Informácie

20.4: Enzýmové imunoanalýzy (EIA) a enzýmové imunoanalýzy (ELISA) - Biológia

20.4: Enzýmové imunoanalýzy (EIA) a enzýmové imunoanalýzy (ELISA) - Biológia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Učebné ciele

  • Vysvetlite rozdiely a podobnosti medzi EIA, FEIA a ELISA
  • Opíšte rozdiel a podobnosti medzi imunohistochémiou a imunocytochémiou
  • Opíšte rôzne účely priamej a nepriamej ELISA

Podobne ako pri western blote, enzýmové imunoanalýzy (EIA) používajú protilátky na detekciu prítomnosti antigénov. EIA sa však od western blotov líšia tým, že testy sa uskutočňujú na mikrotitračných platniach resp in vivo skôr ako na absorpčnej membráne. Existuje mnoho rôznych typov EIA, ale všetky zahŕňajú molekulu protilátky, ktorej konštantná oblasť viaže enzým, pričom variabilná oblasť ponecháva voľnú väzbu na svoj špecifický antigén. Pridanie substrátu pre enzým umožňuje vizualizáciu alebo kvantifikáciu antigénu (obrázok (PageIndex{1})).

V EIA je substrátom pre enzým najčastejšie chromogén, bezfarebná molekula, ktorá sa premieňa na farebný konečný produkt. Najpoužívanejšie enzýmy sú alkalická fosfatáza a chrenová peroxidáza, pre ktoré sú ľahko dostupné vhodné substráty. V niektorých EIA je substrátom fluorogén, nefluorescenčná molekula, ktorú enzým premieňa na fluorescenčnú formu. EIA, ktoré využívajú fluorogén, sa nazývajú fluorescenčné enzýmové imunoanalýzy (FEIA). Fluorescencia môže byť detekovaná buď fluorescenčným mikroskopom alebo spektrofotometrom.

MMR TITER

MMR vakcína je kombinovaná vakcína, ktorá poskytuje ochranu proti osýpkam, mumpsu a ružienke (nemecké osýpky). Väčšina ľudí dostáva MMR vakcínu ako deti a tak majú protilátky proti týmto ochoreniam. Z rôznych dôvodov sa však aj očkovaní jedinci môžu neskôr v živote stať náchylnými na tieto ochorenia. Niektoré deti môžu napríklad dostať iba jedno kolo MMR vakcíny namiesto odporúčaných dvoch. Okrem toho titer ochranných protilátok v tele jednotlivca môže začať klesať s vekom alebo v dôsledku niektorých zdravotných stavov.

Na určenie, či je titer protilátky v krvnom obehu jednotlivca dostatočný na poskytnutie ochrany, je možné vykonať test titra MMR. Test je jednoduchý imunotest, ktorý možno rýchlo vykonať pomocou vzorky krvi. Výsledky testu ukážu, či jedinec má ešte imunitu alebo potrebuje ďalšiu dávku MMR vakcíny.

Podrobenie sa titru MMR je často pred prijatím do zamestnania pre zdravotníckych pracovníkov, najmä tých, ktorí budú často v kontakte s malými deťmi alebo pacientmi s oslabenou imunitou. Ak by sa zdravotnícky pracovník nakazil osýpkami, mumpsom alebo ružienkou, jednotlivec by tieto choroby mohol ľahko preniesť na vnímavých pacientov, čo by viedlo k prepuknutiu choroby. V závislosti od výsledkov titra MMR môže byť potrebné, aby zdravotnícki pracovníci boli pred začatím práce preočkovaní.

Imunofarbenie

Jedným silným využitím EIA je imunofarbenie, pri ktorom konjugáty protilátka-enzým zlepšujú mikroskopiu. Imunohistochémia (IHC) sa používa na vyšetrenie celých tkanív. Ako je vidieť na obrázku (PageIndex{2}), časť tkaniva môže byť zafarbená na vizualizáciu rôznych typov buniek. V tomto príklade sa mAb proti CD8 použila na farbenie buniek CD8 v reze tkaniva mandlí. Teraz je možné spočítať počet buniek CD8, určiť ich relatívny počet v porovnaní s ostatnými prítomnými typmi buniek a určiť umiestnenie týchto buniek v tomto tkanive. Takéto údaje by boli užitočné na štúdium chorôb, ako je AIDS, pri ktorom je normálna funkcia buniek CD8 rozhodujúca pre spomalenie progresie ochorenia.

Imunocytochémia (ICC) je ďalšou hodnotnou formou imunofarbenia. Aj keď je to podobné ako pri IHC, v ICC sa materiál extracelulárnej matrice odstráni a bunková membrána sa naleptá alkoholom, aby bola priepustná pre protilátky. To umožňuje protilátkam prechádzať cez bunkovú membránu a viazať sa na špecifické ciele vo vnútri bunky. Týmto spôsobom možno vizualizovať organely, cytoskeletálne zložky a iné vnútrobunkové štruktúry. Zatiaľ čo niektoré ICC techniky používajú EIA, enzým môže byť nahradený fluorescenčnou molekulou, čo z neho robí fluorescenčný imunotest.

Cvičenie (PageIndex{1})

  1. Aký je rozdiel medzi imunohistochémiou a imunocytochémiou?
  2. Čo musí platiť o produkte enzymatickej reakcie používanej v imunohistochémii?

Enzymovo viazané imunosorbentné testy (ELISA)

Enzýmovo viazané imunosorbentové testy (ELISA) sú široko používané EIA. Pri priamom teste ELISA sú antigény imobilizované v jamke mikrotitračnej platne. Do každej jamky sa pridá protilátka, ktorá je špecifická pre konkrétny antigén a je konjugovaná s enzýmom. Ak je prítomný antigén, potom sa protilátka naviaže. Po premytí, aby sa odstránili všetky nenaviazané protilátky, sa pridá bezfarebný substrát (chromogén). Prítomnosť enzýmu premení substrát na farebný konečný produkt (obrázok (PageIndex{1})). Aj keď je táto technika rýchlejšia, pretože vyžaduje použitie len jednej protilátky, má nevýhodu v tom, že signál z priamej ELISA je nižší (nižšia citlivosť).

V sendvičovej ELISA je cieľom použiť protilátky na presnú kvantifikáciu špecifického antigénu prítomného v roztoku, ako je antigén z patogénu, sérový proteín alebo hormón z krvi alebo moču, aby sme vymenovali len niekoľko príkladov. Prvým krokom sendvičovej ELISA je pridanie primárnej protilátky do všetkých jamiek mikrotitračnej doštičky (obrázok (PageIndex{3})). Protilátka sa prilepí na plast hydrofóbnymi interakciami. Po vhodnej inkubačnej dobe sa všetky nenaviazané protilátky vymyjú. Porovnateľné premývania sa používajú medzi každým z nasledujúcich krokov, aby sa zabezpečilo, že na platni zostanú pripojené iba špecificky viazané molekuly. Potom sa pridá blokujúci proteín (napr. albumín alebo mliečny proteín kazeín), aby sa naviazali zostávajúce nešpecifické miesta viažuce proteíny v jamke. Niektoré z jamiek dostanú známe množstvá antigénu, aby sa umožnila konštrukcia štandardnej krivky, a do ostatných jamiek sa pridajú neznáme roztoky antigénu. Primárna protilátka zachytí antigén a po premytí sa pridá sekundárna protilátka, čo je polyklonálna protilátka, ktorá je konjugovaná s enzýmom. Po poslednom premytí sa pridá bezfarebný substrát (chromogén) a enzým ho premení na farebný konečný produkt. Intenzita farby vzorky spôsobená konečným produktom sa meria spektrofotometrom. Množstvo vytvorenej farby (merané ako absorbancia) je priamo úmerné množstvu enzýmu, ktorý je zase priamo úmerný zachytenému antigénu. Testy ELISA sú mimoriadne citlivé a umožňujú kvantifikáciu antigénu v nanograme (10–9 g) rozsah na ml.

