Informácie

Ako sa vakcíny na báze mRNA potiahnuté lipidom transportujú do buniek na expresiu?

Ako sa vakcíny na báze mRNA potiahnuté lipidom transportujú do buniek na expresiu?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Vo videu CNN Vedec hovorí, že vakcína proti koronavírusu by mohla byť pripravená približne do roku 202100:25„Robin Shattock, vedúci oddelenia slizničných infekcií a imunity na Imperial College London“ hovorí:

Mali sme prístup k sekvencii, ktorú zverejnili čínski vedci a sprístupnili ju globálne, čo bola obrovská vec. A od tejto sekvencie sme prešli k identifikácii časti sekvencie, ktorá kóduje povrchové proteíny vírusu. A túto sekvenciu používame na výrobu našej vakcíny.

Používame konkrétny prístup, keď vyrábame syntetickú vakcínu založenú na RNA, takže v podstate ide o genetický kód, zabalíme ho v podstate do lipidovej kvapôčky a použijeme na injekciu do svalu; exprimuje tento proteín a telo ho rozpozná ako cudzie a vytvorí ochranné protilátky.

Predpokladám, že spomínaná RNA je mRNA, a tak akonáhle sa dostane do cytoplazmy svalových buniek príjemcu vakcíny, bude exprimovaná a nejakým spôsobom vrátená do bunkovej membrány, kde bude rozpoznaná ako cudzia prechodom lymfocytov.

otázky:

  1. Je to v podstate správne, pokiaľ to ide?
  2. Ak áno, čo spôsobuje fúziu lipidovej kvapôčky so svalovými (alebo inými) bunkami?

Nemôžem na to dať smerodajnú odpoveď, pretože moja doktorandská práca bola založená na dodaní mRNA pomocou peptidov namiesto lipidov, ale mnohé z pojmov sú rovnaké. Tiež nemám čas uvádzať poriadne citácie, ale toto je asi príliš na komentár.

Každopádne, mRNA je veľmi krehká molekula, sérovými nukleázami sa dá extrémne rýchlo rozložiť v krvi. Preto musíme chrániť mRNA zmiešaním s nejakou inou chemikáliou, v tomto prípade zmesou kladne nabitých lipidov. Pozitívne nabité lipidy sú priťahované k záporne nabitému fosfátovému hlavnému reťazcu mRNA a tvoria nanočastice, ktoré zachytávajú mRNA vo vnútri a skrývajú ju pred nukleázami. Lipidy sú často, ale nie vždy, PEGylované, čo znamená, že molekula polyetylénglykolu (PEG) je pripojená k lipidu. PEG skupiny tvoria vrstvu na vonkajšom povrchu nanočastíc, ktorá pomáha predchádzať väzbe proteínov.

Tieto mRNA lipidové nanočastice sa potom injikujú pacientovi. Pravdepodobne pôjde o intramuskulárnu injekciu, takže častice budú s najväčšou pravdepodobnosťou absorbované svalovými bunkami. Presný mechanizmus vysvetľujúci, prečo sú lipidové nanočastice priťahované k bunkám, nie je úplne jasný, ale pravdepodobne ide o kombináciu elektrostatickej príťažlivosti medzi kladne nabitou nanočasticou a záporne nabitou bunkovou membránou a proteínmi, ktoré sa viažu na nanočastice a sú potom rozpoznávané receptormi na bunkový povrch.

Potom, čo je častica zachytená bunkou, je zvyčajne zachytená vo vnútri membránovo viazanej štruktúry nazývanej endozóm. Keď endozóm dozrieva, okyslí sa a keď pH klesne z približne 7 na približne 5,5, nanočastice sa rozrušia. Lipidy, ktoré tvoria nanočastice, sa môžu zlúčiť s lipidmi, ktoré tvoria endozomálnu membránu, pričom túto membránu narušia a otvoria endozóm, čo umožní mRNA uniknúť do cytoplazmy.

Keď sa mRNA dostane do cytoplazmy, nájde ribozóm a vytvorí proteín. Presne ako ste povedali, proteín bude v tomto prípade viazaný na membránu a exprimovaný na vonkajšom povrchu buniek pre prípadné imunitné rozpoznanie.


Syntetická mRNA: produkcia, zavedenie do buniek a fyziologické dôsledky

Nedávne pokroky umožnili syntetizovať mRNA in vitro, ktorá je relatívne stabilná, keď je zavedená do cicavčích buniek, má zníženú schopnosť aktivovať vrodenú imunitnú odpoveď proti exogénnej (vírusu podobnej) RNA a môže byť účinne preložená na proteín. Boli vyvinuté aj syntetické metódy na produkciu mRNA s jedinečnými výskumnými vlastnosťami, ako je foto-sieťovanie, fluorescenčná emisia a pripojenie ligandov prostredníctvom cvakacej chémie. Syntetická mRNA sa ukázala ako účinná v mnohých aplikáciách prospešných pre ľudské zdravie, ako je imunizácia pacientov proti rakovine a infekčným chorobám, zmiernenie chorôb obnovením deficitných proteínov, premena somatických buniek na pluripotentné kmeňové bunky na použitie v terapiách regeneratívnej medicíny a inžinierstvo genómu vytvorením špecifické zmeny v DNA. Táto úvodná kapitola poskytuje základné informácie týkajúce sa nasledujúcich 20 kapitol tohto zväzku, ktoré predstavujú protokoly pre tieto aplikácie syntetickej mRNA.

Kľúčové slová: Analógy cap Katiónové lipidy Elektroporácia Imunoterapia Vrodená imunita Nukleoporácia Poly(A) Expresia proteínov Translačná účinnosť Stabilita mRNA.


Vakcína Pfizer, Biontech Covid-19 využíva technológiu, ktorá by mohla spôsobiť revolúciu v budúcom očkovaní

Minulý týždeň Pfizer zverejnil predbežné zistenia, ktoré ukázali, že jeho kandidát na vakcínu je viac ako 90 percent účinný pri prevencii symptomatického Covid-19. V pondelok Moderna pridala k povzbudivým správam, pričom prvé výsledky z jej 3. fázy štúdie ukázali, že jej experimentálna vakcína je 94,5 percentne účinná pri prevencii choroby. Vidieť takéto konzistentné výsledky v tejto fáze skúšok je dobrým znamením, povedal del Rio.

„Z toho mám pocit, že Pfizer nebola náhoda,“ povedal. "Toto je naozajstné." Toto skutočne funguje."

Hoci sú výsledky upokojujúce, sú stále predbežné – úplné výsledky štúdie ešte neboli publikované v recenzovanom časopise, ktorý by mali preskúmať iní vedci – a zatiaľ nie je známe, ako dlho by vakcíny mohli poskytovať ochranu alebo či budú fungovať dobre. všetky vekové skupiny a etniká.

Jedným z hlavných rozdielov medzi týmito dvoma kandidátmi na vakcínu je spôsob ich skladovania. Obe vyžadujú dve dávky, ale vakcína Pfizer sa musí skladovať pri teplotách mínus 94 stupňov Fahrenheita alebo nižších, čo vyvolalo obavy z praktickosti, ako by sa mohli prepravovať a šíriť. Vakcína Moderna nevyžaduje ultrachladné skladovanie a môže zostať stabilná pri bežných úrovniach chladenia - medzi približne 36 až 46 stupňami Fahrenheita - počas 30 dní.

Tento rozdiel je pravdepodobne spôsobený tým, ako je zabalená syntetická mRNA alebo messenger RNA vakcín, podľa Pauly Cannonovej, docentky mikrobiológie na Keck School of Medicine na Univerzite v južnej Kalifornii. Samotná mRNA je krehká molekula, čo znamená, že musí byť potiahnutá ochranným tukovým obalom, aby bola stabilná.

Podmienky chladenia môžu súvisieť s tým, ako bola mRNA vyrobená a stabilizovaná, povedal Cannon, hoci tieto presné podrobnosti sú vlastníctvom spoločností.

Dr. Drew Weissman, profesor medicíny na University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, bol prvým priekopníkom vo výskume vakcín mRNA a teraz spolupracuje s BioNTech, nemeckou biotechnologickou spoločnosťou, ktorá je partnerom spoločnosti Pfizer. Povedal, že pokračujú práce na zlepšení experimentálnej vakcíny - vrátane vylepšení jej požiadaviek na skladovanie.

"Určite existujú zlepšenia, ktoré sa už vyvíjajú," povedal.

Vakcína Pfizer aj vakcína Moderna sa vyrábajú pomocou syntetickej messengerovej RNA. Na rozdiel od DNA, ktorá nesie genetickú informáciu pre každú bunku v ľudskom tele, messenger RNA riadi produkciu bielkovín v tele oveľa sústredenejším spôsobom.

"Keď jeden konkrétny gén potrebuje vykonať svoju prácu, vytvorí svoju kópiu, ktorá sa nazýva messenger RNA," povedal Cannon. "Ak je DNA veľkým návodom na použitie pre bunku, potom messenger RNA je ako keď si skopírujete len jednu stránku, ktorú potrebujete, a vezmete ju do svojej dielne."

Vakcína Pfizer a vakcína Moderna používajú syntetickú mRNA, ktorá obsahuje informácie o charakteristickom vrcholovom proteíne koronavírusu. Vakcíny v podstate fungujú tak, že sa plížia pokyny, ktoré nasmerujú telo, aby produkovalo malé množstvo proteínu. Keď imunitný systém rozpozná tento proteín, telo následne začne produkovať ochranné protilátky.

"Tieto protilátky budú pôsobiť nielen proti malému proteínu, ktorý sa vytvoril po očkovaní, ale tiež rozpoznajú a zabránia tomu, aby sa koronavírus dostal do našich buniek, ak budeme v budúcnosti vystavení," povedal Cannon. "Je to naozaj šikovný trik."

Ale akokoľvek elegantný mechanizmus je teoreticky, mRNA vakcíny čelia skutočným biologickým výzvam, pretože boli prvýkrát vyvinuté v 90. rokoch. V skorých štúdiách na zvieratách napríklad vakcíny spôsobovali znepokojujúci zápal.

"To sa stalo jednou z veľkých otázok: Ako to dostanete do tela bez vytvorenia zápalovej reakcie?" povedal Norman Baylor, prezident a generálny riaditeľ spoločnosti Biologics Consulting a bývalý riaditeľ Úradu pre výskum a kontrolu vakcín FDA.

Aj keď ani jedna zo spoločností doteraz nehlásila žiadne vážne bezpečnostné obavy, vedci budú v priebehu času naďalej monitorovať účastníkov oboch skúšok.

"Vždy existuje obava, že keď sa pokúšate oklamať imunitný systém - čo robí vakcína - že by ste mohli mať neúmyselné vedľajšie účinky," povedal Cannon. "Imunitný systém je neuveriteľne komplikovaný a líši sa od človeka k človeku."


Ak účastníci klinických skúšok fázy 3 nie sú úmyselne vystavení vírusu, ako možno vypočítať účinnosť vakcíny?

Ľudia v klinických štúdiách boli rozdelení do dvoch skupín – tí, ktorí dostali vakcínu, a tí, ktorí dostali falošnú injekciu. Išli by do práce a do školy a mali by sociálne interakcie ako zvyčajne. Keďže klinické štúdie fázy 3 sa väčšinou robili na miestach s veľmi aktívnymi pandémiami, ako sú USA a Brazília, určitý počet účastníkov by bol v ich každodennom živote vystavený vírusu, ktorý spôsobuje COVID-19.

Účinnosť sa vypočítala porovnaním počtu infekcií medzi tými, ktorí dostali vakcínu, a tými, ktorí dostali falošnú injekciu.

Účinnosť je to, ako dobre vakcína funguje v klinických štúdiách. Účinnosť je to, ako dobre bude vakcína alebo produkt fungovať v reálnom svete.


Výsledky

Generovanie a charakterizácia SAM kódujúcich chrípkové NP a M1 antigény

Gény NP a M1 s plnou dĺžkou boli amplifikované z reverzne transkribovaného RNA genómu vírusu chrípky A/PR/8/34 (H1N1) a potom klonované do hlavného reťazca DNA plazmidu ako dva monocistrónne (SAM(NP) alebo SAM( M1)) a jeden bicistronický (SAM(M1-NP)) vektor (obr. 1A). Boli syntetizované zodpovedajúce ssRNA in vitro enzymatickou transkripčnou reakciou z lineárneho plazmidového DNA templátu pomocou T7 RNA polymerázy [31]. The in vitro aktivita monocistronických a bicistronických SAM replikónov bola meraná po elektroporácii v BHK bunkách a porovnaná s kontrolnou samoamplifikujúcou RNA so známou potenciou (STD). Prítomnosť intracelulárnych molekúl dsRNA, ako markerov amplifikácie RNA, bola hodnotená prietokovou cytometriou (obr. 1B). Frekvencie buniek dsRNA + BHK po transfekcii dvomi SAM(NP) a SAM(M1) monocistronickými alebo SAM(M1-NP) bicistronickými replikónmi boli porovnateľné alebo vyššie ako tie, ktoré sa získali pri STD, čo naznačuje, že nové replikóny samy o sebe zosilnený. Frekvencie buniek dsRNA + a proteín + boli porovnateľné pre každý replikón, čo naznačuje, že expresia antigénu bola paralelná s amplifikáciou RNA.

(a) Konštrukty SAM(NP), SAM(M1) a SAM(M1-NP) vykazujúce 5' uzáver, štyri neštrukturálne gény (nsp1-4), subgenomický promótor 26S (sivá šípka), antigén vakcíny ( s) a 3' polyadenylovaný koniec. (b-d) Samoamplifikácia SAM replikónov a expresia antigénu hodnotená po transfekcii buniek BHK rôznymi replikónmi. (b) Percento BHK buniek pozitívnych na replikáciu SAM vektorov (dsRNA + bunky) a exprimujúce zodpovedajúci proteín (proteín + bunky) sa analyzovalo prietokovou cytometriou a označilo sa ako priemer ± SD. (c) Bunkové lyzáty z buniek BHK infikovaných vírusom PR8 (0,1 multiplicita infekcie) (pruh 1), falošne transfekovaných (pruh 2) alebo transfekovaných SAM (NP) (horný panel) a SAM (M1) (dolný panel) (dráha 3) alebo SAM(M1-NP) (dráha 4) sa analyzovali pomocou Western blotu za redukčných podmienok. (d) Frekvencia buniek BHK exprimujúcich NP a M1 transfekovaných falošnými, SAM (NP), SAM (M1) alebo bicistronickými replikónmi SAM (M1-NP) sa analyzovala prietokovou cytometriou. (e) Frekvencia (priemer ± SD) a priemerná intenzita fluorescencie (MFI) buniek BHK exprimujúcich antigény NP alebo M1 po transfekcii rôznymi formuláciami SAM/LNP. Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou Mann-Whitney U testu. *p< 0,05 v porovnaní so skupinami liečenými SAM(NP) alebo SAM(M1). Uvedené údaje reprezentujú tri nezávislé experimenty.

Expresia antigénu bunkami BHK po transfekcii rôznymi replikónmi SAM sa ďalej charakterizovala pomocou Western Blot (obr. 1C) a prietokovej cytometrie (obr. 1D). Proteíny M1 aj NP exprimované monocistronickými (pruh 3) alebo bicistronickými (pruh 4) vektormi vykazovali vo westernových blotoch pásy s molekulovými hmotnosťami ekvivalentnými príslušným proteínom exprimovaným bunkami BHK infikovanými vírusom PR8 (pruh 1) (obr. 1C) . Nakoniec, percento buniek BHK exprimujúcich NP alebo M1 bolo vyššie ako 70 % pre monocistronické a bicistronické replikóny a väčšina buniek BHK transfekovaných bicistronickým replikónom koexprimovala M1 a NP (obr. 1D). Pre in vivo V štúdiách boli vektory SAM zapuzdrené s LNP. Stredná veľkosť častíc a polydisperzita sa merali dynamickým rozptylom svetla pre SAM(NP)/LNP, SAM(M1)/LNP, [SAM(M1)+ SAM(NP)]/LNP a SAM(M1-NP)/LNP. Z-priemerné priemery sa pohybovali od 130 do 142 nm s nízkym indexom polydisperzity (údaje nie sú uvedené), čo naznačuje malé jednotné lipidové častice schopné zapuzdreť viac ako 95 % mRNA [31]. Nakoniec analýza prietokovou cytometriou ukázala, že percento a MFI buniek BHK exprimujúcich NP alebo M1 antigény po transfekcii rôznymi formuláciami SAM/LNP boli porovnateľné medzi jednotlivými antigénovými a kombinovanými skupinami (obr. 1E).

Imunogenicita vakcín SAM(NP) a SAM(M1).

Na vyhodnotenie imunogenicity SAM replikónov exprimujúcich NP a/alebo M1 antigény boli BALB/c myši imunizované i.m. dvakrát, s odstupom ôsmich týždňov, s 0,1 μg SAM(NP), SAM(M1), zmesou oboch SAM(NP)+SAM(M1) alebo SAM(M1-NP) a dodávaných s LNP. Infekcia nízkou dávkou vírusu PR8 a liečba PBS sa použili ako pozitívne a negatívne kontroly.

NP- a M1-špecifické IgG boli už detegovateľné v sére myší imunizovaných SAM po prvej dávke a boli posilnené druhou imunizáciou (obr. S1A). Myši, ktoré dostali jednotlivé antigény, dosiahli titre protilátok 1,5 až 2-krát vyššie (p<0,01) ako tie, ktoré boli očkované oboma antigénmi, čo naznačuje, že NP a M1 vyvolávajú miernu antigénnu interferenciu [38, 39]. Séra z myší imunizovaných SAM nedokázali neutralizovať infekciu buniek MDCK vírusom PR8 in vitro (obr. S1B), čo je v súlade s vnútornou lokalizáciou týchto antigénov vo víruse [40].

