Informácie

18.3: Vylučovanie dusíka a cyklus močoviny - biológia

18.3: Vylučovanie dusíka a cyklus močoviny - biológia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Cyklus močoviny

Teraz sme v pozícii, aby sme videli, čo sa stane s prebytkom NH3/NH4+ ktorý sa hromadí v mitochondriách pečene. Ak je vaša strava bohatá na bielkoviny a teda aminokyseliny, keďže sa nedajú skladovať ako bielkoviny ako také, sú metabolizované na energiu a metabolické produkty sa môžu premeniť na tuky alebo sacharidy. Zanecháva nadbytočný dusík, ktorý končí väčšinou ako močovina na vylučovanie.

Močovina je vo vode veľmi rozpustná, netoxická molekula, ktorú biochemici používajú v laboratóriu na chemickú denaturáciu proteínu (v koncentráciách 3-6 M). Klinické koncentrácie močoviny v krvi sú vyjadrené ako močovina v krvi Dusík (BUN), ktoré sa pohybujú od 7 do 20 mg/dl N, čo zodpovedá 2,5 až 7,1 mM močovina. Hladiny v sére závisia predovšetkým od rovnováhy medzi syntézou močoviny v pečeni a jej elimináciou obličkami. Normálne koncentrácie močoviny v bunkách by mali byť podobné.

Močovina sa vyrába cestou nazývanou cyklus močoviny, ako je znázornené na obrázku nižšie.

arginosukcinát lyáza

Názvy enzýmov sú:

  • CPS1: karbamoylfosfát syntáza I
  • OTC: ornitín transkarbamoyláza
  • ASS1: arginosukcinát syntáza 1
  • ASL: arginosukcináza lyzáza (aka arginosukcináza)
  • ARG1: argináza

Je farebne kódovaný na označenie zdrojov atómov C a N. Jeden N pochádza z amoniaku (alebo nepriamo z amidoN glutamínu), zatiaľ čo atóm C pochádza z uhličitanu. Druhý pochádza z amínu aspartátu. Všimnite si, že na napájanie cyklu sa používajú 3 ATP. Všimnite si tiež guanidínovú skupinu arginínu (NH(NH2+)NH2) je bezprostredným donorom 2 atómov N v kroku, pri ktorom vzniká močovina. S vedomím, že jedna aminokyselina bola bezprostredným darcom atómov dusíka v močovine, by ste to ľahko predpovedali.

Teraz sa pozrime na niektoré kroky, počnúc tými, ktoré sú poháňané ATP, čo sú tiež tie, kde je dusík začlenený do prekurzorov močoviny.

Karbamoylfosfát syntáza I (CPS I)

Tento enzým katalyzuje prvú "spustenú" cestu dráhy a vytvára reaktant, ktorý vstupuje do cyklu, karbamoylfosfát. Vyžaduje si to špecifický kofaktor, N-acetyl-glutamát (NAG), produkovaný acetyláciou glutamátu acetyl-COA pomocou enzýmu NAG syntázy, ktorý je aktivovaný arginínom. Reakcia nie je súčasťou cyklu, ale poskytuje preň vstup.

Cytosolická verzia tohto enzýmu, CPS II, sa používa na syntézu arginínových a pyrimidínových nukleotidov pomocou glutamínu ako donora NH4+ktorý reaguje s karboxyfosfátom za vzniku karbamoylfosfátu. Nie je regulovaná NAG.

CPS I poskytuje spôsob vytvorenia (C=O)NH2 jednotka pre močovinu kondenzáciou bikarbonátu a amoniaku za vzniku karbamátu, ktorý obsahuje vysokoenergetický "motív" vzhľadom na jeho hydrolýzu. (Poznámka: to neznamená, že prerušená väzba je vysokoenergetická, nesprávne pomenovanie nájdené v mnohých knihách.) Reakcia je teda poháňaná 2 ATP ako zdrojom energie. Močovina je potom molekula, ktorá "nesie" oba NH3/NH4+ ale aj uhličitan.

Reakčný mechanizmus pre karbamoylfosfátsyntázu je uvedený nižšie.

Dve molekuly vysokoenergetického motívu (opäť s ohľadom na ich produkty hydrolýzy) sú chránené pred nešpecifickou hydrolýzou, keď zmiešaný anhydrid prechádza sekvestrovaným tunelom do vzdialenejšieho miesta fosforylácie v multimérnom enzýme.

Nižšie uvedená štruktúra ukazuje 2 ADP a NAG viazané na jeden reťazec multiméru. "Voľne plávajúci" NAG, ADP a ióny (horčík a draslík) by boli naviazané na druhý monomér, ktorý nie je znázornený.

iCn3D model: vymeňte

Proteín existuje v rovnovážnej zmesi monomér-dimér. Každý monomér má 1 NAG a 2 ADP, ktoré predstavujú dve rôzne väzbové miesta pre dva rôzne fosforylačné kroky, ako je uvedené v reakcii vyššie. Dve fosforylačné miesta sú spojené tunelom, ktorý umožňuje prechod zmiešaného anhydridu do miesta fosforylácie karbamátu. NAG je jednoznačne alosterický modifikátor, pretože nie je viazaný v blízkosti fosforylačných miest. Pri väzbe na apo formu enzýmu vyvoláva veľkú zmenu konformácie, ktorá umožňuje prevahu kompetentnej konformácie enzýmu s úplným tunelom.

Obrázky tunela pre jeden monomér ľudského enzýmu CPS I sú uvedené nižšie.

Hore: ADP sú zobrazené nižšie v medzerníku s farbou CPK. Tunel medzi dvoma lokalitami ADP je zvýraznený purpurovou farbou. Žltá molekula je NAG, ktorý opäť uplatňuje svoj aktivačný účinok väzbou na alosterické miesto, čím sa tunel efektívne otvára.

Nasledujúci obrázok ukazuje enzýmový monomér v inej orientácii s použitím tunela ChExVis: nástroj na extrakciu a vizualizáciu molekulárnych kanálov. Veľká červená a zelená guľa ukazovala povrchové otvory.

Horný panel na obrázku nižšie zobrazuje polomer tunela v Angstromoch, ktorý prechádza z červenej gule do zelenej gule na obrázku vyššie. Spodný panel ukazuje mieru hydrofóbnosti (červená)/hydrofilnosti (modrá) aminokyselín obklopujúcich tunel.

ASS1: Arginosukcinát syntáza 1

Ďalší ATP sa štiepi, aby poháňal konverziu citrulínu na arginosukcinát, ktorý by sa dal ľahko odštiepiť v ďalšom kroku za vzniku aminokyseliny arginínu.

ASL: arginosukcináza lyzáza (aka arginosukcináza)

Tento enzým katalyzuje beta-eliminačnú reakciu, ktorá môže prebiehať buď mechanizmom E2 alebo E1. Všeobecný, ale veľmi skrátený mechanizmus znázorňujúci dvojkrokovú (E1) elimináciu cez karbaniónový medziprodukt je znázornený nižšie.

Model pod arginosukcinátom (AS11) sa viaže na aktívne miesto jedného zo štyroch monomérov ASL z Mycobacterium tuberculosis (6IEN). Zdá sa, že kľúčové katalytické zvyšky sú Ser 262 a His 161, ktoré pôsobia ako všeobecné kyseliny/zásady na uľahčenie abstrakcie protónov a ich redonácie. Zdá sa, že Lys 288 má atypické pKa (6,0), ktoré by mohlo uľahčiť deprotonáciu Ser 262, čo mu umožňuje pôsobiť ako všeobecná báza. https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/iub.2000

https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/i...qKVpmzdwBzFJL8 O

Ornitín transkarbamyoláza

Mechanizmus reakcie je tu pomerne jednoduchý. Karbamoylfosfát je aktivovaný elektrofil, v ktorom je karbonyl C atakovaný deprotonovanou aminoskupinou ornitínu za vzniku citrulínu. Gén sa nachádza na chromozóme X u ľudí, takže mutácie u mužov vedú k "hyperamonemickej kóme" a smrti. Heterozygotné samice môžu byť asymptomatické alebo sa to vo všeobecnosti ukáže ako smrteľné. Heterozygotné samice sú buď asymptomatické, alebo majú problémy vyplývajúce z defektov v biosyntéze pyrmidínov, ktoré možno zmierniť nízkoproteínovou diétou s prídavkom arginínu.

