Informácie

8.2: Izolácia alebo detekcia špecifickej sekvencie pomocou PCR - Biológia

8.2: Izolácia alebo detekcia špecifickej sekvencie pomocou PCR - Biológia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Zložky PCR reakcie

The Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je metóda replikácie DNA, ktorá sa vykonáva v skúmavke (t.j. in vitro). Tu sa „polymeráza“ týka enzýmu DNA polymerázy extrahovaného a purifikovaného z baktérií a „reťazová reakcia“ sa týka schopnosti tejto techniky produkovať milióny kópií molekuly DNA pomocou každej novoreplikovanej dvojitej špirály ako templátu na syntézu dvoch nové dvojité špirály DNA. PCR je preto veľmi účinný spôsob amplifikácie DNA.

Okrem schopnosti vytvárať veľké množstvá DNA existuje aj druhá charakteristika PCR, vďaka ktorej je mimoriadne užitočná. Pripomeňme, že väčšina DNA polymeráz môže pridať nukleotidy iba na koniec existujúceho reťazca DNA, a preto vyžaduje primer na spustenie procesu replikácie. Pre PCR sa používajú chemicky syntetizované priméry s približne 20 nukleotidmi. V ideálnej PCR priméry hybridizujú iba s ich presnou komplementárnou sekvenciou na templátovom reťazci (obrázok (PageIndex{3})).

Experimentátor môže teda presne kontrolovať, ktorá oblasť templátu DNA je amplifikovaná riadením sekvencie primerov použitých v reakcii.

Na uskutočnenie amplifikácie PCR experimentátor spojí do malej tenkostennej skúmavky (obrázok (PageIndex{4})) všetky potrebné zložky na replikáciu DNA, vrátane DNA polymerázy a roztokov obsahujúcich nukleotidy (dATP, dCTP dGTP, dTTP), templát DNA, primery DNA, pH pufor a ióny (napr. Mg2+) vyžadované polymerázou. Úspešné PCR reakcie boli uskutočnené s použitím iba jednej molekuly DNA ako templátu, ale v praxi väčšina PCR reakcií obsahuje mnoho tisíc templátových molekúl. Templátová DNA (napr. celková genómová DNA) už bola zvyčajne purifikovaná z buniek alebo tkanív použitím techník opísaných vyššie. Avšak v niektorých situáciách je možné vložiť celé bunky priamo do PCR reakcie na použitie ako templát.

Základným aspektom PCR je termálne cyklovanie, čo znamená vystavenie reakcie sérii presne definovaných teplôt (obrázok (PageIndex{5})). Reakčná zmes sa najskôr zahreje na 95 °C. To spôsobí roztavenie vodíkových väzieb medzi vláknami templátových molekúl DNA, príp denaturácia. Takto vznikajú dve jednovláknové molekuly DNA z každej dvojzávitnice (obrázok (PageIndex{6})). V ďalšom kroku (žíhanie), zmes sa ochladí na 45-65 °C. Presná teplota závisí od použitej sekvencie primérov a cieľov experimentu. To umožňuje tvorbu dvojvláknových helixov medzi komplementárnymi molekulami DNA, vrátane spojenia primérov s templátom. V poslednom kroku (rozšírenie) zmes sa zahreje na 72 °C. Toto je teplota, pri ktorej je konkrétna DNA polymeráza použitá v PCR najaktívnejšia. Počas predlžovania sa syntetizuje nové vlákno DNA, začínajúc od 3' konca priméru, pozdĺž dĺžky vlákna templátu. Celý proces PCR je veľmi rýchly, pričom každá teplotná fáza zvyčajne trvá 30 sekúnd alebo menej. Každý cyklus troch teplôt (denaturácia, žíhanie, predlžovanie) sa zvyčajne opakuje asi 30-krát, čím sa cieľová oblasť zosilní približne 230-zložiť. Všimnite si na obrázku, že väčšina novo syntetizovaných reťazcov v PCR začína a končí sekvenciami buď identickými alebo komplementárnymi so sekvenciami primérov; aj keď je niekoľko prameňov dlhších ako toto, sú v takej malej menšine, že ich možno takmer vždy ignorovať.

Obrázok (PageIndex{6}): PCR s očíslovanými tromi fázami tepelného cyklu. Templátový reťazec (modrý) sa replikuje z primérov (červený) s novo syntetizovanými reťazcami v zelenej farbe. Zelené vlákna lemované dvoma väzbovými miestami pre priméry sa budú zvyšovať exponenciálne prostredníctvom následných cyklov PCR. (Wikipedia-madprime-GFDL)

Najskoršie reakcie PCR používali polymerázu z E. coli. Pretože vysoká teplota denaturačného kroku zničila enzým, po každom cykle sa musela pridať nová polymeráza. Aby sa to prekonalo, výskumníci identifikovali termostabilný DNA polymerázy ako napr Taq DNA pol, od Thermus acquaticus, teplomilná baktéria, ktorá žije v horúcich prameňoch. Taq a podobné termostabilné polymerázy z iných horúcich prostredí sú schopné zostať funkčné v opakovaných cykloch amplifikácie. Taq polymeráza zvyčajne nemôže amplifikovať fragmenty dlhšie ako približne 3 kbp, ale za určitých špecializovaných podmienok môže PCR amplifikovať fragmenty až do približne 10 kbp. Iné polymerázy, buď samotné alebo v kombinácii s Taq, sa používajú na zvýšenie dĺžky amplifikovaných fragmentov alebo na zvýšenie presnosti replikácie.

Po dokončení tepelnej cyklizácie (amplifikácie) sa alikvot z PCR reakcie zvyčajne nanesie na an elektroforetický gél (opísané nižšie), aby sa určilo, či sa fragment DNA s očakávanou dĺžkou úspešne amplifikoval alebo nie. Pôvodná templátová DNA bude zvyčajne taká zriedená, že na géli nebude viditeľná, iba amplifikovaný produkt PCR. Prítomnosť ostrého pásu očakávanej dĺžky naznačuje, že PCR bola schopná zosilniť svoj cieľ. Ak bolo účelom PCR otestovať prítomnosť konkrétnej templátovej sekvencie, je to koniec experimentu. V opačnom prípade môže byť zostávajúci produkt PCR použitý ako východiskový materiál pre množstvo iných techník, ako je sekvenovanie alebo klonovanie.

Aplikácia PCR: Aféra StarLink

PCR je veľmi citlivá (to znamená, že môže amplifikovať veľmi malé počiatočné množstvá DNA) a špecifická (to znamená, že môže amplifikovať iba cieľovú sekvenciu zo zmesi mnohých sekvencií DNA). Vďaka tomu je PCR dokonalým nástrojom na testovanie toho, či je geneticky modifikovaná kukurica prítomná v spotrebiteľských produktoch na regáloch supermarketov. Hoci v súčasnosti (2013) je 85 % kukurice v Spojených štátoch geneticky modifikovaných a obsahuje gény, ktoré vládne regulačné orgány schválili na ľudskú spotrebu, už v roku 2000 environmentálne skupiny ukázali, že kmeň geneticky modifikovanej kukurice, ktorý bol schválený len pre Používa sa ako krmivo pre zvieratá, bol primiešaný do kukurice používanej pri výrobe potravín pre ľudí, ako sú taco škrupiny.

Na tento účel skupiny zakúpili taco škrupiny z obchodov v oblasti Washingtonu DC, extrahovali DNA z taco škrupín a použili ju ako templát v reakcii PCR s primérmi špecifickými pre nepovolený gén (Cry9C). Ich podozrenie sa potvrdilo, keď tento produkt PCR nechali naniesť na agarózový gél a videli pás očakávanej veľkosti. PCR test dokázal odhaliť jedno transgénne zrno v celom bušli kukurice (1 na 100 000). Spoločnosť (Aventis), ktorá predávala transgénne semeno farmárom, musela zaplatiť za zničenie veľkého množstva kukurice a bola terčom skupinovej žaloby nahnevaných spotrebiteľov, ktorí tvrdili, že im ochoreli z taco škrupín. Hoci sa nikdy nepreukázali žiadne legitímne prípady ujmy a žalobcom bolo priznaných 9 miliónov dolárov, z ktorých 3 milióny išli na právne poplatky, a zvyšok rozsudku išiel spotrebiteľom vo forme kupónov na taco škrupiny. Aféra poškodila spoločnosť a odhalila slabosť v spôsobe, akým sa v tom čase v Spojených štátoch zaobchádzalo s geneticky modifikovanými plodinami.


8.2: Izolácia alebo detekcia špecifickej sekvencie pomocou PCR - Biológia

Hlavným cieľom tejto práce bolo porovnať metódy izolácie DNA v plesniach rodu Mucorales s osobitným zreteľom na množstvo a čistotu získanej DNA. Získaná DNA bola potom amplifikovaná špecifickou real-time PCR.

Dizajn

Päť postupov extrakcie DNA sa vykonalo v skrini biologickej bezpečnosti triedy 2 vo vyhradenej miestnosti s vhodnými preventívnymi opatreniami pre biologickú bezpečnosť a vhodnými metódami likvidácie biologického odpadu. Celkom 6 Mucorales boli použité klinické kmene.

Výsledky

Z hľadiska koncentrácie a čistoty metódy A ukázali veľké množstvo DNA huby, zatiaľ čo metódy E uvádzajú čistú DNA huby s R260/280 1,7 blízko optimálnej 1,8. Množstvo DNA dosahuje štatistický rozdiel pri teste ANOVA s hodnotou p 0,0005

Záver

Celkovo bola metóda E najúčinnejšou metódou pri extrakcii DNA z kultúr húb v porovnaní s inými metódami vzhľadom na čas, náklady, technickú odbornosť a prístrojové vybavenie. Použitie tohto testu umožní výskumníkom rýchlo získať DNA z húb na použitie v molekulárnych testoch


Molekulárna analýza DNA

V tejto podkapitole načrtneme niektoré zo základných metód používaných na separáciu a vizualizáciu špecifických fragmentov DNA, ktoré sú zaujímavé pre vedcov. Niektoré z týchto metód nevyžadujú znalosť kompletnej sekvencie molekuly DNA. Pred príchodom rýchleho sekvenovania DNA boli tieto metódy jediné dostupné na prácu s DNA, no stále tvoria základný arzenál nástrojov používaných molekulárnymi genetikmi na štúdium reakcií tela na mikrobiálne a iné choroby.

Sondovanie nukleových kyselín

Molekuly DNA sú malé a informácie obsiahnuté v ich sekvencii sú neviditeľné. Ako výskumník izoluje konkrétny úsek DNA alebo keď ho izoluje, zistí, z akého organizmu je, aká je jeho sekvencia alebo aká je jeho funkcia? Jedna metóda na identifikáciu prítomnosti určitej sekvencie DNA využíva umelo skonštruované kúsky DNA nazývané sondy. Sondy možno použiť na identifikáciu rôznych bakteriálnych druhov v prostredí a na klinickú detekciu patogénov je teraz dostupných mnoho DNA sond. Napríklad DNA sondy sa používajú na detekciu vaginálnych patogénov Candida albicans, Gardnerella vaginalisa Trichomonas vaginalis.

Na skríning genómovej knižnice na konkrétny gén alebo sekvenciu, ktorá nás zaujíma, musia výskumníci o tomto géne niečo vedieť. Ak majú výskumníci časť sekvencie DNA pre požadovaný gén, môžu navrhnúť a DNA sonda, jednovláknový fragment DNA, ktorý je komplementárny k časti požadovaného génu a líši sa od iných sekvencií DNA vo vzorke. DNA sonda môže byť syntetizovaná chemicky v komerčných laboratóriách, alebo môže byť vytvorená klonovaním, izoláciou a denaturáciou DNA fragmentu zo živého organizmu. V každom prípade musí byť DNA sonda označená molekulárnou značkou alebo majákom, ako je rádioaktívny atóm fosforu (ako sa používa na autorádiografia) alebo fluorescenčné farbivo (ako sa používa vo fluorescenčných). in situ hybridizácia alebo FISH), aby bolo možné vidieť sondu a DNA, na ktorú sa viaže (obrázok 1). Vzorka DNA, ktorá sa má sondovať, musí byť tiež denaturovaná, aby bola jednovláknová, aby sa sonda jednovláknovej DNA mohla napojiť na vzorku jednovláknovej DNA v miestach, kde sú ich sekvencie komplementárne. Aj keď sú tieto techniky cenné na diagnostiku, ich priame použitie na spúte a iných telesných vzorkách môže byť problematické kvôli komplexnej povahe týchto vzoriek. DNA sa často musí najskôr izolovať z telesných vzoriek pomocou metód chemickej extrakcie predtým, ako sa DNA sonda môže použiť na identifikáciu patogénov.

Obrázok 1. Sondy DNA možno použiť na potvrdenie prítomnosti podozrivého patogénu vo vzorkách pacientov. Tento diagram ilustruje, ako možno použiť DNA sondu na hľadanie požadovaného génu spojeného s podozrivým patogénom.

Klinické zameranie: Karni, 2. časť

Tento príklad pokračuje v Karniho príbehu, ktorý sa začal v mikróboch a nástrojoch genetického inžinierstva.

Mierne symptómy podobné chrípke, ktoré Karni zažíva, môžu byť spôsobené ľubovoľným počtom infekčných agens. Okrem toho, niekoľko neinfekčných autoimunitných stavov, ako je roztrúsená skleróza, systémový lupus erythematosus (SLE) a amyotrofická laterálna skleróza (ALS), má tiež symptómy, ktoré sú v súlade s Karniho skorými príznakmi. V priebehu niekoľkých týždňov sa však Karniho symptómy zhoršili. Začala pociťovať bolesti kĺbov v kolenách, búšenie srdca a zvláštne ochabnutie tvárových svalov. Okrem toho ju trápil stuhnutý krk a bolestivé bolesti hlavy. Neochotne sa rozhodla, že je čas vyhľadať lekársku pomoc.

  • Poskytujú Karniho nové symptómy nejaké stopy o tom, aký typ infekcie alebo iného zdravotného stavu môže mať?
  • Aké testy alebo nástroje môže poskytovateľ zdravotnej starostlivosti použiť na určenie patogénu spôsobujúceho Karniho symptómy?

K príkladu Karni sa vrátime neskôr na tejto stránke.

Elektroforéza na agarózovom géli

Existuje množstvo situácií, v ktorých môže výskumník chcieť fyzicky oddeliť zbierku fragmentov DNA rôznych veľkostí. Výskumník môže tiež štiepiť vzorku DNA reštrikčným enzýmom za vzniku fragmentov. Výsledný vzor distribúcie veľkosti a fragmentov môže často poskytnúť užitočné informácie o sekvencii báz DNA, ktoré možno použiť, podobne ako skenovanie čiarového kódu, na identifikáciu jedinca alebo druhu, ku ktorému DNA patrí.

Gélová elektroforéza je technika bežne používaná na separáciu biologických molekúl na základe veľkosti a biochemických charakteristík, ako je náboj a polarita. Elektroforéza na agarózovom géli sa široko používa na separáciu DNA (alebo RNA) rôznych veľkostí, ktoré môžu byť generované štiepením reštrikčnými enzýmami alebo inými prostriedkami, ako je PCR (obrázok 2).

Vďaka svojej negatívne nabitej kostre je DNA silne priťahovaná ku kladnej elektróde. Pri elektroforéze na agarózovom géli je gél orientovaný horizontálne v tlmivom roztoku. Vzorky sa vložia do vzorkových jamiek na strane gélu, ktorá je najbližšie k negatívnej elektróde, a potom sa pretiahnu cez molekulárne sito agarózovej matrice smerom k pozitívnej elektróde. Agarózová matrica bráni pohybu väčších molekúl cez gél, zatiaľ čo menšie molekuly prechádzajú cez gél ľahšie. Vzdialenosť migrácie teda nepriamo koreluje s veľkosťou fragmentu DNA, pričom menšie fragmenty prechádzajú gélom na dlhšiu vzdialenosť. Veľkosti fragmentov DNA vo vzorke možno odhadnúť porovnaním s fragmentmi známej veľkosti v a rebríček DNA tiež spustiť na rovnakom géli. Na oddelenie veľmi veľkých fragmentov DNA, ako sú chromozómy alebo vírusové genómy, možno elektroforézu na agarózovom géli modifikovať periodickým striedaním orientácie elektrického poľa počas gélová elektroforéza s pulzným poľom (PFGE). In PFGEmenšie fragmenty sa môžu preorientovať a migrovať o niečo rýchlejšie ako väčšie fragmenty a táto technika tak môže slúžiť na oddelenie veľmi veľkých fragmentov, ktoré by inak putovali spolu počas štandardnej elektroforézy na agarózovom géli. V ktorejkoľvek z týchto elektroforéznych techník je možné rôznymi metódami detegovať umiestnenie fragmentov DNA alebo RNA v géli. Jednou z bežných metód je pridávanie etídium bromid, škvrna, ktorá sa vloží do nukleových kyselín na nešpecifických miestach a môže byť zviditeľnená pri vystavení ultrafialovému svetlu. Teraz sú k dispozícii iné škvrny, ktoré sú bezpečnejšie ako etídium bromid, potenciálny karcinogén.

Obrázok 2. Kliknutím zobrazíte väčší obrázok. (a) Proces elektroforézy na agarózovom géli. (b) Výskumník vkladá vzorky do gélu. (c) Táto fotografia ukazuje dokončenú elektroforézu na agarózovom géli. Rebríček DNA je umiestnený v dráhach 1 a 9. Sedem vzoriek je umiestnených v dráhach 2 až 8. Gél bol zafarbený etídium bromidom a fotografovaný pod ultrafialovým svetlom. (kredit a: úprava práce Magnusa Manskeho kredit b: úprava práce Ministerstva poľnohospodárstva USA kredit c: úprava práce Jamesa Jacoba)

Analýza polymorfizmu dĺžky reštrikčného fragmentu (RFLP).

Miesta rozpoznávania reštrikčných enzýmov sú krátke (dlhé len niekoľko nukleotidov), sekvenčne špecifické palindrómy a možno ich nájsť v celom genóme. Rozdiely v sekvenciách DNA v genómoch jednotlivcov teda povedú k rozdielom v distribúcii miest rozpoznávaných reštrikčnými enzýmami, ktoré možno po elektroforéze na agarózovom géli vizualizovať ako odlišné pásové vzory na géli. Polymorfizmus dĺžky reštrikčného fragmentu (RFLP) analýza porovnáva DNA pásy rôznych vzoriek DNA po reštrikčnom štiepení (obrázok 3).

Obrázok 3. Analýza RFLP sa môže použiť na diferenciáciu sekvencií DNA. V tomto príklade je normálny chromozóm štiepený na dva fragmenty, zatiaľ čo štiepením mutovaného chromozómu vzniká len jeden fragment. Malé červené šípky ukazujúce na dva rôzne chromozómové segmenty ukazujú umiestnenie rozpoznávacích miest reštrikčných enzýmov. Po digescii a elektroforéze na agarózovom géli pruhové vzory odrážajú zmenu tým, že ukazujú stratu dvoch kratších pruhov a zisk dlhšieho pruhu. (kredit: úprava práce Národným centrom biotechnologických informácií)

RFLP analýza má mnoho praktických aplikácií v medicíne a forenzná veda. Napríklad epidemiológovia používajú analýzu RFLP na sledovanie a identifikáciu zdroja špecifických mikroorganizmov zapojených do prepuknutia otravy jedlom alebo určitých infekčných chorôb. Analýza RFLP sa môže použiť aj na ľudskej DNA na určenie vzorov dedičnosti chromozómov s variantnými génmi, vrátane tých, ktoré sú spojené s dedičnými chorobami alebo na stanovenie otcovstvo.

