, médium alebo intimu, ako sa posúdilo podľa vzoru jadrového farbenia.

Biofyzikálne merania

Generovanie izometrickej sily sa meralo pomocou skôr opísaných metód. Izolovalo sa 10 mezenterických odporových artérií vetvy II, očistilo sa od tuku a spojivového tkaniva a umiestnilo sa do ľadovo chladného PSS s nasledujúcim zložením (v mol/l) NaCl 140, KCl 4,7, MgSO47H2O 1,17, NaHCO3 5, KH2PO4 1,15, Na2HPO4 1,10, CaCl2 1,0, HEPES 20 a glukóza 5, pH 7,4. Nádoby sa potom namontovali na drôtený myograf zahriaty na 37 °C a naplnený plynom 95 % vzduch/5 % CO2, natiahnutý na vopred stanovenú dĺžku, ktorá bola ekvivalentná vnútornému priemeru 200 až 225 μm, a nechal sa ekvilibrovať počas 30 minút. Po ekvilibračnej perióde boli cievy vyvolané kontrakciou 5 μmol/l norepinefrínu, kým sa nezískali reprodukovateľné kontraktilné odozvy (tri alebo štyrikrát).

Niektoré cievy boli študované po odstránení endotelu pomocou ľudského vlasu a funkčná denudácia bola overená v nasledujúcich protokoloch absenciou relaxačnej odozvy na pridanie 1 μmol/l acetylcholínu. 24 Iné cievy podstúpili procedúru chemického poškodenia perivaskulárnych nervov. 25 PSS sa odčerpalo zo segmentu a 50 μl 0,75 % roztoku etanolického fenolu (90:10) v PSS sa priamo aplikovalo na 15-sekundovú periódu (čas empiricky odvodený v predbežných experimentoch), po čom nasledovalo rozsiahle premytie počas 30-minútová perióda. Táto liečba vedie k takmer úplnej strate kontraktilnej odpovede na aktiváciu perivaskulárnych nervov pomocou stimulácie elektrickým poľom pri 30 Hz, 70 V a trvaní 2 ms.

Relaxácia indukovaná Ca2+ bola hodnotená kumulatívnym pridávaním Ca2+ do ciev, ktoré boli vopred kontrahované 5 μmol/l norepinefrínu, pričom veľkosť relaxácie bola vyjadrená ako percento počiatočného napätia. Keď bola prítomná fázová aktivita, merania sa uskutočňovali od základnej línie pred kontrakciou po dno fázového prechodu.

Biotest

Biologický test sa použil na určenie, či je difúzna vazodilatačná látka vyvolaná Ca2+ z adventiciálneho povrchu artérií mezenterickej rezistencie. Segment biotestu bol 1,5- až 2-mm dlhý prstenec mezenterickej rezistentnej artérie namontovaný na darcovskom tkanive drôteného myografu, ktorý pozostával z časti pasáže mezenterickej rezistentnej artérie s hmotnosťou 20 až 30-násobku hmotnosti segmentu biotestu, ktorý bol pripevnený. nad preparátom pomocou kanyly umiestnenej v úseku mezenterického kmeňa. PSS, ktorý bol splynovaný 95 % vzduchu/5 % CO2 a udržiavaná pri 35 °C sa nechala kvapkať na segment biologického testu prietokovou rýchlosťou 1,5 ml/min buď priamo z kanyly alebo po superfúzii cez segment darcu. Na kvantifikáciu relaxačnej odozvy sa experimentálna stopa digitalizovala pomocou softvéru UN-SCAN-IT (Silk Scientific Corp) a pre každé ošetrenie sa určila plocha pod relaxačnou krivkou.

Štatistická analýza

Všetky údaje sú prezentované ako priemer ± SEM a štatistická analýza sa uskutočnila pomocou softvérového balíka SYSTAT. Porovnania medzi skupinami sa uskutočňovali pomocou ANOVA s dizajnom opakovaných meraní, keď to bolo vhodné. Hodnota P<05 bolo brané na označenie štatisticky významného rozdielu.

Výsledky

Expresia génu CaR

Na posúdenie expresie génu CaR sa izolovala celková RNA z obličky potkana (pozitívna kontrola, gangliá dorzálnych koreňov a artéria mezenterickej rezistencie). Komplementárna DNA bola syntetizovaná pomocou RT a amplifikovaná pomocou PCR s primérmi navrhnutými na amplifikáciu 1052 bp oblasti CaR potkaních obličiek. 15 mRNA kódujúca CaR bola prítomná v obličkách a DRG, ale nie v artérii mezenterickej rezistencie (obr. 1A). Kontrolné experimenty, v ktorých sa PCR uskutočnila v neprítomnosti kroku RT, neodhalili žiadny produkt, čo naznačuje, že nedošlo ku kontaminácii vzorky genómovou DNA. Sekvenčná analýza ampliméru izolovaného z obličiek aj z DRG ukázala úplnú homológiu s publikovanou sekvenciou potkaních obličiek. Tieto údaje naznačujú, že mRNA pre CaR je prítomná v bunkových telách senzorických nervov, ale nie je detegovateľná v arteriálnej stene. Možné vysvetlenia sú, že proteín CaR sa syntetizuje v tele DRG bunky a periférne sa transportuje do perivaskulárnych neurónov alebo že koncentrácia mRNA CaR je príliš nízka na to, aby sa dala detegovať v nervoch arteriálnej steny pomocou metódy RT-PCR.

Proteínová expresia CaR

Analýza Western blot sa použila na testovanie hypotézy, že proteín imunoreaktívny s paratyroidným CaR je prítomný v DRG a stene mezenterickej rezistencie artérie. Proteín extrahovaný z štítnej žľazy (pozitívna kontrola, gangliá dorzálnych koreňov a mezenterické rezistentné artérie) sa použil pri analýze Western blot, ako je opísané v časti „Metódy“. V súlade s predchádzajúcimi správami 12 13 migroval prištítny teliesok CaR ako dublet s molekulovými hmotnosťami ≈ 140 a ≈ 160 kD (obr. 1B). Imunoreaktívny proteín z DRG a artérií mezenterickej rezistencie sa javil ako jeden pás, ktorý migroval s dolným pásom dubletu prištítnych teliesok (obr. 1B). Preabsorpcia anti-CaR s nadbytkom antigénu významne znížila signál CaR zo všetkých troch prípravkov.

Imunocytochemická lokalizácia

Imunocytochemická analýza sa použila na určenie miesta expresie CaR v stene mezenterickej rezistencie artérie. Celé prípravky boli imunofarbené anti-CaR, ako je opísané v časti „Metódy“ a kontrastne zafarbené hematoxylínom, aby sa zviditeľnili jadrá v rôznych vrstvách artérie. Jemný nervový vzor farbenia bol prítomný v adventiciálnej vrstve (obr. 2A), ale nie v mediálnej (obr. 2B) alebo endoteliálnej (obr. 2C) vrstvách. Okrem toho nebolo pozorované žiadne farbenie, keď bola sekundárna protilátka použitá samotná (obr. 2D).