Na základe kľúčovej ochrannej úlohy, ktorú zohrávajú NP- a M1-špecifické T bunky proti chrípkovému ochoreniu [12, 14], sme zamerali ďalšiu sadu analýz na charakterizáciu antigén-špecifických T-buniek pomocou ICS a prietokovej cytometrie (obr. 2 ). Antigénovo špecifické bunky vylučujúce cytokíny boli identifikované medzi podskupinami CD44high CD8+ a CD4+ T buniek, ako už bolo opísané [30] v splenocytoch stimulovaných imunizovaných zvierat. in vitro s NP147-155 peptid (obr. 2A), rekombinantný NP proteín (obr. 2B) alebo s peptidovým poolom odvodeným od M1 (obr. 2C). NP-špecifické CD8 + T bunky boli detegovateľné už 10 dní po prvej imunizácii a udržiavali sa na frekvenciách okolo 0, 1 až 0, 2% až do týždňa 6 (obr. 2A). 10-násobný nárast bol pozorovaný 10 dní po druhej imunizácii, s frekvenciami NP-špecifických CD8+ T buniek v rozmedzí od 1 do 2 % z celkového počtu CD8+ T buniek a kontrakciou na 0,6–0,9 % po 6 týždňoch. Väčšina NP-špecifických CD8+ T buniek boli IFN-y+ a IFN-y+/TNF-a+, charakteristické pre efektorový fenotyp. Žiadne M1-špecifické CD8+ T-bunky neboli detegované u myší vystavených PR8 a v žiadnej skupine vakcíny SAM(M1) v akomkoľvek testovanom časovom bode (údaje nie sú uvedené).

(a-b) BALB/c myši (n = 24/skupina) boli imunizované i.m. dvakrát s odstupom 8 týždňov s 0,1 μg SAM(NP), SAM(M1), SAM(M1-NP) alebo s 0,2 μg SAM(NP)+SAM(M1). Desať dní a 6 týždňov po každej imunizácii bola prietokovou cytometriou na stimulovaných splenocytoch stanovená frekvencia antigén (Ag) špecifických, cytokín vylučujúcich CD8+ (a) alebo CD4+ (b, c) T buniek. in vitro s NP147-155 peptid (a), rekombinantný NP proteín (b) alebo s M1-odvodeným peptidovým poolom (c). Farebný kód označuje rôzne kombinácie cytokínov produkovaných príslušnými bunkami. Ako kontrola bola skupina myší infikovaná nízkou dávkou chrípkového vírusu PR8. Údaje pochádzajú z dvoch samostatných a zlúčených experimentov. Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou Mann-Whitney U testu. *p< 0,05 v porovnaní so SAM(NP) (a-b) a SAM(M1) (c). Frekvencie Ag-špecifických CD4+ a CD8+ T buniek boli významne vyššie (p<0,05) vo všetkých skupinách imunizovaných SAM a vystavených PR8 ako v PBS vo všetkých časových bodoch. Indukcia antigén-špecifických pamäťových T buniek vakcínami SAM(NP) a SAM(M1).

Podobne NP-špecifické CD4+ T bunky boli detegovateľné už 10 dní po prvej imunizácii a boli to prevažne Th0 (IL-2+/TNF-α+, TNF-α+ a IL-2+) a multifunkčné Th1 (IFN -y+/IL-2+/TNF-a+) (obr. 2B). Druhá imunizácia rozšírila NP-špecifické CD4+ T bunky vo všetkých imunizačných skupinách, najmä v multifunkčnej Th1 subpopulácii (IFN-y+/IL-2+/TNF-a+). Frekvencie NP-špecifických CD4 + T buniek sa pohybovali od 0,1–0,2 % do 6 týždňov po prvej imunizácii, zvýšili sa na 0,3–0,5 % 10 dní po druhej imunizácii a 6 týždňov potom klesli na 0,1–0,3 %. Neboli pozorované žiadne významné rozdiely, pokiaľ ide o intenzitu alebo kvalitu odpovedí medzi rôznymi skupinami očkovanými proti SAM, s výnimkou časového bodu 6 týždňov po 2. čase, keď bola intenzita NP-špecifických reakcií T buniek významne znížená u myší imunizovaných SAM(M1- NP) v porovnaní s ďalšími dvoma skupinami očkovanými SAM. M1-špecifické CD4+ T-bunky vykazovali kinetiku a fenotyp podobný NP-špecifickým CD4+ T-bunkám, aj keď s nižšími frekvenciami (obr. 2C). Neboli pozorované žiadne rozdiely vo frekvenciách antigén-špecifických T-buniek indukovaných samotným SAM(M1) alebo v kombinácii so SAM(NP).

Myši vopred vystavené nízkej dávke vírusu PR8 vykazovali približne 0,6 % a 0,1 % NP-špecifických CD8+ a CD4+ T buniek, v danom poradí, ktoré sa nezvýšili po druhej expozícii vírusu. Je pravdepodobné, že HA-špecifické protilátky indukované prvou expozíciou PR8 neutralizovali druhú vírusovú infekciu, čím zabránili vyvolaniu a expanzii NP-špecifických T-buniek.Nízke frekvencie M1-špecifických CD4+ T-bunkových reakcií, ale žiadne M1-špecifické CD8+ T-bunky neboli detegované u infikovaných myší, ako sa pozorovalo u myší imunizovaných SAM. U myší liečených PBS neboli detegované žiadne NP- alebo M1-špecifické T bunky. Podobné imunitné profily boli pozorované, keď sa uvádzali celkové počty, a nie frekvencie, antigén-špecifických CD4 a CD8 T buniek (údaje nie sú uvedené).

Okrem sekrécie cytokínov sme charakterizovali pamäťový fenotyp antigén-špecifických T buniek v slezinách imunizovaných myší meraním frekvencie efektora (TEFF, CD44 high /CD62L low /CD127 low ), efektorová pamäť (TEM, CD44 high /CD62L low / CD127 high ) a centrálnu pamäť (TCMCD44high/CD62Lhigh/CD127high) T bunky v rôznych časových bodoch po vakcinácii (obr. 3).

Desať dní a 6 týždňov po každej imunizácii sa v centrálnej pamäti určila frekvencia NP-špecifických (a-b) alebo M1-špecifických (c) buniek vylučujúcich cytokíny: TCM (CD44 high /CD62L high /CD127 high), pamäť efektora: TEM (CD44 high /CD62L low / CD127 high) a efektor: TEFF (CD44 high /CD62L low /CD127 low ) podmnožiny. Šípky označujú časy imunizácie. Údaje pochádzajú z dvoch samostatných a zlúčených experimentov. Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou Mann-Whitney U testu. *p< 0,05 v porovnaní so SAM(NP) (a-b) alebo SAM(M1) (c).

Nízke frekvencie antigén-špecifických TCM, TEM a TEFF bunky sa merali po prvej imunizácii všetkými vakcínami SAM, zatiaľ čo po druhej imunizácii sa frekvencia NP-špecifických CD8 + TCM bunky boli posilnené až na 0,2 % (obr. 3A) a niektoré NP- a M1-špecifické CD4+TCM boli tiež detegované bunky (obr. 3B a 3C). Frekvencie CD8+ a CD4+TEM a TEFF zvýšená po druhej vakcinácii, vrchol na 10. deň a kontrakcia po 6 týždňoch. Táto kinetika bola pozorovaná pre CD8+ aj CD4+, bez väčších rozdielov medzi imunizovanými skupinami, s výnimkou NP-špecifického CD4+ TEM bunky, ktoré vykazovali významne zníženú frekvenciu v skupinách s vakcínou SAM(NP)+SAM(M1) a SAM(M1-NP) v porovnaní s myšami imunizovanými SAM(NP). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že vakcíny SAM indukujú silnú aktiváciu CD8+ ako CD4+ T buniek a expanziu efektorového pamäťového priestoru.

Indukcia cytotoxických T buniek vakcínou SAM(NP).

Nakoniec sme charakterizovali antigén-špecifické T bunky indukované vakcínami SAM pre cytotoxickú aktivitu in vitro a in vivo (Obr. 4). Cytotoxicita T-buniek bola hodnotená kvantifikáciou povrchovej expresie CD107a ako miera degranulačného procesu [41] po in vitro antigénová stimulácia splenocytov z imunizovaných zvierat. Po dvoch imunizáciách samotným SAM(NP) alebo v kombinácii so SAM(M1) bola väčšina NP-špecifických CD8+ T buniek CD107a+ (obr. 4A). Imunizácia samotným SAM(NP) vyvolala vyššiu frekvenciu CD107a+ NP-špecifických CD8 T buniek v porovnaní s kombinovanými vakcínami (p< 0,05). Nedetegovali sme CD107a na NP- alebo M1-špecifických CD4+ T bunkách, čo naznačuje, že formulácie SAM neindukovali cytotoxické CD4+ T bunky.

Indukcia NP-špecifických CD8+ T buniek samotným SAM(NP) alebo v kombinácii so SAM(M1) bola charakterizovaná 10 dní po druhej imunizácii. (a) Povrchová expresia CD107a na stimulovaných splenocytoch in vitro s NP147-155 bola hodnotená prietokovou cytometriou. Údaje ukazujú frekvenciu CD8+ T buniek vylučujúcich cytokíny, ktoré exprimujú (čierne stĺpce) alebo neexprimujú (sivé stĺpce) CD107a. b) Percento in vivo NP-špecifická lýza cieľových buniek vypočítaná pre každú imunizačnú skupinu. (c) Reprezentatívne histogramy znázorňujúce frekvenciu NP chrípky147-155-pulzný (CFSE + ) a HIV Gag197-2015-pulzné (CMTMR+) cieľové bunky získané v každej imunizačnej skupine 18 hodín po adoptívnom prenose. Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou Mann-Whitney U testu. *p<0,05 **p< 0,01 v porovnaní so SAM (NP).

Na vyhodnotenie in vivo cytotoxická aktivita NP-špecifických CD8+ T buniek, ekvivalentný počet splenocytov značených CFSE alebo CMTMR bol pulzovaný H2-Kd-obmedzeným NP147-155 peptid (0,5 uM CFSE) alebo s nepríbuzným HIV-Gag197-205 peptid (10 μM CMTMR), v tomto poradí, a boli adoptívne prenesené do myší imunizovaných 0,1 μg SAM (NP), 0,2 μg SAM (NP) + SAM (M1) alebo 0,1 μg SAM (M1-NP). Percento buniek CFSE+ a CMTMR+ prítomných v slezinách sa meralo prietokovou cytometriou o 18 hodín neskôr (obr. 4B a 4C). Špecifická lýza > 93 % bola nameraná u myší imunizovaných SAM(NP), zatiaľ čo 74 % a 60 % špecifickej lýzy bolo detegovaných v skupinách imunizovaných SAM(NP)+SAM(M1) a SAM(M1-NP). . U myší ošetrených PBS sa nezistila žiadna špecifická lýza, čo by potvrdilo antigénovú špecifickosť cytotoxickej aktivity. Tieto výsledky ukázali, že formulácie SAM indukovali NP-špecifické CD8+ T bunky s cytotoxickou aktivitou in vivo proti cieľovým bunkám pulzovaným s H2-Kd-obmedzeným imunodominantným NP peptidom. Okrem toho sme pozorovali zvýšené in vivo cytotoxická aktivita u myší očkovaných SAM(NP) v porovnaní s myšami imunizovanými kombinovanými vakcínami v súlade s pozorovanými frekvenciami CD107a+ NP-špecifických CD8+ T buniek in vitro v príslušných imunizačných skupinách (obr. 4A).

Ochranná účinnosť u myší proti napadnutiu homológnymi a heterosubtypickými vírusmi chrípky

Na preskúmanie ochrannej účinnosti vakcín SAM boli myši BALB/c imunizované dvakrát, osem týždňov od seba, 0,1 μg SAM (NP), SAM (M1), SAM (M1-NP) alebo 0,2 μg SAM (NP) +SAM(M1) vektory formulované v LNP a vystavené letálnej dávke homológneho PR8 chrípkového vírusu adaptovaného na myši. Ako kontroly sme zahrnuli dve skupiny myší, ktoré boli predtým vystavené nízkej dávke vírusov chrípky PR8 alebo HK68. Prežitie, strata hmotnosti a klinické skóre sa merali 14 dní po stimulácii (obr. 5).

BALB/c myši (n = 18) boli imunizované i.m. dvakrát s odstupom 8 týždňov s 0,1 μg SAM(NP), SAM(M1), SAM(M1-NP) alebo s 0,2 μg SAM(NP)+SAM(M1). Štyri týždne po poslednej injekcii boli myši stimulované homológnym PR8 (a-d) alebo heterosubtypickým HK68 (e-g) vírusom chrípky. U myší sa monitorovalo prežitie (a a e), strata telesnej hmotnosti (baf) a klinické skóre (c a g) počas 14 dní po infekcii a usmrtené, keď klinické skóre dosiahlo 4. Uvedené údaje sú priemer ± SD. (d) Vírusové titre merané v pľúcach odobratých na 3., 6. a 17. deň po stimulácii chrípkou a vyjadrené ako násobné zvýšenie v porovnaní s predinfikovanými vzorkami. Uvádzajú sa jednotlivé myši, priemer a SD. Údaje sú odvodené z dvoch nezávislých a zlúčených experimentov. Štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou Log rank analýzy (Mantel Coxov test) (a, e) a Mann-Whitneyho U testu (b, c, d, f, g): *p<0.05, **p<0.01, ***p< 0,001 v porovnaní so skupinou liečenou PBS.

Myši imunizované replikónmi SAM exprimujúcimi NP, buď samostatne alebo v kombinácii s M1 a formulované s LNP, boli chránené pred letálnou infekciou homológnym vírusom PR8, pričom vykazovali podstatne a významne vyššiu (p<0,0001) miera prežitia v porovnaní s kontrolnými myšami liečenými PBS (obr. 5A). Myši imunizované vakcínami SAM(NP), SAM(NP)+SAM(M1) a SAM(M1-NP) mali mieru prežitia 71, 70 a 78 %. Na rozdiel od toho podávanie samotnej vakcíny SAM(M1) malo slabú ochranu (miera prežitia 25 %) a štatisticky sa nelíšila od kontrolných myší liečených PBS (miera prežitia 5 %). Ako sa očakávalo, myši vopred vystavené PR8 boli úplne chránené pred homológnou expozíciou, zatiaľ čo myši vopred vystavené heterosubtypickému vírusu HK68 boli čiastočne chránené (78 %) s mierou prežitia podobnou tej, ktorú poskytuje vakcína SAM (M1-NP). Vo všetkých imunizovaných skupinách sa pozoroval prechodný úbytok telesnej hmotnosti ako príznak chrípkového ochorenia. Avšak myši očkované replikónmi exprimujúcimi NP vykazovali rýchlejšie zotavenie z choroby v porovnaní so zvieratami liečenými PBS, čo dokazuje významne znížená strata telesnej hmotnosti (obr. 5B) a klinické skóre (obr. 5C). 3 dni po infekcii chrípkou mali zvieratá imunizované vakcínami SAM(NP) a kombinovanými (NP+M1 alebo M1-NP) významne znížené pľúcne vírusové titre v porovnaní s myšami liečenými PBS (p< 0,01) a po 6 dňoch úplne odstránili častice vírusu chrípky z pľúc (obr. 5D). Strata telesnej hmotnosti a klinické skóre indikovali stredný stupeň ochorenia u myší imunizovaných SAM(M1) v súlade s výsledkami prežitia a pomalšou kontrolou titrov pľúcnych vírusov.

Aby sme určili krížovú ochranu poskytovanú vakcínami SAM, napadli sme myši heterosubtypickým kmeňom HK68 a hodnotili sme prežitie, stratu telesnej hmotnosti a celkové klinické skóre. Všetky vakcíny SAM boli spojené so 100% prežitím, zníženou celkovou stratou hmotnosti a nízkym klinickým skóre (obr. 5E–5G). Na rozdiel od toho myši liečené PBS vykazovali horší výsledok s 30% mierou prežitia, viac ako 15% stratou telesnej hmotnosti na vrchole infekcie (6. – 8. deň) a klinickým skóre vyšším ako 3. Rozdielna ochranná účinnosť SAM( M1) vakcína v modeloch homológnej a heterosubtypovej infekcie by mohla byť spôsobená rozdielom vo virulencii vírusov PR8 a HK68 [42], ako naznačujú rôzne miery prežitia pozorované u myší liečených PBS.

Účinok vakcín SAM na reakcie pľúcnych T-buniek po stimulácii vírusom chrípky

Očkovanie môže ovplyvniť reakcie T-buniek na chrípkovú infekciu v mieste vstupu vírusu. Preto sme charakterizovali zloženie pľúcnych T-buniek v deň 0, 3, 6 a 17 po expozícii PR8 v SAM(NP), SAM(M1), SAM(NP)+SAM(M1) alebo SAM(M1-NP)- očkované myši (obr. 6).

BALB/c myši boli imunizované i.m. dvakrát, s odstupom 8 týždňov, s PBS, 0,1 μg SAM(NP), SAM(M1), SAM(M1-NP) alebo s 0,2 μg SAM(NP)+SAM(M1). Štyri týždne po druhej imunizácii boli myši infikované vírusom PR8. NP-špecifické CD8 T bunky získané v pľúcach po infekcii boli charakterizované prietokovou cytometriou. (a) Počty NP-špecifických CD8+ T buniek. Údaje sú od jednotlivých myší (znázornené ako bodky), zatiaľ čo plné pruhy označujú priemer ± SD. (b) Kumulatívna frekvencia Ag-špecifických, cytokín secernujúcich CD8+ T buniek, uvedená ako absolútny počet na pľúca. Farebný kód predstavuje rôzne kombinácie cytokínov produkovaných príslušnými bunkami po in vitro stimulácia médiom (m), NP147-155 peptid (NP) alebo M1 peptidový pool (M1), ako je uvedené. (c) Absolútny počet NP-špecifických CD8+ T buniek pozitívnych (čierny stĺpec) alebo nie (sivý stĺpec) na CD107a. Údaje pochádzajú z dvoch nezávislých a zlúčených experimentov. Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou Mann-Whitney U testu. *p<0,05 **p< 0,01 v porovnaní so skupinou liečenou PBS.