Argináza

Existujú dva všeobecné varianty tohto enzýmu, argináza I je cytosolický enzým exprimovaný v pečeni a podieľa sa na syntéze močoviny. Argináza II je mitochondriálny enzým a všeobecnejšie sa podieľa na metabolizme arginínu.

Substrát L-arginín sa viaže na aktívne miesto, ale nekoordinuje sa priamo s centrami kovových iónov. Hydroxid premosťujúci kov potom iniciuje nukleofilný útok na guanidíniovú skupinu substrátu, čo vedie k vytvoreniu tetraedrického medziproduktu. prenos protónov na odchádzajúcu aminoskupinu sprostredkovaný Asp-128, kolaps tetraedrického medziproduktu poskytuje produkty l-ornitín a močovinu.V poslednom kroku, na regeneráciu aktívneho miesta a uvoľnenie produktov, vstupuje molekula vody, ktorá premosťuje dvojjadrový klaster mangánu, ktorý spôsobí, že sa močovinový produkt presunie na koncové koordinačné miesto na mangáne 1. Disociácia produktu uľahčuje ionizáciu molekuly vody premosťujúcej kov za vzniku katalyticky aktívneho hydroxidového iónu Prenos protónov z vody premosťujúcej kov do objemu -rozpúšťadlo je sprostredkované bočným reťazcom His-141."

Nižšie uvedený model ukazuje aktívne miesto ľudskej arginázy I (3KV2) v komplexe s inhibítorom N(omega)-hydroxy-nor-L-arginínom, v ktorom je jeden z guanidinoN nahradený OH. Dve sivé gule sú ióny Mn.

Tu je ďalší model zobrazený na aktívnom mieste vody (480) v blízkosti iónov MN. Molekuly vody môžu pôsobiť ako ligandy a viazať ióny kovov v prechodnom stave prostredníctvom koordinačnej kovalentnej väzby. pKa viazanej vody sa posúva na nižšiu hodnotu, čím sa zvyšuje pravdepodobnosť deprotonácie za vzniku OH-, čo je lepšia báza aj nukleofil. Zdá sa, že voda 480 v aktívnom mieste tvorí koordinačnú kovalentnú väzbu s iónom Mn za vzniku hydroxidu aktívneho miesta, ktorý atakuje guanidínovú skupinu arginínu, čo vedie k tvorbe močoviny a ornitínu.

Statický obrázok:

Nariadenie

Ak sa konzumuje nadbytok aminokyselín/proteínov, zmena v génovej expresii môže zvýšiť hladiny enzýmov v cykle močoviny. Z krátkodobého hľadiska je aktivita regulovaná enzýmom, ktorý zabezpečuje prístup do cyklu, karbamoylfosfátsyntázou, ktorej aktivita je regulovaná kyselinou N-acetylglutámovou a ktorá katalyzuje krok obmedzujúci rýchlosť. Ako je uvedené vyššie, bez alosterického regulátora, NAG, je enzým funkčne neaktívny. Hladiny NAG určuje enzým NAG syntáza, ktorý je sám regulovaný voľným arginínom, bezprostredným prekurzorom močoviny v cykle. Doplnkový arginín sa podáva pacientom s poruchou močovinového systému a jeho účinok pravdepodobne nastáva reguláciou NAG syntázy.

Spojenie medzi cyklom močoviny a cyklom TCA

Dve z hlavných ciest, ktoré ste preskúmali, cykly TCA a močoviny, nie sú lineárne, ale cyklické. Aké výhody ponúkajú „kruhové“ oproti lineárnym? Vodítko nám možno ponúka porovnanie s ekonomickými cestami. V lineárnej ekonomike sa suroviny používajú na výrobu produktu, ktorý sa nakoniec vyhodí ako odpad. Žiaľ, lineárne cesty dominujú nášmu svetu za veľkú cenu pre naše životné prostredie. Svet by mal prejsť na obehové hospodárstvo, aby sa znížila neefektívnosť lineárnej ekonomiky a aby bola životaschopnejšia a aby sa znížili škody na životnom prostredí a súvisiace zmeny klímy. Obehové hospodárstvo sa vyznačuje tým, čo sa označuje ako 3R: znížte, znovu použite a recyklujte. To šetrí zdroje a energiu. Tieto charakteristiky sa vzťahujú aj na kruhové biochemické cesty, pretože znížené hladiny metabolitov sa opätovne používajú a recyklujú.

Vzhľadom na to by nemalo byť prekvapením, že cyklus močoviny a TCA sú prepojené, najmä ak vezmeme do úvahy, že kyselina fumarová je produktom cyklu močoviny a cyklickým metabolitom cyklu TCA. Okrem toho je kyselina asparágová pre oxalacetát jeden transaminatínový krok.

Jeden z dusíkov v močovine pochádza z amínu aspartátu, ktorý sa môže vytvoriť transamináciou oxalacetátu z cyklu TCA za vzniku aspartátu. Keďže cyklus TCA je cyklus, do cyklu sa musí vrátiť ekvivalent jedného oxalacetátu. Robí tak nepriamo z fumarátu, medziproduktu TCA, ktorý vzniká ako vedľajší produkt močovinového cyklu, ale fumarát sa tvorí v cytoplazme. Tam sa premení na malát, ktorý môže byť transportovaný do mitochondrií transportným proteínom, mitochondriálnym 2-oxoglutarátovým/malátovým transportérom, ktorý je súčasťou ďalšieho cyklu znázorneného na obrázku vyššie, tzv. asparatový arginosukcinátový skrat. K zavedeniu fumarátu do raketoplánu dochádza cez asparatový arginosukcinátový skrat znázornené na obrázku vyššie. Akonáhle malát vstúpi do mitochondriálnej matrice, môže sa priamo premeniť na oxaloacetát.

Všimnite si, že tieto spojené cykly vyžadujú prítomnosť mitochondriálnych aj cytoplazmatických foriem niekoľkých enzýmov () a rovnováhy medzi dvoma kľúčovými aminokyselinami v mitochondriálnom delení, gluatamátom a asparatátom. Jedným z takýchto kľúčových enzýmov je ASčasť Amino Transferáza (AST), aka Glutamát Oxalacetát Transamináza (GOT), pomenovaný pre reverznú reakciu aspartát + α-ketoglutarát ↔ oxalacetát + glutamát. Ako bolo uvedené v predchádzajúcej kapitole, tento kľúčový enzým možno nájsť v krvi, ak je poškodená pečeň, takže jeho hladiny sa bežne používajú pri lekárskych testoch na poškodenú funkciu pečene.

Ďalšou kľúčovou funkciou jablčného asparatu je priniesť do mitochondrií redukované "ekvivalenty" NADH, ktoré sa produkujú v cytoplazme z glykolýzy a oxidácie mastných kyselín. Pre NAD neexistuje žiadny membránový transportér+ alebo NADH. Namiesto toho môže byť cytoplazmatický malát, produkovaný cytosolickou redukciou oxalakátu pomocou NADH, transportovaný do matrice, ktorá môže reformovať mitochondriálny NADH pri premene na oxalacetát. NADH sa potom môže použiť na napájanie produkcie ATP prostredníctvom mitochondriálnych elektrónových transpsortných / oxidačných fosfoylačných dráh.