Biofyzikálne merania

Uskutočnili sa aj experimenty na testovanie hypotézy, že aktivácia perivaskulárneho CaR je spojená s Ca2+-indukovanou moduláciou arteriálnej reaktivity. Pretože neexistujú žiadni známi antagonisti CaR, tieto experimenty boli navrhnuté tak, aby stanovili citlivosť Ca2+ a neuronálnu závislosť relaxačného javu Ca2+. Ako je znázornené na obr. 3A, pridanie 5 umol/l norepinefrínu do mezenterickej rezistentnej artérie indukuje zvýšenie tonusu, ktorý pretrváva na stabilnej úrovni > 30 minút a prejavuje vazomotoriku. Keď sa kumulatívne pridá extracelulárny Ca2+, pozorovala sa relaxácia závislá od dávky (obr. 3B) s ED50 hodnota 2,47±0,17 mmol/l stanovená z ciev od 12 samostatných zvierat. Navyše pridanie 3 alebo 5 mmol/l Ca2+ často spôsobilo prechodné potlačenie rytmickej aktivity, ktoré sa vrátilo s 3- až 5-minútovým oneskorením.

Pretože je možné, že Ca 2+-indukovaná relaxácia je sprostredkovaná účinkom Ca 2+ na vyvolanie produkcie NO buď z endotelu 6 26 alebo nitroxidergických nervov 27, účinok inhibície NO syntázy na Ca 2+ - indukovaná relaxácia bola hodnotená predbežným ošetrením 0,3 mmol/l L-NAME, čo je dávka 24, ktorá účinne inhibuje acetylcholínom indukovanú relaxáciu segmentov vopred kontrahovaných 100 mmol/LK+ (kontrola, 32,5 ± 8 % relaxácia L-NAME, 14,5 ± 7,2 % P<05, n=6). Blokáda NO syntázy nemala žiadny vplyv na citlivosť na Ca2+ alebo na veľkosť relaxácie indukovanej Ca2+, čo naznačuje, že ani endoteliálny, ani neurónový NO nesprostredkuje relaxáciu (obr. 4).

Endotelové bunky uvoľňujú vazodilatačné látky iné ako NO (tj produkty cyklooxygenázy, ako je prostacyklín a domnelý hyperpolarizačný faktor odvodený od endotelu). 28 Úloha endotelu bola preto hodnotená štúdiom segmentov ciev, ktoré boli mechanicky zbavené endotelu. Odstránenie endotelu významne znížilo acetylcholínom indukovanú relaxáciu ciev vopred kontrahovaných 5 μmol/l norepinefrínu (relaxácianeporušené=90,5±3,9% oproti relaxáciiobnažený=8.3±2.5, P<005, n=5), ale nemal žiadny vplyv na relaxáciu indukovanú Ca2+ (obr. 4).

Na testovanie hypotézy, že Ca2+-indukovaná relaxácia je závislá na funkčne intaktných perivaskulárnych nervoch, sa hodnotil účinok deštrukcie fenolických nervov. 25 Akútna denervácia sa dosiahla aplikáciou 0,75 % roztoku fenolu priamo na nádobu na 15 sekúnd, po čom nasledovalo rozsiahle premytie. Po ošetrení fenolom vo všeobecnosti došlo k zníženiu silovej odozvy na norepinefrín a na rozdiel od relaxačnej odozvy pozorovanej pred pridaním fenolu viedlo kumulatívne pridanie Ca2+ k prírastkovému zvýšeniu aktívnej sily (obr. 5A). Na testovanie toho, či bola fenolom ovplyvnená vnútorná schopnosť cievy relaxovať, sa hodnotili relaxačné reakcie na donor NO nitroprusid sodný a otvárač K+ kanálov (pinacidil). Na rozdiel od odpovede na Ca, 2+ obidvaja agonisti uvoľnili prekontrahované artérie. Odpoveď na nitroprusid bola v porovnaní s predchádzajúcimi výsledkami nedotknutá,24 zatiaľ čo odpoveď na pinacidil bola posunutá doprava (pD2 [mol/l] pre pinacidilpokračovanie=-5,81±0,2 oproti pinacidilufenol=−4.67±0.19, P<05, n=5], čo naznačuje mierny inhibičný účinok na agonistu K+ kanála.

Ako test na možné nešpecifické poškodenie artérie vyvolané fenolom sa hodnotil účinok aplikácie fenolu 3 dni pred odberom vaskulárneho tkaniva, ako je opísané v časti „Metódy“. Rovnako ako pri akútnej aplikácii fenolu, zvýšenie Ca2+ spôsobilo kontrakciu ciev, ktoré boli odobraté zvieratám liečeným fenolom, zatiaľ čo cievy zvierat liečených simulovane/vehikulom sa uvoľnili v reakcii na Ca2+ (obr. 5B). Je potrebné poznamenať, že relaxačná odozva simulovane liečených zvierat bola znížená v porovnaní s odozvami znázornenými na obrázkoch 3 až 5 a predpokladáme, že je to výsledok neurotoxického účinku vehikula (100 % etanol).

Pretože tieto údaje ukázali, že extracelulárny Ca2+ indukuje relaxáciu prostredníctvom mechanizmu závislého od nervov, na testovanie hypotézy, že extracelulárny Ca2+ vyvoláva uvoľňovanie difúznej vazodilatačnej látky z adventiciálneho povrchu artérií mezenterickej rezistencie, sa použil biologický test. Priame pridanie norepinefrínu do biotestovacej nádoby cez kanylu spôsobilo zvýšenie sily a zvyšujúce sa koncentrácie extracelulárneho Ca2+ spôsobili stupňovité zníženie napätia (obr. 6). Keď sa postup opakoval, pričom sa umožnilo roztoku najprv superfúzovať donorovú pasáž, pozorovali sa dva efekty. Prvým bolo, že kontraktilná odozva biotestovacej cievy na norepinefrín bola významne oslabená superfúziou média cez darcu (vrchol odozvy bol 68 ± 8,9 % kontroly, P= 0,009), čo naznačuje prítomnosť bazálneho vazodilatačného faktora, druhým bolo, že relaxačná odpoveď na zvýšený Ca2+ bola významne zvýšená, najmä pri najnižších koncentráciách Ca2+ (obr. 6).

Uskutočnili sa tiež experimenty na testovanie hypotézy, že vazodilatačná látka, ktorá sprostredkováva relaxáciu indukovanú Ca2+, je jedným z primárnych senzorických nervových prenášačov (tj buď CGRP alebo členom rodiny tachykinínov). 29 Blokáda CGRP receptorov preinkubáciou s CGRP8–37 (1 umol/l), čo je selektívny antagonista CGRP 30, ktorý významne potláča relaxáciu indukovanú CGRP v tomto prípravku (údaje nie sú uvedené), nemal účinok na relaxáciu indukovanú Ca2+ (obr. 7). Podobne blokáda receptora substancie P (neurokinín 1) buď peptidovým antagonistom Spantide II (10 μmol/l) 31 alebo nepeptidovým antagonistom SR140333 (0,3 μmol/l) 32 bola bez účinku (obr. 7). Okrem toho blokáda receptora neurokinínu 2 (tachykinín A) nepeptidovým antagonistom SR48968 (0,3 umol/l)32 tiež nemala vplyv na relaxáciu indukovanú Ca2+ (obr. 7). Pretože tieto údaje a predbežné experimenty s použitím peptidových antagonistov pre ďalšie možné neurotransmitery, vrátane 4Cl-d-Phe, 6Leu17-VIP, nor-binaltorfimínu (dynorfínu), a-helikálneho CRF a galantidu (galanínu), 33 ukázali, že mediátor nemusí byť peptidový transmiter, testovali sme hypotézu, že mediátor je hyperpolarizačný faktor.