V nepriamom teste ELISA kvantifikujeme skôr antigén-špecifickú protilátku ako antigén. Môžeme použiť nepriamu ELISA na detekciu protilátok proti mnohým typom patogénov, vrátane Borrelia burgdorferi (Lymská choroba) a HIV. Medzi nepriamymi a priamymi testami ELISA sú tri dôležité rozdiely, ako je znázornené na obrázku (PageIndex{4}). Namiesto použitia protilátky na zachytenie antigénu, nepriama ELISA začína pripojením známeho antigénu (napr. peptidov z HIV) na dno jamiek mikrotitračnej platne. Po blokovaní nenaviazaných miest na platni sa pridá sérum pacienta; ak sú prítomné protilátky (primárna protilátka), naviažu antigén. Po vymytí všetkých nenaviazaných proteínov je sekundárna protilátka s jej konjugovaným enzýmom namierená proti primárnej protilátke (napr. antihumánny imunoglobulín). Sekundárna protilátka nám umožňuje kvantifikovať, koľko antigén-špecifickej protilátky je prítomné v sére pacienta podľa intenzity farby produkovanej reakciou konjugovaného enzýmu a chromogénu.

Rovnako ako pri niekoľkých iných testoch na protilátky, o ktorých sa hovorí v tejto kapitole, vždy existuje obava zo skríženej reaktivity s protilátkami namierenými proti nejakému inému antigénu, čo môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom. Nemôžeme teda definitívne diagnostikovať infekciu HIV (alebo akýkoľvek iný typ infekcie) na základe jediného nepriameho testu ELISA. Musíme potvrdiť akýkoľvek podozrivý pozitívny test, ktorý sa najčastejšie robí buď pomocou imunoblotu, ktorý skutočne identifikuje prítomnosť špecifických peptidov z patogénu, alebo pomocou testu na identifikáciu nukleových kyselín spojených s patogénom, ako je napríklad PCR s reverznou transkriptázou (RT-PCR ) alebo test na antigén nukleovej kyseliny.

Cvičenie (PageIndex{2})

  1. Aký je účel sekundárnej protilátky v priamom teste ELISA?
  2. Čo kvantifikujú priame a nepriame testy ELISA?

klinické zameranie - 2. časť

Hoci kontaktovanie a testovanie 1300 pacientov na HIV by bolo časovo náročné a drahé, správcovia dúfali, že minimalizujú zodpovednosť nemocnice tým, že budú proaktívne vyhľadávať a liečiť potenciálne obete zločinu nečestného zamestnanca. Dôležité je včasné odhalenie HIV a včasná liečba môže spomaliť progresiu ochorenia.

Existuje celý rad skríningových testov na HIV, ale najpoužívanejší je nepriamy test ELISA. Ako pri iných nepriamych testoch ELISA, test funguje tak, že sa antigén (v tomto prípade HIV peptidy) naviaže na jamku v 96-jamkovej platni. Ak je pacient HIV pozitívny, anti-HIV protilátky sa naviažu na antigén a budú identifikované pomocou druhého konjugátu protilátka-enzým.

Cvičenie (PageIndex{3})

  1. Aký presný je nepriamy test ELISA na HIV a aké faktory môžu ovplyvniť presnosť testu?
  2. Mala by nemocnica použiť nejaké iné testy na potvrdenie výsledkov nepriamej ELISA?

Imunofiltrácia a imunochromatografické testy

V niektorých situáciách môže byť potrebné detegovať alebo kvantifikovať antigény alebo protilátky, ktoré sú v roztoku prítomné vo veľmi nízkej koncentrácii. Aby to bolo možné, boli vyvinuté imunofiltračné techniky. Pri imunofiltrácii prechádza veľký objem tekutiny cez poréznu membránu do absorpčnej podložky. Antigén pripojený k poréznej membráne zachytí protilátku pri jej prechode; alternatívne môžeme tiež pripojiť protilátku k membráne na zachytenie antigénu.

Metóda imunofiltrácie bola upravená vo vývoji imunochromatografických testov, bežne známych ako laterálne prietokové testy alebo strip testy. Tieto testy sú rýchle a jednoduché, vďaka čomu sú obľúbené na použitie v mieste starostlivosti (t. j. v ordinácii lekára) alebo na domáce použitie. Jedným príkladom je test TORCH, ktorý umožňuje lekárom skríning tehotných žien alebo novorodencov na infekciu množstvom vírusov a iných patogénov (Toxoplazma, iné vírusy, rubeola, cytomegalovírus, herpes simplex). Domáce tehotenské testy sú ďalším široko používaným príkladom laterálneho prietokového testu (obrázok (PageIndex{5})). Imunofiltračné testy sú tiež populárne v rozvojových krajinách, pretože sú lacné a nevyžadujú neustále chladenie sušených činidiel. Technológia je však zabudovaná aj do niektorých sofistikovaných laboratórnych zariadení.

Pri laterálnych prietokových testoch (obrázok (PageIndex{6})) sa tekutiny, ako napríklad moč, nanášajú na absorpčnú podložku na testovacom prúžku. Tekutina preteká kapilárnym pôsobením a pohybuje sa cez pás guľôčok s protilátkami pripojenými k ich povrchu. Kvapalina vo vzorke vlastne hydratuje reagencie, ktoré sú v prúžku prítomné vo vysušenom stave. Guľôčky potiahnuté protilátkou vyrobené z latexu alebo malých častíc zlata budú viazať antigény v testovacej tekutine. Komplexy protilátka-antigén potom pretekajú cez druhý prúžok, ktorý má imobilizovanú protilátku proti antigénu; tento prúžok zadrží guľôčky, ktoré majú naviazaný antigén. Tretí kontrolný prúžok viaže všetky guľôčky. Červená farba (od zlatých častíc) alebo modrá (od latexových guľôčok) vznikajúca na testovacej čiare znamená pozitívny test. Ak sa farba rozvinie iba na kontrolnej čiare, test je negatívny.

Podobne ako techniky ELISA, aj laterálne prietokové testy využívajú sendviče protilátok, ktoré poskytujú citlivosť a špecifickosť. Aj keď nie sú také kvantitatívne ako ELISA, tieto testy majú tú výhodu, že sú rýchle, lacné a nezávisia od špeciálneho vybavenia. Môže ich teda vykonávať ktokoľvek kdekoľvek. Existujú určité obavy z toho, že sa takéto výkonné diagnostické testy dostanú do rúk ľudí, ktorí nemusia pochopiť obmedzenia testov, ako je napríklad možnosť falošne pozitívnych výsledkov. Zatiaľ čo domáce tehotenské testy sa stali všeobecne akceptovanými, domáce testy na detekciu protilátok na choroby, ako je HIV, vyvolali v lekárskej komunite určité obavy. Niektorí sa pýtali, či by malo byť povolené samopodávanie takýchto testov v neprítomnosti zdravotníckeho personálu, ktorý môže vysvetliť výsledky testov a nariadiť vhodné potvrdzujúce testy. Avšak s rastúcim počtom dostupných testov laterálneho prietoku a rýchlym vývojom technológie laboratória na čipe ([link]) sa domáce lekárske testy pravdepodobne stanú v budúcnosti ešte bežnejšou.