Z energetického hľadiska sa na výrobu jednej molekuly močoviny používajú štyri fosfoanhydridové väzby v 2 molekulách ATP. Tento veľký energetický výdaj je čiastočne kompenzovaný ATP vyrobeným z "fumarátových ekvivalentov", ktorý vstupuje do mitochondrií cez asparát arginosukcinátové a asparátové arginosukcinátové skraty a prechod NADH cez oxidačnú fosforyláciu.


Ontogenéza metabolizmu a vylučovania dusíka

U mnohých druhov rýb je skorý spôsob metabolizmu a vylučovania dusíka ovplyvnený dominanciou aminokyselín ako primárneho paliva a výsledným toxickým konečným produktom, amoniakom. Pelagické vajcia morských teleostov pri neresení obsahujú veľkú zásobu žĺtkov FAA. Počas konečného dozrievania oocytov vznikajú FAA hydrolýzou špecifických proteínov žĺtka a pomáhajú pri hydratácii vajíčka. Na začiatku exogénneho kŕmenia larvy morských rýb nevyhnutne prijmú novú zásobu FAA so svojou korisťou zooplanktónu a môžu tak pokračovať v disipácii energie na báze aminokyselín napriek nízkej proteolytickej kapacite čriev. Rýchlosť vylučovania amoniaku sa zvyšuje s vývojovým štádiom, ale amoniak sa tiež akumuluje na značné hladiny v čase vyliahnutia. Historicky sa vylučovanie močoviny považovalo za menej dôležité u embryí a lariev teleostov, ale nedávno boli počas embryogenézy u niektorých druhov detegované významné hladiny enzýmov močovinového cyklu, napriek nízkym alebo nedetegovateľným hladinám u dospelých. Mechanizmy vylučovania dusíka boli študované iba u embryí pstruha dúhového sladkovodného, ​​kde je vylučovanie amoniaku závislé od gradientu parciálneho tlaku NH3. Budúci výskum rozmanitého radu druhov s rôznymi životnými históriami a prostrediami rozšíri naše chápanie ontogenézy vylučovania dusíka.


Zmena vzorcov vylučovania dusíka a kapacity katabolizmu aminokyselín počas životného cyklu mihule morskej (Petromyzon marinus)

Ryba bez čeľustí, mihuľa morská (Petromyzon marinus), trávi časť svojho života ako larva (ammocoete) žijúca v norách, kým prejde premenou na voľne plávajúce parazitické mláďa, ktoré sa živí krvou rýb. Predpovedali sme, že zvieratá v tomto juvenilnom, parazitickom štádiu majú veľkú kapacitu na katabolizáciu aminokyselín pri požití veľkého množstva krvi bohatej na bielkoviny. Šesťnásobne až 20-krát vyššie rýchlosti vylučovania amoniaku (J(Amm)) u postmetamorfných (nekŕmiacich sa) a parazitických mihule v porovnaní s ammocoetami naznačujú, že bazálne rýchlosti katabolizmu aminokyselín sa po metamorfóze zvýšili. Bolo to pravdepodobne spôsobené väčšou bazálnou katabolizačnou kapacitou aminokyselín, pri ktorej bola šesťnásobne vyššia aktivita pečeňovej glutamátdehydrogenázy (GDH) u parazitických mihulí v porovnaní s ammocoetami. Imunoblotting tiež odhalil, že množstvo GDH bolo 10-krát a trikrát väčšie u parazitických mihulí ako u ammocoet a migrujúcich mihulí proti prúdu. Vyššie aktivity pečeňového alanínu a aspartátaminotransferázy u parazitických mihuľoviek tiež naznačujú zvýšenú kapacitu katabolizácie aminokyselín v tomto štádiu života. Na rozdiel od parazitických mihulí dvojnásobne väčšia zásoba voľných aminokyselín vo svale migrujúcich mihulí v protiprúde potvrdila, že toto obdobie prirodzeného hladovania je sprevádzané výraznou proteolýzou. Karbamoylfosfátsyntetáza III bola detegovaná v nízkych hladinách v pečeni parazitických a upstream migrujúcich mihulí, ale nezistil sa žiadny dôkaz extrahepatálnej (svaly, črevo) produkcie močoviny prostredníctvom cyklu ornitínovej močoviny. Detekcia aktivity arginázy a vysokých koncentrácií arginínu v pečeni vo všetkých skúmaných životných štádiách však usudzuje, že hydrolýza arginínu je dôležitým zdrojom močoviny. Dospeli sme k záveru, že metamorfóza je sprevádzaná metabolickou reorganizáciou, ktorá zvyšuje schopnosť parazitických morských mihulí katabolizovať prerušovane veľké aminokyselinové záťaže vznikajúce pri požití krvi bohatej na proteíny od ich koristi/hostiteľov. Následná generácia energeticky bohatých uhlíkových skeletov môže byť potom oxidovaná alebo zadržaná pre syntézu glykogénu a mastných kyselín, ktoré sú základnými palivami pre migračné a neresiace sa fázy životného cyklu mihule morskej.


Ako hmyz vylučuje dusíkaté odpady

Mikroorganizmy a bezstavovce používajú primitívnejšie a jednoduchšie mechanizmy na zbavenie sa splodín metabolizmu ako cicavčí systém funkcie obličiek a močových ciest. V organizmoch pred zložitými obličkami sa vyvinuli tri vylučovacie systémy: vakuoly, plameňové bunky a Malpighove tubuly.

Učebné ciele

  • Vysvetlite, ako vakuoly prítomné v mikroorganizmoch fungujú pri vylučovaní odpadu
  • Opíšte spôsob, akým plamenné bunky a nefrídie v červoch vykonávajú vylučovacie funkcie a udržiavajú osmotickú rovnováhu
  • Vysvetlite, ako hmyz používa malpighovské tubuly na vylučovanie odpadu a udržiavanie osmotickej rovnováhy
  • Identifikujte bežné odpady a odpadové systémy

Preprava močoviny

Proteín transportéra močoviny (UT)-A1 je exprimovaný v apikálnej plazmatickej membráne terminálneho vnútorného medulárneho zberného kanálika (IMCD) (10�). Pozostáva z 12 transmembránových domén spojených cytoplazmatickou slučkou (obrázky 2 a ​ a 3)3) (13). UT-A3 je N-terminálna polovica UT-A1 a je tiež exprimovaná v IMCD, primárne v bazolaterálnej membráne, ale môže byť detekovaná v apikálnej membráne po stimulácii vazopresínom (14,15). UT-A2 je C-terminálna polovica UT-A1 a je vyjadrená v tenkej zostupnej končatine (11,15�). UT-A4 je N-koncových 25 % UT-A1 spojených s C-koncovými 25 % (11). Proteín UT-B1 je exprimovaný v červených krvinkách (11, 16, 17) a v nefenestrovaných endoteliálnych bunkách, ktoré sú charakteristické pre zostupné vasa recta, najmä v tých, ktoré sú mimo zhlukov zberných kanálikov (18).

Transportéry močoviny pozdĺž nefrónu. Karikatúra a histológia zobrazujú transportéry močoviny (UT-A1/UT-A3, UT-A2 a UT-B1) pozdĺž nefrónu. UT-B1 sa nachádza hlavne vo vasa recta, UT-A2 sa nachádza v tenkom zostupnom ramene Henleho slučky a UT-A1 (apikálny) a UT-A3 (bazolaterálny) sa nachádza vo vnútornom medulárnom zbernom kanáli. Upravené z odkazu 12 so súhlasom.

Štyri renálne izoformy UT-A proteínu. UT-A1 je najväčší proteín obsahujúci 12 transmembránových helixov. Helixy 6 a 7 sú spojené veľkou intracelulárnou slučkou, o ktorej nedávne štúdie ukázali, že je rozhodujúca pre funkčné vlastnosti UT-A1 (1). UT-A3 je N-koncová polovica UT-A1, zatiaľ čo UT-A2 je C-koncová polovica UT-A1. UT-A4 je N-koncová štvrť UT-A1 spojená s C-koncovou štvrtinou. Upravené z odkazu 13 so súhlasom.