Predbežné ošetrenie 10 mmol/l TEA, čo je širokospektrálny blokátor K+ kanálov,34 úplne inhibovalo relaxáciu indukovanú Ca2+ (obr. 8). Podobne, keď boli artérie mezenterickej rezistencie vopred kontrahované 100 mmol/l K+ v prítomnosti 1 μmol/l fenotolamínu, relaxačná odpoveď na kumulatívne pridanie Ca2+ bola úplne otupená (obr. 8). Pretože tieto údaje podporili hypotézu, že Ca2+ môže indukovať produkciu hyperpolarizačného faktora, a existuje značný dôkaz, že relaxačné faktory odvodené od endotelu sú metabolity kyseliny arachidónovej odvodené od cytochrómu P450, skúmali sme účinok mikonazolu, ktorý je blokátor cytochrómu P450. 37 Predliečenie mezenterických rezistentných artérií 3 μmol/l mikonazolu, ktoré nemalo žiadny vplyv na relaxáciu indukovanú pinacidilom (údaje nie sú uvedené), významne inhibovalo relaxáciu indukovanú Ca2+ (obr. 8). Nakoniec, pretože kyselina arachidónová sa uvoľňuje v mnohých bunkách aktiváciou fosfolipázy A2hodnotili sme účinok 5 μmol/l chinakrínu, čo je fosfolipáza A2 antagonista. 38 Táto koncentrácia chinakrínu, ktorá nemala žiadny vplyv na pinacidilom indukovanú relaxáciu (údaje nie sú uvedené), antagonizovala Ca2+-indukovanú relaxáciu izolovaných mezenterických odporových artérií (obr. 8).

Diskusia

Táto správa popisuje niekoľko nových a potenciálne dôležitých zistení týkajúcich sa regulácie vaskulárnej reaktivity extracelulárnym Ca2. 2+ Jedným zistením je, že DRG, ktoré obsahujú telá buniek senzorických nervových vlákien, exprimujú mRNA pre CaR a táto správa je zjavne spracovaná tak, že proteín CaR je transportovaný z DRG do perivaskulárnej nervovej siete periférnych artérií. Druhým zistením je, že zvýšenie Ca2+ z 1,0 na 1,25 mmol/l a viac uvoľňuje izolované odporové artérie a relaxácia je úplne eliminovaná fenolovou deštrukciou perivaskulárnych nervov. Tretím zistením na základe výsledkov biotestu je, že adventiciálny povrch artérií odporu uvoľňuje difúznu vazodilatačnú látku v reakcii na zvyšujúce sa koncentrácie Ca. 2+ Po štvrté sa zdá, že relaxácia indukovaná Ca2+ je sprostredkovaná produkciou alebo uvoľňovaním hyperpolarizujúceho faktora odvodeného od nervov, ktorým je metabolit kyseliny arachidónovej generovaný cytochrómom P450. Tieto zistenia boli kolektívne syntetizované, aby vytvorili novú hypotézu, ktorá tvrdí, že zmeny v extracelulárnom Ca2+ modulujú vaskulárnu reaktivitu prostredníctvom aktivácie perivaskulárneho CaR, ktorý je lokalizovaný v senzorických nervoch a reaguje na zmeny extracelulárneho Ca2+ uvoľnením hyperpolarizačného vazodilatátor.

Naše zistenia týkajúce sa perivaskulárnej lokalizácie CaR potvrdzujú správu Ruata et al, 17, ktorí ukázali, že mozgové tepny sa farbia pozitívne na perivaskulárny CaR. Okrem toho naše údaje poskytujú dôležité rozšírenie tohto zistenia tým, že demonštrujú, že periférny/perivaskulárny senzorický nervový systém exprimuje receptor citlivý na Ca2+. Kľúčovým dôsledkom tohto pozorovania je, že na rozdiel od súčasného názoru, že distribúcia CaR je obmedzená na niekoľko tkanív (paratyroid, štítna žľaza, obličky a mozog), receptor môže byť prítomný v rozsiahlej sieti v celom organizme. Naše zistenia tiež úhľadne zapadajú do konceptu, že senzorické nervové vlákna majú senzorickú eferentnú motorickú funkciu, prostredníctvom ktorej sa neurotransmiter uvoľňuje v reakcii buď na reflexnú aktiváciu alebo na lokálne stimuly, vrátane cytokínov a vodíkových iónov. 19 29 39 Tieto pozorovania by mali mať dôležité dôsledky, pokiaľ ide o naše chápanie toho, ako homeostáza Ca 2+ celého zvieraťa moduluje regionálnu funkciu.

Niekoľko aspektov našich experimentov si zaslúži ďalšiu diskusiu vrátane údajov, ktoré podporujú perivaskulárnu lokalizáciu CaR. Demonštrácia je založená na dvoch nezávislých dôkazoch. Jednou je analýza RT-PCR, ktorá ukazuje, že správa pre CaR je prítomná v DRG, ale nie v tkanive z arteriálnej steny. To je dôležité, pretože to vysvetľuje, prečo predchádzajúce pokusy o identifikáciu CaR pomocou analýzy Northern blot neboli úspešné. Druhým súborom podporných údajov sú výsledky Western blot a imunocytochemických analýz. Interpretácia údajov RT-PCR je výrazne posilnená dôkazom, že protilátka špecifická pre CaR odhalila perivaskulárnu nervovú lokalizáciu proteínu.

Jedným bodom, ktorý je potrebné riešiť, sú údaje, ktoré spájajú aktiváciu CaR s moduláciou vaskulárneho tonusu. Primárnym dôkazom, ktorý slúži na stanovenie spojenia, je skutočnosť, že relaxácia indukovaná Ca2+ nie je závislá na intaktnom endoteli, zistenie, že relaxácia indukovaná Ca2+ je zrušená akútnou a subchronickou fenolovou denerváciou, a výsledky tzv. biotest, ktorý ukázal, že zvýšenie extracelulárneho Ca2+ indukuje uvoľňovanie difúznej vazodilatačnej látky. Hoci sú provokatívne, uznávame, že všetky tieto zistenia sú nepriame a absolútny dôkaz prepojenia medzi CaR a relaxáciou bude závisieť od špecifickej farmakologickej blokády alebo tkanivovo špecifickej delécie CaR v relevantnom zvieracom modeli. Podľa našich vedomostí však nie sú k dispozícii žiadne selektívne antagonisty CaR a mutant s myšou deléciou, ktorý bol vyvinutý, nerastie za neonatálne štádium, a preto ho nemožno použiť na tento typ kardiovaskulárnej štúdie. 40

Súvisiacou otázkou je identita vazodilatačnej látky, ktorá sprostredkováva Ca2+-indukovanú relaxáciu, táto štúdia naznačuje, že nejde ani o NO, ani o bežný senzorický nervový peptidový transmiter, ako je CGRP alebo člen rodiny tachykinínových peptidov, ale skôr o nervový odvodený hyperpolarizačný faktor. Medzi údajmi, ktoré podporujú tento záver, sú naše zistenia, že dva manévre, ktoré antagonizujú pôsobenie hyperpolarizujúcich faktorov odvodených od endotelu (napr. predkontrakcia artérie s depolarizujúcou koncentráciou K + a predliečenie TEA), úplne blokujú relaxáciu indukovanú Ca2+ (Obr. 8). Okrem toho výsledky farmakologickej analýzy ďalej naznačujú, že produkcia hyperpolarizačného faktora indukovaná Ca2+ je spojená s uvoľňovaním kyseliny arachidónovej prostredníctvom aktivity fosfolipázy A2 a následný metabolizmus enzýmom cytochrómu P450. Je potrebné poznamenať, že sa ukázalo, že CaR mozgu je spojený s uvoľňovaním kyseliny arachidónovej, keď je exprimovaný v bunkách vaječníkov čínskeho škrečka, 41 a epoxyeikosatriénové kyseliny, čo sú zlúčeniny generované cytochrómom P450, sa ukázali ako hyperpolarizujúce vazodilatátory. 42 43 Pokiaľ je nám známe, toto je prvý dôkaz, že exogénny ligand (tj Ca 2+ ) môže vyvolať produkciu nervovo odvodeného hyperpolarizačného faktora zo senzorických nervov.