Cvičenie (PageIndex{4})

  1. Aký fyzikálny proces vyžaduje metóda laterálneho toku, aby fungovala?
  2. Vysvetlite účel tretieho prúžku v teste laterálneho prietoku.

Tabuľka (PageIndex{1}) porovnáva niektoré kľúčové mechanizmy a príklady niektorých EIA diskutovaných v tejto časti, ako aj imunobloty, o ktorých sa diskutovalo v časti Detekcia komplexov antigén-protilátka.

Tabuľka (PageIndex{1}): Imunobloty a enzýmové imunoanalýzy
Typ testuMechanizmusŠpecifické postupyPríklady
ImunoblotyPoužíva konjugáty enzým-protilátka na identifikáciu špecifických proteínov, ktoré boli prenesené na absorpčnú membránuWestern blot: Zisťuje prítomnosť konkrétneho proteínuDetekcia prítomnosti HIV peptidov (alebo peptidov z iných infekčných agens) v sére pacienta
ImunofarbeniePoužíva konjugáty enzým-protilátka na farbenie špecifických molekúl na bunkách alebo v bunkáchImunohistochémia: Používa sa na farbenie špecifických buniek v tkaniveVyfarbite na prítomnosť buniek CD8 v hostiteľskom tkanive
Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA)Používa konjugáty enzým-protilátka na kvantifikáciu cieľových molekúlPriama ELISA: Používa jedinú protilátku na zistenie prítomnosti antigénuDetekcia HIV antigénu p24 do jedného mesiaca po infikovaní
Nepriama ELISA: Meria množstvo protilátky produkovanej proti antigénuDetekcia HIV protilátok v sére
Imunochromatografické (laterálny prietok) testyTechniky využívajú na diagnostiku ochorenia zachytávanie tečúcich, farebne značených komplexov antigén-protilátka fixovanou protilátkouSendvičová ELISA: Meria množstvo antigénu viazaného protilátkouDetekcia protilátok na rôzne patogény v sére pacienta (napr. rýchly streptokok, tyčinka proti malárii)
Tehotenský test na detekciu ľudského chorionického gonadotropínu v moči

klinické zameranie - 3. časť

Aj keď je nepriamy test ELISA na HIV citlivý test, existuje niekoľko komplikácií. Po prvé, ak je infikovaná osoba testovaná príliš skoro po infikovaní, test môže priniesť falošne negatívne výsledky. Obdobie sérokonverzie je vo všeobecnosti približne tri týždne, ale v niektorých prípadoch to môže byť viac ako dva mesiace.

Okrem falošne negatívnych výsledkov sa môže vyskytnúť aj falošná pozitivita, zvyčajne v dôsledku predchádzajúcich infekcií inými vírusmi, ktoré indukujú skrížene reagujúce protilátky. Miera falošne pozitívnych výsledkov závisí od konkrétnej značky použitého testu, ale 0,5 % nie je nezvyčajné.1 Kvôli možnosti falošne pozitívneho výsledku sú všetky pozitívne testy nasledované potvrdzujúcim testom. Tento potvrdzujúci test je často imunoblot (western blot), v ktorom sa HIV peptidy z krvi pacienta identifikujú pomocou konjugátu HIV špecifického mAb-enzýmu. Pozitívny western blot by potvrdil infekciu HIV a negatívny blot by potvrdil neprítomnosť HIV napriek pozitívnemu testu ELISA.

Bohužiaľ, Western bloty pre HIV antigény často poskytujú neurčité výsledky, v takom prípade nepotvrdzujú ani nevyvracajú výsledky nepriamej ELISA. V skutočnosti môže byť miera indeterminantov 10 – 49 % (preto sa western bloty v kombinácii s ich cenou nepoužívajú na skríning). Podobne ako pri nepriamej ELISA sa môže vyskytnúť nedeterminantný western blot v dôsledku skríženej reaktivity alebo predchádzajúcich vírusových infekcií, očkovaní alebo autoimunitných ochorení.

Cvičenie (PageIndex{5})

  1. Koľko falošne pozitívnych testov ELISA by sa dalo očakávať z 1300 testovaných pacientov?
  2. Koľko neurčitých western blotov sa dá očakávať z falošne pozitívnych?
  3. Ako by nemocnica riešila prípady, v ktorých bol western blot pacienta neurčitý?

Kľúčové pojmy a zhrnutie

  • Enzýmové imunotesty (EIA) sa používajú na vizualizáciu a kvantifikáciu antigénov. Používajú protilátku konjugovanú s enzýmom na viazanie antigénu a enzým premieňa substrát na pozorovateľný konečný produkt. Substrát môže byť buď chromogén alebo fluorogén.
  • Imunofarbenie je technika EIA na vizualizáciu buniek v tkanive (imunohistochémia) alebo skúmanie vnútrobunkových štruktúr (imunocytochémia).
  • Priama ELISA sa používa na kvantifikáciu antigénu v roztoku. Primárna protilátka zachytáva antigén a sekundárna protilátka dodáva enzým. Produkcia konečného produktu z chromogénneho substrátu je priamo úmerná množstvu zachyteného antigénu.
  • Nepriama ELISA sa používa na detekciu protilátok v sére pacienta pripojením antigénu na jamku mikrotitračnej platničky, čo umožňuje pacientovi (primárnej) protilátke naviazať antigén a sekundárnej protilátke konjugovanej s enzýmom na detekciu primárnej protilátky.
  • Imunofiltrácia a imunochromatografické testy sa používajú v laterálne prietokové testy, ktorý možno použiť na diagnostiku tehotenstva a rôznych chorôb detekciou farebne značených komplexov antigén-protilátka v moči alebo iných vzorkách tekutín

Viacero možností

V enzýmovom imunoteste enzým

A. je viazaný antigénovým väzbovým miestom protilátky.
B. sa pripojí k jamke mikrotitračnej platne.
C. je konjugovaný s podozrivým antigénom.
D. sa viaže na konštantnú oblasť sekundárnej protilátky.

D

Pri použití EIA na štúdium mikrotubulov alebo iných štruktúr vo vnútri bunky najskôr bunku chemicky fixujeme a potom bunky ošetríme alkoholom. Aký je účel tejto protialkoholickej liečby?

A. Vytvára dostatočne veľké otvory v bunkovej membráne na to, aby prešli protilátky.
B. Membrána je lepkavá, takže protilátky sa naviažu a budú vychytávané receptorom sprostredkovanou endocytózou.
C. Odstraňuje negatívne náboje z membrány, ktoré by inak odpudzovali protilátky.
D. Zabraňuje nešpecifickej väzbe protilátok na bunkovú membránu.

A

V tehotenskom teste s laterálnym prietokom vidíte na kontrolnej čiare modrý pásik a na testovacej čiare sa nevytvára žiadny pás. Toto je pravdepodobne ________ test na tehotenstvo.

A. pozitívny
B. falošne pozitívne
C. falošne negatívne
D. negatívny

D

Pri vykonávaní FEIA fluorogén nahrádza ________, ktorý sa používa v EIA.