Manipulácia s močovinou pozdĺž Nefrónu

Močovina sa filtruje cez glomerulus a vstupuje do proximálneho tubulu. Koncentrácia močoviny v ultrafiltráte je podobná plazme, takže množstvo močoviny vstupujúcej do proximálneho tubulu je riadené GFR. Vo všeobecnosti sa 30 %� % filtrovanej náplne močoviny vylúči. Koncentrácia močoviny sa zvyšuje v prvých 75 % proximálneho stočeného tubulu, kde dosahuje hodnotu približne o 50 % vyššiu ako v plazme (11). Toto zvýšenie je výsledkom odstraňovania vody, sekundárneho transportu soli, a je udržiavané v celom zvyšku proximálneho tubulu. Transport močoviny cez proximálny tubul nie je regulovaný vazopresínom (nazývaným aj antidiuretický hormón), ale zvyšuje sa so zvýšeným transportom sodíka.

Existujú dva typy Henleových slučiek: dlhá slučka v juxtamedulárnych nefrónoch a krátka slučka v kortikálnych nefrónoch. Rozdiel je v tom, že nefróny s krátkou slučkou nemajú tenkú vzostupnú končatinu (obrázok 4). Všetky časti krátkych slučiek sú priepustné pre močovinu, ale smer a veľkosť pohybu močoviny sa mení v závislosti od diuretického stavu zvieraťa (11). Koncentrácia močoviny v skorom distálnom tubule (na konci slučky) môže dosiahnuť 7-násobok plazmatickej koncentrácie u antidiuretických potkanov, čo je vyššie ako koncentrácia na začiatku slučky. Preto intervenujúce segmenty podporujú sekréciu močoviny za antidiuretických podmienok. Naproti tomu počas vodnej diurézy nie je rozdiel v proximálnom tubulárnom pohybe močoviny, zatiaľ čo v krátkych slučkách dochádza k čistej reabsorpcii močoviny (11).

Štruktúra nefrónu. Karikatúra zobrazuje kôru (hore), vonkajšiu dreň (v strede) a vnútornú dreň (dole), pričom ukazuje umiestnenie rôznych subštruktúr nefrónu označených takto: 1, glomerulus 2, proximálny stočený tubulus 3s a 3l, proximálny rovný tubul v nefrone s krátkou slučkou (3s) a dlhý slučkový nefrón (3l) 4s a 4l, tenká zostupná končatina 5, tenká vzostupná končatina 6s a 6l, medulárna hrubá vzostupná končatina 7, macula densa 8, distálny stočený tubulus 9, kortikálny zberný kanál 10, vonkajší dreňový zberný kanál 11, počiatočný vnútorný dreňový zberný kanál a 12, terminálny vnútorný dreňový zberný kanál. Upravené z odkazu 11 so súhlasom Americkej fyziologickej spoločnosti.

Obrázok 5 sumarizuje permeabilitu močoviny pre rôzne segmenty nefrónov z obličiek potkana. Priepustnosť močoviny proximálnych stočených tubulov je vyššia ako v proximálnych priamych tubuloch. Tenké zostupné ramená krátkych slučiek majú nízku priepustnosť močoviny vo vonkajšej dreni, ale vyššia priepustnosť močoviny je v dlhých kľučkách vo vnútornej dreni. Zvýšená intraluminálna koncentrácia močoviny v tenkých zostupných končatinách je výsledkom zmeny pomeru močovina:voda v dôsledku straty vody. Hoci existujú značné rozdiely v hodnotách absolútnej permeability močoviny nameraných u rôznych zvierat, všeobecne sa uznáva, že močovina sa vylučuje do lúmenu tenkých končatín za antidiuretických podmienok (11). Okrem toho sa koncentrácia močoviny zvyšuje reabsorpciou vody poháňanou hypertonickým medulárnym interstíciom, ktorá je výsledkom pohybu močoviny z IMCD.

Merané priepustnosti močoviny v rôznych nefrónových častiach obličky potkana. CCD, kortikálny zberný kanál DCT, distálny stočený tubulus IMCD, vnútorný dreňový zberný kanál mTAL, medulárny hrubý vzostupný končatinový kanál OMCD, vonkajší dreňový zberný kanál PCT, proximálny stočený tubulus PST, proximálny rovný tubulus tAL, tenká vzostupná končatina tDL, tenká zostupná končatina tDL. Upravené z odkazu 11 so súhlasom Americkej fyziologickej spoločnosti.

Koncentrácia močoviny sa zvyšuje na tenkých vzostupných končatinách (11) v dôsledku gradientu sekrécie močoviny, ktorý zabezpečuje reabsorpcia močoviny z IMCD. Gradient klesá, keď tenké vzostupné končatiny stúpajú a hnacia sila na presun močoviny do tubulárneho lúmenu sa tiež znižuje. Koncentrácia močoviny dosiahne úroveň, ktorá je ekviosmolárna s okolitým interstíciom na začiatku medulárnej hrubej vzostupnej končatiny. Na rozdiel od tenkých ascendentných končatín majú hrubé ascendentné končatiny nižšiu priepustnosť močoviny (11,16). Dochádza však k celkovému zvýšeniu koncentrácie močoviny v lúmene od začiatku hrubej vzostupnej končatiny až po distálny stočený tubulus.

Distálny stočený tubul má nízku priepustnosť močoviny, avšak časť močoviny sa v tomto segmente reabsorbuje, takže koncentrácia močoviny klesá z približne 110 % filtrovanej náplne na približne 70 % v počiatočnej časti kortikálneho zberného kanálika. Kortikálny aj vonkajší medulárny zberný kanál majú nízku permeabilitu močoviny (11,16). Naproti tomu IMCD má vysokú priepustnosť močoviny, ktorú zvyšuje vazopresín. Dochádza k rozsiahlej reabsorpcii močoviny z lúmenu IMCD do interstícia. Tubulárna tekutina (moč) vystupujúca z IMCD obsahuje približne 50 % filtrovanej náplne močoviny.

Mechanizmus koncentrácie moču

Močovina a transportéry močoviny hrajú kľúčovú úlohu vo vnútorných medulárnych procesoch na produkciu koncentrovaného moču. Význam močoviny sa doceňuje už takmer 8 desaťročí od Gamble a kol. prvýkrát opísal ȁmôže úsporu vody pri renálnej funkcii, ktorá sa vzťahuje na močovinu” (19). Proteínová deprivácia znižuje maximálnu schopnosť koncentrácie moču a je obnovená infúziou močoviny alebo korekciou proteínovej malnutrície (11,16). Znížená maximálna schopnosť koncentrácie moču je prítomná u niekoľkých geneticky upravených myší, ktorým chýbali rôzne transportéry močoviny, vrátane UT-A1/A3, UT-A2, UT-B1 a UT-A2/B1 knockout myší (11,12,16) . Aj keď mechanizmus, ktorým vnútorná dreň koncentruje moč, zostáva kontroverzný, úlohu musí zohrávať účinok odvodený od močoviny alebo transportérov močoviny (11,16,17).

Najrozšírenejším mechanizmom na produkciu koncentrovaného moču vo vnútornej dreni je hypotéza pasívneho mechanizmu, ktorú navrhli Kokko a Rector (20) a Stephenson (21). Pasívny mechanizmus vyžaduje, aby vnútorná medulárna intersticiálna koncentrácia močoviny prevyšovala koncentráciu močoviny v lúmene tenkej vzostupnej končatiny. Ak sa do hlbokej vnútornej drene dostane nedostatočné množstvo močoviny, schopnosť koncentrácie moču sa zníži, pretože chemické gradienty potrebné na pasívnu reabsorpciu NaCl z tenkej vzostupnej končatiny nie je možné stanoviť. Primárnym mechanizmom dodávky močoviny do vnútorného medulárneho interstícia je reabsorpcia močoviny z terminálneho IMCD (22). Reabsorpcia močoviny je sprostredkovaná transportérovými proteínmi močoviny UT-A1 a UT-A3 (11,16,17). Obrázok 2 ukazuje umiestnenie kľúčových transportných proteínov močoviny, ktoré sa podieľajú na koncentrácii moču.