V čase provokačnej dávky chrípky (deň 0), H2-Kd/NP147-155 pentamer + CD8+ T bunky už boli detegovateľné v pľúcach myší imunizovaných SAM(NP) a kombináciami, ale nie SAM(M1) alebo PBS. Ich počet sa zvýšil vo všetkých imunizačných skupinách na 6. deň po infekcii a zostal vysoký na 17. deň v SAM (NP) a kombinovaných skupinách (obr. 6A). IFN-γ + /TNF-α + , TNF-α + a IFN-γ + NP-špecifické CD8 + T bunky boli detegované v SAM(NP) a kombinovaných skupinách už v deň 0. Ich frekvencia sa zvýšila na 6. deň po infekcii a ukázali komplexnejší IFN-y + /IL-2 + /TNF-a + fenotyp na 17. deň. Nakoniec boli M1-špecifické CD8+ T bunky detegované na 6. a 17. deň v skupine vakcíny SAM(M1), ale nie v skupinách s kombinovanou formuláciou (obr. 6B). V súlade s efektorovým fenotypom pozorovaným pomocou ICS bola väčšina NP-špecifických CD8+ T buniek nájdených v pľúcach NP-imunizovaných zvierat CD107a+ (obr. 6C).

Keďže antigén-špecifické CD4+ T bunky môžu mať tiež úlohu pri sprostredkovaní ochrany tým, že prispievajú k rozvoju efektorových funkcií CD8+ T buniek [43, 44], charakterizovali sme pľúcne NP- a M1-špecifické CD4+ T bunky po očkovanie a následná infekcia chrípkou. Charakteristický profil CD4 Th1 pozorovaný po systémovej imunizácii (obr. 2) sa zachoval po infekcii antigén-špecifickými CD4+ T bunkami infiltrujúcimi do pľúc, ktoré exprimovali IFN-y a TNF-a, samotné alebo v kombinácii (obr. S2). Nakoniec histologická analýza pľúc očkovaných myší ukázala, že vysoký počet efektorových CD8 + a CD4 + T buniek prítomných od 6. dňa po stimulácii neindukoval zjavnú patológiu, ale bol skôr spojený s nízkym histopatologickým skóre (obr. S3). .

Celkovo tieto údaje naznačujú, že očkovanie ovplyvnilo reakciu T-buniek v pľúcach po chrípke. Myši imunizované vakcínami SAM(NP) vykazovali rýchly a zvýšený nábor cytotoxických CD8+ T buniek a polyfunkčných CD4+ Th1 buniek do pľúc, čo bolo spojené s účinnou kontrolou vírusu, zníženými pľúcnymi léziami a výrazne zvýšenou mierou prežitia .

Súbežné podávanie vakcíny SAM(M1-NP) s monovalentnou inaktivovanou vakcínou proti chrípke

Ideálna skrížená ochranná vakcína proti chrípke by mala indukovať humorálne reakcie oproti povrchovému HA antigénu a reakcie T-buniek proti interným konzervovaným chrípkovým antigénom (NP a M1) [45, 46]. Preto sme hodnotili možnosť použitia vakcíny SAM(M1-NP) na báze RNA v kombinácii s monovalentnou inaktivovanou vakcínou proti chrípke (MIIV) odvodenou od vírusu A/California/7/2009 (H1N1) (Cal/H1N1). BALB/c myši boli imunizované i.m. dvakrát, s odstupom ôsmich týždňov, s 0,1 μg kontrolného vektora SAM(M1-NP) alebo SAM(GFP) v LNP, v kombinácii so suboptimálnou dávkou MIIV (0,1 μg) zvolenou na posúdenie možnej synergie s vakcínami SAM. Ako negatívna a pozitívna kontrola boli použité myši ošetrené PBS a myši vopred vystavené nízkej dávke vírusu chrípky PR8. Jeden mesiac po poslednej imunizácii boli myši infikované 10-násobkom letálnej dávky PR8 vírusu, aby sa zvýšila prísnosť modelu a boli monitorované počas 14 dní po infekcii.

U myší imunizovaných SAM(M1-NP)+MIIV sa miera prežitia významne zvýšila v porovnaní s myšami liečenými PBS s 91 % a 20 %, zatiaľ čo samotný MIIV poskytoval v týchto experimentálnych podmienkach iba čiastočnú ochranu (37 % prežitia) (obr. 7A). Všetky imunizované zvieratá vykazovali známky ochorenia v priebehu pozorovania, s prechodným úbytkom hmotnosti vrcholiacim štyri dni po infekcii (obr. 7B). Na naše prekvapenie 80 % zvierat v kontrolnej skupine vektora SAM (GFP) + MIIV prežilo infekciu, aj keď sme predtým ukázali, že samotný SAM (GFP) neindukoval imunitné reakcie špecifické pre H1, ani nechránil myši pred výzvou. s vírusom PR8 [30].

BALB/c myši (n = 20) boli imunizované i.m. dvakrát, s odstupom 8 týždňov, s 0,1 μg SAM (M1-NP) alebo SAM (GFP) v kombinácii s 0,1 μg MIIV (Cal/H1N1). Štyri týždne po poslednej injekcii boli myši stimulované 10-násobkom letálnej dávky heterológneho vírusu chrípky PR8. U myší sa sledovalo prežitie (a) a strata telesnej hmotnosti (b) počas 14 dní po infekcii. Údaje ukazujú priemer jednotlivých myší ± SD. Údaje sú odvodené z dvoch samostatných a zlúčených experimentov. Štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou analýzy logaritmu (Mantel Coxov test). ***p< 0,001 v porovnaní s PBS. (c) Neutralizačné titre proti vírusom Cal a PR8 v sérach odobratých dva týždne po druhej imunizácii. (d, e) Desať dní po druhej imunizácii bola pomocou prietokovej cytometrie na stimulovaných splenocytoch stanovená frekvencia antigén-špecifických cytokín secernujúcich CD8+ (d) alebo CD4+ (e) T buniek. in vitro s Cal/H1 peptidovým poolom (d, e) alebo PR8/H1 peptidovým poolom (d, e). Údaje sú odvodené z dvoch nezávislých a zlúčených experimentov. Štatistické analýzy s Mann-Whitney U testom boli uskutočnené na celkových cytokínoch. *p< 0,05 v porovnaní s MIIV.

Preskúmať možný adjuvantný účinok [47, 48] vektora ssRNA in vivoporovnávali sme adaptívne imunitné reakcie vyvolané rôznymi kombináciami vakcín meraním titrov funkčných protilátok špecifických pre antigén (obr. 7C) a frekvencií T-buniek (obr. 7D a 7E) dva týždne po druhej imunizácii. Titre vírusovej neutralizácie proti kmeňu vakcíny A/California/7/2009 (H1N1) sa pohybovali od 1,5x104 do 2x104 a významne sa nelíšili v sére od myší imunizovaných SAM(M1-NP)+MIIV alebo SAM(GFP)+ MIIV a MIIV samostatne, zatiaľ čo proti vírusu PR8 nebola zistená žiadna neutralizačná aktivita (obr. 7C), čo potvrdzuje predchádzajúce pozorovania [30]. Naopak, kombinovanie SAM (M1-NP) alebo SAM (GFP) s MIIV viedlo k zvýšeným frekvenciám CD8 + a CD4 + T buniek špecifických pre vakcínu Cal/H1 a PR8/H1 skrížene reagujúcich v porovnaní s MIIV (obr. 7D a 7E ). H1-špecifické CD8+ T bunky vykazovali polyfunkčný efektorový fenotyp pozostávajúci z kombinácií IFN-y a TNF-a. Okrem toho spoločné podávanie replikónov SAM s MIIV posunulo zvyčajný fenotyp Th0/Th2 vyvolaný MIIV a charakterizovaný produkciou IL-13/IL-4 na profil Th0/Th1, v ktorom dominuje produkcia IFN-γ/ TNF-a/IL-2 a IL-2/TNF-a. Podobný vzor pomocných T pozorovaný pri kombinovaní vektorov SAM kódujúcich antigény M1-NP alebo GFP s MIIV naznačuje, že polarizácia reakcie T-buniek bola spôsobená replikónom ako takéa pravdepodobne nebol závislý od antigénu. Nakoniec, NP- a M1-špecifické T-bunkové reakcie boli normálne pozorované u myší imunizovaných SAM(M1-NP)+MIIV (S4 obr.).

Tieto výsledky ukázali, že spoločné podávanie SAM (M1-NP) a MIIV vyvolalo širšiu imunitu, čo malo za následok zvýšenú ochranu proti heterológnym chrípkovým vírusom v porovnaní so samotným MIIV. Toto je tiež prvý dôkaz, že kombinácia vektorov ssRNA a vakcín na báze proteínov môže byť uskutočniteľná na zlepšenie účinnosti súčasných vakcín proti sezónnej a pandemickej chrípke.


Úvod

Tento prehľad sa zameriava na testy uvoľňovania šarže vakcín alebo šarží, ktoré sú nevyhnutné na monitorovanie kritických atribútov kvality (CQA) a na zabezpečenie konzistentnej výroby vysoko kvalitných a dobre charakterizovaných vakcínových produktov. V tomto rýchlo sa rozvíjajúcom prostredí vývoja je obzvlášť dôležité, aby sa kontrola kvality a konzistentnosti zachovala pri rozširovaní výroby a napredovaní globálnych dodávateľských reťazcov. Analytické premostenie prostredníctvom demonštrácie porovnateľnosti šarží založenej na CQA bude ešte viac potrebné v programoch vakcín proti COVID-19, aby sa minimalizovala potreba časovo náročného a drahého klinického premostenia.

Portfólio vakcín COVID-19 vo vývoji je veľké a každým dňom sa rozširuje, pričom využíva všetky dostupné nové a tradičné technológie očkovacích platforiem. Medzi nimi platforma mRNA nedávno dodala prvé dve vakcíny proti COVID-19, ktoré sú tiež vôbec prvými vakcínovými produktmi z tejto technologickej platformy1,2,3,4. Okrem toho platforma vírusových vektorov, ktorá predtým poskytla dve vakcíny proti ebole, s použitím replikujúcich sa aj nereplikujúcich sa vektorov5,6,7, teraz dodala vakcíny proti SARS-CoV-28,9,10,11,12. Medzi ďalšie používané platformy patria živé atenuované vírusy (LAV), inaktivované vírusy a rekombinantné proteíny a vírusom podobné častice na báze proteínov (VLP), z ktorých všetky majú dlhú históriu dodávania schválených vakcín proti iným vírusom.Napriek tomu existujú príležitosti na implementáciu rýchlejších, citlivejších a robustnejších testov dávkového uvoľňovania.

Predbežné analýzy údajov z 3. fázy skúšok mRNA vakcín ukázali vynikajúcu účinnosť13,14. V rámci platformy mRNA sa zdá, že samoreplikujúce sa alebo samoamplifikujúce konštrukty mRNA (sa-mRNA) ponúkajú výhodu potenciálnej účinnosti pri nižšej dávke 15 . Toto sa však ešte musí preukázať, najmä v kontexte SARS-CoV-2.

Tento prehľad načrtne príležitosti na zlepšenie rýchlosti testovania dávkového uvoľnenia bez ohrozenia kvality. Toto je obzvlášť dôležité pre vakcíny proti COVID-19, ktoré si budú vyžadovať rýchle uvoľnenie šarží vakcín, aby sa zabezpečila urgentná dodávka. Robustné a rýchlejšie obrátkové testy na potenciu a ďalšie vybrané CQA budú tiež dôležité pre monitorovanie dlhodobej a zrýchlenej stability. Požiadavky na nástroje a testy závisia od platformy vakcín a produktu, hoci existujú spoločné znaky. Predovšetkým sa zameriame na testy účinnosti, ktoré sú kľúčové pre podávanie bezpečných a imunogénnych dávok vakcín. Aj keď sú testy zavedené pre osvedčené platformy, ako sú LAV a rekombinantné proteíny, pre niektoré CQA možno vyvinúť rýchlejšie a robustnejšie testy in vitro.

Okrem antigénu konečná formulácia vakcínového liečivého produktu (DP) často obsahuje adjuvans a pomocné látky, ako sú stabilizátory alebo kryoprotektanty. Testovanie uvoľnenia šarže pre DP musí zahŕňať kľúčové testy pre tieto komponenty. Ďalej musí byť vylúčená alebo riešená akákoľvek potenciálna interferencia týchto zložiek v antigénnych testoch, napr. potencia.

K 25. januáru 2021 je podľa prebiehajúcej krajinnej analýzy CEPI16,17 približne 58 kandidátskych vakcín na celom svete v rôznych fázach klinických skúšok a okrem toho je niekoľko veľmi blízko vstupu do fázy 1 humánneho skúšania. Šestnásť kandidátskych vakcín je už vo fáze 2b/3 skúšok, zatiaľ čo zvyšok z nich je v 1, 1/2 a 2 klinických fázach. V nadchádzajúcich týždňoch sa niektoré z týchto údajov môžu zmeniť v dôsledku nedávneho schválenia núdzového použitia (po dokončení fázy 3) niekoľkých vakcín, ktoré môžu vstúpiť do fázy 4 po udelení licencie.

V priebehu rokov poskytli regulačné agentúry ako Food and Drug Administration (FDA) USA a Európska agentúra pre lieky (EMA), ako aj Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) usmernenia a odporúčania na kontrolu kvality vakcín vyrobených rôznymi platformami. technológií. Všeobecné pokyny pre vakcíny proti COVID-19 boli zverejnené18,19,20,21,22,23,24,25 a v súčasnosti sa pripravujú konkrétnejšie odporúčania.

Princípy analytického hodnotenia založeného na CQA

Testy založené na CQA sú z väčšej časti špecifické pre produkt a platformu. Ďalšie kritické testy, napr. zvyšková hostiteľská bunka a nečistoty súvisiace s procesom, ako je DNA, proteíny, DNAáza, trypsín a sérový albumín, môžu byť generické, ale majú vplyv na bezpečnosť a integritu produktu. Kvantitatívne a citlivé metódy sú dobre vyvinuté pre takéto nečistoty a nebudú sa tu rozoberať. Mikrobiologické testovanie vrátane sterility je kľúčové pre zaistenie bezpečnosti akéhokoľvek produktu. Tradičné testovanie sterility založené na kultúre, ktoré si vyžaduje niekoľko týždňov, je často najpomalším a rýchlosť obmedzujúcim krokom pri uvoľňovaní šarže vakcíny. Boli hlásené rýchle a spoľahlivé metódy testovania sterility, ale zatiaľ nedostali viac ako obmedzený stupeň regulačnej akceptácie na uvoľnenie produktov bunkovej terapie s krátkou skladovateľnosťou 26 . Tieto môžu byť ďalej hodnotené v kontexte rýchlejšieho uvoľňovania šarží vakcín proti COVID-19.

Testy účinnosti pre LAV vakcíny tradične využívajú testovanie infekčnosti založené na bunkovej kultúre, ako je stredná infekčná dávka v tkanivovej kultúre (TCID50) a testy plakov, ktoré v závislosti od vírusu často trvajú niekoľko dní, kým vytvoria definitívnu indikáciu cytopatických účinkov (CPE). Tieto metódy založené na CPE sa tiež používajú pre vakcíny s vírusovým vektorom. Alternatívne metódy so zvýšenou citlivosťou detekcie, pri zachovaní základnej bunkovej inkubácie na frontende, boli rozsiahle študované. Tieto metódy môžu výrazne skrátiť čas obrátky a ponúknuť vyššiu priepustnosť. Pokiaľ ide o rýchly vývoj a dodávku vakcín proti SARS-CoV-2, teraz existujú naliehavé potreby a príležitosti na dôslednú implementáciu takýchto testov s ohľadom na prijatie zo strany regulačných orgánov. Je možné a skutočne veľmi žiaduce spojiť rýchlosť s kvalitou, ako aj implementovať inovatívne analytické metódy, ktoré tiež zlepšia presnosť a presnosť.

Zdá sa, že väčšina vývojárov si vybrala ako antigén buď úplný glykoproteín (S-proteín) alebo jeho časť, ako je väzbová doména receptora angiotenzín konvertujúceho enzýmu-2 (ACE-2) (RBD), zatiaľ čo viac ako 50 kandidátov na vakcínu tiež zahŕňalo viac ako jeden cieľ, napr. S, M, E a N proteíny (pozri obr. 1). Pre všetky projekty založené na nukleových kyselinách a vírusových vektoroch by mala byť expresia proteínových antigénov zodpovedajúcich príslušným transgénom v ideálnom prípade testovaná vo vhodných bunkách ako súčasť testov účinnosti. Očakáva sa, že protilátky vypestované v sére príjemcov vakcíny budú obsahovať SARS-CoV-2 viažuce a neutralizujúce protilátky. Publikované údaje naznačujú, že proteín S by mohol indukovať neutralizačné protilátky27.

Počet projektov je uvedený pre každý cieľový antigén. Rôzne technológie používané na platforme sú kódované rôznymi farbami, ako je definované vo vložke.

Kvalita vakcíny musí byť hodnotená analytickými metódami, ktoré odrážajú jej identitu, čistotu, štrukturálnu integritu a biologickú aktivitu ako mieru účinnosti. Tieto merania a kvantitatívne stanovenie dávok, ktoré sa majú podať, musia byť čo najpresnejšie a najpresnejšie, hoci konkrétne testy na kvantifikáciu týchto CQA závisia od platformy a produktu, ktorý sa podáva príjemcom vakcíny. In vitro test účinnosti, ako jeden príklad, sa bude líšiť pre rôzne technológie (pozri tabuľku 1). Dokonca aj pre jedného vývojára, ktorý používa konkrétnu platformu, sa použije viacero miest po celom svete, aby sa umožnila výroba a rýchla distribúcia stoviek miliónov dávok v rôznych častiach sveta. Stanovenie a splnenie špecifikácií pre testy indikujúce kvalitu má teda prvoradý význam pri zabezpečovaní dodávky bezpečných a účinných vakcín konzistentnej kvality na celom svete.