A. antigén
B. chromogénny substrát
C. enzým
D. sekundárna protilátka

B

Vyplň prázdne

Na detekciu protilátok proti baktériám v krvnom obehu pomocou EIA by sme spustili (n) ________, ktorý by sme začali pripojením antigénu z baktérií do jamiek mikrotitračnej platne.

nepriama ELISA

Stručná odpoveď

Prečo je dôležité v sendvičovej ELISA, aby mal antigén viacero epitopov? A prečo by mohlo byť výhodné použiť v tomto teste polyklonálne antiséra namiesto mAb?

Tehotenský testovací prúžok zisťuje prítomnosť ľudského chorionického gonadotropínu v moči. Tento hormón spočiatku produkuje plod a neskôr placenta. Prečo sa pri tomto teste uprednostňuje testovací prúžok pred použitím priameho alebo nepriameho testu ELISA s ich lepšie kvantifikovateľnými výsledkami?

Kritické myslenie

Označte primárne a sekundárne protilátky a diskutujte o tom, prečo bude produkcia konečného produktu úmerná množstvu antigénu.

Poznámky pod čiarou

  1. 1 Thomas, Justin G., Victor Jaffe, Judith Shaffer a Jose Abreu, „HIV Testing: US Recommendations 2014“, Osteopatický rodinný lekár 6, č. 6 (2014).

Laboratórna diagnostika vírusových ochorení

FRANK FENNER, . DAVID O. WHITE, vo veterinárnej virológii, 1987

Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA)

ELISA (tiež známy ako enzýmová imunoanalýza, EIA) ponúka rovnakú citlivosť ako rádioimunoanalýza bez inherentných nevýhod drahých izotopov s krátkym polčasom rozpadu a potreby bezpečnej manipulácie a likvidácie a nákladného gama počítadla. Základné princípy sú podobné princípom rádioimunologického testu (obr. 13-3). Protilátka je naviazaná na pevnú fázu, zvyčajne na jamky mikrotitračnej tácky. Do jamiek sa pridajú vzorky, u ktorých existuje podozrenie, že obsahujú antigén. Po vhodnom reakčnom čase sa jamky premyjú a pridá sa druhá vírusovo špecifická protilátka, ktorá bola konjugovaná s enzýmom. Po naviazaní sa obsah jamky prepláchne a pridá sa substrát pre enzým. Test sa odčíta zmenou farby v substráte a môže sa urobiť kvantitatívnym sériovým riedením antigénu, aby sa získal konečný bod, alebo fotometrickým odčítaním množstva zmeny farby, čo je odraz množstva naviazanej protilátky konjugovanej s enzýmom. Rovnako ako v rádioimunoteste existuje mnoho variácií v protokole, napr. využívajúce veľmi vysokú afinitu avidínu k biotínu (obr. 13-3, vpravo). Okrem toho, ak sa antigén naviaže na platňu ako prvý, postup je rovnako vhodný na detekciu a kvantifikáciu vírusovej protilátky.

Obr. 13-3. Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA) na detekciu vírusu a/alebo vírusového antigénu. Doľava, priamo. Správne, avidín-biotín.

Postupy ELISA boli vyvinuté pre širokú škálu aplikácií vo veterinárnej medicíne. Na jednej úrovni sa predávajú súpravy na rýchlu diagnostiku mnohých dôležitých vírusových ochorení samotnými veterinármi. Na ďalšej úrovni boli postupy ELISA automatizované zavedením automatického dávkovania, umývania a spektrofotometrických čítacích a záznamových prístrojov, ktoré umožňujú spracovanie stoviek vzoriek za deň, napr. pri testovaní ošípaných na protilátky proti pseudobesnosti.


20.4 EIA a ELISA

Podobne ako pri Western blote, enzýmové imunoanalýzy (EIA) používajú protilátky na detekciu prítomnosti antigénov. EIA sa však od western blotov líšia tým, že testy sa uskutočňujú na mikrotitračných platniach resp in vivo skôr ako na absorpčnej membráne. Existuje mnoho rôznych typov EIA, ale všetky zahŕňajú molekulu protilátky, ktorej konštantná oblasť viaže enzým, pričom variabilná oblasť ponecháva voľnú väzbu na svoj špecifický antigén. Pridanie substrátu pre enzým umožňuje vizualizáciu alebo kvantifikáciu antigénu (obrázok 20.22).

V EIA je substrátom pre enzým najčastejšie chromogén, bezfarebná molekula, ktorá sa premieňa na farebný konečný produkt. Najpoužívanejšie enzýmy sú alkalická fosfatáza a chrenová peroxidáza, pre ktoré sú ľahko dostupné vhodné substráty. V niektorých EIA je substrátom fluorogén, nefluorescenčná molekula, ktorú enzým premieňa na fluorescenčnú formu. EIA, ktoré využívajú fluorogén, sa nazývajú fluorescenčné enzýmové imunoanalýzy (FEIA). Fluorescencia môže byť detekovaná buď fluorescenčným mikroskopom alebo spektrofotometrom.

Mikro pripojenia

Titer MMR

MMR vakcína je kombinovaná vakcína, ktorá poskytuje ochranu proti osýpkam, mumpsu a ružienke (nemecké osýpky). Väčšina ľudí dostáva MMR vakcínu ako deti a tak majú protilátky proti týmto ochoreniam. Z rôznych dôvodov sa však aj očkovaní jedinci môžu neskôr v živote stať náchylnými na tieto ochorenia. Niektoré deti môžu napríklad dostať iba jedno kolo MMR vakcíny namiesto odporúčaných dvoch. Okrem toho titer ochranných protilátok v tele jednotlivca môže začať klesať s vekom alebo v dôsledku niektorých zdravotných stavov.

Na určenie, či je titer protilátky v krvnom obehu jednotlivca dostatočný na poskytnutie ochrany, je možné vykonať test titra MMR. Test je jednoduchý imunotest, ktorý možno rýchlo vykonať pomocou vzorky krvi. Výsledky testu ukážu, či jedinec má ešte imunitu alebo potrebuje ďalšiu dávku MMR vakcíny.

Podrobenie sa titru MMR je často pred prijatím do zamestnania pre zdravotníckych pracovníkov, najmä tých, ktorí budú často v kontakte s malými deťmi alebo pacientmi s oslabenou imunitou. Ak by sa zdravotnícky pracovník nakazil osýpkami, mumpsom alebo ružienkou, jednotlivec by tieto choroby mohol ľahko preniesť na vnímavých pacientov, čo by viedlo k prepuknutiu choroby. V závislosti od výsledkov titra MMR môže byť potrebné, aby zdravotnícki pracovníci boli pred začatím práce preočkovaní.

Imunofarbenie

Jedným silným využitím EIA je imunofarbenie, pri ktorom konjugáty protilátka-enzým zlepšujú mikroskopiu. Imunohistochémia (IHC) sa používa na vyšetrenie celých tkanív. Ako je vidieť na obrázku 20.23, časť tkaniva môže byť zafarbená na vizualizáciu rôznych typov buniek. V tomto príklade sa mAb proti CD8 použila na farbenie buniek CD8 v reze tkaniva mandlí. Teraz je možné spočítať počet buniek CD8, určiť ich relatívny počet v porovnaní s inými prítomnými typmi buniek a určiť umiestnenie týchto buniek v tomto tkanive. Takéto údaje by boli užitočné na štúdium chorôb, ako je AIDS, pri ktorých je normálna funkcia buniek CD8 rozhodujúca pre spomalenie progresie ochorenia.