V koncentrácii moču hrá dôležitú úlohu aj transportér močoviny UT-B1 (11). Proteín UT-B1 je exprimovaný v červených krvinkách a zostupnej vasa recta (11). UT-B1 je antigén Kiddovej krvnej skupiny, antigén menšej krvnej skupiny. Ľudia bez UT-B1 nie sú schopní koncentrovať svoj moč 𾠀 mOsm/kg H2O, aj po nedostatku vody a podaní vazopresínu (23). UT-B1 knockout myši majú tiež zníženú maximálnu schopnosť koncentrovať moč v porovnaní s myšami divokého typu (24). Tieto údaje naznačujú, že transport močoviny v červených krvinkách je dôležitý pre účinnú protiprúdovú výmenu, ktorá je nevyhnutná pre maximálnu koncentráciu v moči (25). Keď červené krvinky zostupujú do drene, akumulujú močovinu, aby zostali v osmotickej rovnováhe s medulárnym interstíciom. Keď červené krvinky stúpajú vo vzostupnej vasa recta, potrebujú stratiť močovinu. V neprítomnosti UT-B1 červené krvinky nie sú schopné dostatočne rýchlo stratiť močovinu a odobrať časť močoviny z drene a do krvného obehu, čím sa zníži účinnosť protiprúdovej výmeny a schopnosť koncentrovať moč (25).

Rýchla regulácia proteínov prenášajúcich močovinu

Vazopresín.

Vasopresín reguluje oba IMCD transportéry močoviny UT-A1 a UT-A3. Vasopresín zvyšuje fosforyláciu a apikálnu plazmatickú membránovú akumuláciu UT-A1 a UT-A3 (14,26). Vazopresín fosforyluje seríny 486 a 499 v UT-A1 a oba musia byť mutované, aby sa eliminovala stimulácia vazopresínom (27). Vasopresín zvyšuje transport močoviny, fosforyláciu transportéra močoviny a akumuláciu apikálnej plazmatickej membrány prostredníctvom dvoch ciest závislých od cAMP: proteínkinázy A a výmenného proteínu aktivovaného cAMP (28) (obrázok 6). Geneticky upravené myši, ktorým chýba UT-A1 a UT-A3, majú zníženú schopnosť koncentrovať moč, majú znížený obsah intersticiálnej močoviny vo vnútri drene a vo svojich IMCD im chýba transport močoviny stimulovaný vazopresínom (29).

Transport močoviny cez bunku IMCD. Vasopresín sa viaže na V2R, ktorý sa nachádza na bazolaterálnej plazmatickej membráne a aktivuje sa α podjednotka heterotrimérneho G proteínu Gsα. Aktivácia G proteínu stimuluje AC k syntéze cAMP. Zvýšenie intracelulárneho cAMP stimuluje niekoľko downstream proteínov vrátane PKA a Epac, ktoré fosforylujú UT-A1 a zvyšujú jeho akumuláciu v apikálnej plazmatickej membráne. Močovina vstupuje do bunky IMCD cez UT-A1 a vystupuje na bazolaterálnej plazmatickej membráne cez UT-A3. AC, adenylylcykláza Epac, výmenný proteín priamo aktivovaný cAMP Gs, G proteín stimulačná podjednotka P, fosfát PKA, proteínkináza AV2R, V2 vazopresínový receptor. Upravené z odkazu 13 so súhlasom.

Hypertonicita.

Transport močoviny cez IMCD je regulovaný nezávisle hypertonicitou (11,16,17). Permeabilita močoviny sa rýchlo zvyšuje pri perfundovaných IMCD, keď je zvýšená osmolalita, dokonca aj v neprítomnosti vazopresínu (30,31). Vazopresín a hyperosmolalita majú aditívny stimulačný účinok na permeabilitu močoviny (11,16,17). Hyperosmolalita, podobne ako vazopresín, zvyšuje fosforyláciu a akumuláciu plazmatickej membrány UT-A1 aj UT-A3 (14,26,32,33). Hyperosmolalita a vazopresín však signalizujú rôznymi cestami: hyperosmolalita cez zvýšenie proteínkinázy Cα a intracelulárny vápnik a vazopresín cez zvýšenie adenylylcyklázy (11,16,17). Hyperosmolalita nestimuluje transport močoviny v proteínkináze Cα knockout myši a majú poruchu koncentrácie moču (31,34,35).

Dlhodobá regulácia prepravcov močoviny

Vazopresín.

Vazopresín dlhodobo reguluje IMCD transportéry močoviny prostredníctvom zmien v nadbytku proteínov (11,16,17). Podávanie vazopresínu počas 2 týždňov potkanom, ktoré majú vrodený nedostatok vazopresínu, a teda centrálny diabetes insipidus, zvyšuje množstvo proteínu UT-A1 vo vnútornej dreni (36). Potlačenie endogénneho vazopresínu potkanmi zaťažujúcimi vodu počas 2 týždňov znižuje množstvo proteínu UT-A1 (36). Zvýšenie množstva proteínu UT-A1 po podaní vazopresínu zodpovedá časovému priebehu zvýšenia obsahu močoviny vo vnútornej dreni po podaní vazopresínu potkanom, ktoré majú vrodený nedostatok vazopresínu. Expresia proteínu UT-A3 je znížená u potkanov, ktoré sú zaťažené vodou počas 3 dní a je zvýšená u potkanov, ktoré sú obmedzené na vodu počas 3 dní. Účinok vazopresínu na množstvo UT-B1 je nejasný, pretože niektoré štúdie ukazujú zvýšenie a iné pokles (11,16,17).

Nízkobielkovinové diéty.

Rats fed a low-protein diet for at least 2 weeks have a decrease in the fractional excretion of urea (37). This results, at least in part, from the functional expression of vasopressin-stimulated urea permeability in the initial IMCD, a segment in which it is not normally present, and an increase in UT-A1 protein abundance (11,16,17). The effect of a low-protein diet on the other urea transporters has not been studied.

Adrenal Steroids.

Glucocorticoids increase the fractional excretion of urea (38). Despite this increase, serum urea nitrogen (SUN) increases in patients given glucocorticoids. This indicates that the increase in urea excretion is insufficient to offset the increase in production in patients given glucocorticoids.

Adrenalectomy, which eliminates both glucocorticoids and mineralocorticoids, produces a urine concentrating defect, although the mechanism is unknown (11). Adrenalectomy increases UT-A1 protein abundance and urea permeability in rat terminal IMCDs (39). Administering dexamethasone to adrenalectomized rats decreases UT-A1 protein abundance and urea permeability (39). Both UT-A1 and UT-A3 protein abundances decrease in rats given dexamethasone (40). The decrease in urea transporters in dexamethasone-treated rats could explain the increase in the fractional excretion of urea because a reduction in urea transporter abundance could result in less urea being reabsorbed and, thus, more being excreted.

Administering mineralocorticoids to adrenalectomized rats also decreases UT-A1 protein abundance in the inner medulla (41). This decrease can be blocked by spironolactone, a mineralocorticoid receptor antagonist (41). Both mineralocorticoid and glucocorticoid hormones appear to work through their respective receptors because spironolactone does not block the decrease due to dexamethasone (41).

Acidosis.