Mnoho vývojárov má značné odborné znalosti v oblasti analytických testov na uvoľnenie šarže a charakterizáciu v kontexte vývoja vakcín proti patogénom pred COVID-19 s použitím rovnakých technologických platforiem. Je však nanajvýš dôležité zamerať sa na implementáciu tých testov a nástrojov, ktoré budú najpriamejšími a najpresnejšími indikátormi alebo náhradnými mierami bezpečnosti, potencie a imunogenicity. Vývoj a vykonávanie týchto metód môže závisieť od klinickej fázy. Kritické testy, ako sú tie, ktoré sú uvedené vyššie, by mali byť kvalifikované v čase klinického vstupu (fáza 1/2a) a v ideálnom prípade validované pred fázou 3. Vývoj reprodukovateľných, vedecky podložených testov a štandardov počas predklinickej fázy umožňuje efektívny proces optimalizácia, uľahčuje regulačné interakcie a vstup do kliniky.

Metódy in vitro sú typicky preferované pre dávkové uvoľňovanie chémie, výroby a kontroly (CMC), pretože sú presnejšie a robustnejšie ako testy in vivo a majú oveľa kratší čas obratu. Avšak korelácia medzi in vitro relatívnou potenciou (IVRP) a in vivo imunogenicitou (v relevantnom zvieracom modeli) môže byť žiaduca ako základný dôvod pre test účinnosti. Vývoj tejto korelácie spôsobom závislým od dávky môže byť komplementárny k vývoju imunologických testov, ktoré dokážu detekovať a kvantifikovať vírus viažuce, ako aj vírus neutralizujúce protilátky u zvierat a neskôr v klinických (ľudských) vzorkách séra.

Analytická porovnateľnosť

Hodnotenie porovnateľnosti šarží na základe CQA je dôležitou súčasťou aktivít CMC. To zaisťuje, že šarže vakcín, ktoré sa používajú v nasledujúcich fázach klinických skúšok, sú ekvivalentné na základe kľúčového CQA produktu, ako je účinnosť, čistota a fyzikálno-chemická integrita. Regulačnou požiadavkou je zachovanie porovnateľnosti medzi materiálom menšieho rozsahu, ako je materiál často používaný v predklinickej štúdii toxicity, a skúšaním fázy 1 s materiálom z neskoršej fázy klinického skúšania (CTM) vyrobeným procesmi vo väčšom rozsahu. Akákoľvek modifikácia procesu a zmena formulácie medzi týmito fázami, ako napríklad pridanie schváleného stabilizátora, by tiež musela byť podložená porovnateľnosťou založenou na CQA. Je to súčasť správnej výrobnej praxe (GMP) a poskytuje ochranu proti potenciálne nákladnému a časovo náročnému klinickému premosteniu. Vyžaduje sa demonštrácia porovnateľnosti medzi fázou 3 a komerčnými šaržami a je obzvlášť kritická, ak ide o zväčšenie alebo zmenšenie, aj keď procesy liečivých látok (DS) a liekových produktov (DP) boli pred fázou 3 zablokované.

Analýza porovnateľnosti môže mať pre vakcíny COVID-19 ďalší rozmer, pretože aj v prípade jedného produktu bude v mnohých prípadoch musieť dôjsť k prenosu technológie medzi vývojárom a výrobným partnerom s vyššou kapacitou, aby sa splnili veľké globálne požiadavky. Vytvorenie jasného plánu medzi zainteresovanými partnermi, s pomocou vhodných regulačných rád, umožní zabezpečiť porovnateľnosť medzi procesmi a šaržami produktov.

Príklady testov založených na CQA

„Skúška účinnosti“ pre vakcínu je v skutočnosti skúška biologickej aktivity, ktorá je náhradou za imunitnú odpoveď vyvolanú antigénom. Toto je typicky test závislý od produktu a/alebo platformy. Zatiaľ čo účinnosť je zložito spojená s dávkou, kvantitatívne metódy na meranie týchto atribútov môžu závisieť od platformy. Napríklad pre rekombinantný proteínový antigén sa meranie dávky (alebo obsahu) zvyčajne uskutočňuje kvantitatívnym proteínovým testom alebo absorbanciou v blízkosti ultrafialového žiarenia (UV), zatiaľ čo účinnosť sa meria imunotestom v sérii vopred určených dávok, ako napr. náhrada biologickej imunitnej odpovede. Na druhej strane pre LAV vakcíny môže byť dávka aj účinnosť vyjadrená ako infekčný titer, hoci obsah, ktorý je očkovanej osobe dávkovaný, obsahuje aj neinfekčné alebo defektné vírusové genómy. V tomto prípade by sa mal merať celkový počet vírusových častíc alebo kópií genómu, aby sa sledoval pomer infekčného k celkovému vírusovému titru. V prípade vakcín s inaktivovaným vírusom sa rozsah inaktivácie meria po strate infekčného titra, pričom ako dávku možno použiť aj imunotest proti kľúčovému epitopu vírusu, ktorý je stále schopný viazať špecifickú mAb alebo polyklonálne sérum. ako test potencie. Pre antigény vložené geneticky do vírusových vektorov sa infekčný titer vektora často používal ako dávka, ako aj účinnosť, hoci celkový počet vírusových častíc bol v iných prípadoch uvádzaný ako dávka. Okrem toho sa ako test účinnosti očakáva expresia cieľového antigénu kódovaného vloženým génom vo vhodnej bunkovej línii. V prípade antigénov DNA a RNA sa dávka ľahko meria absorbančnými a fluorescenčnými metódami alebo kvantitatívnou PCR (qPCR). Avšak účinnosť by sa mala merať oddelene transfekciou vhodných bunkových línií a expresiou proteínového antigénu.

Účinnosť je tiež primárnym indikátorom stability a bude potrebné ju monitorovať ako funkciu času pre všetky kandidátske antigény vo veľkom (DS), ako aj formulované DP. Iná stabilita indikujúca CQA zahŕňa fyzikálnu, chemickú a štrukturálnu integritu. Agregácia, degradácia alebo štrukturálne rozvinutie môže spôsobiť stratu biologickej účinnosti a môže vyvolať problémy s toxicitou, napr. vyvolaním nežiaducej imunitnej odpovede. V závislosti od povahy antigénu, t.j. technologickej platformy, sa tieto testy budú líšiť, ale platia rovnaké základné princípy.

Rekombinantné vakcíny na báze proteínov

Pre podjednotkové a VLP antigény a skutočne pre všetky triedy antigénov, korelácia závislá od dávky medzi in vitro potenciou a imunitnou odpoveďou na zvieracích modeloch často tvorí základ pre potenciálne účinný a bezpečný výber dávky v klinických skúškach. Avšak ako test uvoľňovania šarže sa zvyčajne uprednostňuje test účinnosti in vitro z niekoľkých dôvodov vrátane vyššej presnosti, nižšej variability medzi testami, rýchlejšieho obratu a vyššieho výkonu. V skutočnosti sa zdá, že vývojári a regulačné agentúry uprednostňujú vakcíny vyvíjané proti SARS-CoV-2. Pre antigény, ktoré fungujú prevažne humorálnou cestou, možno imunitnú odpoveď alebo „imunogenicitu“ určiť meraním hladín protilátok vo zvieracom sére, ktoré sa viažu na cieľové epitopy na antigéne. Typicky sa používajú imunoanalýzy, ako sú väzbové a kompetitívne enzýmové imunoanalýzy (ELISA) a povrchová plazmónová rezonancia (SPR). Reakcie sprostredkované T-bunkami alebo bunkami sprostredkovaná imunita (CMI) sa určuje vyhodnotením indukcie cytokínov, ako sú interferóny (IFN), interleukíny (IL) a faktory nekrózy nádorov (TNF). Ďalšia predklinická práca mimo CMC môže zahŕňať testovanie na neutralizáciu celého vírusu v príslušnom titri protilátkami vypestovanými vo zvieracích sérach.

Existuje niekoľko príkladov rekombinantných proteínových podjednotkových a VLP antigénov, pre ktoré boli úspešne vyvinuté in vitro testy účinnosti. Napríklad pri schválených VLP vakcínach proti vírusu hepatitídy B (HBV) a ľudskému papilomavírusu (HPV) bola dobre preukázaná korelácia medzi in vitro ELISA a in vivo produkciou neutralizujúcich protilátok28,29,30. IVRP testy boli akceptované regulačnými agentúrami. V prípade trimérnej postfúznej vakcíny proti respiračnému syncyciálnemu vírusu (RSV) na báze F-proteínu, ktorá bola v klinickom vývoji (ale nie schváleným produktom), bola stanovená korelácia medzi sendvičovou ELISA IVRP a in vivo imunogenicitou 31 a IVRP použitý ako test účinnosti uvoľňovania šarže.

Zatiaľ čo ELISA v rôznych formách, ako je priama väzba, kompetitívna alebo sendvičová, bola široko používaná a spoľahlivá technológia, novšie technológie imunotestov poskytujú rýchly obrat, vysokú priepustnosť a dobrú presnosť. Príkladom je VaxArray, ktorý predstavil InDevR 32 . Okrem toho, SPR a biovrstvová interferometria (BLI) sú alternatívne možnosti pre priame testy väzby antigén-protilátka33,34. mAb CR3022, pôvodne vyvinutá proti S-proteínu SARS-CoV, sa tiež viaže s vysokou afinitou na SARS-CoV-2 (hoci nie je neutralizujúca) a môže sa použiť na ELISA alebo ktorýkoľvek z týchto alternatívnych imunotestov ako test potencie uvoľňovania šarže. . Boli publikované mAb špecifické pre RBD pre SARS-CoV-2 S-proteín 27 a niekoľko z nich je komerčne dostupných. Bol publikovaný náhradný test neutralizácie vírusu SARS-CoV-2, ktorý je založený na protilátkou sprostredkovanej inhibícii interakcie medzi S-proteínom a receptorom angiotenzín konvertujúceho enzýmu-2 (ACE-2)35.

Spoľahlivosť imunologického testu účinnosti závisí od presnosti a presnosti nezávislého testu na meranie obsahu (dávky) použitého antigénu. Pre rekombinantné proteínové antigény sa používajú spektrofotometrické metódy (ako je absorbancia pri 280 nm alebo A280 nm) alebo sa môže použiť proteínový test na báze farbiva. Merania A280 nm by mala zahŕňať korekcie rozptylu svetla, ktorý môže byť výsledkom agregácie proteínov.

Fyzikálno-chemická a štrukturálna integrita proteínových antigénov sú ďalšie CQA, ktoré môžu ovplyvniť účinnosť aj bezpečnosť. Zachovanie kľúčových epitopov môže byť určené naviazaním špecifických mAb, čo môže tiež poskytnúť indikáciu celkovej integrity a stability terciárnej štruktúry. Priame merania stability sekundárnych štruktúr a tepelného rozvinutia proteínových antigénov je možné monitorovať ďaleko-UV cirkulárnym dichroizmom (CD) a diferenciálnou skenovacou kalorimetriou (DSC). Ide o pomerne rýchle a podporné nástroje, aj keď nemajú vysoké rozlíšenie. Ako súčasť rozsiahlej štrukturálnej charakterizácie vyššieho rádu sa uskutočnila kryoelektrónová mikroskopia na kandidátskom antigéne, NVAX-CoV2373, čo je stabilizovaná forma predfúzneho hrotového glykoproteínu 36 . Počas vývoja, ktorý vedie ku konečnému procesu, poskytuje podrobná štrukturálna charakterizácia silný základ pre koreláciu štruktúry a funkcie pre proteínové antigény. Akonáhle je tento základ vytvorený, jednoduchý funkčný test (napr. väzba protilátky), ktorý konzistentne koreluje so štrukturálnou perturbáciou, môže slúžiť ako náhradný CQA test. Okrem počiatočnej kvantifikácie úrovne čistoty by sa mala sledovať a integrovať do programu stability aj degradácia proteínu a posttranslačná modifikácia na úrovni primárnej štruktúry. Zatiaľ čo VLP tvoria samostatne asociované proteínové jednotky dobre definovaných veľkostí, možnosť nešpecifickej proteínovej agregácie by mala byť monitorovaná dobre opísanými hydrodynamickými metódami, napr. technikami založenými na rozptyle svetla. Agregácia HPV 11 a HPV16 L1 VLP priamo korelovala so stratou účinnosti, ako bolo merané produkciou protilátok u myší37. Nešpecifická agregácia môže potenciálne tiež spôsobiť nežiaducu imunitnú odpoveď.

Historicky rekombinantné vakcíny na báze proteínov vždy vyžadovali adjuvans pre optimálnu imunitnú odpoveď. Hliníkové soli, ako je hydroxid hlinitý, fosforečnan a hydroxyfosforečnan-sulfát, boli po desaťročia jedinými schválenými adjuvans. V posledných rokoch bolo schválených niekoľko nových adjuvans na báze lipidu A, ako je monofosforyl lipid A a glukopyranozyl lipid A v stabilnej emulzii (MPLA, GLA-SE), skvalén (AS03, MF59) a saponíny (Matrix-M). vo vakcínových produktoch alebo na klinické skúšky. Ďalším príkladom je syntetická DNA cytozínfosfoguanínu (CpG). Súčasný rad kandidátskych vakcín proti SARS-CoV-2 zahŕňa stabilizovanú predfúznu formu povrchového proteínu v kombinácii s adjuvans, ako je AS03, CpG 1018, MF-59 a Matrix-M 38,39,40,41. V týchto prípadoch bude musieť uvoľňovanie DP vakcíny zahŕňať profily čistoty takýchto adjuvans.

Vakcíny na báze nukleových kyselín: platformy pDNA a mRNA

Spoločné znaky a rozdiely

Vakcíny na báze nukleových kyselín kódujú vybrané proteínové antigény a spoliehajú sa na ľudské bunky, aby tieto antigény po podaní produkovali. Pri vývoji vakcín proti SARS-CoV-2 sa používajú technológie pDNA aj mRNA, založené na nukleotidových sekvenciách, ktoré by exprimovali S-proteín v ľudských bunkách. Neutralizácia protilátkami vypestovanými vo zvieracích sérach, ako aj ochrana proti napadnutiu vírusom u očkovaných zvierat sa použili na podporu výberu potenciálne bezpečnej a imunogénnej dávky pre počiatočné klinické skúšky. V počiatočných fázach klinických skúšok (fáza 1/2a) môže byť z regulačného hľadiska postačujúce pokročiť s balíkom CMC obsahujúcim testy založené na CQA, ako je genetická identita, konformačná čistota a obsah. To by mohlo byť podporené demonštráciou antigén-špecifickej imunitnej odpovede na zvieracích modeloch s použitím sérologického testu, ako je napríklad neutralizačný test redukcie plakov.Avšak vo fáze 3 sa očakáva, že test účinnosti demonštruje expresiu proteínového antigénu v relevantnej bunkovej línii a bude korelovať s expresiou in vivo. Smernice WHO a regulačné dokumenty od EMA a FDA nedávno poskytli tieto odporúčania42,43,44. Publikované bolo aj usmernenie uvádzajúce analýzu vzhľadu, identity, účinnosti a integrity pre dávkové uvoľňovanie mRNA vakcín úradnou kontrolnou autoritou (OCABR) 23 .

Expresia antigénu v transfekovaných bunkách môže byť preukázaná kvalitatívne, napr. analýzou Western blot s použitím protilátok proti SARS-CoV-2. Počas úsilia o vývoj vakcíny zameraného na SARS-CoV sa to dosiahlo pre experimentálnu DNA vakcínu, ktorá využívala nukleoproteínovú (N-proteínovú) kódujúcu sekvenciu45. Kvantitatívne stanovenie hladín antigénu je možné získať použitím fluorescenčne značených protilátok proti S-proteínu SARS-CoV-2 pre projekty pDNA (a mRNA), ktoré využívajú kódujúcu sekvenciu tohto antigénu. Prietoková cytometria bola použitá na kvantitatívnu detekciu expresie antigénu v kandidátskych vakcínach na báze nukleových kyselín46. Transgénna expresia pDNA vakcín môže byť tiež kvantifikovaná na úrovni RNA v transfekovaných bunkách pomocou RT-PCR47.

Účinnosť transfekcie ako miera účinnosti konštruktov mRNA v dendritických bunkách a niekoľkých ďalších bunkových líniách bola stanovená pomocou fluorescenčne značenej mRNA a detekcie prietokovou cytometriou48. Príklady zahŕňajú mRNA transkripty kódujúce antigény besnoty a Zika49,50.

Medzi pDNA a mRNA antigénmi je zásadný rozdiel v mechanizme účinku. To vedie k niekoľkým dôležitým rozdielom v charakteristikách výsledných produktov. Antigény pDNA vyžadujú intracelulárny transport na uskutočnenie transkripcie v bunkovom jadre, po ktorom nasleduje výstup do cytosólu, kde dochádza k translácii. Na druhej strane antigény mRNA sú dodávané priamo do bunkovej cytoplazmy na transláciu na zodpovedajúci proteín. Tento rozdiel je najpravdepodobnejším dôvodom, prečo sú požadované dávky pDNA vakcín zvyčajne oveľa vyššie ako dávky mRNA vakcín. Vakcíny pDNA sa najlepšie dodávajú elektroporáciou pomocou špeciálneho zariadenia po intramuskulárnych alebo subkutánnych injekciách. Zariadenie vyžaduje schválenie regulačným orgánom, ale po schválení sa môže použiť na elektroporáciu všetkých antigénov pDNA, pokiaľ sa nezmenia jeho dizajn. Antigény pDNA majú zvyčajne vyššiu stabilitu a požiadavky na formuláciu sú jednoduchšie, zatiaľ čo antigény mRNA sú zvyčajne fyzikálne menej stabilné a vyžadujú enkapsuláciu lipidovými nanočasticami (LNP), aby boli chránené pred degradáciou RNAázami. To tiež vedie k relatívne väčšiemu počtu testov uvoľňovania a charakterizácie pre DP na báze mRNA.