Forenzní vedci používajú RFLP analýzu ako formu DNA odtlačky prstov, ktorý je užitočný na analýzu DNA získanej z miest činu, podozrivých a obetí. Vzorky DNA sa odoberajú, počet kópií molekúl vzorky DNA sa zvyšuje použitím PCRa potom podrobené štiepeniu reštrikčnými enzýmami a elektroforéze na agarózovom géli, aby sa vytvorili špecifické pásové vzory. Porovnaním vzorov páskovania vzoriek odobratých z miesta činu s tými, ktoré boli odobraté od podozrivých alebo obetí, môžu vyšetrovatelia definitívne určiť, či dôkazy DNA zozbierané na mieste činu po sebe zanechali podozriví alebo obete.

Southern Blots a modifikácie

Niekoľko molekulárnych techník využíva komplementaritu sekvencií a hybridizáciu medzi nukleovými kyselinami vzorky a DNA sondami. Typicky je sondovanie vzoriek nukleových kyselín v géli neúspešné, pretože keď sa sonda DNA vsiakne do gélu, vzorky nukleových kyselín v géli difundujú von. Na prenos nukleových kyselín na tenkú, kladne nabitú membránu vyrobenú z nitrocelulózy alebo nylonu sa teda bežne používajú blotovacie techniky. V Southern blot technika vyvinutá Sirom Edwinom Južná v roku 1975 sa fragmenty DNA vo vzorke najskôr oddelia elektroforézou na agarózovom géli a potom sa prenesú na membránu pomocou kapilárneho účinku (obrázok 4). Fragmenty DNA, ktoré sa viažu na povrch membrány, sú potom vystavené špecifickej jednovláknovej DNA sonde značenej rádioaktívnym alebo fluorescenčným molekulárny maják na pomoc pri detekcii. Southern bloty sa môžu použiť na detekciu prítomnosti určitých sekvencií DNA v danej vzorke DNA. Akonáhle je cieľová DNA v membráne vizualizovaná, výskumníci môžu vyrezať časť membrány obsahujúcu fragment, aby získali požadovaný fragment DNA.

Obrázok 4.V technike Southern blot sa fragmenty DNA najprv oddelia elektroforézou na agarózovom géli, potom sa prenesú kapilárnym pôsobením na nylonovú membránu, ktorá sa potom nasiakne DNA sondou označenou molekulárnym majákom pre ľahkú vizualizáciu.

Variácie Southern blot – dot blot, slot blot a spot blot – nezahŕňajú elektroforézu, ale namiesto toho koncentrujú DNA zo vzorky do malého miesta na membráne. Po hybridizácii s DNA sondou sa meria detekovaná intenzita signálu, čo umožňuje výskumníkovi odhadnúť množstvo cieľovej DNA prítomnej vo vzorke.

A kolónia blot je ďalšia variácia Southern blotu, v ktorej sú kolónie reprezentujúce rôzne klony v genómovej knižnici prenesené na membránu pritlačením membrány na kultivačný tanier. Bunky na membráne sa lyzujú a membrána sa potom môže testovať, aby sa určilo, ktoré kolónie v genómovej knižnici obsahujú cieľový gén. Pretože kolónie na platni stále rastú, bunky, o ktoré je záujem, môžu byť izolované z platne.

V Northern blotĎalšia variácia Southern blotu, RNA (nie DNA) je imobilizovaná na membráne a testovaná. Northern bloty sa typicky používajú na detekciu množstva mRNA vytvoreného prostredníctvom génovej expresie vo vzorke tkaniva alebo organizmu.

Microarray analýza

Ďalšia technika, ktorá využíva hybridizáciu medzi komplementárnymi sekvenciami nukleových kyselín, je tzv mikročipová analýza. Mikročipová analýza je užitočná na porovnanie vzorcov génovej expresie medzi rôznymi typmi buniek – napríklad bunky infikované vírusom verzus neinfikované bunky alebo rakovinové bunky verzus zdravé bunky (obrázok 5).

Typicky sa DNA alebo cDNA z experimentálnej vzorky ukladá na podložné sklíčko vedľa známych sekvencií DNA. Každé sklíčko môže obsahovať viac ako 30 000 rôznych typov fragmentov DNA. Odlišné fragmenty DNA (zahŕňajúce celú genómovú knižnicu organizmu) alebo cDNA fragmenty (zodpovedajúce úplnému komplementu exprimovaných génov v organizme) je možné jednotlivo naliať na podložné sklíčko.

Po uložení na podložné sklíčko je možné z týchto dvoch vzoriek izolovať genómovú DNA alebo mRNA na porovnanie. Ak sa izoluje mRNA, reverzne sa transkribuje na cDNA pomocou reverznej transkriptázy. Potom sa dve vzorky genómovej DNA alebo cDNA označia rôznymi fluorescenčnými farbivami (typicky červenou a zelenou). Značené vzorky genómovej DNA sa potom spoja v rovnakých množstvách, pridajú sa do mikročipu a nechajú sa hybridizovať s komplementárnymi bodmi na mikročipe.

Hybridizáciu vzoriek molekúl genómovej DNA možno monitorovať meraním intenzity fluorescencie na konkrétnych miestach na mikročipe. Rozdiely v množstve hybridizácia medzi vzorkami možno ľahko pozorovať. Ak sa nukleové kyseliny jednej vzorky hybridizujú s konkrétnym bodom na mikročipe, potom sa toto miesto bude javiť ako zelené alebo červené. Ak sa však nukleové kyseliny oboch vzoriek hybridizujú, škvrna sa bude javiť ako žltá v dôsledku kombinácie červeného a zeleného farbiva.

Hoci technológia microarray umožňuje holistické porovnanie medzi dvoma vzorkami v krátkom čase, vyžaduje si sofistikované (a drahé) detekčné vybavenie a softvér na analýzu. Kvôli nákladom je táto technológia zvyčajne obmedzená na výskumné prostredia. Výskumníci použili mikročipovú analýzu na štúdium toho, ako je ovplyvnená génová expresia v organizmoch, ktoré sú infikované baktériami alebo vírusmi alebo sú podrobené určitým chemickým úpravám.

Obrázok 5. (a) Sú znázornené kroky mikročipovej analýzy. Tu sa porovnávajú vzory génovej expresie medzi rakovinovými bunkami a zdravými bunkami. (b) Informácie z mikročipov možno vyjadriť ako tepelnú mapu. Gény sú zobrazené na ľavej strane rôzne vzorky sú zobrazené v spodnej časti. Gény exprimované iba v rakovinových bunkách sú zobrazené v rôznych odtieňoch červenej gény exprimované iba v normálnych bunkách sú zobrazené v rôznych odtieňoch zelenej. Gény, ktoré sú exprimované v rakovinových aj normálnych bunkách, sú znázornené žltou farbou.

Premýšľajte o tom

  • Z čoho pozostáva DNA sonda?
  • Prečo sa po gélovej elektroforéze štiepenia DNA používa Southern blot?

8.2: Izolácia alebo detekcia špecifickej sekvencie pomocou PCR - Biológia

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) bezpochyby predstavuje jedinú najdôležitejšiu techniku ​​v oblasti molekulárnej biológie súčasnosti. To, čo PCR dosahuje v technických termínoch, možno opísať veľmi jednoducho – umožňuje rýchlu a neobmedzenú amplifikáciu špecifických sekvencií nukleových kyselín, ktoré môžu byť prítomné vo veľmi nízkych koncentráciách vo veľmi zložitých zmesiach. Za menej ako desať rokov od svojho počiatočného vývoja sa stal kritickým nástrojom pre všetkých praktizujúcich molekulárnych biológov a poslúžil na to, aby priniesol molekulárnu biológiu do praxe mnohých iných oblastí biomedicínskych vied a mimo nej. Dôvody sú viaceré. Po prvé, PCR poskytuje maximálnu citlivosť a jednotlivé molekuly DNA možno detegovať a analyzovať na obsah sekvencie (Li a kol., 1988 Arnheim a kol., 1990). Po druhé, poskytuje maximálne rozlíšenie — všetky polymorfizmy, od zmien jednej bázy až po veľké preskupenia, možno rozlíšiť pomocou vhodného testu na báze PCR. Po tretie, je extrémne rýchly — pre mnohé aplikácie je možné prejsť od vzoriek hrubého tkaniva k výsledkom v rámci jedného pracovného dňa. Napokon, táto technika je prostriedkom demokracie – akonáhle sú zverejnené sekvencie páru oligonukleotidov, ktoré definujú konkrétnu PCR reakciu, ktokoľvek kdekoľvek s finančnými prostriedkami na nákup oligonukleotidov môže reprodukovať rovnakú reakciu na vzorkách podľa vlastného výberu. to je v protiklade s analýzami RFLP, v ktorých sú výskumníci často závislí od štedrosti iných, aby poskytli klony, ktoré sa majú použiť ako sondy. O princípoch a aplikáciách tejto techniky bolo publikovaných množstvo kníh a tisíce článkov v časopisoch [Erlich (1989) a Innis a kol. (1990) sú dva prvé príklady].

Hoci aplikácie PCR sú také rozmanité ako laboratóriá, v ktorých sa táto technika praktizuje, táto časť sa zameria výlučne na šesť všeobecných aplikácií, ktoré sú relevantné pre detekciu a typizáciu genetických variácií u myší. Štyri z týchto aplikácií sú založené na PCR amplifikácii konkrétnych lokusov, ktoré boli predtým charakterizované na úrovni sekvencie. V týchto prípadoch musia byť páry primérov zvolené tak, aby boli čo najšpecifickejšie pre príslušný lokus, aby sa predišlo artefaktom PCR produktov. K dispozícii sú počítačové programy, ktoré pomáhajú pri navrhovaní primérov (Lowe a kol., 1990 Dietrich a kol., 1992), ale ručná kontrola je zvyčajne postačujúca. Je potrebné dávať pozor, aby sa zabránilo samokomplementarite v rámci ktoréhokoľvek priméru a prítomnosti komplementárnych sekvencií medzi týmito dvoma primérmi. Potenciálne priméry by sa tiež mali skrínovať pomocou programu na porovnávanie sekvencií, aby sa predišlo homológii s vysoko opakovanými prvkami B1, B2 a L1 (pozri časť 5.4). Dĺžka základného náteru by mala byť aspoň 20 báz, obsah G:C by mal byť aspoň 50% a teplota topenia by mala byť aspoň 60°C.

Aj keď sú dodržané všetky tieto podmienky, stále je možné zistiť, že konkrétny pár primérov nebude správne fungovať pri amplifikácii špecifického lokusu do reprodukovateľného produktu, ktorý možno jasne odlíšiť od pásov na pozadí artefaktov. Existuje množstvo prístupov, ktoré je možné použiť na odstránenie takýchto problémov (Erlich, 1989 Innis et al., 1990), ale ak všetko ostatné zlyhá, jeden alebo oba priméry by sa mali nahradiť alternatívami odvodenými od iných susedných lemujúcich sekvencií, ktoré tiež vyhovujú pravidlá uvedené vyššie.

8.3.1 Polymorfizmy reštrikčných miest

8.3.1.1 Prehľad

Rýchle, vysoko účinné testy na báze PCR môžu byť navrhnuté tak, aby detegovali všetky RFLP — predtým definované analýzou Southern blot —, pokiaľ je pochopená povaha RFLP a sú dostupné sekvenčné informácie lemujúce skutočné polymorfné miesto. Pár PCR primérov, ktoré lemujú toto miesto, sa potom môže syntetizovať podľa práve opísaných pravidiel a testovať ich schopnosť amplifikovať špecifický produkt, ktorý možno ľahko identifikovať ako pás zafarbený etídiumbromidom pomocou gélovej elektroforézy.

Pri najjednoduchšom a najbežnejšom type RFLP znázornenom na obrázku 8.6 je polymorfizmus výsledkom rozdielu jedného nukleotidu, ktorý poskytuje rozpoznávacie miesto pre reštrikčný enzým v jednej alelickej forme a nie v druhej. Polymorfizmus tohto typu možno rýchlo detegovať (1) amplifikáciou oblasti okolo polymorfného miesta z každej vzorky (2) podrobením amplifikovaných materiálov príslušnému reštrikčnému enzýmu na krátku dobu štiepenia a (3) rozlíšením neštiepeného produktu PCR. z menších štiepených fragmentov gélovou elektroforézou. Výberom primerov, ktoré sú relatívne rovnako vzdialené a dostatočne vzdialené od polymorfného miesta, je možné ľahko rozlíšiť alelické formy na agarózových alebo polyakrylamidových géloch, ako je znázornené na obrázku 8.6.

Tento protokol založený na PCR poskytuje výsledky oveľa rýchlejšie a je oveľa jednoduchšie ho vykonať ako alternatíva Southern blot, ktorá vyžaduje blotovanie, značenie sondou, hybridizáciu a autorádiografiu. Pretože hlavným nákladom spojeným s PCR je počiatočné sekvenovanie lokusu a syntéza PCR primerov, je to tiež menej nákladné vo všetkých prípadoch, kde sa očakáva typovanie veľkého počtu vzoriek pre konkrétny príslušný lokus.

Dokonca aj RFLP spôsobené zložitejšími mutačnými udalosťami možno analyzovať pomocou PCR. Obrázok 8.7 znázorňuje logiku navrhovania stratégií PCR na detekciu delécií, inzercií, inverzií a translokácií. Jedinou požiadavkou je znalosť sekvencií, ktoré obklopujú body zlomu spojené s každou konkrétnou genetickou udalosťou.

8.3.1.2 Ń'-nepreložené regióny ako zdroj mapovania

Dôležitým zdrojom na identifikáciu nových polymorfizmov reštrikčných miest, ktoré môžu byť typizované pomocou PCR, sú 3'-nepreložené (3'-UT) oblasti transkriptov. Tieto oblasti nie sú pod rovnakými selektívnymi obmedzeniami ako kódujúce sekvencie a sú často rovnako polymorfné ako náhodné netranskribované genómové oblasti. Avšak 3'-UT oblasti sú priamymi markermi pre 3' konce génov. Zvyčajne nie sú prerušené intrónmi a sú často dostatočne odlišné medzi rôznymi členmi génovej rodiny, aby umožnili lokusovo špecifickú analýzu.

Takmer všetky cDNA knižnice sú konštruované z cDNA molekúl, ktoré boli iniciované primárnou aktiváciou z poly(A) konca prítomného na 3' konci mRNA. Pre všetky klony získané z týchto knižníc je jednoduché získať informácie o sekvencii pre niekoľko stoviek párov báz 3'-UT oblasti priamo susediacej s poly(A) chvostom. Táto sekvenčná informácia sa môže použiť na navrhnutie páru PCR primérov, ktoré sa môžu následne použiť na amplifikáciu a sekvenovanie rovnakej oblasti z iného kmeňa alebo druhu myší, ako napr. M. spretus alebo M. m. kastaneus. Pri porovnaní 2312 bp prítomných v 3'-UT oblastiach odvodených z 22 náhodných myších cDNA klonov, Takahashi a Ko (1993) zistili celkovú mieru polymorfizmu jednu zmenu na každých 92 bp. Tieto zmeny jednej bázy sa preniesli do polymorfizmov reštrikčných miest v deviatich z 22 analyzovaných klonov. S primérmi, ktoré sú už k dispozícii, tieto novo identifikované polymorfizmy poskytujú PCR markery na priame mapovanie zodpovedajúcich génov, ktoré sú nerozoznateľné vo svojich kódujúcich oblastiach.

8.3.2 Detekcia alelických zmien definovaných jednotlivými pármi báz

8.3.2.1 Hybridizácia a zmeny jedného páru báz

Hoci PCR detekcia RFLP je zlepšením oproti detekcii Southern blot, skutočná výhoda PCR spočíva v jej takmer univerzálnej schopnosti rozlišovať alely líšiace sa zmenami jednej bázy, aj keď nevytvárajú ani neničia žiadne známe reštrikčné miesto. V skutočnosti bude väčšina náhodných zmien bázových párov typu non-RFLP a pred príchodom PCR neexistovali žiadne účinné prostriedky, ktorými by bolo možné tieto alely ľahko sledovať vo veľkom počte vzoriek. Práve toto obmedzenie viedlo pôvodne k vývoju protokolu PCR (Saiki et al., 1986).

Neschopnosť detegovať zmeny jednej bázy na Southern blotoch bola dôsledkom tak teoretických obmedzení, ktoré sú vlastné procesu hybridizácie, ako aj praktických obmedzení v citlivosti sond nukleových kyselín a eliminácii šumu pozadia. Pri analýze Southern blot je citlivosť, pri ktorej možno detegovať cieľové sekvencie v rámci definovanej vzorky, priamo úmerná dĺžke sondy. Napríklad 1 kb sonda bude hybridizovať s desaťnásobným množstvom cieľovej sekvencie ako 100 bp sonda (má rovnakú špecifickú aktivitu), čo povedie k signálu, ktorý je desaťkrát silnejší. Z tohto dôvodu je vždy najlepšie použiť čo najdlhšie sondy pre tradičné Southern blot štúdie, ako aj pre iné protokoly ako napr. in situ hybridizácia. Sila signálu je dôležitá nielen na zníženie množstva času potrebného na autorádiografickú expozíciu, ale aj na umožnenie detekcie na pozadí "šumu", ktorý je vlastný každému hybridizačnému experimentu. Ak sú podmienky vôbec menej ako optimálne, pomer signálu k šumu klesne pod 1,0, keď sa veľkosť sondy zníži pod 100-200 bp.

Jediné sily, ktoré držia dve vlákna dvojitej špirály DNA pohromade, sú dvojité alebo trojité vodíkové väzby, ktoré existujú v každom páre báz. Jednotlivé vodíkové väzby sú veľmi slabé a dvojitá špirála má dostatočnú stabilitu len vtedy, keď sa sčítajú vo veľkom počte, aby sa vyhli rozdeleniu v dôsledku bežných tepelných fluktuácií. Pre molekuly DNA, ktoré majú veľkosť v rozsahu od niekoľkých párov báz až po kritickú hodnotu ㅪ bp, hrá samotná dĺžka rozhodujúcu úlohu pri určovaní, či špirála zostane neporušená alebo sa rozpadne. Keď sa však táto horná hranica prekročí, dĺžka už nie je faktorom tepelnej stability. V skutočnosti existuje len malé okno — ㅂ až 40 bp —, cez ktoré je možné dosiahnuť diferenciálnu hybridizáciu sondy k cieľu na základe rozdielov v dĺžke hybridu.

Ako by však dĺžka mohla ovplyvniť detekciu alel, keď sú dĺžky cieľa aj sondy udržiavané konštantné? Odpoveď je, že efektívne dĺžka hybridu je určená najdlhšie úsek DNA, ktorý neobsahuje žiadne nezhody. Keď teda sonda s dĺžkou 21 báz hybridizuje s cieľom, ktorý sa líši na jedinej báze priamo v strede sekvencie, efektívna dĺžka hybridov, ktoré sa vytvoria, je iba 10 bp. Pretože 10 bp hybrid je výrazne menej stabilný ako 21 bp hybrid, je ľahké navrhnúť hybridizačné podmienky (v podstate výberom správnej teploty), aby dokonalý hybrid zostal nedotknutý, zatiaľ čo nedokonalý hybrid nie. Na rozdiel od toho tepelná stabilita 50 bp hybridu nie je dostatočne odlišná od tepelnej stability 100 bp hybridu (ekvivalentného sekvenčného zloženia), aby umožnila detekciu diferenciálnou hybridizáciou.