Metabolic acidosis is a common complication of renal failure. Acidosis increases protein degradation and shifts the nitrogen and urea loads within the kidney (42). UT-A1 protein abundance increases in the inner medulla of acidotic rats, which may represent compensation for the loss of kidney concentrating ability (increase in urine volume and a decrease in urine osmolality) that occurs during acidosis (43).

Hypokalemia.

Prolonged hypokalemia can cause a decrease in urine concentrating ability (44). The abundance of UT-A1, UT-A3, and UT-B1 proteins in the inner medulla is reduced in rats fed a potassium-restricted diet (44,45). UT-A2 protein abundance was reduced in one study but increased in another (44,45). The reason for the different findings is unclear.

In summary, renal urea transport and urea transport proteins mediate a central role in the urine concentrating mechanism. Urine concentrating defects have been demonstrated in several urea transporter knockout mice (11,12,16). In many clinical conditions associated with altered urine concentrating ability or water homeostasis, changes in urea excretion and urea transporters may be contributory factors.


Materiály a metódy

Experimental animals

Laboratory-reared Rivulus marmoratus Poey were maintained as described previously (Frick and Wright, 2002). Wild-caught fish were collected from Twin Cays and Little Lagoon Cay, near Dangriga, Belize, and held as described previously (Frick and Wright, 2002).

Experimental protocol

Excretion during emersion

Two separate experiments were performed on laboratory-reared fish. (i) Fish were exposed in air for 12 h (N=18) and then returned to water excretion rates were measured every 2 h following emersion and compared with rates measured ‘pre-emersion’. (ii) Fish were exposed in air for 11 days (N=6), and excretion rates were measured during emersion and compared with rates measured in fish under control conditions (immersion).

Under air-exposed conditions, the fish were removed from water and placed onto a moist substratum (filter paper and cotton batting saturated with approximately 2 ml of 16 ‰ sea water). In experiment ii, the amount of urea and ammonia excreted over a 24 h period was measured after 1, 3, 5, 7, 9 and 11 days of air-exposure and under control conditions. Technical control experiments were performed in which a known amount of ammonia and urea were placed on the filter paper and left for 24 h to determine whether there was any loss (or gain) due to bacterial contamination or other factors. The filter paper and cotton were collected after 24 h, and the water was carefully extracted.

Ammonia volatilization

To measure the amount of ammonia excreted through volatilization, an apparatus was constructed similar to that used by Davenport and Sayer (1986). Air was first bubbled through acidified distilled water (ADW) (pH 6) to remove any ammonia in the air supply. The air was then passed into a second chamber containing the fish on filter paper saturated with 16 ‰ sea water at pH 6. The air exiting the second chamber was bubbled through a third chamber containing 0.5 mol l –1 KOH, which removed CO2. Air from the third chamber was bubbled through five separate acid traps each containing ADW to ‘fix’ any ammonia present in the air. Preliminary studies showed that five acid traps were necessary to ensure maximal recovery of the volatilized ammonia. Control trials were run in which filter paper was saturated (i) with ammonia-free, pH 6, 16 ‰ sea water or (ii) with a known amount of ammonia (100 μmol l –1 ) in 16 ‰ sea water, pH 6. These control trials established that no ammonia volatilization was measured in the absence of a fish.

Routes of excretion

To determine the sites of JAmm a JUrea in laboratory-reared R. marmoratus, a Plexiglas chamber (see Wells and Pinder, 1996) was used to separate the anterior (representing primarily branchial excretion) and posterior (cutaneous, kidney and intestinal excretion) of the fish. Fish were lightly anaesthetized in 2-phenoxy-ethanol (1.2 ml l –1 ) to reduce stress during the restraining period. The head end of the fish was then positioned through a small hole (approximately 5 mm in diameter) in a 3 cm×3 cm piece of dental dam, forming a tight seal around the fish just posterior to the operculum. Under control conditions (N=7), 4 ml of 16 ‰ sea water was placed into both the front and back ends of the chamber. In a separate group of fish, moist pieces of cotton were placed in the front and back ends of the chamber during air-exposure (N=7). After 1 h, water or cotton/filter samples were collected for later determination of ammonia and urea concentrations. In a preliminary experiment, to test for leakage across the dental dam barrier, a dye was placed in one half of the chamber and distilled water in the other half. Absorbance at 660 nm was used to quantify leakage. There was negligible (<1 %) leakage between the anterior and posterior portions of the chamber.

Nitrogen metabolism

Laboratory-reared fish held under air-exposed and control conditions were killed after 1, 4 and 10 days. Tissue samples were stored at –80°C and analysed within 3 weeks. Tissue ammonia, urea and FAA levels and enzyme activities were measured in whole-body samples (N=6) as adequate amounts of individual tissues were not available because of the small size of the fish and the limited number of fish available. Although whole-animal samples include both intracellular and extracellular fluid, values represent mostly tissue intracellular concentrations (approximately 95 % of volume).

Amphibious fish typically experience water loss during emersion, which could concentrate tissue solutes (e.g. ammonia, urea or FAAs). Wet mass measurements were taken in laboratory-reared fish after 1, 3 and 10 days of air-exposure (N=7) and under control conditions (N=7) to test for significant mass loss.

Analytical techniques

Ammonia and urea analyses

The concentrations of ammonia and urea levels in the water were determined as described previously (Frick and Wright, 2002). Ammonia levels in the acid traps of the volatilization experiment were determined using the method of Verdouw et al. (1978).

Tissue ammonia and urea levels of whole fish were determined as described previously (Frick and Wright, 2002) and were expressed as mmol N g –1 wet mass. All spectrophotometric measurements were performed using a Perkin Elmer UV/VIS spectrophotometer (Lambda 2) (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT, USA).

Tissue amino acid analysis

Tissue FAA levels were measured using high-performance liquid chromatography (HPLC) (Hewlett-Packard series II 1090 liquid chromatograph), as described previously (Frick and Wright, 2002).

Enzyme analysis

Frozen tissues (whole fish) were ground to a fine powder under liquid nitrogen. The powdered tissue was then diluted 23-fold with extract buffer (50 mmol l –1 Hepes buffer, pH 7.5, 50 mmol l –1 KCl, 1 mmol l –1 dithiothreitol and 0.5 mmol l –1 EDTA), homogenized on ice (Euro Turrax T20b homogenizer) for three bursts of 10 s and then sonicated (Vibracell CV18 2368) for three bursts of 10 s. The homogenate was centrifuged (14 000 g, 4°C) for 10 min, and the resulting supernatant was used to measure the activities of the enzymes Ala-AT, Asp-AT, GDH, ME, CCO and CS. For the OUC enzymes (CPSase, OTCase and ARG) and the accessory enzyme GS, an additional step was carried out. The resulting supernatant was passed through a Sephadex G-25 column (10 ml) equilibrated with extract buffer to remove low-molecular mass (<5000 g mol –1 ) substrates and effectors (Felskie et al., 1998). The protein concentration of the extract was measured before and after filtration to calculate the dilution factor of the column.

The activities of OUC enzymes were measured as described previously: OTCase by Wright et al. (1995), ARG by Felskie et al. (1998) and GS by Shankar and Anderson (1985). CPSase activity was determined using the reaction mixture described by Chadwick and Wright (1999), and [ 14 C]carbamoyl phosphate production was measured using the technique described by Anderson et al. (1970). OTCase, ARG, GS and CPSase activities were measured at 27°C for consistency with methods in the literature. The limits of detection for these assays were estimated to be 0.04 nmol g –1 min –1 for CPSase, 0.01 μmol g –1 min –1 for OTCase and ARG and 0.08 μmol g –1 min –1 for GS (Chadwick and Wright, 1999).