Bioanalytický pokrok v platforme mRNA

Samoreplikujúca sa RNA alebo sa-mRNA je ďalším vývojom platformy mRNA s potenciálom dosiahnuť ekvivalentnú imunitnú odpoveď pri nižšej dávke, než je potrebná pre štandardnú mRNA51. In vitro test účinnosti pre konštrukt sa-mRNA bol vyvinutý na meranie účinnosti replikácie zachytením intermediárnej dvojvláknovej RNA (dsRNA) a porovnateľnej expresie proteínu v jednotlivých bunkách antigén-špecifickou protilátkou. Tento test je založený na prístupe nepriameho značenia protilátok, kde sa meraná schopnosť expresie proteínu meria transfekciou antigénom kódovanej mRNA do buniek obličiek mláďat škrečka (BHK) s následným farbením primárnou protilátkou označenou fluorochrómom52. Frekvencie fluorescenčných pozitívnych buniek naznačujú úroveň expresie proteínu, čo potvrdzuje identitu antigénu do 48 hodín. Tento postup by mohol ľahko umožniť detekciu viacerých proteínov v jednej bunke a mohol by byť adaptabilný ako prístup založený na platforme pomocou sekundárnych protilátok na detekciu viacerých protilátok špecifických pre antigén. Intracelulárna dsRNA produkovaná počas replikačného cyklu je markerom amplifikácie RNA. Bunky BHK transfekované sa-mRNA chrípky a vírusu Zika vykazovali vysoké frekvencie dsRNA pozitívnych buniek zafarbených (merané prietokovou cytometriou) s anti-dsRNA protilátkou, čo odhaľuje spustenie samoamplifikácie52,53. Je zaujímavé, že imunogénny profil sa-mRNA vakcíny vírusu Zika je porovnateľný s frekvenciami dsRNA pozitívnych BHK buniek a expresiou proteínu53. Podobne by sa mohla vyvinúť priama a sendvičová ELISA s použitím elektroporovaných buniek s RNA vakcínami. Súčasné portfólio kandidátov na vakcínu COVID-19 na báze mRNA zahŕňa kandidátov na sa-mRNA.

Vývojári mRNA vakcín venovali veľkú pozornosť stabilite a efektívnemu dodávaniu antigénov. Keďže zakrytie na 5'-konci môže mať vplyv na stabilitu a transláciu, percento zakrytej RNA je CQA, ktoré by sa malo merať kvantitatívne. Metódy typicky používané na tento účel boli preskúmané48. Pri formulácii a podávaní liekových produktov sa LNP vo veľkej miere používajú s cieľom stimulovať vrodenú imunitnú odpoveď a tieto štúdie zahŕňajú klinické štúdie 54 . Nedávno sa zistilo, že transkripty mRNA kódujúce pre- a post-fúzny RSV F-proteín a formulované v LNP vyvolávajú ochrannú imunitnú odpoveď v modeloch hlodavcov55. Tieto formulácie typicky zahŕňajú enkapsuláciu mRNA v LNP. Preto by sa mala ako CQA určiť aj účinnosť zapuzdrenia. Stredná hydrodynamická veľkosť a distribúcia veľkosti (polydisperzita) LNP by sa mali udržiavať v rozmedzí cieľových špecifikácií. Na sledovanie týchto parametrov sú vhodné dynamické alebo viacuhlové techniky rozptylu svetla. Je potrebné monitorovať množstvo a čistotu každého lipidu použitého v LNP, pretože tieto parametre pravdepodobne prispievajú k účinnosti a bezpečnosti. Uvádza sa, že formulácia dvoch kandidátskych sa-mRNA vakcín proti vírusu Zika s katiónovou nanoemulziou (CNE) indukuje silnú imunitu u myší a primátov (okrem človeka)53. V tomto prípade bola použitá jednoduchá zmes mRNA antigénu s CNE adjuvans.

Odstránenie dsRNA v konečnom produkte, ktorý je výsledkom in vitro transkribovaných transkriptov mRNA, je dôležité, pokiaľ je to možné, pretože je známe, že dsRNA spôsobuje nežiaducu lokálnu imunitnú odpoveď v mieste vpichu. Bola opísaná jednoduchá metóda na odstránenie dsRNA56. Toto je ďalší CQA, ktorý by sa mal kvantitatívne monitorovať, pokiaľ ide o bezpečnosť.

V kontexte fyzikálnej stability vakcín na báze mRNA sa dosiahla výrazne zlepšená tepelná stabilita pre lyofilizovanú kandidátsku vakcínu mRNA s glykoproteínom besnoty57. Počas skladovania by sa mala sledovať aj genetická stabilita.

Nedávne dodávky vakcín COVID-19 z platformy mRNA

Technológie založené na mRNA predstavujú relatívne novú platformu. Dve z modifikovaných vakcín proti SARS-CoV-2 na báze mRNA rýchlo pokročili cez klinické fázy58,59,60,61 a nedávno dodali produkty, ktoré získali povolenie na núdzové použitie (EUA) od niekoľkých regulačných agentúr. Tieto produkty, BNT-162b2 a mRNA-1273, boli vyvinuté spoločnosťami Pfizer-BioNTech a Moderna Therapeutics. Obidve sú založené na nereplikujúcich sa sekvenciách mRNA kódujúcich S-proteín plnej dĺžky zabalený v LNP, aby poskytoval ochranu proti RNAázam. Hodnotiaca správa EMA o BNT162b2 poskytuje komplexný súhrn testov, ktoré boli vykonané na tomto produkte 3 . Testy špecifické pre produkt zahŕňajú in vitro bioanalytické dávkové uvoľňovanie a charakterizačné testy pre antigén a LNP.

Vakcíny založené na vírusových vektoroch

Vírusovo prenášané vakcíny tvoria významnú časť globálneho portfólia so 60 kandidátmi na vakcíny, ktoré sa vyvíjajú proti SARS-CoV-2. Kandidátske vakcíny sú založené na replikujúcich sa a nereplikujúcich sa vektoroch vrátane, ale nie výlučne, vírusu vezikulárnej stomatitídy (VSV), osýpok, modifikovanej vakcínie ankara (MVA), adenovírusu 26 a 5 (Ad26, Ad5) a šimpanzieho adenovírusu Oxford konstrukt 1 ( ChAdOx1). Tieto vakcíny sa hodnotia buď v homológnom alebo heterológnom režime prime-boost, alebo v režime s jednou dávkou. Pred COVID-19 boli licencované dva produkty, oba proti ebole, využívajúce vírusové vektorové platformy. Okrem toho boli pre všetky vyššie uvedené vektory hlásené klinické skúšky demonštrujúce prijateľné bezpečnostné profily62,63,64,65,66. Hodnotenie bezpečnosti vírusovej vektorovej vakcíny je založené na rovnakých princípoch ako tie, ktoré sú aplikované na LAV. Okrem toho je potrebné z hľadiska CMC monitorovať koncentráciu replikačne kompetentných vírusových častíc, ktoré sa môžu objaviť počas výroby replikačne deficitného vírusového vektora. Sila vírusovej vektorovej vakcíny by mala ideálne odrážať infekčnosť aj expresiu transgénu67,68,69,70. Expertná skupina pre Európsky liekopis (skupina 15) poskytla usmernenie o vhodných analytických stratégiách pre vírusové vektorované vakcíny71 a okrem toho boli publikované usmernenia OCABR pre analýzy nereplikujúcich sa ľudských a šimpanzích adenovírusových vektorových vakcín21,22.

Vírusové vektorové vakcíny sa typicky dávkujú na základe infekčnosti a/alebo celkového množstva vírusových častíc. Testy na stanovenie infekčnosti vakcín s vírusovým vektorom sú založené na rovnakých princípoch založených na bunkách a zažívajú rovnaké výzvy, aké sú opísané nižšie pre LAV. Z aktuálne schválených produktov na ebolu využíva rekombinantná vakcína na báze VSV proti kmeňu Zaire vírusu eboly (rVSV-ZEBOV) kombináciu infekčnosti stanovenej testom TCID50 a celkových vírusových častíc hodnotených testom kvapôčkovej digitálnej polymerázovej reťazovej reakcie (ddPCR). 72. Podobne, primárna primárna vakcína proti ebole s primárnou aktiváciou a zosilnením Ad26.ZEBOV/MVA-BN®-Filo sa dávkuje na základe celkového počtu vírusových častíc stanovených pomocou qPCR a testu účinnosti na báze qPCR (QPA). QPA kombinuje qPCR s testom infekčnosti založeným na tkanivovej kultúre, aby sa kvantifikovala (primárna) účinnosť adenovírusu, zatiaľ čo účinnosť boost MVA-BN®-Filo sa určuje výlučne na základe infekčnosti pomocou metódy založenej na prietokovej cytometrii73. Priepustnosť a doba obratu týchto testov infekčnosti sú vylepšené v porovnaní s klasickejšími TCID50, pretože vyššia citlivosť detekcie umožňuje skrátenie inkubačného času bunka-vírus zo 7 dní alebo dlhšie na 2 dni. Okrem toho sa zlepšila aj presnosť a presnosť analýzy a qPCR umožňuje automatizovanú analýzu74.

Kvantifikácia vírusových častíc môže byť tiež uskutočnená pomocou rôznych nástrojov na meranie veľkosti častíc. Napríklad, Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), napr. NanoSight® (Malvern Instruments Ltd) a ZetaView® (Particle Metrix GmbH), sleduje Brownov pohyb častíc cez prietokovú kyvetu v reálnom čase. Z video parametrov, ako je veľkosť častíc a počet, sú určené, ktoré môžu byť korelované s množstvom 75 VP. Ďalšou rýchlou analytickou metódou na kvantifikáciu vírusových častíc je vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC), kde kolóna umožňuje oddelenie intaktných vírusových častíc od iných bunkových kontaminantov alebo fragmentovaných vírusových častíc76.

V prípade vakcín na báze adenovírusu, ktoré sa široko používajú na odozvu na COVID-19, sa na kvantifikáciu vírusových častíc bežne používajú merania absorbancie pomocou metód založených na korelácii medzi obsahom proteínu v adenovírusových prípravkoch a absorbanciou pri 260 nm (pre vírusovú DNA ) s príslušnými kontrolami 77,78 . Použitie takýchto metód umožňuje kontrolu koncentrácie adenovírusových častíc počas procesu a vysokovýkonnú analýzu uvoľňovania. Okrem toho je dostupných niekoľko komerčných súprav využívajúcich produkciu vírusových hexónových proteínov na analýzu infekčných titrov adenovírusových zásob za 48 hodín.

Spočiatku sa akceptujú semikvantitatívne testy, ako je gélová elektroforéza a Western blot, aby sa preukázala transgénová expresia vírusových vektorových vakcín, aj keď pre neskoršie štádium klinických skúšok a udeľovanie licencií budú na posúdenie účinnosti potrebné kvantitatívne metódy. Môžu sa použiť rôzne metódy, vrátane biochemických (napr. väzba na proteíny, enzymatické reakcie), imunochemických (napr. prietoková cytometria, ELISA) a molekulárnych (napr. PCR, microarray). Napríklad vakcína proti ebole licencovaná spoločnosťou Janssen vakcíny používa ELISA na stanovenie expresie transgénu v primárnej adenovírusovej vakcíne a prietokovú cytometriu na posilnenie MVA79,80.

Keďže vakcíny s vírusovým vektorom sú rekombinantné produkty, genetická stabilita je dôležitým CQA na preukázanie, že požadovaný gén, ako aj vektor, sú nekompromisné. Vo všeobecnosti sa to testuje v charakterizačných štúdiách pred udelením licencie a nie na uvoľnenie šarže. Toto sa robí pasážovaním vírusu, normálne niekoľko pasáží za tým, čo bude výrobná pasáž, a sekvenovaním niekoľkých následných pasáží s použitím buď Sangerovho sekvenovania alebo sekvenovania novej generácie (NGS).

Nedávne pokroky v dodávaní vakcíny COVID-19 založenej na vírusovom vektore

Bola zverejnená predbežná analýza fázy 3 klinickej štúdie vakcíny AstraZeneca-Oxford na báze ChAdOx1 (AZD1222)81 a táto vakcína získala EUA v Spojenom kráľovstve a mnohých ďalších krajinách82. Fáza 3 klinického skúšania bola spomalená, najmä v USA, v dôsledku nežiaducej udalosti, aj keď bola pozorovaná s extrémne nízkou frekvenciou a bez preukázanej súvislosti s vakcínou. To demonštruje kritickú úlohu bioanalytickej charakterizácie v plnom rozsahu, hoci odpoveď u každého jednotlivca nemožno predpovedať so 100% istotou ani v prípade injekcie placeba. Boli hlásené predbežné výsledky testov vakcíny Ad26.SARSCoV-2.S Johnsonom a Johnsonom83,84. Táto vakcína má výhodu v stabilite pri skladovaní v chladničke (2–8 °C) a ponúka možnosť ochrannej účinnosti už od jednej dávky. Táto vakcína teraz získala EUA podľa FDA 85.

Živé atenuované vírusové vakcíny

Táto platforma už desaťročia produkuje niektoré z najúčinnejších vakcín a má dobré výsledky v oblasti bezpečnosti, čoho príkladom je globálne používanie vakcíny proti osýpkam a ružienke u dojčiat. Účinná je staršia technológia zoslabenia viacnásobným prechodom cez bunky a novšie zavedenie zoslabenia pomocou genetického inžinierstva. Obavy o bezpečnosť však zahŕňajú dosiahnutie rovnováhy medzi vyvolaním ochrannej imunitnej odpovede a vyvolaním infekcie vyvolanej vakcínou. V prípade upravených vírusov sa musí monitorovať neprítomnosť reverzných mutantov a NGS je v tomto ohľade účinným nástrojom. Otázku potencie verzus bezpečnosť najlepšie riešia testy účinnosti, ktoré sú čo najpresnejšie a najpresnejšie. Tradičné testy infekčného titra, ako je TCID50, ktoré sú široko akceptované regulačnými agentúrami, často trpia veľkými štandardnými odchýlkami. V závislosti od vírusu môžu mať tieto testy dlhý čas obratu kvôli nízkej citlivosti detekcie CPE, ktorá si vyžaduje veľký počet replikačných cyklov, aby bolo dostatočné percento bunkovej populácie zabité infekciou. Ako je opísané vyššie v časti o vakcínach založených na vírusových vektoroch, PCR alebo detekčné techniky založené na fluorescencii poskytujú citlivejšiu detekciu a tým umožňujú skrátenie inkubačného času s bunkami. Publikované príklady týchto aplikácií pre niekoľko LAV zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na osýpky, rotavírus, VSV a HIV-186,87,88. Fluorescentný fokusový test (FFA), fluorescenčný test infekčného titra na báze protilátok, ponúka výhodu citlivosti, automatického počítania ložísk a relatívne vysokého výkonu. V porovnaní s plakovými a TCID50 testami môže byť infekcia buniek kvantitatívne detegovaná skôr v procese namiesto toho, aby sa čakalo na lýzu bunkovej membrány. Preto je možné infekčný titer ako jednotku tvoriacu ohnisko určiť podstatne rýchlejšie v porovnaní s testom založeným na CPE. FFA sa používa ako test účinnosti dávkového uvoľňovania pre schválenú LAV vakcínu proti chrípke89. Je však dôležité zistiť, že tvorba fokusov je výsledkom infekcie a nepozorujeme jednoducho väzbovú udalosť, ktorá nemusí viesť k CPE. Preukázanie zhody s plakom alebo testom TCID50 môže byť súčasťou procesu validácie FFA90. S vhodnými kontrolami by FFA mohla poskytnúť citlivý a primerane rýchly test účinnosti na bunkách pre projekty SARS-CoV-2 LAV. Vznikajúca technológia bez označenia pre infekčné merania je založená na laserovej silovej cytológii na detekciu a kvantifikáciu buniek infikovaných vírusom. Zdá sa, že je citlivejší a oveľa rýchlejší ako test TCID50 a môže ponúkať vyššiu presnosť91. Táto metóda sa môže použiť aj na rýchle testovanie počas výroby.

Neklinické a klinické testy

Mimo CMC sa vo fáze predklinického a klinického skúšania vyvíjajú špecifické testy na testovanie imunitnej odpovede indukovanej u zvierat a ľudí. Tieto testy sú ďalej testované na robustnosť, kvalifikované a validované v neskorších fázach na podporu procesu vývoja vakcíny. Výzvy vrátane variability v biológii in vivo a technických rozdielov medzi laboratóriami môžu často sťažiť porovnanie údajov získaných jednotlivými laboratóriami v neskorých fázach a multicentrických skúškach. Okrem toho mnohonásobné testy vyvinuté pre vakcíny rôznych modalít tiež zvyšujú zložitosť. Na zmiernenie niektorých z týchto výziev v súvislosti so spoľahlivým imunologickým profilovaním každého kandidáta na vakcínu založenom na rôznych platformách a na poskytnutie robustných testov na uľahčenie regulačného procesu CEPI vytvorila globálnu sieť siedmich centrálnych laboratórií (CL). Imunitné odpovede vyvolané rôznymi vakcínami počas predklinickej a klinickej fázy sa budú analyzovať zavedením spoločných protokolov, štandardov protilátok a ekvivalentných kľúčových činidiel v týchto laboratóriách92,93.