V roku 1985 teda detekcia rozdielov v jednej báze prostredníctvom diferenciálnej hybridizácie Southern blot nebola možná kvôli dvom protichodným problémom. Po prvé, len s veľmi krátkymi sondami & oligonukleotidmi s menej ako 50 bázami —, ktoré zmeny jednej bázy poskytli dostatočne veľký rozdiel na to, aby sa dali ľahko detegovať. Avšak len s oveľa dlhšími sondami — s niekoľkými stovkami báz alebo viac — boli sila signálu a pomer signálu k šumu dostatočné na to, aby umožnili špecifickú detekciu cieľovej sekvencie v akejkoľvek alelickej forme v rámci vysoko komplexného myšacieho genómu. Ako by sa dalo prelomiť túto slepú uličku?

Odpoveďou bolo, samozrejme, zamerať sa skôr na cieľové sekvencie než na podmienky sondy alebo hybridizácie. PCR poskytla prostriedok na zvýšenie absolútneho množstva cieľovej sekvencie, ako aj pomeru cieľovej k necieľovej, o prakticky neobmedzené rády. To zase vedie k proporcionálnemu zvýšeniu potenciálnej sily signálu, čo zase umožňuje použiť krátke oligonukleotidy na hybridizáciu a čo zase umožňuje detekciu rozdielov v jednotlivých bázach v jednoduchom plus/mínus teste.

8.3.2.2 Alelicky špecifické oligonukleotidy

Akonáhle boli sekvenované alternatívne alely a bola identifikovaná jediná zmena páru báz medzi týmito dvoma, je možné navrhnúť protokol PCR, ktorý umožňuje sledovať ich segregáciu (Farr, 1991). Najprv sa identifikujú PCR priméry, ktoré umožňujú špecifickú amplifikáciu oblasti, ktorá zahŕňa variantné nukleotidové miesto (pre túto aplikáciu nie je dĺžka produktu kritická a môže mať dĺžku kdekoľvek od 150 do 400 bp). Ďalej sa vyrobia dva alelovo špecifické oligonukleotidy (ASO), v ktorých je variantný nukleotid čo najbližšie k stredu, berúc do úvahy ďalšie faktory opísané v úvode časti 8.3. Ideálna dĺžka ASO je 19-21 báz a dostatočne krátka na to, aby umožnila diferenciálnu hybridizáciu založenú na jedinej zmene bázy a dostatočne dlhá na to, aby poskytovala vysokú pravdepodobnosť lokusovej špecifickosti. Dve ASO sa používajú s definovanými vzorkami na určenie teploty, pri ktorej sa získa pozitívna hybridizácia s cieľovou DNA obsahujúcou správnu alelu, ale nie s cieľovou DNA obsahujúcou iba alternatívnu alelu.

Typicky sa vzorka genómovej DNA podrobí PCR amplifikácii s lokusovo špecifickými primérmi, alikvotné časti amplifikovaného materiálu sa nanesú do dvoch "bodiek" a každá sa sonduje so značenými formami každého z dvoch ASO. Hybridizácia v jednej bodke, ale nie v druhej, naznačuje homozygota pre túto alelu, zatiaľ čo hybridizácia v oboch bodoch naznačuje heterozygota, ktorý nesie obe alely.

Sila tohto protokolu na detekciu alel je v jeho jednoduchosti. Eliminácia stekania gélu šetrí čas a umožňuje jednoduchú automatizáciu. S veľkým množstvom cieľovej sekvencie je možné použiť protokoly nerádioaktívneho značenia, ktoré sú bezpečnejšie a umožňujú dlhodobé skladovanie značených sond (Helmuth, 1990 Levenson a Chang, 1990). Existujú však úskalia, ktoré je dôležité mať na pamäti. Po prvé, niektoré varianty môžu byť odolné voči reprodukovateľnej PCR analýze kvôli problémom, ktoré sú vlastné sekvencii, ktorá obklopuje miesto zmeny bázy. Po druhé, plus/mínus testy akéhokoľvek druhu sú predmetom problému falošných negatív. (Vždy je možné pred hybridizáciou vložiť krok spustenia gélu, aby ste si boli istí, že amplifikovaný materiál je skutočne prítomný v analyzovanej alikvotnej časti.) Napokon pri analýze myší odvodených z čohokoľvek iného ako definovaného kríženia vždy existuje riziko, že bude existovať tretia nová alela, ktorú nemôže detegovať žiadna z dvoch ASO vyvinutých na analýzu. Zviera heterozygotné pre takúto novú alelu (spolu s jednou z dvoch známych alel) by mohlo byť nesprávne charakterizované ako homozygotné pre jednu prítomnú známu alelu, pretože protokol nie je kvantitatívny. Napriek týmto nástrahám zostáva protokol PCR/ASO užitočným nástrojom pre genetickú analýzu.

8.3.2.3 Test ligácie oligonukleotidov

Hood a jeho kolegovia vyvinuli alternatívny protokol na detekciu dobre definovaných alel, ktoré sa líšia zmenami jednej bázy (Landegren a kol., 1988 Landegren a kol., 1990). Táto metóda, nazývaná test oligonukleotidovej ligácie (OLA) alebo detekcia génov sprostredkovaná ligázou, je založená na požiadavke na správne párovanie báz na 3'-konci jedného oligonukleotidu, ako aj na 5'-konci susedného oligonukleotidu pred ligázou. môže pracovať za vzniku kovalentnej fosfodiesterovej väzby. Koncepčný rámec protokolu je znázornený na obrázku 8.8. Najprv sa potenciálna cieľová sekvencia amplifikuje pomocou PCR. Ďalšia hybridizácia sa uskutočňuje súčasne s dvoma oligonukleotidmi komplementárnymi k sekvenciám, ktoré sú vedľa seba a priamo lemujú variant nukleotidu. Samotná variantná báza bude buď komplementárna alebo nekomplementárna k 3'-báze prvého alelovo špecifického oligonukleotidu. Tento ASO je vopred modifikovaný pripojenou biotínovou skupinou, ale nie je inak označený. Druhý oligonukleotid, ktorý je značený rádioaktívne alebo neizotopicky, sa rozprestiera cez susednú sekvenciu, ktorá je spoločná pre obe analyzované alely. V reakcii je prítomná aj ligáza a ak sú oba oligonukleotidy dokonale zhodné s cieľovou sekvenciou, ligáza medzi nimi vytvorí kovalentnú väzbu. Ak dôjde k nesprávnemu párovaniu na spojovacom mieste, objavia sa dva oligonukleotidy nie podviazať sa. Biotinylovaný materiál môže byť ľahko a absolútne oddelený od nebiotinylovaného materiálu s použitím streptavidínovej matrice a výsledná vzorka môže byť potom testovaná na prítomnosť značky spojenej s druhým oligonukleotidom.

Existujú dve hlavné výhody použitia ligázou sprostredkovaného detekčného protokolu ako náhrady za PCR/hybridizačný protokol opísaný v predchádzajúcej časti. Po prvé, šanca na falošne pozitívny výsledok protokolu OLA je v podstate nulová. Po druhé, protokol OLA je vysoko prístupný automatizácii. Ako pri všetkých plus/mínus testoch sú však dôležité správne kontroly, aby sa vylúčila možnosť falošne negatívnych výsledkov.

8.3.2.4 Ligázová reťazová reakcia

Kombináciou OLA spolu s exponenciálnou amplifikačnou stratégiou PCR bola vyvinutá nová technika, ktorá sa označuje ako ligázová reťazová reakcia alebo LCR (Barany, 1991 Weiss, 1991). Rovnako ako OLA, detekcia nukleotidových rozdielov s protokolom LCR je založená na požiadavke na dokonalé párovanie na dvoch miestach, ktoré lemujú zlom medzi dvoma oligonukleotidmi, aby medzi nimi ligáza vytvorila fosfodiesterovú väzbu, ako je znázornené na obrázku 8.8. Rozdiel je v tom, že v protokole LCR sa používajú štyri oligonukleotidy zodpovedajúce oblastiam, ktoré lemujú polymorfné miesto na oboje reťazcov cieľovej molekuly DNA. V tom spočíva mechanizmus zosilnenia. Ak cieľová sekvencia poskytuje zhodu, obe sady lemujúcich oligonukleotidov sa ligujú. Po denaturácii môže teraz každý z novovytvorených oligonukleotidov s dvojitou dĺžkou pôsobiť ako templát pre novú sadu oligonukleotidov na párovanie báz a ligáciu. LCR teda pokračuje cyklami žíhania v prítomnosti tepelne stabilnej ligázy, po ktorej nasleduje denaturácia a potom opäť žíhanie. Jediný rozdiel vo vzore termocykléra od vzoru použitého pre PCR je eliminácia kroku predlžovania. Na konci procesu môžu byť produkty LCR ľahko detegované rovnakým spôsobom, aký sa používa pre OLA, ako je znázornené na obrázku 8.8. Na rozdiel od toho, detekcia polymorfných miest pomocou PCR vyžaduje následný protokol — buď hybridizáciu s alelovo špecifickým oligonukleotidom alebo reštrikčné štiepenie, po ktorom nasleduje gélová elektroforéza.

Základným rozdielom medzi LCR a pôvodným protokolom OLA je citlivosť: LCR vyžaduje oveľa menej východiskového materiálu, pretože produkt sa počas protokolu amplifikuje. Výhod LCR protokolu oproti PCR je niekoľko. Po prvé, ako OLA, ani LCR nebude produkovať falošne pozitívne výsledky. Po druhé, pretože produkt LCR je priamo testovateľný bez ďalších detekčných schém, proces je oveľa prístupnejší automatizácii a je oveľa pravdepodobnejšie, že bude kvantitatívny. Nevýhodou LCR je, že sa môže použiť iba na detekciu substitúcií jednej bázy, ktoré boli predtým charakterizované sekvenčnou analýzou.

8.3.3 Jednovláknový konformačný polymorfizmus (SSCP)

8.3.3.1 Historické pozadie

Existuje mnoho okolností, kedy je najužitočnejšie mať možnosť sledovať gény — na rozdiel od anonymných sekvencií — priamo v rámci experimentálnych krížení. Už bolo popísaných množstvo rôznych prístupov, ale všetky majú svoje obmedzenia. RFLP spojené s génom sa detegujú medzi rôznymi druhmi — M. spretus a tradičné inbredné M. musculus kmene, napríklad — v primeranej frekvencii, ale je oveľa ťažšie ich nájsť medzi inbrednými M. musculus kmeňov samotných. Na použitie ktoréhokoľvek z prístupov závislých od alelovo špecifických oligonukleotidov je najprv potrebné sekvenovať príslušný lokus z rôznych kmeňov myší, identifikovať varianty bázových párov, syntetizovať ASO, ako aj iné primery špecifické pre lokus, otestovať ich špecifickosť a optimalizáciu reakčných podmienok pre každý lokus. A v tomto bode máme stále iba protokol na rozlíšenie dvoch alelických stavov.

Dokonalý protokol genetika na detekciu a analýzu polymorfizmov v akomkoľvek lokuse by spĺňal nasledujúce kritériá. Po prvé, umožnilo by to detekciu akýchkoľvek a všetkých variantov párov báz v oblasti DNA ako viacerých alel. Po druhé, nevyžadovalo by to predchádzajúce sekvenčné informácie z každej alely. Po tretie, nevyžadovalo by to syntézu ASO. Po štvrté, samotný testovací protokol by si nevyžadoval žiadne špeciálne vybavenie alebo špeciálne zručnosti nad rámec tých, ktoré sa nachádzajú v štandardnom laboratóriu molekulárnej biológie. Nakoniec by test bol rýchly a výsledky by boli ľahko reprodukovateľné.

Všetky tieto kritériá boli do značnej miery splnené pomocou jednoduchého protokolu, ktorý využíva skutočnosť, že aj zmeny jedného nukleotidu môžu zmeniť trojrozmernú rovnovážnu konformáciu, ktorá jednotlivé pramene bude predpokladať pri nízkych teplotách (Orita a kol., 1989a). Ak sa vzorka DNA denaturuje pri vysokej teplote a potom sa rýchlo umiestni na ľad, bude inhibovaná reformácia hybridov DNA. Namiesto toho sa každé jednotlivé vlákno zrúti do seba v tom, čo sa často nazýva náhodná cievka. V skutočnosti je teraz jasné, že každý jednotlivý reťazec nadobudne najvýhodnejšiu konformáciu založenú na stave s najnižšou voľnou energiou. Pravdepodobne najvýhodnejším stavom je stav, v ktorom veľké množstvo báz môže navzájom vytvárať vodíkové väzby. Dokonca aj jediná zmena nukleotidu by mohla narušiť predchádzajúci najvýhodnejší stav a podporiť iný, ktorý, ak je dostatočne odlišný, bude prebiehať so zmenenou pohyblivosťou na géli. Nazývajú sa rôzne alelické stavy lokusu, ktoré sa detegujú pomocou tohto protokolu jednovláknové konformačné polymorfizmy (SSCP) (Beier a kol., 1992 Beier, 1993).

8.3.3.2 Denaturačná gradientová gélová elektroforéza

Vývoj protokolu SSCP bol výsledkom skoršej techniky, ktorá umožňovala detekciu zmien jednej bázy v genómovej DNA po elektroforéze prostredníctvom zvyšujúceho sa gradientu denaturantu (Fischer a Lerman, 1983). Táto technika sa nazýva denaturačná gradientová gélová elektroforéza (DGGE). Malé zmeny v sekvencii majú dramatické účinky na bod v denaturačnom gradiente, v ktorom by sa konkrétne dvojvláknové genómové reštrikčné fragmenty rozdelili na jednotlivé vlákna. S pripojením "GC-svorky" — zloženého z úseku pevne sa viažucich G:C bázových párov — mohol byť fragment DNA držaný spolu s dvojitou špirálou v zovretej oblasti pripojenej k otvoreným jednoduchým vláknam prítomný v roztavenej oblasti. Táto dvojfázová molekula by bola veľmi odolná voči ďalšej migrácii v géli a v podstate by bola zastaviť na svojej ceste. Dve alelické formy genómového fragmentu, ktoré sa líšia čo i len jediným párom báz, by prešli týmto prechodom v rôznych denaturačných bodoch a to by bolo pozorované ako rôzne migračné vzdialenosti v denaturačnom gradientovom géli. V pôvodnom protokole boli rôzne alelické formy detegované priamo v celkovej genómovej DNA po Southern blotting a hybridizácii s lokusovo špecifickou sondou. V čase, keď bol vyvinutý DGGE, neboli k dispozícii žiadne iné prostriedky na detekciu zmien párov báz, ktoré nemenili reštrikčné miesta, a tak DGGE rozšíril horizont polymorfizmu. Nanešťastie, DGGE vyžaduje použitie na mieru vyrobeného zariadenia a je únavné vykonávať ho na rutinnom základe.

V posledných rokoch bol protokol DGGE modifikovaný na použitie v spojení s PCR ako prostriedok na počiatočnú detekciu alelických variantov medzi vzorkami získanými od rôznych jedincov v rámci populácie (Sheffield et al., 1989). Diferenciálna migrácia produktov PCR môže byť detegovaná priamo v géloch farbením etídium bromidom a variantné alely môžu byť vyrezané z gélu na sekvenčnú analýzu. Hlavnou výhodou použitia DGGE je, že je možné detegovať takmer všetky jednobázové substitúcie (Myers et al., 1985). Je teda ideálny pre situáciu, keď chceme hľadať zriedkavé variantné alely medzi jednotlivcami v rámci populácie bez potreby sekvenovania cez všetky alely divokého typu, ktoré budú prítomné vo väčšine vzoriek. Napriek tomu sa DGGE nezväčšuje ľahko, a preto to nie je metóda voľby, keď sa na detekciu alelických variantov môže použiť aj iný menej náročný protokol. V mnohých prípadoch bude lepší protokol SSCP.

8.3.3.2 Protokol SSCP a jeho citlivosť

Jednou z hlavných predností nového detekčného protokolu SSCP, ktorý vyvinuli Orita et al. (1989a 1989b) je jeho jednoduchosť. Vo svojej základnej forme sa produkty PCR jednoducho denaturujú pri 94°, ochladia sa na teplotu ľadu, aby sa zabránilo tvorbe hybridov, a potom sa elektroforézujú na štandardných nedenaturujúcich polyakrylamidových géloch.

Dve vlákna produktu PCR budú zvyčajne prebiehať s veľmi odlišnými mobilitami a zmeny báz môžu ďalej meniť mobilitu každého vlákna. To, čo sa štandardnou analýzou javí ako jediný produkt PCR, sa teda môže rozdeliť na štyri rôzne pásy na géli SSCP, ak bola pôvodná vzorka DNA heterozygotná pre zmeny báz, ktoré zmenili mobilitu oboch vlákien.

Rôzne štúdie analyzovali páry produktov PCR, o ktorých je známe, že sa líšia substitúciami jednej bázy, aby sa získal odhad frakcie, ktorú možno rozlíšiť protokolom SSCP. V jednej takejto štúdii bolo rozlíšiteľných 80 % z 228 variantných produktov PCR (Sheffield et al., 1993). V inej štúdii bola miera detekcie 80-90 % (Michaud et al., 1992). Keď sa však táto posledná sada vzoriek analyzovala za troch rôznych elektroforetických podmienok, miera detekcie bola úžasných 100 %.

8.3.3.3 Výkonný nástroj na detekciu polymorfizmov medzi klasickými inbrednými kmeňmi

Keď sa SSCP analýza vykonala na súbore produktov PCR amplifikovaných buď z 3'-nepreložených alebo intrónových oblastí 30 náhodných myších génov, 43 % vykazovalo polymorfizmus v porovnaní s klasickými inbrednými kmeňmi B6 a DBA a 86 % vykazovalo polymorfizmus medzi B6 a M. spretus (Beier a kol., 1992). Rýchlosť, s akou sa detegujú polymorfizmy SSCP medzi B6 a DBA, je oveľa väčšia ako rýchlosť pozorovaná pri RFLP analýze a je rovnaká ako frekvencia polymorfizmu pozorovaná pre mikrosatelity opísané v časti 8.3.6.

V porovnaní s inými systémami na detekciu polymorfizmov má prístup SSCP množstvo výhod: (1) SSCP má potenciálnu použiteľnosť na všetky jedinečné sekvencie v génoch aj negénových oblastiach (2) PCR priméry môžu byť navrhnuté priamo zo sekvencií cDNA a (3) Ak jedna amplifikovaná oblasť nevykazuje polymorfizmus, vždy sa dá posunúť proti smeru alebo po prúde do inej. Stále je však pravdepodobné, že mikrosatelity — opísané v časti 8.3.6 — budú mať väčší počet rôznych alel, čo ich robí užitočnejšími pri priamočiarych prístupoch k snímaniu odtlačkov prstov. SSCP a mikrosatelitná analýza spolu poskytujú výkonnú dvojicu nástrojov založených na PCR pre klasickú analýzu väzieb s rekombinantnými panelmi odvodenými z intra- aj medzidruhových krížení.