The activities of both CPSase II and III were measured. CPSase II requires glutamine as a substrate, does not require N-acetylglutamate, AGA (nor is it affected by the addition of AGA) and is inhibited by UTP. CPSase III requires glutamine and AGA as substrates, and is not inhibited by UTP. Thus, to differentiate between CPSase II and III, activities were measured in the presence of glutamine alone (CPSase II), glutamine+AGA (CPSase II and III) and glutamine+AGA+UTP (CPSase III). To assess the ability of these fish to utilize ammonia as a substrate in the OUC rather than glutamine (as reported in H. fossilis) (Saha et al., 1997), preliminary tests were run using 5 mmol l –1 NH4Cl in place of glutamine. As activities in the presence of ammonia were relatively low compared with activities in the presence of glutamine, only glutamine was used as a substrate in subsequent experiments.

GDH, Ala-AT, Asp-AT, CS and ME were measured at 25°C, as described by Singer and Ballantyne (1991). CCO activity was measured at 25°C using the assay of Blier and Guderley (1988). The protein concentrations of extracts were measured using the method of Bradford (1976) with bovine serum albumin as a standard.

Statistical analyses

All data are presented as means ± standard error of the mean ( s.e.m .). Single-factor analyses of variance (ANOVAs) were used to examine the differences between control and air-exposed values for tissue analysis (levels of urea and ammonia and enzyme activities) and excretion rates. Amino acid data were analyzed using a General Linear models procedure using the SAS system (version 6.12 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). The Tukey test was used to determine where differences were significant (P⩽0.05) between treatment and control fish. Assumptions for normality were verified by generating appropriate residual plots. Data transformations (logarithmic, square root and inverse square root) were used when appropriate to meet the above assumptions.


18.3: Nitrogen Excretion and the Urea Cycle - Biology

Sixteen male Holstein calves were assigned to four treatments at 3 days of age. Treatments were whole milk, an all milk protein commercial replacer, a whey protein milk replacer, and a high fat whey protein milk replacer all fed at 10% of body weight. All treatments were isonitrogenous. Chopped wheat straw was fed ad libitum. Calves underwent preputial re-section for collection of urine. Five-day nitrogen balance trials were at 1, 5, 9, and 13 wk. Basic nitrogenous components of urine were separated with an amino acid analyzer. Analysis of body weights and straw intakes by balance period showed no differences. Nitrogen balance was lower for the whey protein and high fat milk replacers than for milk. Nitrogen digested was lower for commercial and whey protein milk replacers than for milk. Nitrogen retained was lower for the commercial, whey protein, and high fat milk replacers than for milk. Nitrogen excretion in urine and feces was greater for the commercial milk replacer treatment. The excretion of ornithine, arginine, lysine, 1-methylhistidine, and 3-methylhistidine was greater in the urine of the commercial and high fat milk replacer groups than in the urine of the milk group. Several ninhydrin positive compounds also were increased. Quantitative measurement of excreted basic nitrogenous compounds in urine may improve the evaluation of nitrogen metabolism in balance experiments.

Nutrition Institute, Ruminant Nutrition Laboratory. Beltsville, MD 20705.

Nutrition Institute, Dairy Food Nutrition Laboratory, Beltsville, MD 20705.


Abstraktné

In living organisms, nitrogen arise primarily as ammonia (NH3) and ammonium (NH4 + ), which is a main component of the nucleic acid pool and proteins. Although nitrogen is essential for growth and maintenance in animals, but when the nitrogenous compounds exceeds the normal range which can quickly lead to toxicity and death. Urea cycle is the common pathway for the disposal of excess nitrogen through urea biosynthesis. Hyperammonemia is a consistent finding in many neurological disorders including congenital urea cycle disorders, reye’s syndrome and acute liver failure leads to deleterious effects. Hyperammonemia and liver failure results in glutamatergic neurotransmission which contributes to the alteration in the function of the glutamate-nitric oxide-cGMP pathway, modulates the important cerebral process. Even though ammonia is essential for normal functioning of the central nervous system (CNS), in particular high concentrations of ammonia exposure to the brain leads to the alterations of glutamate transport by the transporters. Several glutamate transporters have been recognized in the central nervous system and each has a unique physiological property and distribution. The loss of glutamate transporter activity in brain during acute liver failure and hyperammonemia is allied with increased extracellular brain glutamate concentrations which may be conscientious for the cerebral edema and ultimately cell death.


Urea Production and Metabolism

Clinical Uses

Uremic symptoms are principally due to the accumulation of ions and toxic compounds in body fluids (79). Because protein-rich foods are the major source of these waste products, CKD can be considered a condition of protein intolerance. Indeed, it has been known since at least 1869 that restricting the amount of protein in the diet of patients with kidney diseases improves their uremic symptoms (80). More recently, we learned that dialysis efficacy is reflected in the removal of urea because changes in urea accumulation reflect changes in accumulated metabolic waste products. Again, this is not a new concept: The link between dietary protein and urea has been recognized since at least 1905, when Folin reported that urea excretion varies directly with different levels of dietary protein (81). These relationships were elegantly documented by Cottini a kol. (Figure 12), who fed patients with CKD different amounts of protein (expressed on the abscissa as nitrogen intake because 16% of protein is nitrogen) (82). With low levels of dietary protein (napr. approximately 12 g protein/d equivalent to approximately 2.5 g nitrogen), nitrogen balance was negative, indicating that this level of dietary protein causes progressive loss of protein stores. When the diet was raised >4 g nitrogen/d, nitrogen balance became positive, signifying that protein stores were being maintained. With progressively more dietary protein, nitrogen balance remained positive but changed minimally. Instead, when dietary protein was above the level required to maintain nitrogen balance and protein stores, it was used to make urea. Clearly, urea production reflects the level of protein in the diet and the risk of developing complications of uremia. In addition, a high-protein diet invariably contains excesses of salt, potassium, phosphates, and so forth (83). The clinical problems that arise from high-protein diets in patients with CKD were recently highlighted in reports concluding that increases in salt intake or serum phosphorus will block the beneficial influence of angiotensin-converting enzyme inhibitors to delay the progression of CKD (84,85).

Urea excretion in adult humans with varying degrees of kidney malfunction fed milk, egg, or an amino acid mixture: assessment of nitrogen balance. Modified from reference 82, with permission.

Urea has special properties that can be used to evaluate the severity of uremia or the degree of compliance with prescribed changes in the diet. These properties include the following: (1) a very large capacity for hepatic urea production from amino acids, (2) urea is the major circulating pool of nitrogen and it crosses cell membranes readily so there is no gradient from intracellular to extracellular fluid under steady-state conditions, and (3) the volume of distribution of urea is the same as water (the urea space is estimated as 60% of body weight) (86–88).

One clinically useful calculation is the steady-state SUN (SSUN), which reflects the severity of uremia because it estimates the degree of accumulation of protein-derived waste products. The SSUN calculation is useful because uremic symptoms are unusual when SSUN is <70 mg/dl.

The requirements for the calculation are that the patient with CKD is in the steady state (i.e., his or her SUN and weight are stable) and urea clearance in liters per day is known. Using the equation below, the amount of dietary protein that will yield a SSUN of 70 mg/dl can be calculated as: The following steps are used to calculate the SSUN. First, the prescribed dietary protein in grams per day is converted into dietary nitrogen by multiplying the grams per day of dietary protein by 16%. Second, the nonurea nitrogen in grams of nitrogen excreted per day is calculated as the excretion of all forms of nitrogen except urea. This amount is approximated as 0.031 g nitrogen/kg per day multiplied by the nonedematous, ideal body weight (4,89). Third, the nonurea nitrogen is subtracted from the nitrogen intake to obtain the amount of urea nitrogen that must be excreted each day in the steady state. Finally, dividing the urea nitrogen excretion in grams per day by the urea clearance in liters per day yields the SSUN in grams per liter.

For example, consider a 70-kg adult with a urea clearance of 14.4 L/d (or 10 ml/min) who is eating 76 g protein/d. His SSUN (in grams per liter) is calculated from the following: 12.2 g/d dietary nitrogen−(0.031 g nitrogen/kg per day times 70 kg). The result is divided by the urea clearance in liters per day and multiplied by 100 to convert SSUN 0.69 g/L to 69 mg/dl.