Imunitná odpoveď sprostredkovaná protilátkami závisí od rozpoznávania antigénov B-bunkami a uvoľňovania protilátok. ELISA sa často používa na vyhodnotenie humorálnych odpovedí. CEPI vybrala metódy ELISA, ktoré využívajú a zachytávajú signály kompletných interakcií SARS-CoV-2 S, RBD a N-proteín IgG protilátka/antigén. ELISA meria iba väzbové protilátky, zatiaľ čo detekcia funkčných protilátok je rozhodujúca pre účinnosť vakcíny a považuje sa za zlatý štandard. Na detekciu neutralizačných protilátok proti SARS-CoV-2 boli vyvinuté robustné neutralizačné testy založené na pseudovírusoch a divokých vírusoch, pretože sú určené na detekciu protilátok schopných inhibovať replikáciu vírusu. Tieto testy sú buď validované alebo kvalifikované.

Reakcia CMI sa primárne opiera o T-bunky a často sa hodnotí pomocou enzýmového imunospotu (ELISPOT) alebo prietokovej cytometrie. CEPI podporovaný ELISPOT je test imunofarbenia, ktorý sa zameriava na kvantitatívne meranie frekvencie T-buniek vylučujúcich cytokíny. Tento test ELISPOT umožňuje detekciu špecifických T-buniek produkujúcich cytokíny TH1 (IFN-γ) a TH2 (IL-5) v mononukleárnych bunkách periférnej krvi (PBMC) stimulovaných peptidmi SARS-CoV-2 pokrývajúcimi S proteín plnej dĺžky. Tieto cytokíny boli často detegované u jedincov infikovaných SARS-CoV-2 a predpovedajú imunitnú ochranu94.

Klinické testy sa používajú na kvantifikáciu imunitných reakcií generovaných u ľudských subjektov po imunizácii, zatiaľ čo testy účinnosti sú navrhnuté na meranie optimálnych dávok a náhradné biologické aktivity, ktoré by potenciálne viedli k požadovaným úrovniam imunitných reakcií. Pri zostavovaní testu účinnosti je žiaduce mať na vedomostiach založenú hypotézu týkajúcu sa mechanizmu účinku vakcíny, ktorá môže korelovať s klinicky relevantnou imunitnou odpoveďou. V prípade vakcín proti SARS-CoV-2 však korelácia ochrany u ľudí ešte nie je známa, hoci ochrana na zvieracích modeloch bola preukázaná pre niektoré kandidátske vakcíny47,58. Zatiaľ čo takáto indikácia ochrannej účinnosti, typicky získaná u hŕstky zvierat, je určite sľubná, nie je zaručeným prediktorom ochrannej účinnosti u ľudí. Napriek tomu je veľmi povzbudivé, že skoré klinické skúšky ukázali, že dávky vybrané na základe testov účinnosti použitých na dávkové uvoľňovanie CMC poskytli vysoké hladiny imunitných reakcií58,95. Vývoj neklinických imunotestov by mohol synergicky pomôcť pri vytváraní funkčne zmysluplných a kvalitatívnych testov účinnosti.

Väčšina vývojárov vakcín proti SARS-CoV-2 používa „interné“ testy, činidlá a panel referenčných činidiel. To sťažuje porovnávanie imunitných reakcií medzi rôznymi vakcínami. Preto je dôležité štandardizovať testy a činidlá na podporu pokročilých fáz klinických skúšok. Na vyriešenie tohto problému CEPI uľahčil vývoj medzinárodného referenčného štandardu pre protilátky schváleného WHO 96 a vývojárom vakcín sa odporúča zahrnúť tento štandard do imunologických testov. Okrem toho CL v globálnej sieti laboratórií CEPI používajú bežné kľúčové reagencie vrátane poťahového proteínu, kmeňa vírusu SARS-CoV-2, vírusových pseudočastíc, peptidových poolov na stimuláciu PBMC, panelu štandardov a kontrol. Tento duálny prístup umožňuje nestranné porovnanie údajov získaných v rámci skúšok vakcín.

Uzatváranie komentárov

Pandémia COVID-19 podnietila globálne úsilie o vývoj vakcín s bezprecedentným pocitom naliehavosti. Vývojári z biofarmaceutického priemyslu, malých aj veľkých a akademických laboratórií vykročili s cieľom ukončiť súčasnú pandémiu. Využívajú sa všetky doteraz vyvinuté technológie očkovacích platforiem, staré aj nové. Regulačné agentúry uprednostňovali preskúmanie žiadostí vyšetrovateľov, ktorí sa snažia o vstup do klinických skúšok a postup v nich. V súčasnosti boli v rámci EUA podané prvé dve mRNA vakcíny viac ako 25 miliónom ľudí. Štyri vírusovo prenášané vakcíny tesne nasledovali pri získaní schválenia na núdzové použitie v rôznych krajinách, ako aj štyri inaktivované vakcíny proti koronavírusu. Keďže klinické skúšky mnohých ďalších kandidátskych vakcín postupujú do pokročilých fáz zahŕňajúcich desiatky tisíc dobrovoľníkov, vývojári hodnotia atribúty kvality kandidátov vakcín, ktoré môžu byť rozhodujúce pre bezpečnosť a imunogenicitu, a prísne interaktívnym spôsobom ich kontrolujú regulačné orgány. Na základe veľkého množstva údajov, ktoré sa už získali z klinických štúdií na ľuďoch az prebiehajúceho očkovania produktmi schválenými EUA v niekoľkých krajinách, je jasné, že bezpečnostné profily vakcín vyrobených pomocou novších platforiem sú vynikajúce. Aby sa splnili naliehavé požiadavky prakticky celej globálnej populácie, mali by sa na testovanie CQA každého produktu implementovať analytické testy s vysokou spoľahlivosťou a krátkymi časmi obratu. Takéto testy boli opísané v literatúre v kontexte vývoja alebo štúdia iných vakcín a môžu byť prispôsobené pre vakcíny proti SARS-CoV-2, napríklad pri meraniach biologickej aktivity alebo účinnosti. Testy uvoľňovania po dávkach by sa mali prednostne vykonávať in vitro. Nie je to vhodné len na dodržiavanie zásad 3R, ale je to vhodné aj pre praktické úvahy vrátane úspory času a zníženia nereprodukovateľnosti spojenej s testami na zvieratách, čo často vedie k nákladnému a zbytočnému odmietnutiu kvalitných šarží. Činidlá pre in vitro imunochemické a biochemické testy, vrátane mAb CR3022, RBD proteínu S a ľudského ACE2, sa teraz sprístupňujú oprávneným vývojárom v dohodách o spolupráci s PATH a NIBSC. Robustné a rýchlejšie testy pre CQA urýchlia prenosy technológií medzi výrobnými závodmi, ktoré sú potrebné pre mnohé projekty COVID-19, aby sa uspokojili veľké potreby dodávok medzi všetkými populáciami sveta. Dobre navrhnutý plán CMC tiež uľahčí regulačné kontroly a schválenia. Okrem toho, vybrané metódy bioanalytického hodnotenia založené na CQA, čiastočne načrtnuté v tomto prehľade, umožnia porovnanie konzistentnosti kvality medzi šaržami vakcín používaných v rôznych klinických fázach a vytvoria cenný most, ktorý sa rozšíri na komerčné produkty.


6. Predklinické a klinické aplikácie LNP ako aplikačných systémov pre vakcíny na báze RNA

Aplikácia LNP ako transportných systémov pre vakcíny na báze RNA je prospešná na dosiahnutie plného potenciálu vakcíny, pretože tieto systémy slúžia na ochranu veľkej enkapsulovanej molekuly nukleovej kyseliny proti degradácii nukleázou [1,121]. Ako dodávacie systémy prechádzajú LNP cez bunkovú membránu na bunkovú absorpciu (endocytózou) a dodávajú svoju uzavretú mRNA do cytosólu až po endozomálnom úniku. LNP môžu tiež ovplyvniť vrodenú imunitnú odpoveď a poskytnúť mRNA vakcínam synergické adjuvantné účinky [2].

Rôzne aplikačné úlohy RNA na preventívne aj terapeutické použitie viedli k rôznym použitiam vakcín na báze RNA proti infekčným patogénom, ako aj proti rakovine. Mnohé výskumné štúdie, ktoré sa zamerali na LNP ako dodávacie systémy pre samozosilňujúcu sa mRNA a konvenčnú mRNA proti rôznym infekčným ochoreniam, preukázali robustnú a rýchlu imunitnú stimuláciu u rôznych živočíšnych druhov [9,27,29,30,122,123,124]. Príklady mRNA vakcín v rôznych formuláciách na báze lipidov vyvinutých na predklinické štúdie proti infekčným chorobám a rakovine sú zhrnuté v tabuľke 1.

Okrem toho rôzne mRNA vakcínové formulácie vyvinuté na ochranu pred infekčnými stavmi vstúpili do klinických štúdií na vyhodnotenie ich účinnosti. Tabuľka 2 sumarizuje stav týchto klinických štúdií. Klinická štúdia uskutočnená Bahlom a kol. [27] a sponzorovaný spoločnosťou Moderna Therapeutics sa považuje za prvý pokus na ľuďoch ( <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03076385","term_id":"NCT03076385">> NCT03076385 ), ktorý používal LNP formulovanú mRNA vakcínu kódujúcu HA antigén chrípky H10N8. Táto štúdia odhalila, že všetkých 31 účastníkov si vytvorilo špecifické titre protilátok � proti HA antigénu chrípky H10N8 po dvoch intramuskulárnych imunizáciách (použitím 100 µg vakcíny) oddelených 3-týždňovými intervalmi, čo naznačuje dobrú imunogenicitu vakcíny. Okrem toho štúdia ukázala, že titre protilátok neutralizujúcich vírus � boli prítomné v sére 87 % očkovaných účastníkov po 43 dňoch očkovania. Výsledky získané zo štúdií na ľuďoch sa považovali za uspokojivé napriek nízkym hodnotám titrov v porovnaní s výsledkami získanými na zvieracích modeloch [27]. Podobné zistenia uviedla skupina Feldmana et al. [125]. Práca týchto autorov preukázala, že vakcíny mRNA formulované s LNP kódujúce HA s plnou dĺžkou z kmeňov chrípky H10N8 a H7N9 boli bezpečné a schopné vyvolať silné humorálne imunitné reakcie u zdravých dospelých po intramuskulárnej vakcinácii dvoma dávkami s odstupom 3 týždňov pri 100 a 25 hod. µg úrovne dávok [125]. Autori tiež uviedli, že profily bezpečnosti a reaktogenity oboch vakcín používaných v dávkach do 100 µg boli porovnateľné s profilmi získanými pre registrované vakcíny formulované s alebo bez adjuvans [125].

Tabuľka 2

mRNA vakcíny, ktoré vstúpili do klinických štúdií proti infekčným chorobám a rakovine.

Sponzorujúci výrobcamRNA vakcínaDoručovací systémCieľSkúšobné čísloEtapaPostavenieOdkaz
Infekčné choroby
Moderna Therapeutics/Národný inštitút pre alergie a infekčné choroby (NIAID)mRNA-1273 (perfúzne stabilizovaná S proteín mRNA vakcína)LNPCOVID-19 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04470427","term_id":"NCT04470427">> NCT04470427Fáza IIIAktívny, nie nábor[126]
BioNTech / Pfizer BNT162
(3 vakcíny LNP–mRNA)
LNPCOVID-19 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04537949","term_id":"NCT04537949">> NCT04537949Fáza IIINábor zamestnancov[126]
CureVacCV7202 (optimalizované pre sekvenciu)LNPBesnota <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03713086","term_id":"NCT03713086">> NCT03713086Fáza IAktívne, nie nábor, PCD: január 2022[127]
Moderná terapiamRNA-1440 (modifikovaná nukleozidmi)LNPChrípka H10N8 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03076385","term_id":"NCT03076385">> NCT03076385Fáza IDokončené PCD: október 2018[27,125]
Moderná terapiamRNA-1851 (modifikovaná nukleozidmi)LNPChrípka H7N9 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03345043","term_id":"NCT03345043">> NCT03345043Fáza IAktívne, nie nábor, PCD: február 2020[27,125]
Moderná terapiamRNA-1653 (modifikovaná nukleozidmi)LNPHMPV/HPIV3 <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03392389","term_id":"NCT03392389">> NCT03392389Fáza IDokončené, PCD: júl 2019[2]
Moderná terapiamRNA-1325 (modifikovaná nukleozidmi)LNPZika <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03014089","term_id":"NCT03014089">> NCT03014089Fáza IDokončené, PCD: júl 2019[123]
Moderná terapiamRNA-1893 Zika <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04064905","term_id":"NCT04064905">> NCT04064905Fáza IAktívne, nie nábor, PCD: február 2021[123]
Moderná terapiamRNA-1647 a mRNA-1443 (modifikované nukleozidmi)LNPHCMV
<"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03382405","term_id":"NCT03382405">> NCT03382405Fáza IAktívne, nie nábor, PCD: júl 2020[2]
Moderná terapiamRNA-1388 (modifikovaná nukleozidmi)LNPChikungunya <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03325075","term_id":"NCT03325075">> NCT03325075Fáza IDokončené, PCD: november 2019[2]
Imunoterapia rakoviny
BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbHmRNA lipoplex (Lipo–MERIT)LipozómyTAA (pokročilý melanóm) <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT02410733","term_id":"NCT02410733">> NCT02410733Fáza IAktívny, nie nábor[128]
BioNTech AGmRNA lipoplex (TNBC–MERIT)LipozómyTAA (triple-negatívna rakovina prsníka) <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT02316457","term_id":"NCT02316457">> NCT02316457Fáza IAktívny, nie nábor[129]

HCMV, ľudský cytomegalovírus hMPV, ľudský metapneumovírus HPIV3, ľudský vírus parainfluenzy typu 3 LNP, lipidové nanočastice PCD, odhadovaný primárny dátum dokončenia TAA, antigény spojené s nádorom.

6.1. RNA/LNP vakcíny proti závažnému akútnemu respiračnému syndrómu, infekcii koronavírusom 2 (SARS-CoV-2)

V súčasnosti sa vakcíny na báze RNA stali jednou z najúčinnejších očkovacích technológií vyvinutých na ochranu pred pandémiou spôsobenou koronavírusom (COVID-19), ktorá sa objavila v decembri 2019 v dôsledku infekcie ťažkým akútnym respiračným syndrómom koronavírusom 2 (SARS-CoV- 2) [122].

Uskutočnili sa rôzne predklinické štúdie [130,131,132,133,134] na vyhodnotenie účinnosti a imunogenicity vakcín založených na LNP–mRNA kódujúcej spike proteín SARS-CoV-2 alebo spike receptor viažucu doménu. Napríklad imunizácia myší samoamplifikujúcou RNA kódujúcou vírusový spike proteín zapuzdrený vo formulácii LNP produkovala výrazne vysoké protilátky špecifické pre SARS-CoV-2 a vyvolala silnú bunkovú imunitnú odpoveď v porovnaní s elektroporovanou pDNA vakcínou. Tieto pozorovania boli pripísané povahe formulácie LNP, ktorá bola použitá [132].

Ďalšia predklinická štúdia hodnotila imunogenicitu nukleozidmi modifikovanej mRNA kódujúcej spike proteín SARS-CoV-2 s plnou dĺžkou alebo spike receptor viažucu doménu u myší. Pozorovalo sa, že tieto dve vakcíny vyvolali okrem silných protilátkových reakcií aj silné reakcie T a B buniek po jednej dávke [130]. Ďalej, mRNA vakcína (mRNA-1273) kódujúca vrcholový proteín SARS-CoV-2 vo formulácii LNP bola vyvinutá spoločnosťou Moderna Therapeutics, Cambridge, MA, USA. Imunizácia primátov (okrem človeka) touto vakcínou produkovala vysokú neutralizačnú aktivitu a pozoruhodne zvýšené protilátky špecifické pre S-proteín [135].

Výsledky získané z predklinických štúdií o mRNA vakcínach formulovaných v LNP boli sľubné pri poskytovaní vakcínového riešenia pre COVID-19 a umožnili presun vakcín na báze RNA na úroveň klinických štúdií. Moderna mRNA-1273 sa považuje za prvú vakcínu, ktorá vstúpila do fázy I klinických štúdií (identifikátor ClinicalTrials.gov <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04283461","term_id": "NCT04283461">> NCT04283461) len 42 dní po identifikácii genetickej sekvencie SARS-CoV-2 [122]. Výrobná spoločnosť nedávno oznámila, že táto vakcína má 94 % účinnosť na základe prvej predbežnej analýzy klinických štúdií fázy III (identifikátor ClinicalTrials.gov <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04470427 ","term_id":"NCT04470427">> NCT04470427) [136].

Rôzne inštitúcie a farmaceutickí výrobcovia využívajú rôzne LNP ako platformové technológie na vývoj vakcín proti COVID-19 na báze RNA. Napríklad vakcína mRNA (BNT162) vyvinutá spoločnosťou BioNTech (Mainz, Nemecko) v spolupráci s Pfizer (New York, NY, Spojené štáty americké) bola navrhnutá tak, aby obsahovala štyri rôzne formáty mRNA, ktoré sa zameriavajú na antigény S-proteínu a domény viažucej receptor. a formulované ako formulácia LNP [122,137,138]. K 9. novembru 2020 BioNTech (Mainz, Nemecko) a Pfizer (New York, NY, Spojené štáty americké) oznámili, že vakcína BNT162 bola viac ako 90 % účinná proti COVID-19 na základe prvej predbežnej analýzy účinnosti z klinickej fázy III. štúdie (ClinicalTrials.gov Identifikátor: <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT04368728","term_id":"NCT04368728">> NCT04368728) [139].