Ďalším bodom, ktorý si vyžaduje diskusiu, je vzťah medzi zjavnou Ca2+ senzitivitou Ca2+ relaxácie a Ca2+ senzitivitou CaR v iných tkanivách. Predpokladá sa, že CaR prištítnej žľazy reguluje sekréciu PTH v reakcii na zmeny v sére ionizovaného Ca2+ v rozsahu 0,8 až 2 mmol/l. Udalosť relaxácie Ca2+ je v tomto rozsahu tiež citlivá, ale k relaxácii jednoznačne dochádza pri koncentráciách až 5 mmol/l. Existujú dve možné vysvetlenia. Jedným z nich je, že citlivosť perivaskulárneho CaR je podobná citlivosti prištítneho telieska a pri vyšších hladinách CaR funguje samostatný mechanizmus nesúvisiaci s CaR. 2+ Druhou možnosťou je, že citlivosť na Ca 2+ perivaskulárneho CaR vykazuje širší rozsah ako v prípade PTH.

Okrem skutočnosti, že naše výsledky poskytujú mechanizmus, ktorým zvýšenie extracelulárneho Ca2+ uvoľňuje izolované tepny – fenomén, ktorý zaujíma vaskulárnych fyziológov už viac ako 85 rokov 1 2 3 –, môžu tiež poskytnúť pohľad na fyziologické mechanizmy, ktorými sa môžu zmeniť celkové -zvieracia rovnováha Ca2+ môže byť spojená s reguláciou krvného tlaku. Hoci existuje množstvo dôkazov, ktoré podporujú hypotézu, že suplementácia Ca2+ znižuje krvný tlak u ľudí s hypertenziou a na zvieracích modeloch vysokého krvného tlaku, 44 45 46 zostáva mechanizmus neobjasnený. 16 Súčasné údaje umožňujú formulovať testovateľnú teoretickú paradigmu, ktorá opisuje mechanizmus, ktorým suplementácia Ca2+ môže modulovať vaskulárnu reaktivitu a krvný tlak. Konkrétne navrhujeme, že zvýšený príjem Ca2+ spôsobuje zvýšenie intersticiálneho Ca2+ v tkanivách zapojených do transcelulárneho pohybu Ca2+ (napr. črevo a obličky), čo vyvoláva uvoľnenie lokálneho hyperpolarizujúceho vazodilatátora, ktorý následne znižuje cievna rezistencia a znižuje krvný tlak.

Ďalšie potenciálne dôsledky tejto práce sú založené na pozorovaniach, že mutácie v CaR už boli spojené s familiárnou hypokalciurickou hyperkalciémiou a neonatálnym ťažkým hyperparatyreoidizmom. 47 48 Ak existujú génové polymorfizmy v perivaskulárnom CaR, môžu prispievať k dedičnej zložke ľudskej esenciálnej a experimentálnej genetickej hypertenzie. 49 Napokon, pretože CaR je osvedčeným cieľom farmakologickej manipulácie, 50 naše údaje tiež poskytujú dôvod na skúmanie aplikácie agonistov a antagonistov CaR na rôzne ľudské patológie, vrátane hypertenzie, a na zvládanie bolesti a zápalu.


Výsledky

Populácia vlákien izolovaných kolagenázou

Je dobre zdokumentované, že kostrové svaly dospelých mdx myši majú vysoké percento centrálne jadrových vlákien (CNF), čo odráža kontinuálny proces regenerácie. Toto percento sa líši od svalu k svalu (Boland a kol. 1995 Pastoret & Sebille, 1995). Pozorovali sme, že percento CNF v populácii izolovanej kolagenázou mdx vlákna bola okolo 25 % a významne sa nelíšila od hodnôt, ktoré sme získali na štandardných histologických rezoch. Kolagenázové štiepenie svalu teda nevytvorilo selekciu vlákien na základe ich stavu diferenciácie (hodnotené podľa polohy jadier). Navyše, rovnaké percento CNF sa udržalo počas 6 dní kultivácie.

Vtok Mn 2+ vo vláknach izolovaných kolagenázou: zmeny z d0 na d5

Jednotlivé rýchlosti zhášania fluorescencie Fura-PE3 v prítomnosti vonkajších iónov Mn 2+ sú znázornené na obr. mdx vlákna. Pri d1 zostala väčšina hodnôt v medziach 5 %, zatiaľ čo malá časť vlákien (8/27 a 9/25 pre normálne a mdx v uvedenom poradí) vykazovali väčšie a široko rozptýlené hodnoty: od 6,1 do 21,5 % min-1 pre normálne vlákna a od 5,3 do 95 % min-1 pre vlákna z mdx svaly (skontrolovali sme, že to nebolo spôsobené obzvlášť vysokou úrovňou zaťaženia Fura-PE3). V d2 bola väčšina hodnôt opäť koncentrovaná v rámci 5 % min −1 limitu len s 1/7 (normálne) a 1/14 (mdx) vykazujúce hodnoty okolo 10–13 % min −1 . V d3 boli priemerné hodnoty 2,5 a 5 % min −1 pre normálne a mdx vlákna, respektíve významný rozdiel (P < 0,01). Tieto posledne menované rýchlosti sú veľmi podobné tým, ktoré boli predtým uvedené pre vlákna izolované kolagenázou po 3 dňoch kultivácie (Tutdibi a kol. 1999) v tomto veku kultúry títo autori nikdy nepozorovali toky nad 10 % min −1 v súbore viac ako 150 individuálnych pozorovaní normálnych aj mdx vlákna (H. Brinkmeier, osobná komunikácia). Keď sme však pozorovania rozšírili na d4 a d5, rozdiel v príleve Ca 2+ medzi normálnym a mdx vlákna už neboli významné.