Imunocytochémia (ICC) je ďalšou hodnotnou formou imunofarbenia. Aj keď je to podobné ako pri IHC, v ICC sa materiál extracelulárnej matrice odstráni a bunková membrána sa naleptá alkoholom, aby bola priepustná pre protilátky. To umožňuje protilátkam prechádzať cez bunkovú membránu a viazať sa na špecifické ciele vo vnútri bunky. Týmto spôsobom možno vizualizovať organely, cytoskeletálne zložky a iné vnútrobunkové štruktúry. Zatiaľ čo niektoré ICC techniky používajú EIA, enzým môže byť nahradený fluorescenčnou molekulou, čo z neho robí fluorescenčný imunotest.

Skontrolujte svoje porozumenie

  • Aký je rozdiel medzi imunohistochémiou a imunocytochémiou?
  • Čo musí platiť o produkte enzymatickej reakcie používanej v imunohistochémii?

Enzymovo viazané imunosorbentné testy (ELISA)

Enzýmovo viazané imunosorbentové testy (ELISA) sú široko používané EIA. Pri priamom teste ELISA sú antigény imobilizované v jamke mikrotitračnej platne. Do každej jamky sa pridá protilátka, ktorá je špecifická pre konkrétny antigén a je konjugovaná s enzýmom. Ak je prítomný antigén, potom sa protilátka naviaže. Po premytí, aby sa odstránili všetky nenaviazané protilátky, sa pridá bezfarebný substrát (chromogén). Prítomnosť enzýmu premieňa substrát na farebný konečný produkt (obrázok 20.22). Aj keď je táto technika rýchlejšia, pretože vyžaduje použitie iba jednej protilátky, má nevýhodu v tom, že signál z priamej ELISA je nižší (nižšia citlivosť).

V sendvičovej ELISA je cieľom použiť protilátky na presnú kvantifikáciu špecifického antigénu prítomného v roztoku, ako je antigén z patogénu, sérový proteín alebo hormón z krvi alebo moču, aby sme vymenovali len niekoľko príkladov. Prvým krokom sendvičovej ELISA je pridanie primárnej protilátky do všetkých jamiek mikrotitračnej platne (obrázok 20.24). Protilátka sa prilepí na plast hydrofóbnymi interakciami. Po vhodnej inkubačnej dobe sa všetky nenaviazané protilátky vymyjú. Porovnateľné premývania sa používajú medzi každým z nasledujúcich krokov, aby sa zabezpečilo, že na platni zostanú pripojené iba špecificky viazané molekuly. Potom sa pridá blokujúci proteín (napr. albumín alebo mliečny proteín kazeín), aby sa naviazali zostávajúce nešpecifické miesta viažuce proteíny v jamke. Niektoré z jamiek dostanú známe množstvá antigénu, aby sa umožnila konštrukcia štandardnej krivky, a do ostatných jamiek sa pridajú neznáme roztoky antigénu. Primárna protilátka zachytí antigén a po premytí sa pridá sekundárna protilátka, čo je polyklonálna protilátka, ktorá je konjugovaná s enzýmom. Po poslednom premytí sa pridá bezfarebný substrát (chromogén) a enzým ho premení na farebný konečný produkt. Intenzita farby vzorky spôsobená konečným produktom sa meria spektrofotometrom. Množstvo vytvorenej farby (merané ako absorbancia) je priamo úmerné množstvu enzýmu, ktorý je zase priamo úmerný zachytenému antigénu. Testy ELISA sú mimoriadne citlivé a umožňujú kvantifikáciu antigénu v rozsahu nanogramov (10 – 9 g) na ml.

V nepriamom teste ELISA kvantifikujeme skôr antigén-špecifickú protilátku ako antigén. Môžeme použiť nepriamu ELISA na detekciu protilátok proti mnohým typom patogénov, vrátane Borrelia burgdorferi ( Lymská choroba ) a HIV . Existujú tri dôležité rozdiely medzi nepriamym a priamym testom ELISA, ako je znázornené na obrázku 20.25. Namiesto použitia protilátky na zachytenie antigénu, nepriama ELISA začína pripojením známeho antigénu (napr. peptidov z HIV) na dno jamiek mikrotitračnej platne. Po blokovaní nenaviazaných miest na platni sa pridá sérum pacienta, ak sú prítomné protilátky (primárna protilátka), naviažu antigén. Po vymytí všetkých nenaviazaných proteínov je sekundárna protilátka s jej konjugovaným enzýmom namierená proti primárnej protilátke (napr. antihumánny imunoglobulín). Sekundárna protilátka nám umožňuje kvantifikovať, koľko antigén-špecifickej protilátky je prítomné v sére pacienta podľa intenzity farby produkovanej reakciou konjugovaného enzýmu a chromogénu.

Rovnako ako pri niekoľkých iných testoch na protilátky, o ktorých sa hovorí v tejto kapitole, vždy existuje obava zo skríženej reaktivity s protilátkami namierenými proti nejakému inému antigénu, čo môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom. Nemôžeme teda definitívne diagnostikovať infekciu HIV (alebo akýkoľvek iný typ infekcie) na základe jediného nepriameho testu ELISA. Musíme potvrdiť akýkoľvek podozrivý pozitívny test, ktorý sa najčastejšie robí buď pomocou imunoblotu, ktorý skutočne identifikuje prítomnosť špecifických peptidov z patogénu, alebo pomocou testu na identifikáciu nukleových kyselín spojených s patogénom, ako je napríklad PCR s reverznou transkriptázou (RT-PCR ) alebo test na antigén nukleovej kyseliny.

Skontrolujte svoje porozumenie

  • Aký je účel sekundárnej protilátky v priamom teste ELISA?
  • Čo kvantifikujú priame a nepriame testy ELISA?

Klinické zameranie

Časť 2

Hoci kontaktovanie a testovanie 1300 pacientov na HIV by bolo časovo náročné a drahé, správcovia dúfali, že minimalizujú zodpovednosť nemocnice tým, že budú proaktívne vyhľadávať a liečiť potenciálne obete zločinu nečestného zamestnanca. Dôležité je včasné odhalenie HIV a včasná liečba môže spomaliť progresiu ochorenia.

Existuje celý rad skríningových testov na HIV, ale najpoužívanejší je nepriamy test ELISA. Tak ako pri iných nepriamych testoch ELISA, test funguje tak, že sa antigén (v tomto prípade peptidy HIV) naviaže na jamku v 96-jamkovej platni. Ak je pacient HIV pozitívny, anti-HIV protilátky sa naviažu na antigén a budú identifikované pomocou druhého konjugátu protilátka-enzým.

  • Aký presný je nepriamy test ELISA na HIV a aké faktory môžu ovplyvniť presnosť testu?
  • Mala by nemocnica použiť nejaké iné testy na potvrdenie výsledkov nepriamej ELISA?

Preskočte na predchádzajúce pole Klinické zameranie. Preskočte na ďalšie pole Klinické zameranie.

Imunofiltrácia a imunochromatografické testy

For some situations, it may be necessary to detect or quantify antigens or antibodies that are present at very low concentration in solution. Immunofiltration techniques have been developed to make this possible. In immunofiltration , a large volume of fluid is passed through a porous membrane into an absorbent pad. An antigen attached to the porous membrane will capture antibody as it passes alternatively, we can also attach an antibody to the membrane to capture antigen.