Celkovo možno použitie LNP na formuláciu vakcín na báze mRNA považovať za sľubný prístup k očkovaniu proti SARS-CoV-2. Tieto formulácie na báze lipidov môžu byť rýchlo vyrobené, a teda urýchliť vývoj vakcíny. Rôzne vakcíny proti COVID-19 na báze mRNA, ktoré sú formulované v LNP, sa v rôznych klinických štúdiách ukázali ako bezpečné a imunogénne. Údaje získané zo štúdií na zvieratách odhalili, že vakcíny LNP–mRNA vyvolali silnú reakciu neutralizujúcich protilátok a poskytli vysokú ochranu proti SARS-CoV-2.

6.2. RNA/LNP vakcíny proti infekcii vírusom chrípky

Vakcíny proti chrípke založené na mRNA sú jednou z najrozsiahlejšie študovaných mRNA vakcín, pretože okrem možnosti merania indukovaných reakcií T a B buniek sa ľahko hodnotí ich účinnosť u malých zvierat. Uvádza sa, že po identifikácii genetickej sekvencie kódujúcej antigén hemaglutinínu (HA) chrípky je možné vyrobiť samoamplifikujúcu sa mRNA vakcínu [4]. Na základe toho bola do 8 dní po identifikácii génovej sekvencie HA antigénu vyrobená samoamplifikujúca mRNA vakcína proti kmeňu chrípky H7N9 v Číne (zapuzdrená v LNP) a preukázala sa, že je imunogénna u myší [4].

Lindgren a kol. [28] tiež vyvinuli modifikovanú nereplikujúcu sa mRNA vakcínu kódujúcu HA pandemického chrípkového kmeňa H10N8 vo formulácii LNP. Intramuskulárna a intradermálna imunizácia makakov rhesus touto vakcínou vyvolala rozšírenie odpovedí B buniek spolu s tvorbou germinálnych centier (GC) v drenážnych lymfatických uzlinách po každej vakcinácii. Okrem toho sa pozorovalo zvýšenie hladiny H10 špecifických T folikulárnych pomocných buniek, ktoré korelovalo s protilátkovými odpoveďami s vysokou aviditou, ku ktorým dochádza po sezónnej vakcinácii proti chrípke u ľudí, čo naznačuje sérokonverziu [28].

Univerzálna vakcína proti chrípke bola vyvinutá s použitím formulácie mRNA–LNP na vyvolanie silnej imunitnej odpovede proti konzervovaným epitopom (chimérne a bezhlavé hemaglutinínové štruktúry) rôznych vírusových kmeňov. Táto univerzálna vakcína proti chrípke vyvolala protilátky proti stopkovej doméne hemaglutinínu a preukázala dobrú ochranu zvierat proti širokému spektru vírusov chrípky [140]. Ďalšiu široko chrániacu vakcínu proti chrípke vyrobili a vyhodnotili Pardi et al. [29], v ktorých boli použité nukleozidmi modifikované mRNA–LNP, ktoré exprimujú HA vírusu chrípky s plnou dĺžkou. Jednorazová imunizácia formulovanou vakcínou viedla k protilátkovým odpovediam špecifickým pre stonky HA v rôznych zvieracích modeloch (myši, králiky a fretky), a teda poskytla ochranu proti homológnym, heterológnym a heterosubtypickým infekciám vírusom chrípky u myší.

Ďalej sa LNP použili na dodanie modifikovanej mRNA vakcíny kódujúcej HA buď H10N8 alebo H7N9 chrípkových kmeňov [27]. Formulovaná vakcína vyvolala silné, rýchle a dlhotrvajúce imunitné reakcie u myší, fretiek a opíc cynomolgus.

6.3. RNA/LNP vakcíny proti infekcii vírusom besnoty

LNP sa použili na formuláciu mRNA vakcín proti infekcii vírusom besnoty. Sekvenčne optimalizovaná, nemodifikovaná mRNA vakcína, kódujúca glykoproteín vírusu besnoty (RABV-G) bola vyvinutá Lutzom a kol. [9]. Jediná imunizácia opíc cynomolgus touto vakcínou viedla k indukcii titrov neutralizácie vírusu, ktoré prekročili referenčné hodnoty stanovené Svetovou zdravotníckou organizáciou (0,5 IU/ml), aby korelovali s ochranou u ľudí. Tieto titre boli závislé od dávky a boli ďalej zvýšené 20-násobným zvýšením po druhej imunizácii zvierat vykonanej v deň 28. Autori si všimli, že ochrana proti besnote zostala stabilná počas obdobia pozorovania 1 roka [9].

6.4. RNA/LNP vakcíny proti infekcii vírusom Zika

Využitie mRNA/LNP vakcín na ochranu proti vírusu Zika bolo opísané v literatúre rôznymi výskumnými skupinami [30,31,123]. Skupina Pardiho a spol. [30] ukázali, že jednorazové intradermálne očkovanie myší (dávka 30 µg) alebo makakov rhesus (50µg dávka) vakcínou mRNA/LNPs modifikovanou nukleozidmi kódujúcou premembránový a obalový (prM𠄾) glykoproteín Vírus Zika viedol k silnej a pretrvávajúcej ochrannej imunite v oboch zvieracích modeloch s indukciou neutralizujúcich protilátok proti vírusu Zika. Podobné výsledky uvádza Richner a kol. [123] po intramuskulárnej vakcinácii myší dvomi 10 µg dávkami modifikovanej mRNA/LNPs vakcíny kódujúcej prM𠄾 glykoproteín vírusu Zika. Ďalej, skupiny Richner a kol.[31,123] zostrojili mRNA/LNP vakcínu s mutáciami ničiacimi konzervovaný epitop fúznej slučky E proteínu. Zistilo sa, že táto mutantná mRNA vakcína chráni pred infekciou vírusom Zika a znižuje produkciu protilátok zvyšujúcich infekciu vírusom dengue (ktorá úzko súvisí s infekciou vírusom Zika) v bunkovej kultúre aj u myší. Rovnaká vakcína bola hodnotená z hľadiska jej schopnosti chrániť plod pred vrodenou malformáciou, ktorá sa môže vyskytnúť počas tehotenstva v dôsledku prenosu vírusu Zika. Autori uviedli, že dve imunizácie vakcínou chránili gravidnú myš pred infekciou matky, placenty a plodu vírusom Zika [31].

Okrem toho môžu byť vakcíny založené na mRNA navrhnuté tak, aby doručovali viacero mRNA kódujúcich rôzne antigény, aby sa po jedinej imunizácii vytvorila imunita proti viacerým patogénom alebo proti rôznym antigénom toho istého infikujúceho patogénu. Tieto multivalentné mRNA kódujúce rôzne antigény sú obzvlášť užitočné na stimuláciu rôznych imunitných reakcií alebo na cielenie antigénov exprimovaných vo viacerých životných cykloch infikujúceho patogénu [2]. Napríklad práca Johna a spol. [32] opísali produkciu LNP zapuzdrujúcich nukleozidmi modifikované mRNA kódujúce päť rôznych podjednotiek pentamérneho proteínového komplexu ľudského cytomegalovírusu (CMV) a glykoproteínu B (gB). Vyrobená vakcína bola účinne dodaná in vivo a viedla k silným imunitným reakciám a široko neutralizujúcim protilátkam u myší aj primátov (okrem človeka) po intramuskulárnej imunizácii. Autori tiež formulovali ďalšiu LNP/mRNA vakcínu kódujúcu imunodominantný antigén CMV T buniek, pp65. Podanie tejto konvenčnej vakcíny s pentamérnym proteínom a gB vakcínou viedlo k multiantigénnym alebo širokým T bunkovým odpovediam a neinterferovalo s hladinami protilátok produkovaných očkovaním myší multivalentným pentamérnym proteínom [32]. mRNA vakcína exprimujúca pentamérne proteíny ľudského CMV vstúpila do klinického hodnotenia av súčasnosti je vo fáze I klinických skúšok [2].

6.5. RNA/LNP vakcíny proti rakovine

Vakcíny proti rakovine pôsobia buď ako profylaktické (na prevenciu infekcií vírusmi spôsobujúcich rakovinu) alebo terapeutické (na liečbu existujúcej rakoviny). Prvá terapeutická vakcína proti rakovine Sipuleucel-T (provenge) bola schválená v roku 2010 na liečbu rakoviny prostaty [141,142]. Klinické prínosy vakcín proti rakovine na zníženie recidívy rakoviny a na zlepšenie celkového prežívania pacientov boli preukázané v rôznych štúdiách [141, 143].

Do vakcín proti rakovine môžu byť kódované rôzne antigény, ako sú antigény spojené s nádorom (TAA) a antigény špecifické pre nádor (TSA). TAA obsahujú proteíny, ktoré sú nadmerne exprimované v rakovinových bunkách, ale sú prítomné aj v normálnych bunkách. TSA sú exprimované iba v nádorových bunkách a sú odvodené z onkogénnych proteínov vírusov alebo z proteínov produkovaných génovými mutáciami alebo preskupeniami [23]. Navyše mutácie v nádorových bunkách počas progresie a karcinogenézy môžu viesť k produkcii zmenených proteínov nazývaných neoantigény. Tieto typy proteínov možno rozpoznať analýzou genetických mutácií v jednotlivých rakovinových bunkách. Využitie neoantigénov môže umožniť výrobu personalizovaných neoepitopových vakcín proti rakovine, ktoré by mohli byť výhodné pri zvyšovaní tolerancie a obmedzovaní normálnej tkanivovej toxicity, ako aj pri zlepšovaní protinádorovej imunitnej odpovede v porovnaní s konvenčnými vakcínami proti rakovine [23,142]. Personalizované vakcíny s RNA mutanómom [144] a personalizované peptidové vakcíny [145] sú príkladmi personalizovaných vakcín, ktoré ukázali sľubné výsledky v klinických štúdiách fázy I.

Bezpečnosť, imunogenicita a znášanlivosť prvého personalizovaného IVAC MUTANOME (BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH), čo je poly-neoepitop kódujúca RNA vakcína, boli hodnotené v klinických štúdiách fázy I (identifikátor ClinicalTrials.gov: <"type": "clinical-trial","attrs":<"text":"NCT02035956","term_id":"NCT02035956">> NCT02035956) zamerané na mutantné neoantigény na liečbu pacientov s melanómom. Pozorovala sa silná imunitná odpoveď proti antigénom vakcíny. Okrem toho bola odpoveď T buniek vytvorená proti 60 % zo 125 vybraných neoepitopov bez nežiaducich reakcií na liek, čo naznačuje dobrú znášanlivosť vakcíny zaradenými pacientmi [146].

Možnosť získať RNA zo vzorky nádoru, vyrobiť antigény špecifické pre pacienta a potom formulovať personalizovanú vakcínu sa považuje za jednu z výhod mRNA vakcín proti rakovine v porovnaní s inými typmi vakcín. Okrem toho signály poskytované prostredníctvom Toll-like receptorov TLR3, TLR7 a TLR8 môžu odrážať adjuvanciu mRNA na zvýšenie imunitnej odpovede [23]. Okrem toho mRNA vakcíny nepredstavujú riziko infekcie a ich výroba je rýchla, škálovateľná a lacná [14,142,147].

mRNA vakcíny stimulujú špecifickú imunitnú odpoveď, keď je kódovaný antigén translatovaný na proteíny v cytosóle buniek prezentujúcich antigén alebo APC (buď dendritické bunky (DC) alebo makrofágy). Exprimované proteíny sú prezentované na molekulách hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) triedy I CD8+ T bunkám, čo stimuluje bunkovú odpoveď. Indukcia podpornej odpovede CD4+ T pomocných buniek, ktorá je rozhodujúca v imunoterapii rakoviny, sa môže uskutočniť fúziou mRNA-kódovaného antigénu s transportnými signálmi MHC triedy II odvodenými z lyzozomálnych proteínov [23,147,148,149,150]. Preto môžu byť mRNA vakcíny vyvinuté tak, aby kódovali antigény špecifické pre rakovinu, aby vyvolali špecifickú imunitnú odpoveď T buniek proti nádorovým bunkám [25].

Klinické skúšky a in vivo podávanie personalizovaných vakcín proti rakovine mRNA využívajú bezpečné a biokompatibilné systémy nanočastíc, ako sú lipidové nanočastice a lipozómy, na formulovanie a optimalizáciu dodania mRNA [25, 142]. Aplikácia nanočasticových systémov ako nosičov pre vakcíny proti rakovine mRNA poskytuje výhody pri ochrane mRNA pred degradáciou okrem zosilnenia protinádorových reakcií možnosťami spoločného podávania vakcíny s adjuvans a využitím ligandov na zacielenie dendritických bunky. Okrem toho môžu nanočasticové systémy poskytnúť možnosť kontrolovať uvoľňovanie a distribúciu vakcíny [44, 142].

Personalizované mRNA vakcíny proti rakovine kódujúce rôzne antigény boli formulované v lipidových nanosystémoch a už vstúpili do klinických štúdií ( <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03897881","term_id":"NCT03897881 ">> NCT03897881, <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT02316457","term_id":"NCT02316457">> NCT02316457, <"type":"clinical-trial" ,"attrs":<"text":"NCT03313778","term_id":"NCT03313778">> NCT03313778, <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03480152"," term_id":"NCT03480152">> NCT03480152, <"type":"clinical-trial","attrs":<"text":"NCT03323398","term_id":"NCT03323398">> NCT03323395) [295] . Úspešná aplikácia LNP na zapuzdrenie personalizovaných mRNA vakcín bola opísaná na liečbu pacientov s melanómom [144]. Všetci pacienti preukázali reakcie T buniek proti neoepitopom vakcíny. Okrem toho sa u dvoch subjektov po začatí očkovania pozoroval veľmi znížený výskyt metastáz, čo viedlo k lepšiemu prežitiu pacientov [144].

Aby sa vyvolala silná cytotoxická odpoveď CD8 T buniek, skupina Oberli et al. [44] vyvinuli LNP na dodávanie mRNA vakcíny kódujúcej modelový imunologický proteín, ovalbumín (OVA). Autori identifikovali optimálnu formuláciu, ktorá obsahuje ionizovateľný lipid (cKK-E12) a aditívum (laurylsulfát sodný). Optimálna formulácia vykazovala zvýšenú odozvu T buniek po znížení molárneho pomeru cKK-E12 z 35 % na 10 %. Imunizácia modelových myší s transgénnym nádorom exprimujúcim OVA alebo s agresívnym melanómom B16F10 pomocou formulovanej mRNA vakcíny kódujúcej zodpovedajúce antigény viedla k silnej aktivácii CD8 T bunkovej imunity okrem pomalého rastu nádoru, zmenšenia nádoru a následne predĺženia prežitia liečených myši [44].

Zvýšenie účinnosti LNP prostredníctvom dodania ich zapuzdrenej mRNA sa môže dosiahnuť pripojením rôznych skupín k povrchu LNP na zacielenie špecifických receptorov na povrchu imunitných buniek. Alternatívne môže súčasné podávanie LNP s adjuvans zosilniť stimuláciu imunitnej odpovede [1,47,112]. Napríklad začlenenie agonistu TLR4 (lipopolysacharid LPS) do LNP znížilo rast nádoru a poskytlo dlhšie prežitie u myší s melanómom B16F10 [44]. Podobne Verbeke a kol. [112] preukázali, že spoločné dodávanie nukleozidmi modifikovanej mRNA s agonistom TLR4 (monofosforyl lipid A MPLA) do lipoplexov mRNA DOTAP𠄼holesterolu vyvolalo vrodenú imunitu a umožnilo vysokú expresiu antigénu in vivo. Okrem toho skupina Lee et al. [47] začlenili lipopeptid tripalmitoyl-S-glyceryl cysteín (Pam3), ktorý je agonistom TLR1 a TLR2, ako adjuvans do LNP zapuzdrujúcich OVA mRNA. Použitie prípravku Pam3–LNP na intramuskulárnu imunizáciu myší viedlo k vysokej expresii nádorových antigénov so zvýšenou stimuláciou bunkovej imunity [47].

Okrem výhod LNP pri podávaní vakcín proti rakovine mRNA môžu byť LNP navrhnuté tak, aby dodávali mRNA kódujúce cytokíny na aktiváciu imunitnej odpovede a zabíjanie nádorových buniek bez toho, aby spôsobili toxicitu alebo vedľajšie účinky na zdravé bunky [25]. Účinnosť mRNA–LNP kódujúcich interleukín-12 (IL-12), príklad cytokínov s protirakovinovou aktivitou, skúmala skupina Lai et al. [151] na potlačenie rastu nádoru v transgénnych myšacích modeloch hepatocelulárneho karcinómu (HCC). Systémové podávanie formulovaných mRNA–LNP neviedlo k toxicite zdravých tkanív, ale znížilo rast nádoru pečene a zvýšilo prežitie liečených myší [151].

Ďalšiu stratégiu na zvýšenie špecificity terapeutických mRNA skúmala skupina Jain et al. [45]. Autori skúmali možnosť využitia terapeutických mRNA na naprogramovanie chorých alebo rakovinových buniek na syntézu toxického proteínu, ktorý spôsobí samodeštrukciu týchto buniek bez poškodenia zdravých buniek. Na tento účel boli cieľové miesta mikroRNA (miRNA) začlenené do modifikovaných mRNA kódujúcich toxické alebo apoptotické proteíny, ako je kaspáza alebo PUMA (p53 upregulovaný modulátor apoptózy). Prítomnosť miRNA väzbových miest umožní zacielenie miRNA, ktoré sú prítomné iba v zdravých bunkách, a potom umožní týmto bunkám rozpoznať a degradovať toxickú mRNA. Zistilo sa, že intratumorálne podanie LNP naplnených týmito kombinovanými sekvenciami miRNA–mRNA u myší bránilo expresii toxických proteínov z mRNA zdravých buniek, ale selektívne spúšťalo apoptózu v nádorových bunkách bez spôsobenia systémovej toxicity [45].


Technológia mRNA nám poskytla prvé vakcíny proti COVID-19. Mohlo by to pozdvihnúť aj drogový priemysel

Pozeral som sa jej do očí, ako mi prikázala, ale keď ma doktor na druhej strane začal bodať ihlou, začal som otáčať hlavou. “Nepozerajte sa na to,” povedal prvý lekár. poslúchol som.