8.3.4 Náhodná amplifikácia polymorfnej DNA

Pri všetkých doteraz opísaných protokoloch PCR existuje absolútna požiadavka na vopred existujúce informácie o sekvencii na navrhnutie primérov, od ktorých závisí špecifická amplifikácia. V roku 1990 dve skupiny demonštrovali, že jednotlivé krátke náhodné oligonukleotidy ľubovoľnej sekvencie možno použiť na primovanie amplifikácie genómových sekvencií reprodukovateľným a polymorfným spôsobom (Welsh a McClelland, 1990 Welsh a kol., 1991 Williams a kol., 1990). Tento protokol sa nazýva náhodná amplifikácia polymorfnej DNA (RAPD). Princíp protokolu je nasledovný. Krátke oligonukleotidy náhodnej sekvencie budú len náhodou komplementárne k početným sekvenciám v genóme. Ak sú dve komplementárne sekvencie prítomné na opačných vláknach genómovej oblasti v správnej orientácii a v dostatočnej vzdialenosti od seba, DNA medzi nimi sa môže amplifikovať pomocou PCR. Každý amplifikovaný fragment bude nezávislý od všetkých ostatných a náhodou bude mať pravdepodobne tiež rôznu dĺžku, ak sa amplifikuje málo pásov, všetky budú navzájom rozlíšiteľné gélovou elektroforézou. Rôzne oligonukleotidy budú amplifikovať úplne odlišné súbory lokusov.

Polymorfizmy RAPD vyplývajú zo skutočnosti, že hybridizačné miesto priméru v jednom genóme je zmenené na slobodný nukleotidu v druhom genóme môže viesť k eliminácii špecifického amplifikačného produktu z tohto druhého genómu, ako je znázornené na obrázku 8.9. Ak má napríklad použitý náhodný primér dĺžku 10 báz, potom bude každý PCR produkt definovaný 20 bázami (10 v cieli priméru na každom konci), ktoré sú všetky náchylné na polymorfné zmeny. 60 Výsledný polymorfizmus bude detegovaný ako dialelický +/ - systém.

Ak sa začne s predpokladom, že na efektívnu amplifikáciu je potrebná úplná komplementarita medzi primérom a cieľom, je možné odvodiť všeobecnú rovnicu na predpovedanie približného počtu, Az amplifikovaných pásov očakávaných ako produkty PCR z genómu komplexnosti C ktorý je aktivovaný jediným oligomérom dĺžky N. 61 Pre amplifikované fragmenty s veľkosťou 2 kb alebo menšou 62 platí rovnica:

Použime 2x109 ako odhad zložitosti jednej kópie časti myšacieho genómu (pozri časť 5.1.2) a vyriešme rovnicu 8.1 pre dĺžky primérov, ktoré sa menia od 8 do 11. N = 8, predpokladaný počet produktov PCR je 18 626 — príliš veľa na to, aby sa dali rozlíšiť akýmkoľvek typom gélovej analýzy. S N = 9, rovnica predpovedá 116 produktov PCR, čo je stále príliš vysoké číslo. S N = 10, predpoveď je 7,2 produktu a pri 11-mere je predpoveď 0,45 produktu. Použitie náhodných 10-mérov by teda bolo najvhodnejšie na získanie maximálneho počtu ľahko rozlíšiteľných pásov z myšacieho genómu.

Boli publikované optimalizácie kompletného protokolu RAPD, od parametrov, na základe ktorých sa vyberajú sekvencie primérov, až po podmienky používané pre PCR (Williams a kol., 1990 Nadeau a kol., 1992). V skutočnosti je možné získať viacero produktov PCR s primérmi dlhšími ako 10-mér, keď sa použijú uvoľnené reakčné podmienky na umožnenie amplifikácie z nezhodných cieľových sekvencií. V skutočnosti jedna skupina navrhla, že 12-14-mérové ​​priméry sú optimálne (Nadeau et al., 1992). Je tiež možné zvýšiť predpokladaný počet produktov jednoduchým trojnásobným zahrnutím dvoch nesúvisiacich náhodných primérov rovnakej dĺžky do každej PCR reakcie. Avšak v každom prípade, keď počet viditeľných produktov PCR prekročí 12 – 20, bolo by potrebné použiť skôr polyakrylamidové gély než agarózové gély, aby sa jasne rozlíšil každý pás, čím by sa dosiahol kompromis pre detekciu väčšieho počtu loci je časovo náročnejšia analýza. Nakoniec protokol, ktorý vyžaduje najmenej času na písanie na lokus je ten, ktorý by sa mal vybrať. Keďže rôzne laboratóriá často vynikajú rôznymi technikami, optimálne podmienky pre analýzu RAPD by sa mali určiť nezávisle v každom laboratóriu.

Vykonala sa komplexná RAPD analýza dvoch najlepšie charakterizovaných inbredných kmeňov — B6 a DBA — so 481 nezávislými 10-mérmi použitými jednotlivo v PCR reakciách (Woodward et al., 1992). Pozorovalo sa priemerne 5,8 PCR produktov na reakciu, čo sa veľmi nelíši od toho, čo bolo predpovedané z rovnice 8.1. Pri priamom porovnaní kmeňov bolo pozorovaných 95 reprodukovateľných rozdielov medzi B6 a DBA medzi kompletným súborom 2 900 zistených diskrétnych pásov. Za predpokladu, že každý polymorfizmus je výsledkom jedinej nukleotidovej zmeny v jednom z dvoch cieľových primérov a všetky takéto zmeny sú detegovateľné, je možné vypočítať priemerný sekvenčný rozdiel medzi týmito dvoma kmeňmi pri 1,6 zmenách na 1000 nukleotidov. Táto nízka úroveň polymorfizmu nie je neočakávaná vzhľadom na vysoký stupeň príbuznosti, o ktorom je známe, že existuje medzi všetkými klasickými inbrednými kmeňmi (pozri časť 2.3.4).

Použitie RAPD ako metódy na detekciu polymorfizmov medzi B6 a DBA by sa javilo ako dosť neefektívne — v priemere bol detegovaný iba jeden polymorfizmus z každých piatich reakcií priméru, ktoré sa uskutočnili. Druhým negatívnym faktorom je, že všetky RAPD polymorfizmy sú binárne +/ - systémy. Ako je teda diskutované vyššie pre RFLP, polymorfizmus zistený medzi jedným párom kmeňov sa nemusí premietnuť do použitia pre iný pár kmeňov. Okrem toho nie je možné rozlíšiť zvieratá, ktoré sú heterozygotné v akomkoľvek lokuse, od zvierat, ktoré sú homozygotné pre alelu "+". Teda v priemere len polovica RAPD polymorfizmov zistených medzi dvoma kmeňmi by bola zmapovateľná medzi potomkami zo spätného kríženia k jednému rodičovi a so systémom intercrossového mapovania je prístup RAPD ešte obmedzenejší (pozri časť 9.4.3).

Napriek tomu existuje veľa funkcií, ktoré hovoria o užitočnosti prístupu RAPD. Predovšetkým medzi nimi je relatívna rýchlosť a jednoduchosť, s akou je možné získať výsledky — nie je potrebné blotovanie alebo rádioaktívna hybridizácia a kompletnú analýzu od začiatku do konca možno vykonať v priebehu jedného pracovného dňa, na rozdiel od RFLP alebo minisatelitných štúdií. . Na rozdiel od všetkých ostatných protokolov založených na PCR, priméry RAPD nie sú závislé od výsledkov nákladných klonovacích a sekvenčných štúdií a akonáhle sa získajú, hlavnou cenou za vzorku je DNA polymeráza použitá na PCR. Preto aj pri porovnávaní inbredných kmeňov môže byť protokol RAPD z dlhodobého hľadiska efektívnejší v porovnaní s inými technikami na generovanie náhodných markerov DNA. Navyše, klonovanie RAPD fragmentov sa môže rýchlo uskutočniť po jednoduchom získaní pásov detegovaných etídiumbromidom.Klonované RAPD lokusy budú mať výhodu oproti minisatelitom a mikrosatelitom v tom, že RAPD lokusy nemusia a väčšina z nich nebude obsahovať opakujúce sa sekvencie.

Ako je to v prípade tradičných lokusov RFLP, medzidruhová úroveň polymorfizmu RAPD je oveľa vyššia ako úroveň pozorovaná u tradičných inbredných kmeňov. Údaje Serikawu a kol. (1992) uvádzajú päťnásobné zvýšenie počtu polymorfných pásov pozorovaných v porovnaní medzi nimi M. spretus a tradičných laboratórnych kmeňov toto zvýšenie zodpovedá známemu zvýšeniu genetickej diverzity. Technológia RAPD bude teda ešte efektívnejšia pre vývoj markerov v kríženiach, ktoré zahŕňajú jedného rodiča, ktorý nepochádza z jedného z tradičných inbredných kmeňov.

Podobne ako minisatelitná analýza môže protokol RAPD poskytnúť genómové odtlačky prstov, ktoré súčasne skenujú lokusy rozptýlené v genóme. V analýze 32 reprezentatívnych inbredných kmeňov udržiavaných v Jackson Laboratory definovali Nadeau a kolegovia (1992) 29 jedinečných kmeňových odtlačkov prstov s použitím iba šiestich primerov. Zdá sa teda, že RAPD poskytuje účinný a jednoduchý prostriedok na priebežné monitorovanie genetickej čistoty inbredných línií.

Nakoniec by sa malo spomenúť, že zatiaľ čo protokol RAPD je užitočným a dôležitým doplnkom k arzenálu nástrojov dostupných na genetickú analýzu myší, má oveľa väčší význam pre genetické štúdie iných druhov, vrátane zvierat a rastlín. , ktoré nie sú dobre charakterizované na úrovni DNA. Pre tieto ďalšie druhy môže technológia RAPD poskytnúť jedinečnú metódu na rýchly vývoj genetických markerov a máp ešte predtým, ako budú dostupné knižnice a klony DNA.

8.3.5 PCR s roztrúsenou repetitívnou sekvenciou

Princíp prístupu RAPD spočíva v tom, že oligonukleotidy, ktoré majú v podstate náhodnú sekvenciu, budú prítomné na náhodných pozíciách v genóme (myši a každého iného druhu) s frekvenciou, ktorú je možné vopred určiť matematicky. Takže výberom oligonukleotidov vhodnej veľkosti a uskutočnením PCR amplifikačných reakcií za vhodných podmienok je možné kontrolovať počet nezávislých genómových fragmentov, ktoré sú amplifikované tak, že môžu byť optimálne rozlíšené pomocou zvoleného systému gélovej elektroforézy. Hoci je prístup RAPD užitočný na analýzu väzieb, neumožňuje rozlíšenie myších sekvencií od sekvencií iných druhov, a preto ho nemožno použiť ako prostriedok na získanie fragmentov myšacieho genómu z buniek, ktoré obsahujú definovanú časť myšacieho genómu vo vnútri. kontext heterológneho genetického pozadia.

Alternatívny prístup, ktorý, podobne ako RAPD, tiež umožňuje súčasnú PCR amplifikáciu viacerých genómových fragmentov, je založený na prirodzenom výskyte vysoko opakovaných prvkov DNA, ktoré sú rozptýlené v celom genóme. Tri rodiny prvkov myšieho opakovania — B1, B2 a L1 — sú prítomné v približne 100 000 kópiách (pozri časť 5.4). Amplifikácia týchto prvkov samých osebe s primérmi špecifickými pre opakovanie by nebola užitočná, po prvé, pretože ich počet kópií je príliš veľký na to, aby sa dal rozlíšiť akýmkoľvek dostupným gélovým systémom, a po druhé, pretože by neexistoval spôsob, ako rozlíšiť väčšinu jednotlivých prvkov. od seba, pretože väčšina by mala rovnakú konsenzuálnu veľkosť. Ak by sa však namiesto toho použil primér špecifický pre opakovanie, ktorý by bol „odvrátený“ od prvku, amplifikovali by sa len oblasti DNA prítomné medzi dvoma prvkami, ktoré by boli dostatočne blízko ku každému a v správnej orientácii, aby umožnili reakciu PCR. pokračovať. Počet prípadov, v ktorých by dva prvky spĺňali tieto podmienky, bude oveľa nižší ako celkový počet kópií, pretože v priemere budú tieto prvky od seba vzdialené vo vzdialenosti približne 30 kb 63 a na všetky praktické účely PCR amplifikácia nie je vyskytujú na vzdialenosti väčšie ako 1-2 kilobázy. Pri práci s (1) jedným alebo kombináciou dvoch alebo viacerých primérov, ktoré (2) hybridizujú s celými rodinami alebo podskupinami prvkov v rámci rodiny, z (3) dvoch koncov toho istého prvku alebo z rôznych prvkov, je možné upraviť počet produktov PCR, ktoré sa vygenerujú, aby sa získal maximálny počet, ktorý možno rozlíšiť pomocou zvoleného systému gélovej elektroforézy (Herman et al., 1992).

Tento všeobecný protokol sa označuje ako Interspersed Repetitive Sequence (IRS) PCR (IRS-PCR). Prvýkrát bol vyvinutý pre použitie s vysoko opakovanými Alu rodiny prvkov v ľudskom genóme (Nelson a kol., 1989) a následne bol aplikovaný na myší genóm (Cox a kol., 1991). Cox a spolupracovníci použili jednotlivé priméry reprezentujúce každú z hlavných tried vysoko rozptýlených opakujúcich sa prvkov — B1, B2 a L1 — na amplifikáciu genómových fragmentov z inbredných myší B6 (M. musculus) a M. spretus. Hoci IRS-PCR vzory získané elektroforézou na agarózovom géli boli extrémne zložité, bolo možné vidieť jasný dôkaz druhovej špecifickosti. Na zjednodušenie vzorov títo pracovníci blotovali a sekvenčne hybridizovali produkty IRS-PCR na jednoduché sekvenčné oligonukleotidy (12-méry obsahujúce tri tandemové kópie tetraméru), ktoré sa často vyskytujú v genóme, ale iba náhodou v podskupine amplifikovaného inter - opakujúce sa regióny. Získané zjednodušené vzory umožnili identifikáciu a mapovanie 13 nových polymorfných lokusov.

Je zrejmé, že užitočnosť IRS-PCR ako všeobecného mapovacieho nástroja nie je väčšia ako užitočnosť techniky RAPD alebo akéhokoľvek iného protokolu, ktorý umožňuje náhodnú amplifikáciu fragmentov PCR z celého genómu. Skutočná sila IRS-PCR však nespočíva vo všeobecnom mapovaní, ale v identifikácii a získaní sekvencií špecifických pre myši z bunkových hybridov, ako je uvedené v časti 8.4.

8.3.6 Mikrosatelity: Polymorfizmy dĺžky jednoduchých sekvencií

8.3.6.1 Čarovná guľka dorazila

Hoci schopnosť identifikovať a typovať jednoduché substitúcie základných párov zmenila tvár genetiky, nebola všeliekom. Nájdenie RFLP v klonovanej oblasti často nie je ľahké, keď sa nájdu, ich polymorfný obsah je často obmedzený a nakoniec dialelický, typizácia veľkého počtu lokusov RFLP analýzou Southern blot je relatívne náročná na prácu. Zmeny bázy, ktoré nie sú RFLP, môže byť tiež ťažké nájsť, hoci táto úloha sa s vývojom protokolu SSCP zjednodušila. Väčšina SSCP však stále vykazuje obmedzený polymorfný obsah iba s dvoma rozlíšiteľnými alelami. Minisatelity sú oveľa polymorfnejšie ako lokusy definované nukleotidovými substitúciami a minisatelitné sondy často umožňujú simultánne typovanie viacerých lokusov rozptýlených v genóme. Avšak minisatelitné elementy ako trieda nemajú žiadne jedinečné sekvenčné charakteristiky a sú rozpoznávané iba Southern blot vzormi, ktoré produkujú, keď sú použité ako sondy. Počet doteraz odkrytých minisatelitných lokusov je menší ako 1000. Vo všeobecnosti teda minisatelity nemôžu poskytnúť špecifické rukoväte na typizáciu novo klonovaných génov alebo genómových oblastí. Ostatné metódy multilokusovej analýzy opísané skôr trpia rovnakými obmedzeniami.

V ďalšej kapitole sa ukáže, že jedným z veľmi dôležitých použití markerov DNA nie je sledovanie konkrétnych záujmových génov v segregačnej analýze, ale skôr poskytovanie „kotvičiek“, ktoré sú rozmiestnené v rovnakých vzdialenostiach pozdĺž každého chromozómu v genóm. Spoločne môžu byť tieto kotevné lokusy použité na vytvorenie "rámcových máp" pre nové kríženia, ktoré sa zase dajú použiť na rýchle zmapovanie akéhokoľvek nového lokusu alebo mutácie, ktoré sú skutočne zaujímavé. Ak je počet kotiev dostatočný, na poskytnutie polohy na mape pre nový lokus bude potrebný iba jeden krížik. Nie je potrebné, aby kotviace lokusy reprezentovali skutočné gény. Ich jediným účelom je označiť konkrétne body pozdĺž molekuly DNA v každom z chromozómov v genóme.

Existujú tri kritériá, ktoré definujú dokonalé kotviace lokusy. Po prvé, mali by byť extrémne polymorfné, takže existuje veľká šanca, že akékoľvek dva homológy chromozómov v druhu budú niesť rôzne alely. Po druhé, mali by byť ľahko identifikovateľné, aby bolo možné vyvinúť vhodný súbor kotiev na analýzu akéhokoľvek komplexného druhu, ktorý chce genetik študovať. Nakoniec by sa mali dať rýchlo písať vo veľkom počte jednotlivcov.

Teraz s úsvitom 90. rokov prišlo to, čo môže byť skutočne čarovnou guľkou, na ktorú genetici (ktorí študujú myši, ako aj všetky ostatné cicavce) čakali na — genomický prvok s nezvyčajne vysokým polymorfným obsahom, ktorý je prítomný na vysoká hustota vo všetkých skúmaných genómoch cicavcov sa dá ľahko odhaliť a rýchlo typizovať: mikrosatelit. Mikrosatelit — tiež známy ako jednoduché opakovanie sekvencie (alebo SSR) — je genómový prvok, ktorý pozostáva z mono-, di-, tri- alebo tetramérnej sekvencie opakovanej viackrát v tandemovom poli.

Na rozdiel od iných rodín rozptýlených krížovo hybridizačných prvkov —, ako sú B1, B2 a L1 —, v ktorých sú jednotlivé lokusy odvodené retrotranspozíciou zo spoločných sekvencií predkov (pozri časť 5.4), jednotlivé mikrosatelitové lokusy sú takmer určite odvodené de novoprostredníctvom náhodného výskytu krátkych jednoduchých opakovaní sekvencií, ktoré poskytujú šablónu pre nerovnaké krížové udalosti (ako je znázornené na obrázku 8.4), ktoré môžu viesť k zvýšeniu počtu opakovaní prostredníctvom stochastických procesov. Vo všeobecnosti nie sú lokusy mikrosatelitov konzervované naprieč líniami vzdialených druhov, napríklad od myší po ľudí, a zdá sa nepravdepodobné, že by tieto prvky, ktoré prakticky nemajú žiadny informačný obsah, mali nejakú funkčnosť v prospech hostiteľského genómu 64 alebo v sebe. Nezdá sa, že by mikrosatelity boli sebecké prvky (diskutované v časti 5.4). Mikrosatelity, podobne ako minisatelity, sú skôr genómové zvláštnosti, ktoré sú výsledkom chýb v rekombinácii alebo replikácii.