The method of immunofiltration has been adapted in the development of immunochromatographic assays , commonly known as lateral flow tests or strip tests. These tests are quick and easy to perform, making them popular for point-of-care use (i.e., in the doctor’s office) or in-home use. One example is the TORCH test that allows doctors to screen pregnant women or newborns for infection by an array of viruses and other pathogens (Toxoplasma, other viruses, rubella, cytomegalovirus, herpes simplex). In-home pregnancy tests are another widely used example of a lateral flow test (Figure 20.26). Immunofiltration tests are also popular in developing countries, because they are inexpensive and do not require constant refrigeration of the dried reagents. However, the technology is also built into some sophisticated laboratory equipment.

In lateral flow tests (Figure 20.27), fluids such as urine are applied to an absorbent pad on the test strip. The fluid flows by capillary action and moves through a stripe of beads with antibodies attached to their surfaces. The fluid in the sample actually hydrates the reagents, which are present in a dried state in the stripe. Antibody-coated beads made of latex or tiny gold particles will bind antigens in the test fluid. The antibody-antigen complexes then flow over a second stripe that has immobilized antibody against the antigen this stripe will retain the beads that have bound antigen. A third control stripe binds any beads. A red color (from gold particles) or blue (from latex beads) developing at the test line indicates a positive test. If the color only develops at the control line, the test is negative.

Like ELISA techniques, lateral flow tests take advantage of antibody sandwiches, providing sensitivity and specificity. While not as quantitative as ELISA, these tests have the advantage of being fast, inexpensive, and not dependent on special equipment. Thus, they can be performed anywhere by anyone. There are some concerns about putting such powerful diagnostic tests into the hands of people who may not understand the tests’ limitations, such as the possibility of false-positive results. While home pregnancy tests have become widely accepted, at-home antibody-detection tests for diseases like HIV have raised some concerns in the medical community. Some have questioned whether self-administration of such tests should be allowed in the absence of medical personnel who can explain the test results and order appropriate confirmatory tests. However, with growing numbers of lateral flow tests becoming available, and the rapid development of lab-on-a-chip technology (Figure 20.1), home medical tests are likely to become even more commonplace in the future.

Check Your Understanding

  • What physical process does the lateral flow method require to function?
  • Explain the purpose of the third strip in a lateral flow assay.

Table 20.4 compares some of the key mechanisms and examples of some of the EIAs discussed in this section as well as immunoblots, which were discussed in Detecting Antigen-Antibody Complexes.

Immunoblots & Enzyme Immunoassays
Type of Assay Mechanizmus Specific Procedures Príklady
Immunoblots Uses enzyme-antibody conjugates to identify specific proteins that have been transferred to an absorbent membrane Western blot: Detects the presence of a particular protein Detecting the presence of HIV peptides (or peptides from other infectious agents) in patient sera
Immunostaining Uses enzyme-antibody conjugates to stain specific molecules on or in cells Immunohistochemistry: Used to stain specific cells in a tissue Stain for presence of CD8 cells in host tissue
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Uses enzyme-antibody conjugates to quantify target molecules Direct ELISA: Uses a single antibody to detect the presence of an antigen Detection of HIV antigen p24 up to one month after being infected
Indirect ELISA: Measures the amount of antibody produced against an antigen Detection of HIV antibodies in serum
Immunochromatographic (lateral flow) assays Techniques use the capture of flowing, color-labeled antigen-antibody complexes by fixed antibody for disease diagnosis Sandwich ELISA: Measures the amount of antigen bound by the antibody Detection of antibodies for various pathogens in patient sera (e.g., rapid strep, malaria dipstick)
Pregnancy test detecting human chorionic gonadotrophin in urine

Clinical Focus

Part 3

Although the indirect ELISA for HIV is a sensitive assay, there are several complicating considerations. First, if an infected person is tested too soon after becoming infected, the test can yield false-negative results. The seroconversion window is generally about three weeks, but in some cases, it can be more than two months.

In addition to false negatives, false positives can also occur, usually due to previous infections with other viruses that induce cross-reacting antibodies. The false-positive rate depends on the particular brand of test used, but 0.5% is not unusual. 10 Because of the possibility of a false positive, all positive tests are followed up with a confirmatory test. This confirmatory test is often an immunoblot (western blot) in which HIV peptides from the patient’s blood are identified using an HIV-specific mAb-enzyme conjugate. A positive western blot would confirm an HIV infection and a negative blot would confirm the absence of HIV despite the positive ELISA.

Unfortunately, western blots for HIV antigens often yield indeterminant results, in which case, they neither confirm nor invalidate the results of the indirect ELISA. In fact, the rate of indeterminants can be 10–49% (which is why, combined with their cost, western blots are not used for screening). Similar to the indirect ELISA, an indeterminant western blot can occur because of cross-reactivity or previous viral infections, vaccinations, or autoimmune diseases.

  • Of the 1300 patients being tested, how many false-positive ELISA tests would be expected?
  • Of the false positives, how many indeterminant western blots could be expected?
  • How would the hospital address any cases in which a patient’s western blot was indeterminant?

Jump to the previous Clinical Focus box. Jump to the next Clinical Focus box.

Poznámky pod čiarou

    Thomas, Justin G., Victor Jaffe, Judith Shaffer, and Jose Abreu, “HIV Testing: US Recommendations 2014,” Osteopathic Family Physician 6, č. 6 (2014).

Ako člen Amazonu zarábame z kvalifikovaných nákupov.

Chcete túto knihu citovať, zdieľať alebo upravovať? Táto kniha je Creative Commons Attribution License 4.0 a musíte pripísať OpenStax.

    Ak celú túto knihu alebo jej časť redistribuujete v tlačenom formáte, musíte na každej fyzickej stránke uviesť nasledujúce označenie:

  • Na vytvorenie citácie použite informácie uvedené nižšie. Odporúčame použiť nástroj na citovanie, ako je tento.
    • Authors: Nina Parker, Mark Schneegurt, Anh-Hue Thi Tu, Philip Lister, Brian M. Forster
    • Vydavateľ/webová stránka: OpenStax
    • Book title: Microbiology
    • Publication date: Nov 1, 2016
    • Miesto: Houston, Texas
    • Book URL: https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction
    • Section URL: https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-4-eias-and-elisas

    © Aug 20, 2020 OpenStax. Obsah učebnice produkovaný OpenStax je licencovaný pod licenciou Creative Commons Attribution License 4.0. Názov OpenStax, logo OpenStax, obaly kníh OpenStax, názov OpenStax CNX a logo OpenStax CNX nepodliehajú licencii Creative Commons a nesmú sa reprodukovať bez predchádzajúceho a výslovného písomného súhlasu Rice University.


    Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs)

    The enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) are widely used EIAs. V direct ELISA, antigens are immobilized in the well of a microtiter plate. An antibody that is specific for a particular antigen and is conjugated to an enzyme is added to each well. If the antigen is present, then the antibody will bind. After washing to remove any unbound antibodies, a colorless substrate (chromogen) is added. The presence of the enzyme converts the substrate into a colored end product (Figure 1). While this technique is faster because it only requires the use of one antibody, it has the disadvantage that the signal from a direct ELISA is lower (lower sensitivity).