Korelácia medzi prítokom Mn2+ a [Ca2+]i

Cytosol [Ca2+] sa meral pre každé vlákno predtým, ako sa určila rýchlosť zhášania Mn2+ (pozri Metódy), aby sa vyhodnotil vzťah medzi prílivom Ca2+ (odhadovaný z prítoku Mn2+) a rovnovážnym stavom hodnota [Ca 2+]i. Spomedzi 132 študovaných vlákien (obr. 1) bolo získaných 130 individuálnych párov hodnôt počas 6 dní štúdie (68 mdx, 62 normálne). Sú zobrazené na obrAbez ohľadu na deň pozorovania. Najväčšia časť výsledkov (116/130) je zoskupená v rámci rýchlosti kalenia 0–10 % min-1 a 25–85 n m [Ca 2+ ]i, ako krajné limity. Výsledky z normálnej a mdx vlákna sa prekrývajú. Tento husto osídlený zhluk úplne vľavo na obr. 2A 2 je znázornený ako zväčšený pohľadB. Celý súbor údajov (obr. 2A) vykazuje extrémne skreslené rozdelenie, v dôsledku čoho je výpočet aritmetických priemerov nevhodný. Namiesto toho sa určili mediány a rozsahy 25–75 percentilov pre rýchlosti zhášania aj pre cytosol [Ca2+], ako je uvedené v tabuľke 1. Mediány sa porovnávali neparametrickou štatistickou analýzou (Mann-Whitney Rank sum test). . Hoci medián rýchlosti ochladzovania bol výrazne väčší v mdx vlákna (P < 0,01), medián cytozolu [Ca2+] sa nelíšil od normálneho (P/ 0,2). Mimo hlavného zhluku výsledkov malá časť vlákien (12/130) vykazovala obe vyššie [Ca2+]i hodnoty v rozsahu 100–140 nm a široký rozptyl rýchlosti prítoku od >5 do 95 % min-1. Všetky výsledky tejto druhej frakcie okrem jedného boli získané v d1. Tu sú výsledky z normálneho a mdx sa už neprekrývajú v dôsledku oveľa vyšších hodnôt prítoku Mn 2+ v štyroch mdx vlákna (ako už vidno na obr. 1). Nehľadiac na veľmi vysoké hodnoty prílevu u niektorých mdx vlákna, [Ca 2+]i hodnoty v tejto skupine sa nelíšili od hodnôt získaných s normálnymi vláknami tejto frakcie s vysokým prítokom Mn2+ a zostali v rozsahu 100–140 nm bez dosiahnutia prahu kontrakcie, pretože všetky vlákna boli uvoľnené s viditeľnými pruhmi v čase meranie. Skontrolovali sme, že tieto výsledky nepochádzajú od rovnakého zvieraťa. Okrem toho, štyri vlákna vykazujúce vysoké rýchlosti toku Mn2+ pochádzali z rôznych kultúr, z ktorých každá tiež obsahovala vlákna s rýchlosťou kalenia len 2 % min-1. Rozptyl výsledkov teda odrážal heterogenitu populácie vlákien a nie rozdiely medzi zvieratami.

Vzťah medzi rýchlosťou prítoku Ca2+ a cytozolom [Ca2+] bol ďalej študovaný umelým zvýšením prítoku Ca2+ s nízkymi koncentráciami Ca2+ ionofóru 4-bróm A23187. Našu štúdiu sme obmedzili na vlákna kultivované 2 a 3 dni, keď boli vlákna so zvýšeným prítokom prirodzene eliminované (pozri nižšie). Ako je vidieť na obr. 3, získali sme rýchlosti prítoku v rozsahu od 2 do 44 % min-1, zatiaľ čo [Ca2+]i zostali v medziach 30–78 n m, bez rozdielu medzi normálnou a mdx vlákna. Výsledky na obrázku 3 ukazujú, že počas trvania experimentu (< 120 minút) je „robustnosť“ cytosolickej homeostázy Ca2+ v reakcii na veľké zvýšenie prílevu Ca2+ rovnako dobrá mdx vlákna ako u normálnych, aj keď tento prílev bol až 10-násobne vyšší ako prirodzene sa vyskytujúce hodnoty.

Korelácia medzi rýchlosťou zhášania Mn2+ a cytozolom [Ca2+] v prítomnosti 4-bróm-A23187

Otvorené symboly, symboly vyplnené normálnymi vláknami, mdx vlákna. Kľúč: deň merania. Vlákna boli získané z 11 normálnych a 3 mdx myši. Koncentrácie A23187: 25–75 n m .

Prežívanie vlákniny a prílev Mn 2+

Výskyt niektorých pomerne vysokých hodnôt prítoku Mn2+ v d1 naznačil, že u niektorých dochádzalo k abnormálne vysokému prítoku Ca2+. mdx a normálne vlákna. To nás podnietilo preskúmať prežitie vlákien. Z technických príčin však nebolo možné sledovať osud jednotlivých vlákien, kde bol meraný prítok Mn 2+. Museli sme sa teda spoľahnúť na štúdiu prežitia populácie vlákien. Šesť kultúr prebiehalo paralelne a počet zostávajúcich vlákien sa počítal od d0 do d3. Počítali sa len dobre predĺžené vlákna (čím sa udržiaval pokojový stav), nevykazujúce žiadne štrukturálne zmeny. Ako je znázornené na obrA, mdx vlákna vykazujú 10 % pokles v počte z d0 na d1, po ktorom nasleduje prudší pokles, takže prežívanie bolo znížené na 51 % v d2. Toto tempo poklesu sa následne spomalilo. Naopak, normálne vlákna vykazovali stabilný pokles o 10–12 % za deň (obr. 4A, bodkovaná čiara), takže prežitie v d2 bolo stále 78 %. Ak teda vezmeme za referenčnú mieru straty normálnych vlákien, mdx vlákna vykazovali nadmernú stratu 27 % (t. j. rozdiel medzi 78 a 51 %) od d0 do d2. Pre normálne vlákna prežívanie hladko klesalo napriek skutočnosti, že časť vlákien (8/27) vykazovala pri d1 hodnoty prítoku Ca2+ v rozsahu > 5 až 21 % min-1. Na obrA a B, štatistická významnosť (označená *) sa týka rozdielu medzi mdx a normálne vlákna.

Ak chcete zistiť, či prudký pokles prežitia mdx vlákna od d1 do d2 mohli byť zoslabené, vlákna boli izolované a udržiavané v médiu obsahujúcom jednu desatinu normálneho [Ca2+]o kultivačného média, t.j. 0,08 m m , za predpokladu, že zníženie [Ca2+]o by podobne znížilo prílev Ca 2+. Za týchto podmienok prežitie mdx vlákna pravidelne klesali z d0 na d3, ako je vidieť na obrBbez prudkého poklesu medzi d1 a d2. Prebytok mdx smrť vlákna z d0 na d2 sa teraz znížila z 27 % (pri 0,8 m m [Ca2+]o) na 10 %. Pri normálnych vláknach zníženie vonkajšieho [Ca2+] neovplyvnilo priebeh doby prežitia. Na uľahčenie porovnania medzi podmienkami Ca2+ 0,8 a 0,08 m m sú údaje z d1, d2 a d3 na obr.A a B boli zostavené na obrC kde sa štatistická analýza teraz týka rozdielov v prežívaní v dvoch [Ca2+]o médiá.

Pri návrate do normálu [Ca 2+]oani jeden typ vlákna nevykazoval žiadnu náhlu významnú zmenu miery prežitia. Oba profily prežitia od d0 do d4 sa približujú k hladkému exponenciálnemu poklesu s časovými konštantami 225 pre normálne a 147 hodín pre mdx vlákna. Teda aj pri nízkych [Ca 2+ ]o, odstránenie mdx vlákna postupovali asi 1,5-krát rýchlejšie ako pri normálnych vláknach. Pri porovnaní prežívania v d2 na obr.4A a Bje zrejmé, že časť bunkovej smrti (≈jedna tretina) pozorovaná v 0,8 m m [Ca2+]o došlo aj pri 0,08 m m, keď sa veľkosť vstupu Ca 2+ úmerne zmenšila. Od d4 do d5 však nebolo možné zistiť žiadne ďalšie významné zníženie prežitia ani pre jeden typ vlákna.