Boli identifikované mikrosatelity obsahujúce všetky kombinácie nukleotidov. Avšak trieda nachádzajúca sa najčastejšie v myšacom genóme obsahuje (CA)n•(GT)n dimér a často sa označuje ako repetice CA. Existencia opakovaní CA, ich prítomnosť pri vysokom počte kópií a ich disperzia v genómoch rôznych vyšších eukaryotických druhov bola prvýkrát preukázaná pred desiatimi rokmi v niekoľkých rôznych laboratóriách (Miesfeld a kol., 1981 Hamada a kol., 1982 Jeang a Hayward, 1983). Hoci sa v nasledujúcom desaťročí objavili nezávislé príklady polymorfizmov s opakovaním CA, až v roku 1989 tri skupiny pracujúce nezávisle odkryli dostatočné dôkazy, ktoré by naznačovali, že mikrosatelity ako trieda sú vo svojej podstate extrémne polymorfné (Pickford, 1989 Weber a máj, 1989 Pedersen a kol. ., 1993). Ďalšie systematické štúdie potvrdili vysokú úroveň polymorfizmu spojenú s mnohými mikrosatelitnými lokusmi vo všetkých vyšších eukaryotoch, ktoré sa skúmali.

8.3.6.2 Typizácia pomocou PCR

Bez PCR by väčšina mikrosatelitov bola zbytočná ako genetické markery. Alelická variácia 65 je založená skôr na rozdieloch v počte opakovaní prítomných v tandemovom poli než na špecifických zmenách párov báz. Jediným spôsobom, ako možno alely rozlíšiť, je meranie celkovej dĺžky mikrosatelitu. To sa najľahšie dosiahne pomocou PCR amplifikácie samotného mikrosatelitu spolu s malým množstvom definovanej ohraničujúcej sekvencie na každej strane, po ktorej nasleduje gélová elektroforéza na určenie relatívnej veľkosti produktu, ako je znázornené na obrázku 8.10.

Mikrosatelitové lokusy možno identifikovať dvoma spôsobmi — vyhľadávaním v databázach sekvencií DNA alebo hybridizáciou s knižnicami alebo klonmi s vhodným oligonukleotidom, ako je (CA)15. V prvom prípade sa informácie o priľahlej sekvencii získavajú priamo z databázy. V druhom prípade je najprv potrebné sekvenovať cez opakujúcu sa oblasť, aby sa získali informácie o priľahlej sekvencii. Jedinečný oligonukleotid na každej strane opakovania sa vyberie na výrobu priméru podľa kritérií opísaných v úvode časti 8.3. Najlepšie je vybrať dva priméry, ktoré sú čo najbližšie k opakujúcej sa sekvencii — čím menší je produkt PCR, tým ľahšie je zistiť akýkoľvek absolútny rozdiel vo veľkosti. Variácie v dĺžke produktov PCR možno detegovať separáciou na agarózových géloch NuSieve™ (FMC Corp.) (Love et al., 1990 Cornall et al., 1991) alebo polyakrylamidových géloch (Weber a May, 1989 Love et al.). , 1990). S agarózovými gélmi sa ľahšie manipuluje, ale polyakrylamidové gély poskytujú vyššie rozlíšenie. Keď je alely ťažké rozlíšiť natívnymi gélmi, často je možné zlepšiť úroveň rozlíšenia spustením denaturačných gélov. Pásy sa detegujú farbením gélov etídiumbromidom alebo striebrom alebo autorádiografiou produktov PCR vytvorených so značenými primérmi.

Ešte vyššiu úroveň nákladovej efektívnosti možno dosiahnuť kombináciou dvoch alebo viacerých lokusov na simultánnu analýzu prostredníctvom multiplexnej PCR. Vzorky možno skombinovať pred PCR reakciou —, ak sa ukázalo, že rôzne páry primérov nespôsobujú kombinatorické artefakty —, alebo po PCR reakcii, ale pred gélovým priebehom. Vo všetkých prípadoch je celý proces prístupný automatizácii.

8.3.6.3 Klasifikácia a frekvencia mikrosatelitov

Mikrosatelity môžu byť klasifikované najskôr podľa počtu nukleotidov v opakujúcej sa jednotke. Mononukleotidové a dinukleotidové opakujúce sa prvky sú celkom bežné pri každom ďalšom zvyšovaní dĺžky nukleotidu — od trinukleotidu cez tetranukleotid po pentanukleotid — frekvencia výskytu rýchlo klesá. Perfektné mikrosatelity sú tie, ktoré obsahujú jeden neprerušovaný opakujúci sa prvok lemovaný na oboch stranách neopakujúcimi sa sekvenciami (Weber, 1990). Veľký podiel mikrosatelitných lokusov je nedokonalé s dvoma alebo viacerými behmi tej istej opakovacej jednotky prerušovanými krátkymi úsekmi iných sekvencií. Polymorfné vlastnosti nedokonalých mikrosatelitov sú určené najdlhším úsekom dokonalého opakovania v rámci lokusu. Nezriedka sú mikrosatelity z an nedokonalé a zlúčenina povahy, so zmiešaním dvoch alebo viacerých odlišných cyklov rôznych opakujúcich sa jednotiek.

Na základe kvantitatívnej dot blot analýzy Hamada a jeho kolegovia (1982a, 1982b) odhadli počet lokusov opakovania CA v myšacom genóme na �, čo zodpovedá priemeru jedného lokusu každých 30 kb. Ďalší odhad počtu CA-repeat kópií sa získal skenovaním 287 kb myších genómových sekvencií zadaných v GenBank pre (CA)n, kde n bolo šesť alebo väčšie (Stallings a kol., 1991). Táto analýza zistila, že sa CA-opakuje v priemere raz za 18 kb. Rozdiel medzi týmito dvoma odhadmi možno úplne vysvetliť sekvenciami, ktoré majú iba 6-9 opakovaní, ktoré sú príliš krátke na to, aby ich bolo možné detegovať dot blot analýzou založenou na hybridizácii (Weber, 1990).

Druhou najčastejšou triedou mikrosatelitov v myšom genóme je opakovanie GA, ktoré sa vyskytuje s frekvenciou približne polovičnou v porovnaní s frekvenciou pozorovanou pri opakovaniach CA (Cornall et al., 1991). GA-repeat lokusy sú rovnako pravdepodobné, že sú polymorfné ako CA-repeat lokusy. Takže skríningom oboch súčasne možno zvýšiť šance na nájdenie užitočného mikrosatelitu o 50 %.

Mononukleotidová repetícia poly(A•T) sa nachádza v myšom genóme s frekvenciou podobnou, ak nie vyššou, ako CA opakovania. Často sa však nachádza vo vysoko rozptýlených opakovaniach B1, B2 a L1, ktoré sú samotné prítomné v 𞲔 000 kópiách na haploidný genóm. Náhodné skríningy poly(A•T) traktov teda často privedú výskumníkov do týchto rozsiahlejších opakujúcich sa oblastí, kde bude ťažké odvodiť páry primérov špecifických pre daný lokus pre analýzu PCR. Ak si však uvedomíte toto úskalie, je možné použiť počítačové programy, ktoré vám pomôžu v tejto úlohe, a často je možné zadať prvky B1 (alebo B2 alebo L1) obsahujúce mikrosatelity (Aitman et al., 1991). . Mononukleotidové repetície, ako v rámci komplexnejších repetujúcich prvkov, tak aj mimo nich, sú rovnako pravdepodobné, že budú polymorfné ako dinukleotidové repetície (Aitman et al., 1991). Druhým potenciálnym úskalím dlhých poly(A•T) traktov je však to, že ako v prípade dlhých (TA)n•(AT)n dinukleotidových traktov je tu znížená teplota topenia, čo si vyžaduje použitie PCR. elongačné kroky za podmienok zníženej špecificity, čo vedie k zvýšenému výskytu artefaktov. V dôsledku týchto úskalí sa poly(A•T) trakty používajú oveľa menej často ako zdroj polymorfných mikrosatelitných markerov. Mikrosatelitný poly(C•G) nie je spojený so žiadnym z týchto úskalí, ale je oveľa menej často pozorovaný rádovo — v myšom genóme (Aitman et al., 1991).

V genóme sú tiež prítomné tri- a tetranukleotidové opakujúce sa mikrosatelity, ale s frekvenciou desaťnásobne nižšou ako je frekvencia dinukleotidových (CA)n a (GA)n lokusov (Hearne et al., 1992). 67 Ako také budú v genómových knižniciach a jednotlivých klonoch zastúpené oveľa menej často. Po odkrytí sa však s týmito mikrosatelitmi vyššieho rádu pracuje oveľa lepšie ako s dinukleotidovými lokusmi. Úroveň polymorfizmu pozorovaná u tri- a tetranukleotidových lokusov sa javí podobná tej, ktorá sa pozorovala pri opakovaniach CA a GA, ale alely sa oveľa ľahšie riešia s posunmi mobility o 3 až 4 bp pre každý rozdiel v jednotke opakovania. Okrem toho, rebríky artefaktov PCR produktov bežne pozorovaných s dinukleotidovými opakovaniami sa neobjavujú tak často alebo tak intenzívne s lokusmi jednotiek opakovania vyššieho rádu (Hearne et al., 1992).

8.3.6.4 Úrovne polymorfizmu a miery mutácií

Ako je to v prípade minisatelitných lokusov, generovanie nových mikrosatelitných alel nie je spôsobené klasickými mechanizmami mutagenézy. Počet tandemových opakovaní sa skôr mení v dôsledku nesprávneho párovania alebo sklzu počas rekombinácie alebo replikácie v rámci sekvencie tandemového opakovania. Ako je znázornené na obrázku 8.4, udalosti tohto typu vytvoria nové alely rozšírením alebo zmenšením veľkosti lokusu. Frekvencia, s akou sa tieto udalosti vyskytujú, je funkciou počtu opakovaní v lokuse so sigmoidálnou distribúciou. CA-mikrosatelity s 10 alebo menej opakujúcimi sa jednotkami pravdepodobne nevykazujú polymorfizmus s 11 až 14 opakujúcimi sa jednotkami, existuje stredná a stúpajúca pravdepodobnosť detekcie polymorfizmu s 15 alebo viac opakujúcimi sa jednotkami, existuje maximálna pravdepodobnosť detekcie polymorfizmu (Weber , 1990 Dietrich a kol., 1992). Aby sa teda maximalizovala pravdepodobnosť detekcie polymorfizmu, mali by sme zamerať analýzy na CA-opakované lokusy, ktoré majú n >= 15. Hybridizačné skríningy môžu byť nastavené na splnenie tejto úlohy sondovaním blotov s (CA)15 oligonukleotidom za veľmi prísnych podmienok 65°C s 0,1 X SSC (Dietrich et al., 1992).

Veľký počet laboratórií teraz oznámil výsledky skúmania frekvencií, pri ktorých sa zisťujú polymorfizmy mikrosatelitov v porovnaní dvoch alebo viacerých inbredných kmeňov alebo druhov myší.Očakáva sa, že skutočné výsledky sa budú líšiť v závislosti od metódy použitej na získanie mikrosatelitov (pretože to určí spodnú hranicu pre počet opakovaní) a metódy použitej na typizáciu produktov PCR (pretože agarózové gély sú menej rozlišujúce ako polyakrylamidové gély). V analýze viac ako 300 mikrosatelitov s opakovaním CA, ktoré sú prevažne n >= 15, priemerná miera polymorfizmu približne 50% bola pozorovaná v párových porovnaniach medzi deviatimi klasickými M. musculus inbredných kmeňov najnižšia pozorovaná hladina polymorfizmu bola 35 % medzi DBA/2J a C3H/HeJ a najvyššia bola 57 % medzi B6 a LP/J (Dietrich et al., 1992). Nie je neočakávané, že pri párových porovnaniach medzi klasickými inbrednými kmeňmi a inými boli pozorované ešte vyššie úrovne polymorfizmu Mus druhu alebo poddruhu. Miera polymorfizmu medzi B6 a M. m. kastaneus bola 77 % a medzi B6 a M. spretusbolo to ㆒% (Love a kol., 1990 Dietrich a kol., 1992). Pre malý, ale významný počet lokusov, priméry navrhnuté na amplifikáciu lokusu inbredného kmeňa nedokázali amplifikovať alelický produkt z M. spretus genómu (Love et al., 1990) je to takmer určite spôsobené interšpecifickým polymorfizmom v cieľovej sekvencii rozpoznanej jedným z ohraničujúcich primerov.

Množstvo výskumníkov sa pokúsilo zmerať rýchlosť, akou sa vytvárajú nové mikrosatelitné alely. To sa dá ľahko dosiahnuť na myši, kde sú dobre zdokumentované vzťahy medzi veľkým počtom rôznych inbredných kmeňov a je možné spočítať generácie, ktoré od seba oddeľujú rôzne kmene (Bailey, 1978). Výsledky týchto štúdií naznačujú, že miera mutácia je vysoko premenlivá — v rozsahu aspoň rádovej veľkosti. Táto variabilita by mohla byť dôsledkom účinkov genómovej polohy, ale predtým, ako sa dá s istotou povedať, musí byť objasnený mechanizmus generovania alel. V doteraz najkomplexnejšej analýze Dietrich a kolegovia (1992) analyzovali priemernú rýchlosť mutácie na 300 lokusoch v rámci súboru BXD rekombinantných inbredných kmeňov. Priemerná rýchlosť mutácie bola vypočítaná ako jedna ku 22 000 na lokus za generáciu, čo je 5-50-krát viac, ako sa bežne pripisuje mutagenéze v klasických lokusoch. Táto priemerná miera "mutácie" mikrosatelitov je dostatočne vysoká na to, aby umožnila generovanie veľkého množstva polymorfizmu medzi jednotlivcami v rámci druhu, ale dostatočne nízka na to, aby jeden mohol presne sledovať segregáciu dvoch alebo viacerých alel z jednej generácie na druhú. v rámci typického genetického kríženia.

8.3.6.5 Úžasná sila mikrosatelitov

Vysoká úroveň polymorfizmu spojená s mikrosatelitmi (ako triedou) predstavuje len jednu zložku ich rýchleho vzostupu, aby sa stali "genetickým nástrojom voľby" pre mapovateľov pracujúcich so všetkými živočíšnymi druhmi. Ich jedinečnosť a sila spočíva aj v ľahkosti, s akou sa dajú odhaliť, v ľahkosti, s akou sa dajú písať na stroji, a v ľahkosti, s akou sa dajú šíriť. Na vytvorenie panelu mikrosatelitných lokusov na analýzu myšacieho genómu Todd a jeho kolegovia jednoducho hľadali v databázach EMBL a GenBank záznamy, ktoré obsahovali (CA)10, (GA)10 alebo ich doplnky (Love et al., 1990 ). Aby sa zväčšila veľkosť tohto panelu pre mapovaciu analýzu s vyšším rozlíšením, genómové knižnice skonštruované tak, aby obsahovali krátke inzerty, boli skrínované s CA-repeat sondami a pozitívne klony boli izolované a sekvenované (Cornall et al., 1991 Dietrich et al., 1992).

Pomocou kombinovaného panelu 317 mikrosatelitných lokusov vyvinulo centrum Whitehead/MIT Genome Center prvú generáciu väzbovej mapy celého myšacieho genómu s priemerným rozostupom 4,3 cM (Dietrich et al., 1992). Po zverejnení oligonukleotidových sekvencií, ktoré definujú a umožňujú typizáciu každého lokusu, sa markery stali dostupnými pre každého demokratickým spôsobom. V januári 1994 skupina Whitehead definovala a zmapovala viac ako 3 000 mikrosatelitných lokusov. 68 Aktuálne mapovanie, distribúcia kmeňov a sekvenčné informácie o všetkých týchto lokusoch je možné získať elektronicky, ako je popísané v prílohe B. Okrem toho komerčný koncern Research Genetics Inc. ešte viac uľahčil život komunite genetiky myší tým, že ponúkol každý primér pár v tomto paneli za výrazne znížené náklady v porovnaní s vlastnou syntézou DNA.

Keďže typizácia mikrosatelitov je založená na PCR a zvyčajne nie je potrebné blotting alebo sondovanie, výsledky možno získať rýchlo s minimálnymi nákladmi na často vzácny materiál a vždy drahocennými hodinami pre mužov a ženy. Dietrich a kolegovia (1992) uviedli, že dvaja vedci môžu "genotypovať nové kríženia pre celý genóm za niekoľko týždňov na kríženie", čo predstavuje rádovo zlepšenie oproti prístupom založeným na RFLP.

Mikrosatelity môžu slúžiť nielen ako značky pre anonymné lokusy, ale aj pre funkčné gény. Stallings a jeho kolegovia (1991) zistili, že 78 % klonov z knižnice myších kozmidov má CA opakovania. Ak by sa hľadali aj opakovania GA, percento mikrosatelitne pozitívnych kozmidových klonov by bolo ešte väčšie. Ešte vyššiu pravdepodobnosť identifikácie mikrosatelitných lokusov — blízko 100% — možno dosiahnuť s klonmi získanými z väčších knižníc inzertov skonštruovaných pomocou kvasinkových umelých chromozómov (YAC) alebo špeciálnych prokaryotických vektorov (pozri časť 10.3.3). Malé fragmenty, ktoré obsahujú mikrosatelit, možno subklonovať a sekvenovať, aby sa identifikoval jedinečný súbor ohraničujúcich primerov pre genetickú analýzu. Mikrosatelity možno skutočne považovať za univerzálne činidlá genetického mapovania.

Počas osemdesiatych rokov 20. storočia viedli ťažkosti pri hľadaní RFLP medzi klasickými inbrednými kmeňmi k vzniku medzidruhového kríženia medzi M. musculus-odvodený inbredný kmeň a M. spretus —, ktorý sa stal kritickým nástrojom pre vývoj prvých máp myšacieho genómu založených na lokusoch DNA s vysokým rozlíšením (Avner a kol., 1988 Copeland a Jenkins, 1991 a časť 9.3). Medzidruhové panely spätného kríženia stále predstavujú výkonný nástroj na mapovanie novo charakterizovaných klonov DNA. S mikrosatelitmi je však teraz možné vrátiť sa ku klasickým kríženiam medzi nimi M. musculus kmene na mapovanie zaujímavých fenotypových variantov, ako je uvedené v časti 9.4.


8 najlepších techník používaných v genomike &ndash Vysvetlené!

Tu uvádzame podrobnosti o ôsmich najlepších technikách používaných v genomike.

Osem techník je: (1) izolácia genómovej DNA, (2) separácia DNA, (3) rezanie a spojenie DNA, (4) klonovanie a vektory, (5) detekcia záujmového génu, (6) rekombinantná DNA a Klonovanie, (7) produkcia viacerých kópií DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a (8) sekvenovanie DNA.

1. Izolácia genómovej DNA:

Keďže DNA je prítomná v jadre bunky, používa sa mnoho metód na narušenie vonkajších bariér, ako je extracelulárna matrica, jadrový obal a bunková stena v prípade rastlín.

Tie sa dosahujú ošetrením tkaniva alebo bunky rôznymi typmi detergentov, ktoré rozpúšťajú vonkajšie bariéry. V prípade rastlinných buniek sa používajú niektoré enzýmy ako celuláza, pektináza, celobiozidáza, xylanáza atď., ktoré rozkladajú bunkovú stenu.