    V sandwich ELISA, the goal is to use antibodies to precisely quantify specific antigen present in a solution, such as antigen from a pathogen, a serum protein, or a hormone from the blood or urine to list just a few examples. The first step of a sandwich ELISA is to add the primary antibody to all the wells of a microtiter plate (Figure 3). The antibody sticks to the plastic by hydrophobic interactions. After an appropriate incubation time, any unbound antibody is washed away. Comparable washes are used between each of the subsequent steps to ensure that only specifically bound molecules remain attached to the plate. A blocking protein is then added (e.g., albumin or the milk protein casein) to bind the remaining nonspecific protein-binding sites in the well. Some of the wells will receive known amounts of antigen to allow the construction of a standard curve, and unknown antigen solutions are added to the other wells. The primary antibody captures the antigen and, following a wash, the secondary antibody is added, which is a polyclonal antibody that is conjugated to an enzyme. After a final wash, a colorless substrate (chromogen) is added, and the enzyme converts it into a colored end product. The color intensity of the sample caused by the end product is measured with a spektrofotometer. The amount of color produced (measured as absorbance) is directly proportional to the amount of enzyme, which in turn is directly proportional to the captured antigen. ELISAs are extremely sensitive, allowing antigen to be quantified in the nanogram (10 –9 g) per mL range.

    Figure 3. Click for a larger image. (a) In a sandwich ELISA, a primary antibody is used to first capture an antigen with the primary antibody. A secondary antibody conjugated to an enzyme that also recognizes epitopes on the antigen is added. After the addition of the chromogen, a spectrophotometer measures the absorbance of end product, which is directly proportional to the amount of captured antigen. (b) An ELISA plate shows dilutions of antibodies (left) and antigens (bottom). Higher concentrations result in a darker final color. (credit b: modification of work by U.S. Fish and Wildlife Service Pacific Region)

    In an indirect ELISA, we quantify antigen-specific antibody rather than antigen. We can use indirect ELISA to detect antibodies against many types of pathogens, including Borrelia burgdorferi (Lyme disease) a HIV. There are three important differences between indirect and direct ELISAs as shown in Figure 4. Rather than using antibody to capture antigen, the indirect ELISA starts with attaching known antigen (e.g., peptides from HIV) to the bottom of the microtiter plate wells. After blocking the unbound sites on the plate, patient serum is added if antibodies are present (primary antibody), they will bind the antigen. After washing away any unbound proteins, the secondary antibody with its conjugated enzyme is directed against the primary antibody (e.g., antihuman immunoglobulin). The secondary antibody allows us to quantify how much antigen-specific antibody is present in the patient’s serum by the intensity of the color produced from the conjugated enzyme-chromogen reaction.

    As with several other tests for antibodies discussed in this chapter, there is always concern about cross-reactivity with antibodies directed against some other antigen, which can lead to false-positive results. Thus, we cannot definitively diagnose an HIV infection (or any other type of infection) based on a single indirect ELISA assay. We must confirm any suspected positive test, which is most often done using either an immunoblot that actually identifies the presence of specific peptides from the pathogen or a test to identify the nucleic acids associated with the pathogen, such as reverse transcriptase PCR (RT-PCR) or a nucleic acid antigen test.

    Figure 4. Click for a larger image. The indirect ELISA is used to quantify antigen-specific antibodies in patient serum for disease diagnosis. Antigen from the suspected disease agent is attached to microtiter plates. The primary antibody comes from the patient’s serum, which is subsequently bound by the enzyme-conjugated secondary antibody. Measuring the production of end product allows us to detect or quantify the amount of antigen-specific antibody present in the patient’s serum.

    Premýšľajte o tom

    • What is the purpose of the secondary antibody in a direct ELISA?
    • What do the direct and indirect ELISAs quantify?

    Clinical Focus: HIV Part 2

    This example continues the story that started in Polyclonal and Monoclonal Antibody Production.

    Although contacting and testing the 1300 patients for HIV would be time consuming and expensive, administrators hoped to minimize the hospital’s liability by proactively seeking out and treating potential victims of the rogue employee’s crime. Early detection of HIV is important, and prompt treatment can slow the progression of the disease.

    There are a variety of screening tests for HIV, but the most widely used is the indirect ELISA. As with other indirect ELISAs, the test works by attaching antigen (in this case, HIV peptides) to a well in a 96-well plate. If the patient is HIV positive, anti-HIV antibodies will bind to the antigen and be identified by the second antibody-enzyme conjugate.

    • How accurate is an indirect ELISA test for HIV, and what factors could impact the test’s accuracy?
    • Should the hospital use any other tests to confirm the results of the indirect ELISA?

    We’ll return to this example later on this page.


    Our ELISAs are a convenient and user-friendly method for studying soluble protein biomarkers in a variety of matrices including serum, plasma, cell culture supernatant, or lysate. Our ELISA offering consists of >1,000 Research Use Only assays, against a wide variety of species including human, mouse, rat, and various other animal models (Agricultural and Companion). Each assay comes with a specific protocol and the required reagents to run a 96-well plate. ELISAs primarily exist in a 96-well format with the vendor providing the reagents necessary to detect and quantitate the target. There are a variety of ELISA methods including Sandwich, Direct, and Competitive.

    The sandwich assay uses a pair of monoclonal antibodies (mAbs) against different epitopes against the same target. The primary mAb, bound to the plate, pulls the protein out of the solution while the second mAb is used to complete the “sandwich” and provide the signal which will indicate the presence of the target. A known amount of the recombinant version of the protein is provided with the kit, allowing the user to create a standard curve against which the signal from one of the samples will be interpreted. The majority of our portfolio is in this sandwich ELISA format.

    The direct ELISA and competitive assays are rarer. The direct assay uses a single mAb to detect the sample which is bound to the plate. The mAb is then bound by a reporter secondary antibody to provide the signal.

    The competitive assay has a known amount of the biomarker pre-bound to the plate. A labeled antibody is co-incubated with the sample which “mops up” the antibody depending on the concentration of the target in the sample. The free antibody is then able to bind to the antigen on the plate and provide a signal after the sample is washed away. In this case, the signal is inversely proportional to the concentration of the target biomarker.


    [28] Enzyme immunoassay ELISA and EMIT

    This chapter discusses the enzyme immunoassay ELISA and EMIT. Enzyme immunoassays can be classified into two fundamentally different types of assays: heterogeneous and homogeneous enzyme immunoassays (EIA). The heterogeneous EIA that include the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) are based on the same principles as are used in radioimmunoassays (RIA). After incubation of antigen and antibodies, the antigen–antibody complexes formed are separated from free antigen and antibody by one of a number of different techniques and the activity in one or both of the fractions is determined. In the homogeneous enzyme immunoassay that includes enzyme multiplied immunoassay technique (EMIT), no such separation is necessary. The principle of EMIT is similar to the modified bacteriophage technique. Antigen-coupled enzyme shows a change in activity (infectivity) upon incubation with antibody. This change is inhibited when the binding of antibody to the antigen-coupled enzyme is prevented by the addition of free antigen. ELISA is generally applicable to the measurement of almost any antigen. In ELISA, the enzyme is a passive passenger through the actual immunoassay. In EMIT, the enzyme plays a key role throughout the assay process. ELISA requires very little knowledge of enzyme technology, whereas enzymology is the key to success in EMIT.