Ca 2+ kanály nezávislé na napätí: charakteristiky a priebeh od d0 do d5

Aktivita kanála bola pozorovaná na FDB vláknach izolovaných kolagenázou technikou patch clamp (konfigurácia pripojená k bunke) pri udržiavacom potenciáli -60 mV (obr. 5A). Výsledky zobrazené v tabuľke 2 udávajú jednokanálovú vodivosť a reverzný potenciál pre rôzne roztoky v náplasťovej pipete. The ja-V vzťah je prísne ohmický, nevykazuje žiadne známky aktivácie alebo deaktivácie napätia a je identický mdx a normálne vlákna (nie sú zobrazené). Katiónová selektivita je slabá a umožňuje toky Ca2+, Ba2+, Mn2+ a Na+ (a najpravdepodobnejšie K+ zvnútra bunky). Odhadovaný PCa/PNa pomer (Lee & Tsien, 1984) je okolo 0,7. Okrem toho je pravdepodobnosť otvorenia značne znížená trojmocnými katiónmi (napr. 50 uM La3+). Otvorené časy ukázali Poissonovu distribúciu, ktorá sa približuje k exponenciálnemu rozpadu, ktorého časová konštanta je tiež uvedená v tabuľke 2. Tieto charakteristiky sa silne podobajú charakteristikám mechanosenzitívnych kanálov, ktoré už boli opísané v podobných prípravkoch (Franco-Obregón & Lansman, 1994). Skutočne, keď sa na náplasti aplikovalo jemné sanie, pozorovali sme vo všetkých testovaných vláknach (10 mdx a 10 C57), významné zvýšenie priemerných otvorených pravdepodobností, ktoré predstavovalo 69 ± 8 % a 53 ± 8 % (s.e.m.), pre mdx a vlákna C57 (bez významného rozdielu medzi myšacími líniami, P/ 0.7, t test). Je zaujímavé, že mechanosenzitivita týchto kanálov bola prítomná v neprítomnosti dystrofínu. Všetky tieto vlastnosti hradlovania boli identické v normálnych a mdx vlákna. Okrem toho sme pozorovali, že zostali nezmenené od d0 do d5.

Na rozdiel od tejto stability sa výskyt týchto kanálov a otvorené pravdepodobnosti líšia medzi normálnymi a mdx vlákna a vykazovali typické vzory zmien z d0 na d5. Výskyt kanálikov sa odhadol ako percento vlákien, ktoré pri odbere vzorky náplasťovou pipetou vykazujú aktivitu kanálika (z každého vlákna sa odoberala vzorka iba raz). Čoskoro po izolácii bola aktivita kanála zaznamenaná v 80 % vlákien, a to v normálnych aj mdx vlákna. Ako je znázornené na obrB, výskyt plynule klesal z d0 na d5, ale pokles bol vždy menej výrazný mdx vlákna. Nakoniec do d5 výskyt klesol na 20 a 32 % pre normálne a mdx vlákna, resp.

Obrázok 5C udáva zmenu priemernej pravdepodobnosti otvorenia kanála od d0 do d5. Pri d0 sú hodnoty pre normálne a mdx vlákna sú veľmi podobné tým, ktoré boli uvedené vyššie, s významným rozdielom medzi týmito dvoma typmi vlákien. Prekvapivo sa pre oba typy vlákien priemerná pravdepodobnosť otvorenia takmer zdvojnásobila pri d1 a obnovila hodnoty d0 o d3, pričom potom zostala stabilná. Pri d5 je priemerná hodnota mdx vláknina bola asi dvojnásobná v porovnaní s normálnou vlákninou (P < 0,05). Tieto prechodné zmeny ešte lepšie ilustrujú histogramy otvorených pravdepodobností od d0 do d5 (obr. 6). V d0 hodnoty nepresiahli 0,1, kým v d1 boli hodnoty pre mdx vlákna sa šíria až do 0,27. Postupne sa obe distribúcie opäť zúžili a obnovili svoje vzory d0 o d5.

Vzorec zmeny z d0 na d5 distribúcie otvorených pravdepodobností napäťovo necitlivých Ca2+ kanálov

Otvorené stĺpce, stĺpce naplnené normálnymi vláknami, mdx vlákna.

Integráciou aktuálnych záznamov počas 120 s pozorovania sa vypočítalo množstvo náboja (pAs) prechádzajúceho cez membránovú náplasť, pričom sa použila náplasťová pipeta naplnená 110 m m CaCl.2. Ako je vidieť na ObrDu oboch typov vlákna bol pozorovaný veľký nárast v d1, po ktorom nasledoval progresívny návrat k hodnotám d0. Pre každý deň, hodnoty pre mdx vlákna boli asi dvojnásobné v porovnaní s normálnymi vláknami, s výnimkou d1, keď sa priemerné množstvo náboja strojnásobilo mdx.

Napriek veľkému rozdielu v experimentálnych podmienkach odhady prílevu Ca2+ buď technikou zhášania fluorescencie Mn2+ (obr. 1) alebo elektrickými meraniami s náplasťovou pipetou naplnenou Ca2+ (obr. 5 a obr. 6 ) poskytujú pozoruhodne konzistentné informácie o troch bodoch: (1) veľké zvýšenie prílevu Ca2+ sa vyvinulo v d1 (2) sprevádzali to veľké rozdiely medzi vláknami v rovnakom období d1-d2 (3) a progresívny návrat k nízkym hodnotám d0 nastal v priebehu nasledujúcich 2 dní (d2-d4). Avšak na rozdiel od meraní nábojov prechádzajúcich cez náplasťové pipety, ktoré boli systematicky vyššie mdx vlákna (obr. 5D), odhad prítoku Ca2+ pomocou rýchlosti zhášania Mn2+ nezistil žiadny rozdiel v d0, d4 a d5 (obr. 1). Myslíme si, že posledné merania lepšie odzrkadľujú fyziologickú situáciu, pretože boli získané v takmer fyziologických podmienkach (v prítomnosti 140 mm Na+), zatiaľ čo technika náplasti umelo zosilňovala tok Ca2+, pretože pipety boli naplnené 110 mm Ca 2+.


Diskusia

Hoci vápnik je hlavnou signálnou dráhou riadiacou bunkové procesy senzorických neurónov, účinky poškodenia periférnych nervov na [Ca2+]c sa skúmali len minimálne. V tejto štúdii demonštrujeme, že axonálne poškodenie znižuje pokojové koncentrácie vápnika. Tento pokles je väčší v priamo axotomizovaných neurónoch ako v susedných neurónoch vystavených degenerujúcim axonálnym segmentom. Vplyv poranenia nie je jednotný medzi typmi neurónov, ale je dominantný v jednotkách, o ktorých sa predpokladá, že majú nenociceptívnu modalitu, ako naznačuje veľký somatický priemer a necitlivosť na kapsaicín.