This calculation arises from the demonstration that in the steady state, the production of urea is directly proportional to the daily protein intake (Figure 12). The only other assumption is that urea clearance is independent of the plasma urea concentration, which is reasonable for patients with CKD. The key concept is that steady-state concentrations of nitrogen-containing waste product produced during protein catabolism will increase in parallel to an increase in the SSUN (4,82,89). By varying the amount of dietary protein, changes in the diet can be integrated with different values of the SSUN. As shown in Table 1, similar concepts can be used to determine whether a patient is complying with the prescribed protein content of the diet (81,86,88).

Estimation of protein intake from urea metabolism

These examples emphasize that the net production of urea in patients with CKD (also known as the urea appearance rate) can be used to estimate protein intake (4,82,89). For dialysis patients, the same relationships have been labeled as “urea generation” or the “normalized protein catabolic rate” (nPCR). Obviously, the nPCR equals the net urea production rate or the urea appearance rate except that it is not expressed per kilogram of body weight. However, the designation nPCR is misleading because the rates of protein synthesis and “catabolism” are far greater than the protein catabolic rate: The nitrogen flux in protein synthesis and degradation amounts to 45–55 g nitrogen/d, equivalent to 280–350 g protein/d (1). The principle of conservation of mass, however, indicates the difference between whole-body protein synthesis and degradation does estimate waste nitrogen production.

Urea Nitrogen Reutilization

Discussion of urea metabolism would be incomplete without addressing urea degradation. It is calculated from the plasma disappearance of injected [ 14 C]urea or [ 15 N]urea (88,90) and averages about 3.6 g nitrogen/d in both normal individuals and patients with uremia. The 3.6 g nitrogen/d arises from degradation of urea by ureases of gastrointestinal bacteria thereby supplying ammonia directly to the liver (88). Because this source of nitrogen could be used to synthesize amino acids and ultimately protein, the degradation of urea has been intensively studied (91). The evidence negates the hypothesis that urea degradation is nutritionally important. First, the amount of urea degraded has been expressed as an extrarenal urea clearance by dividing the rate of urea degradation by the SSUN. In normal adults, the extrarenal urea clearance averages approximately 24 L/d if this value were present in patients with CKD and a high SUN, the amount of ammonia derived from urea would be very high (79,88). However, the quantity of ammonia arising from urea in patients with CKD is not significantly different from that of normal individuals, indicating that the extrarenal clearance of urea in patients with CKD must be greatly reduced the mechanism for this observation is unknown (88).

Results from other testing strategies lead to the conclusion that it is unlikely that urea degradation contributes a nutritionally important source of amino acids to synthesize protein. We fed patients with CKD a protein-restricted diet and measured the turnover of urea using [ 14 C]urea. The results were compared with those obtained in a second experiment in which patients received neomycin/kanamycin as nonabsorbable antibiotics in order to inhibit bacteria that were degrading urea. In roughly half of the patients, antibiotic administration blocked urea degradation but there was no associated increase in urea appearance. This result means that ammonia arising from degradation is simply recycled into urea production and hence does not change urea appearance (90). We also addressed the hypothesis that removal of nitrogen released by urea degradation would suppress synthesis of amino acids and thereby worsen Bn. In this case, the hypothesis was rejected because inhibiting urea degradation with nonabsorbable antibiotics actually improved Bn (92). Finally, Varcoe a kol. measured the turnover of urea and albumin simultaneously and concluded that the contribution of urea degradation to albumin synthesis was minimal (93).

The possibility that ammonia from urea degradation is used to synthesize amino acids was recently examined in hibernating bears (94). The authors noted that hibernating bears have very low values of SSUN (approximately 5–10 mg/dl) despite a decrease in GFR and they suggested that SSUN was low because urea was being used to synthesize amino acids. This finding would contribute to another oddity of hibernating bears, namely that their muscle mass and other stores of protein are relatively “spared” from degradation. Why the metabolism of hibernating bears might differ from that of patients with CKD is unknown and we applaud the investigators who gathered the information as experimenting on bears is quite tricky, even if they are hibernating.

Is Urea Toxic?

Because excess dietary protein produces uremic symptoms and because urea is the major source of circulating nitrogen, the potential for toxic responses to urea have been investigated using different experimental designs. Johnson a kol. added urea to the dialysate of hemodialysis patients who were otherwise well dialyzed (95). Complications induced by the added urea were minimal until the SSUN was chronically >150–200 mg/dl. This led to gastrointestinal irritation. There was no investigation of ammonia or inhibitors of urea degradation so the effect of urea can only be considered an association. An indirect evaluation of both mice with CKD and cultured cells revealed that urea may stimulate the production of reactive oxygen species. Reddy a kol. concluded that a high SUN not only increased reactive oxygen species but also caused insulin resistance (96). However, it is difficult to assign insulin resistance to a single factor considering that there are so many uremia-induced complex metabolic pathways (97,98). It will be interesting to evaluate whether the production of reactive oxygen species initiates similar events in patients with CKD.

Another potential role of urea in producing uremia-induced toxicity is through the development of protein carbamylation, which could disrupt the structure of a protein interfering with signaling pathways and so forth. Stim a kol. reported that the rate of carbamylation of hemoglobin increased in parallel with the increase in SUN and that carbamylation was significantly higher in patients with ESRD compared with normal individuals (99). These responses were confirmed by Berg a kol. (100) except that the carbamylated protein was albumin, rather than hemoglobin. Thus, carbamylation of several proteins can occur in uremic individuals but whether this produces toxic reactions has not been defined.

Finally, there are patient-based reports that cast doubt on the hypothesis that urea is a toxin. Hsu a kol. studied a man and a woman from a family of patients who had chronic but unexplained azotemia. Results of the evaluation indicated that the high SUN arose from a autosomal dominant genetic defect in urea reabsorption (101). Kidney function of the two participants revealed subnormal urea clearances but otherwise normal values of inulin clearance, urea excretion, and responses of urea clearance to diuresis and antidiuresis plus normal sodium clearances. Although the mechanism for the familial azotemia was not identified, the report is relevant because the participants had no clinical or laboratory findings attributable to the increase in SUN despite years of values varying from 49 to 65 mg/dl and from 55 to 60 mg/dl, respectively. In another case study, Richards and Brown studied a woman with prolonged azotemia to examine the association between a high SUN and the development of uremic symptoms (102). The participant subsisted on a diet consisting primarily of fish and a protein powder, yielding urea nitrogen production rates of 40–50 g/d for years. Although the participant maintained a SUN of 50–80 mg/dl for years, she had normal values of hemoglobin, plasma creatinine, BP, and no weight loss. Together, these reports indicate that even a prolonged increase in the concentration of urea does not produce toxic reactions, at least in patients with normal kidney function.

Urea is the largest circulating pool of nitrogen and its production changes in parallel to the degradation of dietary and endogenous proteins. These facts and other properties of urea can be used to estimate the degree of uremia and the compliance with prescribed amounts protein in the diet. The available evidence in patients with CKD suggests that reutilization of ammonia derived from urea degradation for the synthesis of amino acids and proteins is minimal. Whether the evidence would be more persuasive under extreme conditions, such as in hibernating bears, is unknown. The ability of urea to create toxicity is unsettled but years of high SUN values do not produce toxic reactions in individuals with otherwise normal kidney function.

In conclusion, renal urea and ammonia metabolism mediate critical roles in nitrogen balance, urine concentration, and acid-base homeostasis. In this review, we evaluated critical processes involved in these homeostatic mechanisms. Abnormal urea and ammonia metabolism both result from and can lead to a wide variety of conditions, including methods for evaluating issues that are critical to caring for patients with impaired renal function.