Akonáhle je bunka rozbitá, úlomky (extracelulárna matrica, membrána atď.) sú odstránené vysokorýchlostnou centrifugáciou. Po odstredení sa nežiaduce proteíny a RNA odstránia pôsobením enzýmov, ako je proteáza (rozklad proteínov) a RNAza (rozklad RNA).

Na izoláciu veľmi čistej formy DNA sa používa technika nazývaná ultracentrifugácia s hustotným gradientom (obr. 81). Pritom sa rôzne bunkové zložky umiestnia na gradient s rôznymi hustotami (používa sa NaCl a sacharóza) a odstredia sa pri veľmi vysokej rýchlosti 40 000 otáčok za minútu až 70 000 (ot./min.).

Keďže rôzne bunkové zložky majú rôzne hustoty, migrujú a zastavujú sa na gradiente, kde sa ich hustota rovná hustote NaCl a sacharózy. Týmto spôsobom sa DNA tiež zastaví pri určitej hustote a je extrahovaná z gradientovej skúmavky.

2. Separácia DNA:

Molekuly DNA sú negatívne nabité, takže keď sú vystavené elektrickému poľu, pohybujú sa z negatívnej na pozitívnu elektródu. Na pohyb DNA pod vplyvom elektrického prúdu sa používa médium, ktoré sa nazýva gél. Je to polotuhá látka vyrobená z polymérov ako agaróza, polyakrylamid atď.

Tento gélujúci materiál tvorí poréznu sieť vlákien a molekuly DNA sa pohybujú cez tieto póry. Na separáciu veľkých molekúl DNA sa používa agarózový gél a na separáciu malých fragmentov DNA sa používa polyakrylamidový gél. Táto metóda sa nazýva gélová elektroforéza. Na gélovú elektroforézu sa používa pufor, ktorý sa podieľa na vedení prúdu cez gél.

Keď sa molekuly DNA pohybujú z negatívnej elektródy na pozitívnu, väčšie molekuly DNA sa pohybujú pomaly a sú bližšie k zápornému pólu. Menšie molekuly DNA sa pohybujú rýchlejšie a sú umiestnené viac smerom ku kladnému pólu. Tento jav je znázornený na obr. 8.2.

3. Rezanie a spájanie DNA:

Technológia rekombinantnej DNA zahŕňa predovšetkým presné rezanie a spájanie molekúl DNA. Na rezanie DNA na určitom mieste sa používajú špeciálne typy enzýmov, ktoré sa nazývajú reštrikčné enzýmy. Charakteristickým znakom reštrikčného enzýmu je, že rozpoznáva špecifickú sekvenciu (nukleotidy) na molekulách DNA a štiepi v tomto mieste. Týmto presným rezaním vytvárajú kompatibilné konce molekuly DNA, ktoré je možné neskôr spojiť.

Typ sekvencie, ktorý je rozpoznávaný reštrikčnými enzýmami, sa nazýva palindrómová sekvencia (sú to sekvencie, ktoré sú navzájom zrkadlovým obrazom – obr. 8.3). Akonáhle je DNA rozrezaná reštrikčným enzýmom, dva kusy akejkoľvek molekuly DNA môžu byť spojené ďalším enzýmom nazývaným ligáza.

4. Klonovanie a vektory:

Na vloženie časti cudzej DNA a na propagáciu fragmentu DNA na produkciu vo veľkom meradle sa používa vektor. Vektory sú klonovacie vehikulá, ktoré sa môžu replikovať vo vhodnom hostiteľovi. Na molekulárne klonovanie sa používa mnoho rôznych typov vektorov – sú to hlavne plazmid (kruhová dvojvláknová molekula DNA), kozmid (kruhové molekuly DNA, ktoré môžu byť zabalené aj vo vnútri vírusu), bakteriofág (vírus infikujúci rôzne bakteriálne kmene) atď. ( Miller, 1992).

Akonáhle je vybraný vhodný vektor, je štiepený reštrikčným enzýmom, aby sa vytvorilo miesto pre inzerciu cudzej DNA. Potom sa cudzia DNA liguje do vektora a prenesie sa do hostiteľskej bunky, kde sa vektor spolu s cudzou DNA môže množiť. Na výber vektora vo vnútri hostiteľskej bunky sa používajú rôzne typy voliteľných markerov - ako je rezistencia na antibiotiká atď.

5. Detekcia génu záujmu:

Na detekciu konkrétneho požadovaného génu sú bežne používané techniky Southern Hybridization, Colony Hybridization, Dot blot (Sambrook et al. 1989). Princíp týchto metód je jednoduchý. Molekula DNA, ktorá nás zaujíma a ktorú chceme detekovať, sa nazýva Cieľ.

Molekula DNA so známou sekvenciou, s ktorou ideme detekovať cieľovú molekulu v zmesi inej molekuly DNA, sa nazýva sonda. Sonda sa pripraví začlenením rádioaktívneho izotopu fosfátu. Zvyčajne sa používa P 32 alebo P 33 rádioizotop fosfátu. P32 alebo P33 je začlenený do dATP, ktorý je stavebným blokom DNA. Tie sú potom začlenené do molekuly sondy procesom nazývaným Labeling.

Pri južnej hybridizácii sa cieľová molekula DNA separuje podľa svojej molekulovej hmotnosti elektroforézou na agarózovom alebo polyakrylamidovom géli. Potom sa DNA v géli denaturuje (DNA sa stane jednovláknovou) pomocou alkálie, ako je NaOH. Po denaturácii sa DNA prenesie na pevný povrch, ako sú membrány vyrobené z nylonu alebo nitrocelulózy.

DNA prenesená na membránu sa použije ako replika a hybridizuje sa s rádioaktívne značenou sondou. Po ukončení hybridizácie sa membrána premyje puframi, aby sa odstránila nešpecifická väzba sondy.

Membrána sa potom vysuší a vloží do röntgenovej autorádiografickej kazety. Po expozícii sondy viazanej na membránu röntgenovým filmom sa rádioaktívny signál deteguje na röntgenovej fólii. Signál zodpovedá pozícii požadovaného génu.

6. Rekombinantná DNA a klonovanie:

Rekombinantná DNA je chimérická molekula DNA, ktorá obsahuje DNA z jedného zdroja a určitá časť molekuly DNA je z iného zdroja. Ako bolo vysvetlené vyššie, molekula DNA môže byť presne narezaná v určitom bode pomocou reštrikčných enzýmov. Keď sú dve molekuly DNA štiepené konkrétnym reštrikčným enzýmom a potom sú spojené enzýmom nazývaným ligáza, výsledná molekula DNA sa nazýva chimérická alebo rekombinantná molekula DNA.

Klonovanie znamená vytvorenie presnej kópie akéhokoľvek materiálu. Je to ako stroj Xerox, ktorý stále vytvára rovnakú kópiu dokumentu. Klonovanie je nevyhnutnou súčasťou technológie rekombinantnej DNA. Klonovanie molekuly DNA znamená produkciu identických kópií tejto molekuly DNA. V tomto prípade je molekula DNA spojená s vektorom alebo vehikulom (čo je vysvetlené v predchádzajúcej časti).

Vektor obsahuje informácie pre replikáciu, ktorá je tiež známa ako začiatok replikácie. V dôsledku prítomnosti pôvodu replikácie vo vektorovej DNA sa vektor po zavedení do hostiteľskej bunky replikuje. Keď dôjde k replikácii vektora, produkuje tiež veľké kópie svojej vlastnej a tiež cudzej DNA (obr. 8.4).

7. Výroba viacerých kópií DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR):

Pomocou PCR možno vytvoriť viacero kópií molekuly DNA. V roku 1983 biochemik Kary Mullis stanovil princíp polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Toto je možné vykonať iba vtedy, ak sú známe časti príslušnej sekvencie. Pritom sa templátová molekula DNA (z ktorej chceme vytvoriť viacero kópií) denaturuje pri vysokej teplote 94°- 95°C (DNA sa stáva jednovláknovou formou).

Potom sa pridajú krátke jednovláknové DNA známe ako priméry (oligonukleotidy zvyčajne dlhé 20-25 báz). Označujú počiatočný bod syntézy DNA po pridaní DNA polymerázy a deoxynukleozidtrifosfátov. Priméry sú homológy k sekvencii templátovej DNA.

Priméry sa viažu na sekvenciu homológov na templátovej DNA a tento proces sa nazýva anelácia. Vyberú sa dva priméry, ktoré svojou polohou na fragmente DNA zabezpečia, že syntéza začne na opačných koncoch fragmentu, pričom treba mať na pamäti, že enzymatická polymerizácia prebieha od 5′ do 3′. Po žíhaní sa pridá termostabilná DNA polymeráza nazývaná Taq polymeráza (odvodená z tepelne stabilnej baktérie Thermus aquaticus a pracuje pri 72 °C).

Táto termostabilná polymeráza je aktívna aj pri vyšších teplotách ako 94°-95°C. Táto polymeráza neustále pridáva komplementárne bázy k primerom a syntetizuje sa nová molekula DNA. Celý tento proces sa niekoľkokrát opakuje a zakaždým sa nazýva cyklus. Z tohto dôvodu sa táto technika nazýva polymerázová reťazová reakcia (PCR).

V PCR sa DNA amplifikuje exponenciálnym spôsobom. To znamená, že z jednej molekuly DNA sa vyrobia dve molekuly DNA. Tieto dve molekuly DNA slúžia ako templáty v ďalšom cykle a tvoria štyri molekuly DNA. Celý tento proces sa cyklicky opakuje.

Opakovaná zmena teploty na dokončenie rôznych krokov v cykle PCR sa vykonáva v zariadení nazývanom Thermal Cycler (PCR stroj). Ide o mikroprocesorovo riadené zariadenie na báze Peltierovej technológie, ktoré je schopné rýchlej zmeny teploty v priebehu niekoľkých sekúnd (obr. 8.5).

PCR sa používa nielen na amplifikáciu genómovej DNA, ale aj na detekciu a analýzu expresie RNA, ako aj na klonovanie exprimovaných génov. V týchto prípadoch procesu amplifikácie predchádza reakcia reverznej transkriptázy (RT). Z RNA materiálu na analyzovanú sa syntetizuje jednovláknová cDNA. Toto je známe ako RT-PCR.

8. Sekvenovanie DNA:

Na určenie sekvencie úseku DNA sa používa technika známa ako Sangerova metóda di+deoxy sekvenovania. Pri tejto metóde sa DNA denaturuje a primér sa nechá napojiť na vlákno DNA. Potom sa uskutoční polymerizačná reakcia v prítomnosti Klenowovej DNA polymerázy a dNTP (deoxyribonukleotidtrifosfát). Zvyčajne sa uskutočňujú štyri reakcie a pri každej reakcii sa spolu so zmesou dNTP používa di+deoxynukleotidtrifosfát (dd-NTP) – napr. dd-ATP, dd-GTP, dd-CTP, dd-TTP (obr. 8.6).

Princíp reakcie spočíva v tom, že DNA polymeráza syntetizuje komplementárne vlákno DNA a počas syntézy, keď je začlenený derivát dd-NTP, sa reakcia zastaví, pretože na 3′ nebude k dispozícii žiadna voľná hydroxylová skupina. koniec. Týmto procesom sa vyrobia fragmenty rôznej dĺžky, ktoré budú na 5′ konci opätovne označené.

Tieto malé fragmenty sa potom rozložia v sekvenčnom géli Acylamid-Urea a vykoná sa autorádiografia, aby sa zistila presná poloha pásov. Z polohy prúžkov môžeme určiť sekvenciu DNA, keďže najnižší prúžok (najmenší prúžok) bude prvou bázou, na ktorej je sekvencia ukončená.


Veda za testom na vírus COVID-19

Nový test Mayo Clinic na vírus, ktorý spôsobuje COVID-19, je opísaný v nedávnej tlačovej správe ako test PCR. Hoci väčšina nebude vedieť, čo to znamená, PCR je dobre používaný nástroj v laboratórnych a lekárskych testoch. Larry Pease, Ph.D., imunológ z Mayo Clinic a profesor bunkovej biológie Gordon H. a Violet Bartels a Kyle Rodino, Ph.D., klinický mikrobiológ, vysvetľujú, ako tento test funguje.

Na začiatok, PCR znamená laboratórnu techniku ​​známu ako polymerázová reťazová reakcia. V tomto teste je cieľom selektívne amplifikovať stopové množstvá genetického materiálu, identifikovať špecifické časti DNA. Len pre pripomenutie, DNA je genetický kód, ktorý je prítomný v každej bunke v tele. Keď sa bunka delí, skopíruje DNA, pričom tieto dva vlákna oddelí a potom skopírovaním šablóny vytvorí nový reťazec DNA. PCR napodobňuje to, čo sa normálne deje v bunkách.

Mayo Clinic oznamuje 12. marca 2020, že vyvinula test, ktorý dokáže odhaliť vírus SARS-CoV-2 v klinických vzorkách. Vírus SARS-CoV-2 spôsobuje COVID-19.

DNA sa používa, pretože na najrozlišujúcejšej úrovni vám štruktúra DNA môže povedať, na aký organizmus sa pozerá. V prípade ľudí môže PCR identifikovať osobu pomocou jej genetického podpisu. V prípade COVID-19 výskumníci zverejnili viac ako 100 genómov zozbieraných od pacientov, aby identifikovali kľúčové znaky vírusu SARS-CoV-2, ktorý spôsobuje toto ochorenie.

PCR funguje iba na DNA a vírus COVID-19 používa RNA ako svoj genetický kód. RNA je podobná DNA, ale má iba jeden reťazec. Našťastie, vírusové enzýmy na premenu RNA na DNA boli objavené pred desiatkami rokov a boli spolu s PCR využité na nájdenie jedinečných podpisov aj v RNA. V tomto prípade sa PCR označuje ako PCR s reverznou transkripciou alebo RT-PCR.

Najprv osoba s príznakmi COVID-19 zavolá svojmu miestnemu poskytovateľovi zdravotnej starostlivosti a spýta sa, ako sa má vyšetriť. Pamätajte: Najprv zavolajte. Nechoďte na kliniku alebo nemocnicu bez toho, aby ste zavolali, aby ste zistili, ako sa najbezpečnejšie testovať. Keď pacient dorazí na bezpečné miesto testovania, zdravotnícky tím odoberie vzorku. Zvyčajne to znamená, že človeku sa do nosa alebo úst vloží úzky tampón na zber buniek zo zadnej časti hrdla.

"Vzorka z horných dýchacích ciest, najmä výter z nosohltanu, je najbežnejšou vzorkou, ktorá sa odoberá na spoľahlivé zistenie vírusu," hovorí Dr. Rodino. "Niektoré vzorky z dolných dýchacích ciest, ako je spútum, sú v niektorých podmienkach tiež prijateľné."

V laboratóriu sa vzorka spracuje, takže sa RNA izoluje a odoberie. Všetko ostatné je odstránené. RNA je zmiešaná s ďalšími zložkami: enzýmami (DNA polymeráza a reverzná transkriptáza), stavebnými blokmi DNA, kofaktormi, sondami a primérmi, ktoré rozpoznávajú a viažu sa na SARS-CoV-2.

Potom sa vírusová RNA prevedie na kópiu DNA a táto jediná kópia sa potom prevedie na milióny kópií pomocou PCR, ktoré možno ľahko detegovať.

Proces je nasledovný: Použitím tepla a enzýmov sa konvertované vlákna vírusovej DNA oddelia. Krátke priméry DNA zodpovedajúce komplementárnemu vláknu templátu vírusovej DNA sa zlepia a fungujú ako umelé štartovacie miesto pre syntézu DNA.

Chemické stavebné bloky DNA sa pridajú a spoja, čím sa predĺži syntetický primér DNA, čím sa vytvorí kópia templátu vírusovej DNA. Druhý primér vyrobený v opačnej orientácii za prvým primérom je tiež prítomný v reakcii. To vytvára kópiu, ktorá je komplementárna k prvému syntetizovanému vláknu.

Po jednom kole syntézy DNA sa reakčná zmes zahreje, aby sa roztopili dve vlákna od seba, čím sa vygenerujú dva templáty, ktoré sa môžu ďalej amplifikovať v ďalšom kole. Kópie sa hromadia, kolo za kolom, exponenciálne, takže sa vytvárajú milióny a milióny kópií, ktoré sa majú študovať konvenčnými prístupmi.

Pretože enzýmy a chemikálie pridané do reakčnej skúmavky sú relatívne odolné voči teplu – „Enzýmy citlivé na teplo sú izolované z tepelne odolných baktérií z horúcich prameňov,“ hovorí Dr. Pease – reakcia môže prebiehať automatizovaným spôsobom zahrievania, chladenia a syntéza DNA. Dokončenie testu a získanie výsledkov trvá len hodiny.

Ak je vo vzorke prítomná komplementárna DNA SARS-CoV-2, priméry môžu kopírovať cieľové oblasti. Keď tieto oblasti kopírujú, sondy prilepené na tieto nové fragmenty uvoľňujú vizuálny signál, ktorý dokáže prečítať prístroj použitý v tomto procese.

"Milióny kópií zosilňujú tento signál, takže ho možno ľahko detegovať ako pozitívny výsledok. Ak vírus nie je prítomný, sondy sa neprilepia, nedochádza k uvoľneniu signálu a je to negatívny výsledok," vysvetľuje Dr. Rodino.

Tento typ analýzy sa používa na výskum a klinické laboratórne testovanie. PCR dokáže odhaliť všetky typy baktérií, parazitov, vírusov a húb, počnúc DNA alebo RNA. Zatiaľ čo princíp a zložky sú podobné, každé použitie vyžaduje špecifické priméry alebo sondy na detekciu rôznych organizmov. Preto bolo potrebné vyvinúť niečo pre SARS-CoV-2 od začiatku. Počas vývoja sú tieto druhy testov vylepšené, aby sa zaistilo, že sú veľmi dobré pri zisťovaní organizmu záujmu (citlivé) a aby sa zabezpečilo, že test neukáže pozitívny výsledok, keď tam organizmus nie je (špecifický).

"Dôležitosť krokov zahrnutých v PCR bola ocenená radom Nobelových cien v priebehu desaťročí," hovorí Dr. Pease. "Lekárska veda napreduje v dôsledku základných objavov o molekulárnom základe živých systémov a toto je jeden príklad toho, ako sa tieto objavy spájajú, aby vyriešili dôležitý problém v našich životoch."

Ako výskumný a klinický tím boli experti z Mayo schopní spustiť test PCR na SARS-CoV-2 v priebehu niekoľkých týždňov, čo zvyčajne trvá mesiace až roky.


Metódy detekcie interakcií proteín-DNA

Metóda chromatínovej imunoprecipitácie (ChIP) sa môže použiť na monitorovanie regulácie transkripcie prostredníctvom modifikácie histónov (epigenetika) alebo väzbových interakcií transkripčného faktora a DNA. Metóda testu ChIP umožňuje analýzu interakcií DNA-proteín v živých bunkách ošetrením buniek formaldehydom alebo inými sieťovacími činidlami, aby sa stabilizovali interakcie pre následné čistenie a detekciu. Vykonávanie testov ChIP vyžaduje znalosť cieľového proteínu a sekvencie DNA, ktorá sa bude analyzovať, pretože výskumníci musia poskytnúť protilátku proti požadovanému proteínu a priméry PCR pre požadovanú sekvenciu DNA. Protilátka sa používa na selektívnu precipitáciu komplexu proteín-DNA z iných fragmentov genómovej DNA a komplexov proteín-DNA. PCR priméry umožňujú špecifickú amplifikáciu a detekciu cieľovej sekvencie DNA. Technika kvantitatívnej PCR (qPCR) umožňuje kvantifikovať množstvo cieľovej sekvencie DNA. ChIP test je prístupný formátom založeným na poli (ChIP-on-chip) alebo priamemu sekvenovaniu DNA zachytenej imunoprecipitovaným proteínom (ChIP-seq).