Nie sú nám známe iné správy o pokojovom [Ca 2+ ] c pri bolestivých neuropatických stavoch, okrem experimentálneho diabetes mellitus. Hoci niektoré štúdie diabetu vyvolaného streptozotocínom zistili zvýšený pokojový [Ca2+]c,23,24 význam pre traumatickú alebo zápalovú neuropatiu je neistý. Napríklad cukrovka je spojená so zvýšenými napäťovo aktivovanými vápnikovými prúdmi v membráne neurónov DRG,31zatiaľ čo sme zistili, že traumatická neuropatia tieto prúdy znižuje.12,13 Existujú tiež kontrastné správy, ktoré ukazujú nezmenený pokojový senzorický neurón [Ca2+] c u diabetických potkanov vyvolaných streptozotocínom32–34a u spontánne diabetického kmeňa potkanov.35

Reakcia [Ca2+]c na kapsaicín

Naším zámerom pri skúmaní odpovede na kapsaicín bolo kategorizovať bunky podľa senzorickej modality.17Potvrdili sme tiež EC50 pre [Ca2+]c odpoveď na kapsaicín v rozsahu 55–72 nm,36,37čo je oveľa menej ako 350–728 nm nevyhnutné na vytvorenie membránového prúdu.38–41Senzorické neuróny exprimujú kapsaicínový receptor TRPV1 na endoplazmatickom retikule,42takže uvoľnenie vápnika uloženého v endoplazmatickom retikule43môže vysvetliť reakcie na nízke koncentrácie kapsaicínu, ktoré sme pozorovali. Na podporu nášho presvedčenia, že [Ca2+]c odpoveď na kapsaicín je platným indikátorom nociceptívnej modality, sme zaznamenali vyššiu mieru odozvy v malých bunkách, ktoré majú tendenciu byť nociceptormi. Okrem toho sa miera odpovede podstatne znížila v axotomizovaných neurónoch L5 DRG po SNL, ale zvýšila sa v L4, čo je v súlade s imunohistochemickými pozorovaniami expresie TRPV1. s tými, ktoré sú kategorizované iba podľa veľkosti, môže byť spôsobené nevysvetliteľným účinkom kapsaicínu na kalibráciu ionofóru. Napriek tomu účinky poranenia medzi skupinami pretrvávali v bunkách ošetrených týmto spôsobom.

Technika merania [Ca 2+ ] c

Stanovenie pokojového [Ca 2+ ] c je vysoko citlivé na technické detaily. Použitie pomerového indikátora, ako je Fura-2, do značnej miery koriguje odchýlky v naplnení farbiva, bielenie alebo rozdiely vo fluorescenčnom signáli v dôsledku hrúbky buniek. Zaznamenali sme podstatnú variabilitu medzi neurónmi v Rmin, Rmax a p. To si vyžaduje určenie kalibračných parametrov pre každý neurón, ak sa [Ca 2+ ] c má porovnávať medzi bunkami, hoci spriemerované kalibračné parametre môžu byť primerané, ak sa porovnávajú opakované merania pre danú bunku (napr. odpoveď na agonistu).

Technické rozdiely môžu čiastočne vysvetliť široký rozsah pokojových [Ca 2+ ] c zaznamenaných pre senzorické neuróny, ktoré sa rozprestierajú od 60 do 207 nm. výber Kd, vek zvieraťa47a variabilita veľkosti neurónov a senzorická modalita populácie vzorky, ako sme ukázali v súčasnej štúdii. Naše zistenie vyššieho pokojového [Ca 2+] c v senzorických neurónoch s veľkým priemerom ako v malých neurónoch kontrastuje s predchádzajúcimi zisteniami u myší32,49 ale je v súlade s nálezmi u potkanov.24

Potenciálne mechanizmy depresie [Ca 2+ ] c po úraze

Cytosolický vápnik je regulovaný vyváženým pôsobením rôznych membránových procesov, ktoré vápnik získavajú, ukladajú a vylučujú. Hoci vstup vápnika cez napäťovo riadené vápnikové kanály neovplyvňuje [Ca2+]c neaktívneho neurónu,50prítok vápnika cez napäťovo nezávislé kanály regulované zásobami vápnika (kapacitný vstup vápnika) je aktívny v pokoji a citlivý na pokojový membránový potenciál .50,51Vychytávanie do endoplazmatického retikula cez pumpa sarkoplazmatického alebo endoplazmatického retikula kalcium-adenozíntrifosfatázová pumpa a vypudzovanie vápnika z bunky plazmatickou membránou kalciová adenozíntrifosfatázová pumpa regulujú pokojové [Ca 2+] c ,52 a mitochondrie tiež sekvestrujú vápnik v neaktívnom neuróne.53Vo väčšine senzorických neurónov je plazmalemálny Na + –Ca 2+ výmenník je konštitutívne aktívny, takže odstraňovanie extracelulárneho Na + zvyšuje pokojový [Ca 2+ ] c .54 Pokles pokojového [Ca 2+ ] c po poranení periférnych nervov môže byť výsledkom poruchy ktoréhokoľvek z týchto regulačné procesy, ale tieto neboli preskúmané.

Odstránenie neurotrofínov odvodených od cieľa môže byť spúšťačom depresie [Ca2+]c, pretože nervový rastový faktor,55neurotrofický faktor odvodený od mozgu a neurotrofín-356 podporujú pokojový [Ca2+]c. Nervový rastový faktor v podviazanom L5 DRG sa však obnoví po 2 dňoch57 a expresia neurotrofického faktora odvodeného z mozgu je zvýšená po poranení nervu.58,59 Alternatívnou príčinou depresívneho pokoja [Ca 2+ ] c môže byť znížená aktivita neurónov, pretože aktivácia neurónov zvyšuje pokojové [Ca 2+ ] c .60,61 Znížená aferentná doprava v dôsledku axotómie alebo nepoužívania končatiny v kombinácii s poranením vyvolaným útlmom napäťovo aktivovaných vápnikových prúdov12,13 môže znížiť cytoplazmatickú záťaž vápnikom. Hoci sa spontánna aktivita vyvíja u poškodených neurónov DRG,8,62 je to typicky veľmi nízke.63,64 Normálne alebo vyššie hladiny pokojového [Ca2+] c v neurónoch potkanov SNL, ktorým chýbala hyperalgézia, môžu odrážať obzvlášť vysoké hladiny spontánnej aktivity v týchto predmetoch. Rozdiely, ktoré sme zaznamenali medzi predpokladanými nociceptívnymi a nízkoprahovými neurónmi, môžu byť tiež spôsobené rozdielmi v neuronálnej aktivite medzi týmito kategóriami modality.

Možné dôsledky zníženia [Ca 2+ ] c

Úlohu zníženého pokojového [Ca2+]c pri vytváraní neuropatickej bolesti podporuje naše pozorovanie normálneho alebo zvýšeného pokojového [Ca2+]c u malého počtu potkanov bez hyperalgézie po SNL. Hoci funkčný dôsledok dynamických [Ca2+]c prechodných javov je dobre známy, úloha pokojového [Ca2+]c bola preštudovaná menej. V rôznych neurónových tkanivách znížený [Ca2+]c urýchľuje bunkovú stratu, vrátane programovanej bunkovej smrti apoptózou.60,61,65DRG neurónová strata bola zaznamenaná ako znak neuropatie po SNL,66,67a indukovaná bunková aktivita môže zabrániť bunkám strata po axotómii v centrálnom nervovom systéme, pravdepodobne zvýšením pokojového [Ca 2+ ] c .68Preto môže nami pozorovaný pokles pokojového [Ca 2+ ] c priamo viesť k strate senzorických neurónov po poranení.