    Assay Principles in Clinical Pathology

    Enzýmy

    EIAs are among the most popular types of immunoassay and employ enzymes as labels. The most common enzyme labels are ALP, HRP, glucose-6-dehydrogenase, and beta-galactosidase. Various detection systems have been used for enzyme labels, including colorimetric assays (monitored visually or photometrically), fluorogenic, and the more sensitive chemiluminescent assays (e.g., adamantyl dioxetane substrates for ALP).

    Examples of EIA include ELISA, EMIT, and CEDIA. ELISA is a heterogeneous EIA technique in which one of the reaction components (e.g., a capture antibody) is attached through nonspecific adsorption or chemically to the surface of a solid phase (e.g., inside surface of a microwell or surface of a magnetic microparticle). The immobilized antibody captures the antigen (analyte), which in turn binds to labeled antibody (conjugate) to form a sandwich of solid-phase Ab:Ag:Ab enzyme. Antibodies in a sample also are quantified by an ELISA procedure in which antigen instead of antibody is bound to a solid phase, and the second reagent is an enzyme-labeled antibody specific for the analyte antibody.

    EMIT is a type of homogeneous EIA used to develop a wide variety of small molecule assays (e.g., drugs). This type of mix and measure assay is easily automated (e.g., using an automated clinical chemistry analyzer). In the EMIT technique, the analyte (e.g., a drug) competes with and enzyme-labeled analyte for binding to the antianalyte antibody. Binding of the analyte antibody to the enzyme–analyte conjugate affects the enzyme and alters its activity (eqn [5] ). The change in enzyme activity is proportional to the analyte concentration in the patient's sample:

    CEDIA is another type of homogeneous EIA. It utilizes inactive fragments (the enzyme donor and acceptor) of β-galactosidase. These two fragments spontaneously reassemble to form active enzyme even if the enzyme donor is attached to an antigen. However, binding of an antibody to the enzyme donor–antigen conjugate inhibits reassembly, thereby blocking the formation of active enzyme. Thus, competition between antigen and the enzyme donor–antigen conjugate for a fixed amount of antibody in the presence of the enzyme acceptor modulates the measured enzyme activity such that high concentrations of antigen produce the least inhibition of enzyme activity and low concentrations, the greatest (eqn [6] ):


    Immunofiltration and Immunochromatographic Assays

    ​For some situations, it may be necessary to detect or quantify antigens or antibodies that are present at very low concentration in solution. Immunofiltration techniques have been developed to make this possible. In immunofiltration, a large volume of fluid is passed through a porous membrane into an absorbent pad. An antigen attached to the porous membrane will capture antibody as it passes alternatively, we can also attach an antibody to the membrane to capture antigen.

    The method of immunofiltration has been adapted in the development of immunochromatographic assays, commonly known as lateral flow tests or strip tests. These tests are quick and easy to perform, making them popular for point-of-care use (i.e., in the doctor’s office) or in-home use. One example is the TORCH test that allows doctors to screen pregnant women or newborns for infection by an array of viruses and other pathogens (Toxoplasma, other viruses, rubella, cytomegalovirus, herpes simplex). In-home pregnancy tests are another widely used example of a lateral flow test (Figure 5). Immunofiltration tests are also popular in developing countries, because they are inexpensive and do not require constant refrigeration of the dried reagents. However, the technology is also built into some sophisticated laboratory equipment.

    In lateral flow tests (Figure 6), fluids such as urine are applied to an absorbent pad on the test strip. The fluid flows by capillary action and moves through a stripe of beads with antibodies attached to their surfaces. The fluid in the sample actually hydrates the reagents, which are present in a dried state in the stripe. Antibody-coated beads made of latex or tiny gold particles will bind antigens in the test fluid. The antibody-antigen complexes then flow over a second stripe that has immobilized antibody against the antigen this stripe will retain the beads that have bound antigen. A third control stripe binds any beads. A red color (from gold particles) or blue (from latex beads) developing at the test line indicates a positive test. If the color only develops at the control line, the test is negative.

    Like ELISA techniques, lateral flow tests take advantage of antibody sandwiches, providing sensitivity and specificity. While not as quantitative as ELISA, these tests have the advantage of being fast, inexpensive, and not dependent on special equipment. Thus, they can be performed anywhere by anyone. There are some concerns about putting such powerful diagnostic tests into the hands of people who may not understand the tests’ limitations, such as the possibility of false-positive results. While home pregnancy tests have become widely accepted, at-home antibody-detection tests for diseases like HIV have raised some concerns in the medical community. Some have questioned whether self-administration of such tests should be allowed in the absence of medical personnel who can explain the test results and order appropriate confirmatory tests. However, with growing numbers of lateral flow tests becoming available, and the rapid development of lab-on-a-chip technology ([link]), home medical tests are likely to become even more commonplace in the future.

    Obrázok 5. A lateral flow test detecting pregnancy-related hormones in urine. The control stripe verifies the validity of the test and the test line determines the presence of pregnancy-related hormones in the urine. (credit: modification of work by Klaus Hoffmeier)​ Obrázok 6. Immunochromatographic assays, or lateral flow tests, allow the testing of antigen in a dilute solution. As the fluid flows through the test strip, it rehydrates the reagents. Antibodies conjugated to small particles bind the antigen in the first stripe and then flow onto the second stripe where they are bound by a second, fixed antibody. This produces a line of color, depending on the color of the beads. The third, control stripe binds beads as well to indicate that the test is working properly. (credit: modification of work by Yeh CH, Zhao ZQ, Shen PL, Lin YC)​
    • ​What physical process does the lateral flow method require to function?
    • Explain the purpose of the third strip in a lateral flow assay.

    ​Table compares some of the key mechanisms and examples of some of the EIAs discussed in this section as well as immunoblots, which were discussed in Detecting Antigen-Antibody Complexes.​

    Immunoblots & Enzyme Immunoassays

    ​PART 3

    ​Although the indirect ELISA for HIV is a sensitive assay, there are several complicating considerations. First, if an infected person is tested too soon after becoming infected, the test can yield false-negative results. The seroconversion window is generally about three weeks, but in some cases, it can be more than two months.

    In addition to false negatives, false positives can also occur, usually due to previous infections with other viruses that induce cross-reacting antibodies. The false-positive rate depends on the particular brand of test used, but 0.5% is not unusual. 1 Because of the possibility of a false positive, all positive tests are followed up with a confirmatory test. This confirmatory test is often an immunoblot (western blot) in which HIV peptides from the patient’s blood are identified using an HIV-specific mAb-enzyme conjugate. A positive western blot would confirm an HIV infection and a negative blot would confirm the absence of HIV despite the positive ELISA.

    Unfortunately, western blots for HIV antigens often yield indeterminant results, in which case, they neither confirm nor invalidate the results of the indirect ELISA. In fact, the rate of indeterminants can be 10–49% (which is why, combined with their cost, western blots are not used for screening). Similar to the indirect ELISA, an indeterminant western blot can occur because of cross-reactivity or previous viral infections, vaccinations, or autoimmune diseases.

    • Of the 1300 patients being tested, how many false-positive ELISA tests would be expected?
    • Of the false positives, how many indeterminant western blots could be expected?
    • How would the hospital address any cases in which a patient’s western blot was indeterminant?

    Jump to the previous Clinical Focus box. Jump to the next Clinical Focus box.


    Pozri si video: SPOLEČNOST: jdeme nebo jsme vezeni?..Soňa Peková (August 2022).