  • zachytiť snímku špecifického proteínu – DNA
    interakcie, aké sa vyskytujú v živých bunkách
  • kvantitatívne v spojení s qPCR analýzou
  • schopnosť profilovať promótor pre rôzne proteíny
  • výskumník potrebuje získať protilátky triedy ChIP
  • vyžaduje navrhnutie špecifických primérov
  • ťažké prispôsobiť sa vysokovýkonnému skríningu

Sprievodca krok za krokom k úspešným testom imunoprecipitácie chromatínu (ChIP).

Tento aktualizovaný prehľad postupu ChIP obsahuje ďalšie podrobnosti o výbere primárnej protilátky (t. j. protilátky validované ChIP). Aplikačná poznámka tiež opisuje a poskytuje príklady chromatínovej imunoprecipitácie (ChIP) ako techniky na štúdium epigenetiky, pretože umožňuje výskumníkom zachytiť snímku špecifických interakcií proteín-DNA.

Naša 72-stranová technická príručka k proteínovým interakciám poskytuje protokoly a technické a produktové informácie, ktoré vám pomôžu maximalizovať výsledky štúdií interakcií s proteínmi. Príručka poskytuje základné informácie, užitočné rady a rady na riešenie problémov pre imunoprecipitačné a koimunoprecipitačné testy, pull-down testy, ďaleký western blotting a zosieťovanie. Príručka obsahuje aj rozšírenú časť o metódach na štúdium interakcií proteín-nukleová kyselina, vrátane ChIP, EMSA a RNA EMSA. Príručka je základným zdrojom pre každé laboratórium, ktoré študuje proteínové interakcie.

Obsah zahŕňa: Úvod do proteínových interakcií, Koimunoprecipitačné testy, Pull-down testy, Far-western blotting, Mapovanie proteínových interakcií, Kvasinkové dvojhybridné reportérové ​​testy, Elektroforetické testy posunu mobility [EMSA], Chromatínové imunoprecipitačné testy (ChIP), Proteín – konjugáty nukleových kyselín a ďalšie.

Uč sa viac

Vyberte produkty

Test posunu elektroforetickej mobility DNA (EMSA) sa používa na štúdium proteínov viažucich sa na známe DNA oligonukleotidové sondy a možno ho použiť na hodnotenie stupňa afinity alebo špecifickosti interakcie. Táto technika je založená na pozorovaní, že komplexy proteín-DNA migrujú pomalšie ako voľné molekuly DNA, keď sú podrobené nedenaturačnej elektroforéze na polyakrylamidovom alebo agarózovom géli. Pretože rýchlosť migrácie DNA je posunutá alebo spomalená po väzbe na proteín, test sa tiež označuje ako test gélového posunu alebo gélovej retardácie. Pridanie protilátky špecifickej pre proteín k väzbovým zložkám vytvára ešte väčší komplex (protilátka–proteín–DNA), ktorý migruje počas elektroforézy ešte pomalšie. Toto je známe ako „superposun“ a možno ho použiť na potvrdenie identity proteínov. Až do koncepcie EMSA sa interakcie proteín-DNA študovali predovšetkým pomocou testov viazania nitrocelulózového filtra pomocou rádioaktívne značených sond.

  • detegovať proteíny viažuce DNA z lyzátov s nízkym výskytom
  • testujú mutácie väzobného miesta s použitím mnohých konfigurácií sondy s rovnakým lyzátom
  • test väzbovej afinity prostredníctvom mutačnej analýzy sondy DNA
  • nerádioaktívna EMSA možná s použitím biotinylovaných alebo fluorescenčne značených sond DNA
  • analyzovať interakcie proteín-DNA in vitro
  • ťažko kvantifikovať
  • je potrebné vykonať test superposun s protilátkou, aby sa zabezpečila identita proteínu v komplexe

Tradične boli DNA sondy rádioaktívne značené 32P začlenením [y-32P]dNTP počas 3' vyplňovacej reakcie s použitím Klenowovho fragmentu alebo 5' koncovým značením pomocou [y-32P]ATP a T4 polynukleotidkinázy. Po elektroforéze sa gél vystaví röntgenovému filmu, aby sa zdokumentovali výsledky. Súprava Thermo Scientific LightShift Chemiluminescent EMSA Kit je nerádioaktívny test, ktorý poskytuje robustný a citlivý výkon. Súprava obsahuje činidlá na nastavenie a prispôsobenie reakcií viazania DNA, kontrolnú sadu DNA a proteínového extraktu na testovanie systému súpravy, stabilizovaný konjugát streptavidín-HRP na sondu pre biotínom značený DNA cieľ a výnimočne citlivý chemiluminiscenčný substrátový modul na detekciu.

Chemiluminiscenčná EMSA štyroch rôznych komplexov DNA-proteín. Cieľové duplexy značené biotínom mali veľkosť od 21 do 25 bp. Transkripčné faktory Oct-1, AP1 a NF-KB boli odvodené z jadrového extraktu HeLa. Extrakt EBNA-1 sa poskytuje ako kontrola v súprave LightShift Chemiluminescent EMSA Kit. Neznačené špecifické kompetitívne sekvencie (ak sa použili) boli prítomné v 200-násobnom molárnom nadbytku oproti označenému cieľu. Časy expozície röntgenového filmu pre každý systém sa pohybovali od 2 minút pre EBNA, Oct-1 a AP1 a 5 minút pre NF-KB.


End-Point RT-PCR: Relatívna vs. konkurenčná vs. porovnávacia

Napriek rýchlemu pokroku v oblasti chémie a prístrojového vybavenia na detekciu PCR v reálnom čase zostáva koncová RT-PCR stále veľmi bežne používanou technikou na meranie zmien v génovej expresii v malých počtoch vzoriek.

Koncová RT-PCR sa môže použiť na meranie zmien v úrovniach expresie pomocou troch rôznych metód: relatívnej, kompetitívnej a komparatívnej. Najbežnejšie používané postupy na kvantifikáciu výsledkov RT-PCR v koncovom bode sa spoliehajú na detekciu fluorescenčného farbiva, ako je etídiumbromid, alebo na kvantifikáciu produktu PCR značeného P32 pomocou fosforimageru alebo v menšej miere na scintilačné počítanie.

Relatívna kvantifikácia porovnáva množstvo transkriptov naprieč viacerými vzorkami pomocou koamplifikovanej internej kontroly na normalizáciu vzorky. Výsledky sú vyjadrené ako pomery génovo špecifického signálu k internému kontrolnému signálu. To poskytuje korigovanú relatívnu hodnotu pre génovo špecifický produkt v každej vzorke. Tieto hodnoty možno porovnať medzi vzorkami na odhad relatívnej expresie cieľovej RNA vo vzorkách, napríklad 2,5-krát viac IL-12 vo vzorke 2 ako vo vzorke 1.

Absolútna kvantifikácia pomocou kompetitívnej RT-PCR meria absolútne množstvo (napr. 5,3 x 105 kópií) špecifickej sekvencie mRNA vo vzorke. Zriedenia syntetickej RNA (identické v sekvencii, ale o niečo kratšie ako endogénny cieľ) sa pridajú k replikátom vzorky RNA a sú koamplifikované s endogénnym cieľom. PCR produkt z endogénneho transkriptu sa potom porovná s koncentračnou krivkou vytvorenou syntetickou "konkurentnou RNA".

Porovnávacia RT-PCR napodobňuje kompetitívnu RT-PCR v tom, že cieľová správa z každej vzorky RNA súťaží o amplifikačné činidlá v rámci jednej reakcie, vďaka čomu je technika spoľahlivo kvantitatívna. Pretože cDNA z oboch vzoriek má rovnaké väzbové miesto priméru PCR, jedna vzorka pôsobí ako kompetitívna pre druhú, takže nie je potrebné syntetizovať kompetitívnu sekvenciu RNA.

Relatívne aj kompetitívne techniky kvantifikácie RT-PCR vyžadujú pilotné experimenty. V prípade relatívnej RT-PCR pilotné experimenty zahŕňajú výber metódy kvantifikácie a určenie exponenciálneho rozsahu amplifikácie pre každú mRNA, ktorá je predmetom štúdie. Pre kompetitívnu RT-PCR sa musí syntetizovať transkript syntetického kompetitora RNA a použiť ho v pilotných experimentoch na určenie vhodného rozsahu pre štandardnú krivku. Porovnávacia RT-PCR poskytuje podobnú citlivosť ako relatívna a kompetitívna RT-PCR, ale vyžaduje podstatne menšiu optimalizáciu a nevyžaduje syntézu konkurenta.


METODICKÉ ASPEKTY

Test PCR v diagnostike zahŕňa niekoľko kritických krokov, ako je extrakcia DNA zo vzoriek, amplifikácia PCR a detekcia amplikónov. Najmä ak sa pomocou PCR testujú špecifické klinické vzorky, ako je CSF, v ktorých je prítomných len niekoľko baktérií, každý postup musí byť starostlivo navrhnutý a vykonaný.

CSF sa široko používa na diagnostiku chorôb centrálneho nervového systému (CNS). Pretože CSF má dôležité funkcie vrátane odpruženia mozgu, udržiavania konštantného intrakraniálneho tlaku, poskytovania živín a odstraňovania toxických metabolitov z CNS, z CSF možno získať nepriame hodnotenie stavu mozgu. Keďže CSF sa považuje za bezmikrobný, detekcia mikróbov v CSF, dokonca aj v nízkych počtoch, poskytuje cenné informácie o možnej infekcii. Je však potrebné poznamenať, že detekcia mikróbov v CSF nie vždy naznačuje infekciu CNS, pretože poškodenie hematoencefalickej bariéry môže umožniť prechod mikróbov. Napriek tomu je detekcia, identifikácia a kvantifikácia mikroorganizmov v CSF dôležitá pri diagnostike meningitídy a iných infekcií CNS. Najnovšie štúdie poukazujú najmä na možné zapojenie mikroorganizmov do špecifických ochorení CNS, vrátane Alzheimerovej choroby a SM (3, 30, 45, 56). Preto je detekcia aj niekoľkých mikroorganizmov v CSF štandardizovaným protokolom kritickou záležitosťou pre diagnostiku takýchto ochorení. Normálny dospelý produkuje približne 500 ml CSF za deň, pričom približne 150 ml CSF v CNS v akomkoľvek danom čase (34). Dostupné množstvo CSF ​​a počet odberov vzoriek na diagnostiku sú teda obmedzené. Vykonanie PCR s použitím vzorky CSF sa preto stane diagnostickým testom prvej línie pre infekcie CNS (11, 33) kvôli citlivosti vyžadujúcej len obmedzené množstvo CSF, špecifickosti testu a rýchlosti. V skutočnosti bolo hlásených množstvo pokusov s použitím PCR na detekciu širokého spektra baktérií vo vzorkách CSF (37, 38, 42, 66). Citlivosť a špecifickosť PCR testu na detekciu patogénov však nemusí byť lepšia ako pri kultivačnom teste, ktorý bol štandardizovaný a validovaný pre väčšinu patogénov, kvôli spoľahlivosti citlivosti PCR na proces testu. Preto môže byť negatívny výsledok PCR použitý so strednou istotou na vylúčenie diagnózy infekcie (33).

Stabilita cieľovej bakteriálnej DNA počas skladovania CSF je dôležitou praktickou záležitosťou v klinických laboratóriách. K dispozícii sú však len obmedzené informácie o účinkoch rôznych podmienok manipulácie a skladovania na stabilitu bakteriálnej DNA v CSF. Vystavenie CSF rôznym podmienkam prostredia, ako je izbová teplota oproti 4ଌ po dobu až 96 hodín a zmrazenie a rozmrazenie až trikrát, neovplyvňuje schopnosť vysoko citlivého testu PCR detekovať bakteriálnu DNA vo vzorkách CSF (60 ). Táto správa však testovala len obmedzené podmienky prostredia. Preto je na detekciu mikróbov po amplifikácii PCR stále nevyhnutné správne skladovanie a manipulácia s CSF.

Kontaminácia.

Keďže PCR je založená na amplifikácii DNA, môžu sa ľahko vyskytnúť falošne pozitívne alebo negatívne výsledky. Najmä jeden cyklus PCR vedie k veľmi veľkému počtu amplifikovateľných molekúl, ktoré môžu potenciálne kontaminovať následné amplifikácie rovnakej cieľovej sekvencie (39). V skutočnosti bol primárny zdroj falošne pozitívnych reakcií identifikovaný ako prenos amplifikovaného produktu z predchádzajúcich reakcií (41). Kontaminácia reagencií, pipetovacích zariadení, laboratórnych povrchov alebo dokonca pokožky pracovníkov (35) môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom. Na kontrolu takejto prenosovej kontaminácie je potrebné zabrániť fyzickému prenosu DNA medzi amplifikovanými vzorkami a medzi pozitívnymi a negatívnymi experimentálnymi kontrolami. Na tento účel musí byť príprava vzoriek na test PCR v miestnosti alebo v digestore oddelenom od miestnosti, v ktorej sa vykonávajú reakcie. Použitie špičky pipety s aerosólovou bariérou je nevyhnutné na zabránenie krížovej kontaminácii, ako aj prenosovej kontaminácii. Vystavenie UV žiareniu je tiež schopné zničiť kontaminujúce amplikóny, ale je účinné len na povrchoch a s amplikónmi väčšími ako 300 bp (19). Použitie uracilu N-glykozyláza (UNG) na štiepenie dUTP začleneného do produktov PCR sa považuje za účinný protokol na enzymatické zabránenie prenosu amplikónovej kontaminácie (41), najmä v klinickom laboratóriu, ktoré vo veľkej miere vykonáva PCR. Toto sa vykonáva nahradením dUTP za dTTP a pridaním UNG do základnej zmesi. Na ochranu produktu obsahujúceho dUTP sa musí UNG pred ďalšou analýzou produktu PCR inaktivovať chemicky alebo teplom. Preto protokol dUTP vyžaduje iba dve zmeny v štandardnom protokole PCR: náhradu dUTP za dTTP vo všetkých reakciách a inkubáciu všetkých zmesí PCR s UNG pred teplotnými cyklami. V skutočnosti bol tento protokol úspešne aplikovaný na detekciu Toxoplasma gondii v CSF, ako aj v iných klinických vzorkách (46).

Extrakcia DNA.

Pretože klinické vzorky majú inhibítory PCR, ako je hemín, ktorý sa viaže na Taq polymerázou a inhibuje jej aktivitu (10), je dôležitá purifikácia DNA, aby sa predišlo takýmto účinkom. V skutočnosti sa inhibítory často detegujú vo vzorkách CSF (14) a varenie CSF nestačí na odstránenie inhibítorov, ktoré ovplyvňujú detekciu mikróbov pomocou PCR (9). Výťažok extrakcie cieľovej DNA je tiež kritickým faktorom pri PCR detekcii baktérií v klinických vzorkách, najmä ak sa očakáva, že vo vzorkách bude len niekoľko baktérií. Keďže baktérie majú pevnú bunkovú stenu, ktorá môže odolávať bežnému protokolu štiepenia na extrakciu DNA, extrakčný protokol pre bakteriálnu DNA v klinických vzorkách by mal byť dodatočným faktorom pri príprave vzorky.

Klasický protokol extrakcie DNA je založený na čistení organickými rozpúšťadlami, ako je fenol-chloroform, po ktorom nasleduje precipitácia etanolom. Precipitáty získané z CSF obsahujúce len niekoľko baktérií môžu obsahovať príliš málo materiálu a nemusia byť viditeľné. Preto môže manipulácia s týmito precipitátmi vyžadovať dohady, najmä počas premývania zrazenín. Zdá sa teda pravdepodobné, že výsledný výťažok bakteriálnej DNA z CSF len s niekoľkými baktériami nemusí byť konzistentný. V tejto súvislosti nedávna štúdia vyvinula nový protokol na purifikáciu DNA s použitím nosičov v pevnej fáze, ktoré selektívne absorbujú nukleové kyseliny (7). Tento protokol je založený na povahe nukleových kyselín, ktoré sa môžu viazať na častice oxidu kremičitého alebo skla v prítomnosti chaotropných činidiel, ako je NaI alebo NaClO4 (44, 62, 65). Takýmto protokolom je chaotropná extrakcia filtrom DNA zo sklenených vlákien (GFX Pharmacia Biotech, Milwaukee, Wisconsin) a na izoláciu DNA využíva matricu zo sklenených vlákien.Súprava na izoláciu DNA založená na metóde guľôčok guanidíniumizotiokyanát-oxid kremičitý (7) je tiež komerčne dostupná (izolačná súprava NucliSens Organon Teknika, Durham, NC). Výsledkom súpravy na izoláciu NucliSens je dostatočný výťažok DNA a vysoko reprodukovateľná PCR pre β-globín na fixovaných bunkách (16). Neexistuje však žiadna správa týkajúca sa použitia takýchto súprav na izoláciu bakteriálnej DNA z klinických vzoriek. Fahle a Fischer (22) skúmali účinnosť izolácie vírusovej DNA z klinických vzoriek, vrátane CSF, pomocou šiestich rôznych komerčných súprav na extrakciu DNA. V správe sa dospelo k záveru, že súprava na izoláciu NucliSens a izolačná súprava Puregene DNA (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) boli najcitlivejšie spomedzi testovaných súprav, vrátane súpravy Generation capture column kit (Gentra Systems), MasterPure Súprava na čistenie DNA (Epicentre Technologies, Madison, Wisconsin), súprava na extrakciu nukleovej kyseliny IsoQuick (MicroProbe Corp., Bothell, Washington) a súprava krvi QIAamp (Qiagen, Valencia, Calf.) na extrakciu cytomegalovírusovej DNA z klinických vzoriek, založené na výťažnosti DNA so širokým rozsahom hodnotených typov vzoriek. Podobné hodnotenia extrakcií DNA s komerčnými súpravami vykonali aj ďalšie tri skupiny (13, 36, 61). Z týchto štúdií sa zistilo, že súprava QIAamp je vhodnejšia ako iné komerčné a nekomerčné metódy hodnotené na extrakciu DNA pre PCR. Niektoré komerčne dostupné extrakčné a purifikačné súpravy založené na protokole purifikácie na pevnej fáze sú uvedené v tabuľke ​ Tabuľka 1. 1. Tieto súpravy eliminujú nielen dohady, ale aj pracné kroky extrakcie fenol-chloroformom. Existujú však len obmedzené informácie týkajúce sa izolácie bakteriálnej DNA z klinických vzoriek, najmä CSF, pomocou týchto komerčných súprav.

STÔL 1.