Druhou úlohou pokojového [Ca2+]c je kontrola odozvy na stimuláciu ligandom. Zvýšený kľudový [Ca 2+ ] c zoslabuje receptorom spúšťanú vápnikovú signalizáciu v lymfocytoch69 a mikrogliách centrálneho nervového systému.70 V DRG neurónoch zvýšená [Ca 2+ ] c inaktivuje odpovede na kapsaicín.37,38,71Naproti tomu je odozva na teplo zosilnená, keď [Ca2+]c sa zvyšuje kapsaicínom alebo ionofórom vápnika,72ale toto sa nezistí po zvýšení [Ca2+]c membránovou depolarizáciou.73Depresívny pokojový [Ca2+]c, ako sme namerali v senzorických neurónoch po poranení môže teda modulovať transdukciu aktivácie membránového receptora na intracelulárne vápnikové signály pre široký rozsah ligandov a stimulov, vrátane katecholamínov, purínov, pH a zápalových mediátorov, ako je bradykinín, komplement a cytokíny. Zmenená expresia receptorov však môže mať konkurenčný vplyv, ako je to v prípade zmien v reakcii na kapsaicín vyvolaných poranením meraných v tejto štúdii. Nízka pokojová hladina [Ca 2+ ] c môže sama osebe vyvolať komplexné genetické účinky, zvýšiť expresiu indukovateľnej syntázy oxidu dusnatého v chondrocytoch a zároveň potlačiť syntézu cyklooxygenázy II74 a zvýšiť expresiu sodíkových kanálov v povrchovej membráne chromafinných buniek nadobličiek.75

Nakoniec neurónovú aktivitu modulujú enzymatické signálne kaskády citlivé na vápnik, ako je kalmodulín, fosfatázy a proteínkinázy A a C. Prostredníctvom regulácie vápnikom aktivovaných K + kanálov76 a hyperpolarizáciou aktivovaných katiónových kanálov77, pokojový [Ca2+]c riadi excitabilitu membrány a aktivitu neurónov. Vápnik/kalmodulín-dependentná proteínkináza II má obzvlášť rôznorodé ciele fosforylácie a môže byť dôležitou dráhou generujúcou funkčné a genetické zmeny z posunov v pokojovom [Ca2+] c .78


6. Zacielenie na gény transportujúce Ca2+ sarkoplazmatického retikula na zlepšenie kontraktility

Veľkú pozornosť venovali perspektívam génovej terapie srdcového zlyhania, najmä obnovy transportu Ca2+. 46, 53, 110–112 Údaje zo zlyhávajúcich ľudských sŕdc naznačujú, že pokles transportu Ca2+ SR je zodpovedný za frekvenciu negatívnej sily pozorovanú v zlyhávajúcich srdciach. Nedávne štúdie sa preto zamerali na obnovenie aktivity pumpy SERCA, buď adenovírusovým prenosom génu SERCA2a alebo inhibíciou PLB. Štúdie adenovírusového génového prenosu ukázali, že nadmerná expresia SERCA2a v zlyhávajúcich ľudských komorových myocytoch zvýšila transport Ca2+ a obnovila rýchlosť kontrakcie a relaxácie. Negatívna frekvenčná odpoveď bola normalizovaná v kardiomyocytoch nadmerne exprimujúcich SERCA2a. 47 Povzbudení týmito in vitro V štúdiách Hajjar a spolupracovníci vyvinuli techniku ​​​​založenú na katétri na zavedenie génov do myokardu. 46, 53, 54, 111, 112 SERCA2a génový prenos v potkanom modeli hypertrofie tlakového preťaženia (kde boli znížené hladiny SERCA2a a bola evidentná závažná kontraktilná dysfunkcia) obnovil systolickú aj diastolickú dysfunkciu na normálnu úroveň. Nadmerná expresia SERCA2a znížila veľkosť ľavej komory a obnovila sklon vzťahu end-diastolický tlak-rozmer na kontrolné hladiny. ďalej SERCA2a prenos génu sa použil na odstránenie ventrikulárnych arytmií v modeli ischemického reperfúzneho (I/R) poškodenia u potkanov. 113, 114 Nadmerná expresia SERCA2a významne znížila ventrikulárne arytmie počas I/R a o 24 hodín neskôr znížila veľkosť infarktu a zlepšila zhrubnutie steny v prednej stene. Tieto štúdie naznačujú, že zníženie diastolického Ca2+ a lepšie zaobchádzanie s intracelulárnymi iónmi sú spojené so zlepšeným prežitím kardiomyocytov. Preto sa zdá, že obnovenie transportu Ca2+ zvýšením aktivity SERCA2a je rozhodujúce pre udržanie srdcovej inotrofie a pre prevenciu patologických účinkov preťaženia Ca2+.

Ukázalo sa, že ablácia fosfolambanu zabraňuje štrukturálnym a funkčným abnormalitám u myších modelov. 8, 115 Preto boli testované stratégie na potlačenie inhibície PLB a zvýšenie aktivity SERCA. Prístupom na zvýšenie aktivity pumpy SERCA je zníženie hladín PLB. Del Monte a kol. 116 ukázali, že adenovírusový génový prenos antisense PLB v zlyhávajúcich ľudských kardiomyocytoch obnovil kontraktilitu, manipuláciu s Ca2+ a silovú frekvenčnú odozvu. Okrem toho bol na škrečkoch BIO14.6 CM testovaný pseudofosforylovaný mutantný PLB peptid (S16EPLN) (vykazujúci progresívne štádium dilatačnej kardiomyopatie a srdcového zlyhania). Expresia mutantnej PLB zvýšila vychytávanie Ca2+ myokardu SR a potlačila progresívne poškodenie systolickej funkcie a kontraktility ľavej komory (LV) až do 28-30 týždňov. 117 Chronická inhibícia aktivity PLB však nemusí byť prospešná v ľudských srdciach, pretože strata funkcie PLB vedie u ľudí k dilatačnej kardiomyopatii v mladom veku. 87, 88 Tieto experimentálne štúdie nám poskytujú sľubné počiatočné výsledky a posúvajú nás o krok vpred smerom k manipulácii aktivity pumpy SERCA ako terapeutickej stratégie na záchranu kontraktilnej funkcie u chorých ľudských sŕdc. Tieto štúdie tiež naznačujú, že udržiavanie fyziologického pomeru SERCA/PLB môže byť nevyhnutné pre schopnosť srdca spĺňať rôzne fyziologické požiadavky.


Záver

Vápnikový ión má veľmi dôležitú úlohu v homeostáze. Je to obzvlášť dôležité pri fyziologických procesoch, ktoré sa vyskytujú počas vykonávania anestézie. Stáva sa tiež veľmi dôležitým aspektom pri vykonávaní kardiopulmonálneho bypassu a pri liečbe kriticky chorého pacienta na jednotke intenzívnej starostlivosti. Súčasný výskum tiež ukazuje, že vápenatý ión je integrálnou súčasťou procesov, ktoré spôsobujú analgéziu aj anestéziu. Hlavným odporúčaním týkajúcim sa úlohy anesteziológa pri liečbe pacientov s abnormálnym metabolizmom vápnika je pokúsiť sa obnoviť a udržať ionizovaný sérový vápnik v normálnych medziach.