Komerčné súpravy na extrakciu DNA založené na protokole purifikácie na pevnej fáze

SúpravaPredajcaMetóda
Súprava zachytávacieho stĺpca generácieGentra SystemsKolóna bez obsahu oxidu kremičitého
NucliSens izolačná súpravaOrganon TeknikaČastice oxidu kremičitého
Mini súprava QIAmp DNAQiagenMembránová kolóna na báze oxidu kremičitého
Súprava na odstreďovanie krvi UltraCleanLaboratóriá MoBioMembrána na báze oxidu kremičitého
Súprava krvnej genomickej DNA MagPrepNovagenMagnetické častice oxidu kremičitého
SNAP súprava DNA plnej krviInvitrogenMembránová kolóna na báze oxidu kremičitého
GFX súprava na čistenie genómovej krvi DNAAmershamMatrica zo sklenených vlákien

Cieľové gény.

Výber cieľových génov a návrh oligonukleotidových primerov sú kritickými prvkami pri určovaní citlivosti PCR (29, 53). Aj keď je ako cieľ vybraný rovnaký gén, PCR s rôznymi súbormi primérov ukazuje 100- až 1000-násobný rozdiel v citlivosti medzi súbormi primérov (29). Preto je sekvencia primérov dôležitá pre citlivosť a špecifickosť PCR. Citlivosť PCR tiež závisí od vybraného cieľového génu, pretože počet kópií génov alebo operónov na baktériu sa líši. V tomto ohľade, ak sa berie do úvahy iba citlivosť PCR, reverzná transkripcia-PCR je ďalšou selekčnou metódou kvôli viacnásobnému počtu kópií mRNA na baktériu. Praktická hodnota reverznej transkripcie-PCR v diagnostike je však obmedzená v dôsledku krátkej životnosti a zraniteľnosti bakteriálnych mRNA.

Sekvenčný polymorfizmus cieľového génu je ďalším problémom vzhľadom na špecifickosť PCR. Niektoré bakteriálne gény, ako napr C. trachomatis gén vonkajšieho membránového proteínu, majú hypervariabilné oblasti v rámci génu (23). Preto sa medzi klinickými izolátmi baktérie môžu vyskytovať produkty PCR rôznych veľkostí, ako aj rôznych sekvencií, keď je takýto gén vybraný ako cieľ pre PCR.

Univerzálna PCR, ktorá amplifikuje konzervované oblasti v rôznych baktériách, je ideálna na detekciu akéhokoľvek patogénu pri skríningu klinických vzoriek (8, 40, 42, 49, 63). Na tento účel bola konzervatívna oblasť génu 16S rRNA vybraná ako cieľový gén pre univerzálnu PCR vzhľadom na skutočnosť, že takmer všetky bežné bakteriálne patogény nachádzajúce sa v telesných tekutinách boli sekvenované (27, 42, 49). Pri použití tejto univerzálnej PCR bola hlásená vysoká citlivosť detekcie PCR pre 10 gramnegatívnych a 250 grampozitívnych baktérií v CSF (42). Keďže však univerzálna PCR dokáže detekovať takmer všetky baktérie, vrátane normálnej flóry, ako sú stafylokoky na koži, rozlišovanie kontaminantov je ťažké, najmä ak vzorky obsahujú málo baktérií.

PCR protokoly.

Existuje niekoľko protokolov PCR na zvýšenie citlivosti, najmä ak ide o malý počet baktérií ako cieľ. Nested PCR je jedným z týchto protokolov na detekciu len niekoľkých baktérií v klinických vzorkách. Proces využíva dve po sebe idúce PCR. Prvá PCR obsahuje externý pár primérov, zatiaľ čo druhá obsahuje buď dva vnorené priméry, ktoré sú interné s prvým párom primérov, alebo jeden z prvých primérov a jeden vnorený primér. Väčší fragment produkovaný prvou reakciou sa použije ako templát pre druhú PCR. Citlivosť a špecifickosť amplifikácie DNA možno značne zlepšiť použitím takejto vnorenej PCR, niekedy s 1000-krát vyššou citlivosťou ako štandardná PCR. Avšak v prípade zistenia C. pneumoniae pomocou nested PCR v štandardnom roztoku obohatenom baktériami sa citlivosť nie vždy zlepšila v porovnaní so štandardnou jednoduchou PCR. Napríklad vnorené a jednotlivé PCR s primérmi špecifickými pre C. pneumoniae omp-1 gén vykazoval rovnakú citlivosť (0,005 inklúzie alebo 2,5 elementárnych teliesok na PCR) (2).

Často sa vyskytujúcim problémom pri PCR amplifikácii cieľových génových sekvencií je výskyt falošných menších pásov v spektre produktu (17). Toto sa zvyčajne interpretuje tak, že je to spôsobené nesprávnym nasadením jedného alebo oboch oligonukleotidových amplimérov do cieľového templátu. Touchdown PCR je navrhnutý tak, aby sa predišlo takýmto problémom a poskytuje jasne špecifický PCR pás. Touchdown PCR využíva protokol so znižovaním žíhacích teplôt v každom cykle zhora pod očakávanú žíhaciu teplotu (17). Aplikácia tejto techniky na detekciu C. pneumoniae poskytli zlepšenú analytickú citlivosť (0,004 až 0,063 jednotky tvoriacej inklúzie na PCR) (43).

Detekcia produktov PCR.

Okrem tradičnej elektroforézy na agarózovom géli obsahujúcom etídiumbromid je pre produkty PCR hlásených niekoľko rôznych protokolov detekcie. Southernova hybridizácia so špecifickou sondou označenou rádioizotopovým alebo nerádioizotopovým markerom na amplikóny PCR sa široko využíva na štúdium špecifickosti PCR. Tento detekčný protokol tiež poskytuje vyššiu citlivosť ako metóda detekcie etídiumbromidom, ale vyžaduje dodatočné blotovanie a hybridizačné kroky. Digoxigenín (DIG)-PCR-enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) je jednou z metód detekcie amplikónov PCR využívajúcich mikrotitračnú platňu a je teraz komerčne dostupný (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.). Táto metóda zahŕňa zachytávacie amplikóny označené DIG sondou imobilizovanou na povrchu streptavidínom potiahnutej ELISA platne. Naviazaný hybrid sa deteguje anti-DIG-peroxidázovým konjugátom a kolorimetrickým substrátom. Ukázalo sa, že tento systém ELISA je 10 až 100-krát citlivejší ako tradičná metóda elektroforézy (48). Detekčná metóda PCR-imunoanalýza využívajúca špeciálne malé zariadenie (Clearview Immunoassay Detection Device Oxoid Inc., Ogdensburg, NY), ktoré obsahuje membránu a podložku na aplikáciu vzorky obsahujúcu latexové guľôčky označené anti-2,4-dinitrofenolovou protilátkou, je ďalší typ detekčnej metódy pre amplikóny určený na detekciu špecifických baktérií v klinických izolátoch (12, 59). Membrána použitá v tomto systéme je potiahnutá líniami antibiotínovej protilátky a anti-DIG protilátky. Preto je hodnotenie výsledkov PCR ako pozitívne alebo negatívne pri použití tejto detekčnej súpravy v klinických laboratóriách, ktoré nemajú vybavenie na elektroforézu, relatívne jednoduché. Aplikácia tejto súpravy na detekciu Neisseria meningitidis v CSF vykazovali detekčný limit jeden až tri organizmy na PCR, čo je 10-krát citlivejšie ako detekcia produktov PCR na tradičnej elektroforéze s agarózovými gélmi (54). Testy na báze fluorescenčných sond so značenými primérmi alebo špecifickými sondami značenými fluorescenčným farbivom boli vyvinuté s výhodami uzavretého systému, ktorý zabraňuje prenosu kontaminácie počas PCR a zvyšuje citlivosť detekcie amplikónov. Existujú dva typy testov, ktoré používajú odčítanie v reálnom čase a koncový bod. Stále viac sa využíva najmä real-time PCR, ktorá poskytuje rýchle a presné informácie o cieľových génoch. Tento prístup má výhodu v kvantifikácii PCR v exponenciálnej fáze namiesto použitia koncového bodu akumulácie produktu PCR alebo pokusu o zachytenie PCR v exponenciálnej fáze, ako sa to robilo predtým v mnohých kvantitatívnych PCR (52). Táto technika, ktorá nie je založená na géli, má niekoľko ďalších výhod oproti bežným technikám na báze agarózového gélu. Napríklad tento systém umožňuje veľké zvýšenie priepustnosti. Test fluorescenčnej sondy prebieha v 96-jamkovom formáte a mnohé z krokov testu sú automatizované. Test je uzavretý systém, v ktorom sa reakčná skúmavka po amplifikácii nikdy neotvorí. Okrem toho používa automatizovaný detekčný systém, ktorý kvantifikuje a vypočítava stupeň fluorescencie oproti fluorescencii kontroly pri každom cykle, a teda presne definuje počet cyklov a lineárny rozsah pre pozitívny výsledok (52). Aj keď v súčasnosti existuje len málo správ o detekcii a kvantifikácii baktérií v CSF pomocou PCR v reálnom čase, táto technika má vďaka týmto výhodám vynikajúci potenciál ako hlavný protokol na detekciu baktérií PCR v klinických vzorkách vrátane CSF.


Diskusia

Ako je predpovedané v hypotéze a znázornené na obr.  1 , ​ ,2, 2 , ​ ,3, 3 , ​ ,4, 4 , ​ ,5, 5, ​ ,6, 6 a ​ a7,7, výskyt rôznych profilov amplifikácie PCR pre rôzne bakteriálne izoláty (obr.ਃ) podporuje hypotézu, že na detekciu všetkých baktérií bol potrebný viac ako jeden všeobecný pár primérov, hypotéza predpovedala nedostatok “Universal Primers”. Výsledky ukázali, že G4, G6, G8, G9 a G10 zlyhali s jedným alebo viacerými izolátmi. Nevyhnutné zlyhanie univerzálnych párov primérov (alebo všeobecných párov primérov) možno ďalej predpovedať na základe distribúcie primérov Tabuľka  2 ukazuje, že žiadny jednotlivý primér nemôže reagovať so všetkými 44 uvedenými rodmi, čo znamená, že ktorýkoľvek daný pár primérov aspoň raz zlyhá ( 2,2 %). “Universal” primérový pár 909F.R (tabuľka  1 ) [17] zlyhá s 22 rôznymi rodmi alebo 50 % z tých, ktoré sú uvedené v tabuľke  2 . To robí 909-primerový pár nie špecifickým ani univerzálnym. Primérový pár QUGP-F3.R2 (ktorý sa ukázal ako užitočný v tejto štúdii, Table  7 ) zlyhá s tromi rodmi, ktorým chýba sekvencia QUGP-R2 (Aquifex, Rickettsia, Thermotoga Table  2 ) a zlyhá s deviatimi rodmi, ktorým chýba QUGP-F3 (Anabaena, Aquifiex, Bordetella, Campylobacter, Chlamedophila1, Desulfovibrio, Mycoplasma, Prochlorococcus, a Termotoga). Pri aplikácii tohto páru primérov PCR na 44 rodov uvedených v tabuľkeਂ pár primérov zlyhá s desiatimi rodmi, čo umožňuje detekciu iba 34 rodov (72 %). Podobne primérový pár QUGP-F5.R4 zistí, že 84 % uvedených rodov QUGP-F5 zlyhá s dvomi rodmi (Chlamydophila1,Rhodopirellula Tabuľka  2 ), kým QUGP-R4 zlyhá Chlamydophila1 a päť ďalších rodov (Mycoplasma, Syntrophobacter, Thermus, Treponema a Wolbachia). V súlade s tým QUGP-F5.R4 zistí iba 37 (84 %) rodov uvedených v tabuľke  2 . Matematicky dva páry QUGP-F3.R2 a QUGP-F5.R4 zistia (95,4 %) všetkých 44 okrem (Chlamydophila1 a Mykoplazma). Zmiešanie týchto dvoch párov však bude mať ďalšiu výhodu vygenerovania nového páru (QUGP-F5.R2), ktorý bude detekovať Mykoplazma ale nie Chlamydophila1. Preto zmiešanie štyroch primerov povedie k detekcii 43 rodov (97,8 %). Teraz je jasné, ako G7 so svojimi 10 pármi primérov dokáže detekovať baktérie. G7 deteguje všetkých 44 rodov uvedených v tabuľke  2, ktoré môžu byť reprezentatívnou vzorkou všetkých baktérií. Podľa tejto štúdie G7 (Acinetobacter, Alkaligenes, Serratia, Klebsiella a inĂŠ Tabuľka  7 ). Tieto výpočty výrazne podporujú potenciál prístupu UM oproti prístupu “Universal Primer”.

Obmedzujúci krok pri identifikácii baktérie pomocou UM spočíva v kroku detekcie (I. etapa). UM vyriešil toto obmedzenie poskytnutím súboru zmesí primérov (tabuľka  5 A, B). Podľa UM môžu Golden Mixtures G7 a G5 potenciálne produkovať 12 rôznych párov primérov (alebo amplikónov PCR). Ďalšie páry primérov je možné generovať začlenením QUGP-F1 a QUGP-R7 do zlatých zmesí. Začlenenie QUGP-F1 generuje 6 ďalších párov primérov (tabuľkaਆ). 20 možných párov primérov uvedených v tabuľke  6 pravdepodobne deteguje akúkoľvek baktériu. G7 umožnil vytvorenie 10 rôznych párov primérov zodpovedných za amplikóny pozorované na obr.ꁪ (QUGP-Fn3 sa nepáruje ani s QUGP-Rn3, ani s QUGP-F4). Pomocou G5 možno vytvoriť dva ďalšie páry primérov (QUGP-Fn5.R4 a QUGP-Fn6.R4). Preto aplikácia G7 a G5 na akúkoľvek baktériu zvýši šance na detekciu tejto baktérie 12-násobne v porovnaní s ktorýmkoľvek párom primérov PCR alebo 20-násobne, ak sa majú použiť všetky páry primérov z tabuľky  6.

Detekcia všetkých 101 testovaných bakteriálnych izolátov s použitím rôznych zmesí QUGP s nulovým zlyhaním výrazne podporuje schopnosť UM detekovať akúkoľvek baktériu. Zlaté zmesi boli vyvinuté z praktických dôvodov a na zjednodušenie procesu v porovnaní s využitím jednotlivých párov primérov G7 samotnej kapacity na produkciu pozitívnych PCR amplikónov s každým z (67/67) testovaných bakteriálnych izolátov, čo svedčí o jeho potenciáli detegovať väčšinu, ak nie všetky baktérie.

G7 aj G10 boli schopné detegovať bakteriálnu DNA pri 10 000-násobnom zriedení, čo znamená, že vzorky by mali byť dostatočne zriedené, ak existuje podozrenie na náhodnú kontamináciu zriedením vzoriek krvi kontaminovaných Staphylococcus epidermidis alebo iné baktérie môžu pomôcť vyhnúť sa detekcii takýchto kontaminantov, táto oblasť si vyžaduje dôkladné preskúmanie predtým, ako bude možné ju prakticky použiť. G7 možno použiť na testovanie prítomnosti alebo neprítomnosti baktérií v rôznych vzorkách vrátane klinických vzoriek.

Aplikácia G7 je pravdepodobne najvhodnejšia pri analýze bakteriálnych spoločenstiev, pretože sa očakáva amplifikácia veľkej väčšiny, ak nie všetkých druhov, v testovanej vzorke. Kvalitatívna analýza zmiešaných produktov PCR s dostupnými technikami, ako sú microarrays [12], C0 t analýza, klonovanie a sekvenovanie, RFLP, analýza denaturačnou gradientovou gélovou elektroforézou [14, 39] alebo akákoľvek kombinácia týchto metód zlepší naše pochopenie bakteriálnych spoločenstiev.

Kritickou požiadavkou na sekvenovanie DNA je, že sekvenačný primér by mal nasedať iba na jedno miesto na templátovej DNA. Preto vzorky obsahujúce zmiešané druhy DNA získané s primérmi General nie sú vhodné na priame sekvenovanie DNA. Ďalšou prekážkou spojenou s ribotypizáciou založenou na sekvenovaní je jej závislosť od dostupnosti sekvencií rDNA pre analýzu vzájomného zarovnania (BLAST). Napríklad analýza BLAST identifikovala izolát QUBC35 ako Citrobacter koseri (95,5 %), bolo identifikované aj ako Citrobacter freundii (92,5 %) resp C. youngae (7,4 %) so systémom API 20E, nedostupnosť niektorých druhov pre analýzu BLAST mohla skresliť identifikáciu izolátu ako C. koseri. Ďalší príklad bol získaný, keď špirálová baktéria QUBC70 bola sekvenovaná PCR, ale bola zle identifikovaná. Bolo to na 95 % totožné s Phaeospirillum sp. najpravdepodobnejšie v dôsledku absencie zodpovedajúcej sekvencie v nukleotidových databázach. Izolát QUBC70 sa identifikuje pomocou biochemického profilovania, získaná sekvencia bude uložená v génovej banke po vykonaní a potvrdení identifikácie baktérie. Úplná bakteriálna nukleotidová/génová banka (najmä pre sekvencie ribozomálnych nukleotidov) určite zlepší spoľahlivosť UM a akýchkoľvek iných metód založených na sekvenciách.

Izoláty vykazujúce homológiu BLAST menej ako 98 % neboli akceptované, pokiaľ neboli overené inou metódou. Dva hlavné dôvody prispeli k zlej identifikácii, zlému sekvenovaniu a absencii zodpovedajúcej sekvencie z nukleotidovej databázy. Ďalšie hrozby pre platnosť UM pochádzajú zo silných asociácií medzi bakteriálnymi druhmi, ako v prípade parazitických baktérií (Bdellovibrio sp.), počet kópií génu a polymorfizmus.

Keď sa na identifikáciu baktérií používajú vysoko konzervované gény, ako sú gény 16S, dlhé sekvencie (�਋ázy) môžu poskytnúť dostatočnú diskriminačnú silu medzi baktériami ako kratšie sekvencie. Preto sú na identifikáciu výhodné sekvencie dlhé �਋áz, hoci je možné použiť druhovo špecifické kratšie sekvencie [9, 20�, 24].

Platnosť UM bola stanovená, všetkých 40 sekvenovaných PCR amplikónov bolo tých z 16S rDNA. UM detekovala a identifikovala 24 rodov a 34 druhov. Tento široký rozsah detekcie a identifikácie druhov oprávňuje aplikáciu metódy na akúkoľvek inú baktériu. UM bola ďalej validovaná, pretože bola v súlade s inými identifikačnými metódami, ako sú API, morfologické a biochemické profily a druhovo špecifické priméry PCR. Reprodukovateľnosť výsledkov získaných UM svedčí o jeho stabilite detekcie všetkých Enterococcus faecalis izoláty (QUBC80, 81 a 83). Schopnosť UM rozlišovať medzi Streptomyces spp. Znázornené boli aj QUBC50, 102, 103, 104 a 106. Opakovanie sekvenovania a analýzy BLAST s rovnakým izolátom ako v QUBC70 odhalili rovnaké presné výsledky.

Na záver, G7 spolu s G5 môžu predstavovať skutočnú substitúciu univerzálnych primérov, ako sa predpokladalo v hypotéze, tieto dve zmesi obsahovali celkovo 8 všeobecných primérov (7 primérov v G7 a 4 priméry v G5). Potenciálne môžu detekovať všetky baktérie, pretože generujú celkom 12 párov primérov. G7 a G5 je možné využiť na mnohé ďalšie aplikácie, ako je detekcia prítomnosti baktérií vo vzorkách, analýzy bakteriálnych spoločenstiev a identifikácia baktérií.


Pozri si video: Reação em cadeia da DNA-Polimerase. Biotecnologia. Biologia. Khan Academy (Jún 2022).