Bolo to začiatkom augusta v New Orleans, kde som sa prihlásil ako účastník klinickej štúdie vakcíny Pfizer-BioNtech COVID-19. Bola to slepá štúdia, čo znamenalo, že som nemal vedieť, či som dostal placebo alebo skutočnú vakcínu. Spýtal som sa doktora, či to naozaj zistím pohľadom na injekčnú striekačku. “Pravdepodobne nie,” odpovedala, “ale chceme byť opatrní. Toto je veľmi dôležité, aby ste to urobili správne.”

Stal som sa očkovacím pokusným králikom, pretože okrem toho, že som chcel byť užitočný, mal som hlboký záujem o úžasné nové úlohy, ktoré teraz zohráva RNA, genetický materiál, ktorý je jadrom nových typov vakcín, liečby rakoviny a génov. - nástroje na úpravu. Písal som knihu o biochemičke z Berkeley Jennifer Doudnej. Bola priekopníčkou v určovaní štruktúry RNA, čo jej a jej doktorandskému poradcovi pomohlo zistiť, ako by mohol byť pôvod všetkého života na tejto planéte. Potom spolu s kolegom vynašli nástroj na úpravu génov riadený RNA, ktorý im priniesol Nobelovu cenu za chémiu za rok 2020.

Nástroj je založený na systéme, ktorý baktérie používajú na boj proti vírusom. Baktérie vyvíjajú vo svojej DNA zoskupené opakované sekvencie, známe ako CRISPR, ktoré si dokážu zapamätať nebezpečné vírusy a potom nasadiť nožnice riadené RNA, aby ich zničili. Inými slovami, je to imunitný systém, ktorý sa dokáže prispôsobiť, aby bojoval s každou novou vlnou vírusov – presne to, čo my ľudia potrebujeme. Teraz, keď sa nedávno schválená vakcína Pfizer-BioNTech a podobná vakcína od Moderny pomaly rozširujú v USA a Európe, bola RNA nasadená na výrobu úplne nového typu vakcíny, ktorá, keď sa dostane k dostatočnému počtu ľudí, zmení kurz. pandémie.

Až do minulého roka sa vakcíny veľmi nezmenili, aspoň čo sa týka koncepcie, viac ako dve storočia. Väčšina z nich bola vytvorená podľa objavu anglického lekára Edwarda Jennera z roku 1796, ktorý si všimol, že mnohé dojičky boli voči kiahňam imúnne. Všetci boli infikovaní formou kiahní, ktorá postihuje kravy, ale je relatívne neškodná pre ľudí, a Jenner sa domnieval, že kravské kiahne im poskytli imunitu voči kiahňam. Vzal teda trochu hnisu z pľuzgiera kravských kiahní, rozotrel ho do škrabancov, ktoré urobil na ruke svojho 8-ročného syna záhradníka, a potom (to bolo v časoch pred bioetickými panelmi) vystavil dieťa kiahňam. Neochorel.

Predtým sa očkovanie vykonávalo tak, že sa pacientom podávala malá dávka skutočného vírusu kiahní v nádeji, že dostanú mierny prípad a potom budú imúnni. Veľkým pokrokom Jennera bolo použitie príbuzného, ​​ale relatívne neškodného vírusu. Odvtedy je očkovanie založené na myšlienke vystavenia pacienta bezpečnému faksimile nebezpečného vírusu alebo iného zárodku. Toto je určené na naštartovanie adaptívneho imunitného systému osoby. Keď to funguje, telo produkuje protilátky, ktoré niekedy po mnoho rokov odvrátia akúkoľvek infekciu, ak napadne skutočný zárodok.

Jedným z prístupov je injekcia bezpečne oslabenej verzie vírusu. Môžu to byť dobrí učitelia, pretože sa veľmi podobajú na skutočné veci. Telo reaguje tvorbou protilátok na boj proti nim a imunita môže trvať celý život. Albert Sabin použil tento prístup pre orálnu vakcínu proti detskej obrne v 50-tych rokoch minulého storočia a to je spôsob, akým teraz bojujeme proti osýpkam, mumpsu, ružienke a ovčím kiahňam.

V rovnakom čase, keď sa Sabin pokúšal vyvinúť vakcínu založenú na oslabenom víruse detskej obrny, Jonas Salk uspel s bezpečnejším prístupom: s použitím usmrteného alebo inaktivovaného vírusu. Tento typ vakcíny môže stále naučiť imunitný systém človeka, ako bojovať so živým vírusom, ale je menej pravdepodobné, že spôsobí vážne vedľajšie účinky. Dve čínske spoločnosti, Sinopharm a Sinovac, využili tento prístup na vývoj vakcín proti COVID-19, ktoré sa v súčasnosti v Číne, Spojených arabských emirátoch a Indonézii používajú len obmedzene.

Ďalším tradičným prístupom je vstreknutie podjednotky vírusu, napríklad jedného z proteínov, ktoré sú na obale vírusu. Imunitný systém si ich potom zapamätá a umožní telu rýchlo a silne reagovať, keď sa stretne so skutočným vírusom. Takto funguje napríklad vakcína proti vírusu hepatitídy B. Použitie iba fragmentu vírusu znamená, že sú bezpečnejšie na injekciu pacientovi a ľahšie sa vyrábajú, ale často nie sú také dobré pri vytváraní dlhodobej imunity. Biotechnológia Novavax so sídlom v Marylande je v poslednom štádiu klinických skúšok vakcíny proti COVID-19 s použitím tohto prístupu a je základom pre jednu z dvoch vakcín, ktoré sa už v Rusku zavádzajú.

Morový rok 2020 si budeme pamätať ako čas, keď tieto tradičné vakcíny nahradilo niečo zásadne nové: genetické vakcíny, ktoré do ľudských buniek dodávajú gén alebo časť genetického kódu. Genetické inštrukcie potom spôsobujú, že bunky samy o sebe produkujú bezpečné zložky cieľového vírusu, aby stimulovali imunitný systém pacienta.

V prípade vírusu SARS-CoV-2&mdash, ktorý spôsobuje COVID-19&mdash, je cieľovou zložkou jeho spike proteín, ktorý pokrýva vonkajší obal vírusu a umožňuje mu infiltrovať ľudské bunky. Jedným zo spôsobov, ako to dosiahnuť, je vloženie požadovaného génu pomocou techniky známej ako rekombinantná DNA do neškodného vírusu, ktorý môže doručiť gén do ľudských buniek. Na výrobu vakcíny proti COVID sa gén, ktorý obsahuje pokyny na vytvorenie časti koronavírusového spike proteínu, upraví do DNA oslabeného vírusu, ako je adenovírus, ktorý môže spôsobiť prechladnutie. Ide o to, že prerobený adenovírus sa dostane do ľudských buniek, kde nový gén spôsobí, že bunky vytvoria veľa týchto vrcholových proteínov. Výsledkom je, že imunitný systém osoby bude pripravený rýchlo reagovať, ak zasiahne skutočný koronavírus.

Tento prístup viedol k jednému z prvých kandidátov na vakcínu proti COVID, ktorý bol vyvinutý v Inštitúte Jenner na Oxfordskej univerzite. Tamojší vedci zabudovali gén spike-protein do adenovírusu, ktorý spôsobuje prechladnutie u šimpanzov, no u ľudí je relatívne neškodný.

Vedúcou výskumníčkou v Oxforde je Sarah Gilbert. Pracovala na vývoji vakcíny proti respiračnému syndrómu na Blízkom východe (MERS) s použitím rovnakého šimpanzieho adenovírusu. Táto epidémia ustúpila skôr, ako mohla byť jej vakcína nasadená, ale dala jej náskok, keď zasiahol COVID-19. Už vedela, že šimpanzí adenovírus úspešne doručil do ľudí gén pre spike proteín MERS. Hneď ako Číňania v januári 2020 zverejnili genetickú sekvenciu nového koronavírusu, začala do šimpanzího vírusu vytvárať gén pre spike-protein, pričom sa každý deň prebúdzala o 4:00.

Jej 21-ročné trojčatá, z ktorých všetky študovali biochémiu, sa dobrovoľne prihlásili ako prví testeri, dostali vakcínu a zisťovali, či si vytvorili požadované protilátky. (Urobili.) Sľubné výsledky priniesli aj pokusy na opiciach uskutočnené v centre pre primátov v Montane v marci.

Bill Gates, ktorého nadácia poskytla veľkú časť financií, prinútil Oxford, aby sa spojil s veľkou spoločnosťou, ktorá by mohla testovať, vyrábať a distribuovať vakcínu. Oxford teda nadviazal partnerstvo s britsko-švédskou farmaceutickou spoločnosťou AstraZeneca. Bohužiaľ, klinické štúdie sa ukázali ako nedbalé, pričom niektorým účastníkom boli podávané nesprávne dávky, čo viedlo k oneskoreniam. Británia ho schválila na núdzové použitie koncom decembra a USA tak pravdepodobne urobia v najbližších dvoch mesiacoch.

Johnson & Johnson testuje podobnú vakcínu, ktorá používa ľudský adenovírus, a nie šimpanzí, ako mechanizmus prenosu génu, ktorý kóduje vytvorenie časti proteínu spike. Je to metóda, ktorá sa v minulosti ukázala ako sľubná, ale mohla by mať tú nevýhodu, že ľudia, ktorí už boli vystavení tomuto adenovírusu, môžu mať voči nemu určitú imunitu. Výsledky jeho klinickej štúdie sa očakávajú koncom tohto mesiaca.

Okrem toho sú teraz v obmedzenej distribúcii dve ďalšie vakcíny založené na geneticky upravených adenovírusoch: jedna vyrobená spoločnosťou CanSino Biologics a používaná v armáde v Číne a druhá s názvom Sputnik V od ruského ministerstva zdravotníctva.

Existuje ďalší spôsob, ako dostať genetický materiál do ľudskej bunky a spôsobiť, že bude produkovať zložky nebezpečného vírusu, ako sú napríklad spike proteíny, ktoré môžu stimulovať imunitný systém. Namiesto inžinierstva génu pre zložku do adenovírusu môžete jednoducho vložiť genetický kód zložky do ľudí ako DNA alebo RNA.

Začnime s DNA vakcínami. Výskumníci z Inovio Pharmaceuticals a niekoľko ďalších spoločností v roku 2020 vytvorili malý kruh DNA, ktorý kódoval časti koronavírusového proteínu. Myšlienkou bolo, že ak by sa mohla dostať do jadra bunky, DNA by mohla veľmi efektívne chrliť pokyny na výrobu častí s hrotmi-proteínmi, ktoré slúžia na trénovanie imunitného systému, aby reagoval na skutočnú vec.

Veľkou výzvou, ktorej čelí DNA vakcína, je doručenie. Ako môžete dostať malý prstenec DNA nielen do ľudskej bunky, ale aj do jadra bunky? Vpichnutie veľkého množstva DNA vakcíny do ramena pacienta spôsobí, že sa časť DNA dostane do buniek, ale nie je to veľmi účinné.

Niektorí z vývojárov DNA vakcín, vrátane Inovio, sa pokúsili uľahčiť dodávanie do ľudských buniek pomocou metódy nazývanej elektroporácia, ktorá dodáva pacientovi impulzy elektrického šoku v mieste vpichu. To otvára póry v bunkových membránach a umožňuje DNA dostať sa dnu. Elektrické pulzné pištole majú veľa malých ihiel a sú znepokojujúce. Nie je ťažké pochopiť, prečo je táto technika nepopulárna, najmä u tých na prijímacej strane. Doteraz nebol vyvinutý žiadny jednoduchý a spoľahlivý mechanizmus dodávania DNA vakcín do jadra ľudských buniek.

To nás privádza k molekule, ktorá sa ukázala ako víťazná v pretekoch očkovacích látok COVID a zaslúži si titul Molekula roka časopisu TIME: RNA. Známejšia je jeho súrodenecká DNA. Ale ako mnohí slávni súrodenci, DNA nerobí veľa práce. Zostáva hlavne uložený v jadre našich buniek a chráni informácie, ktoré kóduje. Na druhej strane RNA skutočne ide von a robí veci. Gény kódované našou DNA sa prepisujú do útržkov RNA, ktoré sa odvážia von z jadra našich buniek do oblasti výroby proteínov. Tam táto mediátorová RNA (mRNA) dohliada na zostavenie špecifikovaného proteínu. Inými slovami, namiesto toho, aby len sedel doma a kuroval informácie, vyrába skutočné produkty.

Vedci vrátane Sydney Brenner z Cambridge a James Watson z Harvardu prvýkrát identifikovali a izolovali molekuly mRNA v roku 1961. Bolo však ťažké využiť ich, aby splnili naše požiadavky, pretože imunitný systém tela často zničil mRNA, ktorú výskumníci vytvorili a pokúsili sa zaviesť. do tela. Potom v roku 2005 dvojica výskumníkov z Pennsylvánskej univerzity, Katalin Kariko a Drew Weissman, ukázala, ako upraviť syntetickú molekulu mRNA, aby sa mohla dostať do ľudských buniek bez toho, aby bola napadnutá imunitným systémom tela.

Keď pred rokom zasiahla pandémia COVID-19, dve inovatívne mladé farmaceutické spoločnosti sa rozhodli využiť túto úlohu messenger RNA: nemecká spoločnosť BioNTech, ktorá vytvorila partnerstvo s americkou spoločnosťou Pfizer a Moderna so sídlom v Cambridge, Massachusetts. Ich úlohou bolo skonštruovať messenger RNA nesúcu kódové písmená, aby sa stala súčasťou koronavírusového spike proteínu & mdasha reťazca, ktorý začína CCUCGGCGGGCA … &mdashand jeho nasadenie v ľudských bunkách.

Spoločnosť BioNTech bola založená v roku 2008 tímom manželov Ugura Sahina a Ozlema Tureciho, ktorí sa zoznámili, keď sa začiatkom 90. rokov vzdelávali v Nemecku na lekárov. Obaja pochádzali z rodín tureckých prisťahovalcov a zdieľali vášeň pre lekársky výskum natoľko, že časť svojho svadobného dňa strávili prácou v laboratóriu. Založili spoločnosť BioNTech s cieľom vytvoriť terapie, ktoré stimulujú imunitný systém v boji proti rakovinovým bunkám. Čoskoro sa tiež stala lídrom vo vývoji liekov, ktoré používajú mRNA vo vakcínach proti vírusom.

V januári 2020 si Sahin prečítal článok v lekárskom časopise Lancet o novom koronavíruse v Číne. Po diskusii so svojou manželkou pri raňajkách poslal e-mail ostatným členom predstavenstva BioNTech, v ktorom uviedol, že je nesprávne veriť, že tento vírus príde a zmizne tak ľahko ako MERS a SARS. “Tentoraz je to iné,” povedal im.

BioNTech spustil havarijný projekt s cieľom navrhnúť vakcínu založenú na sekvenciách RNA, ktoré Sahin dokázal napísať v priebehu niekoľkých dní, čo by spôsobilo, že ľudské bunky vytvoria verzie spike proteínu koronavírusu. Akonáhle to vyzeralo sľubne, zavolal Sahin Kathrin Jansen, vedúcej výskumu a vývoja vakcín v spoločnosti Pfizer. Obe spoločnosti spolupracovali od roku 2018 na vývoji vakcín proti chrípke pomocou technológie mRNA a on sa jej opýtal, či by spoločnosť Pfizer chcela vstúpiť do podobného partnerstva pre vakcínu COVID. “Práve som sa ti chystal zavolať a navrhnúť to isté,” Jansen odpovedal. Dohoda bola podpísaná v marci.

V tom čase už podobnú mRNA vakcínu vyvíjala Moderna, oveľa menšia spoločnosť s iba 800 zamestnancami. Jej predseda a spoluzakladateľ, Noubar Afeyan, Armén narodený v Bejrúte, ktorý sa prisťahoval do USA, bol fascinovaný mRNA v roku 2010, keď počul názor skupiny výskumníkov z Harvardu a MIT. Spoločne vytvorili spoločnosť Moderna, ktorá sa spočiatku zameriavala na používanie mRNA na vývoj personalizovanej liečby rakoviny, ale čoskoro začala experimentovať s použitím techniky na výrobu vakcín proti vírusom.

V januári 2020 vzal Afeyan jednu zo svojich dcér do reštaurácie neďaleko svojej kancelárie v Cambridge, aby oslávila svoje narodeniny. Uprostred jedla dostal naliehavú textovú správu od generálneho riaditeľa jeho spoločnosti Stéphane Bancel zo Švajčiarska. A tak sa v mrazivej teplote vyrútil von, zabudol si vziať kabát a zavolať ho späť.

Bancel povedal, že chce spustiť projekt na použitie mRNA na pokus o vakcínu proti novému koronavírusu. V tom čase mala Moderna vo vývoji viac ako 20 liekov, ale žiadne sa nedostalo ani do záverečnej fázy klinických skúšok. Napriek tomu ho Afeyan okamžite splnomocnil, aby začal pracovať. “Nerob si starosti s tabuľou,” povedal. “Len sa hýbte.” Moderna, ktorá nemala zdroje spoločnosti Pfizer, sa musela spoliehať na financovanie od vlády USA. Anthony Fauci, šéf Národného inštitútu pre alergie a infekčné choroby, bol oporou. “Choď do toho,” vyhlásil. “Nech to stojí čokoľvek, nerobte si starosti.”

Bancelovi a jeho tímu Moderna trvalo iba dva dni, kým vytvorili sekvencie RNA, ktoré by produkovali spike proteín, a o 41 dní neskôr odoslali prvú škatuľu fľaštičiek do Národného inštitútu zdravia, aby sa mohli začať včasné testy. Afeyan má vo svojom mobilnom telefóne obrázok tej krabice.

Vakcína mRNA má určité výhody oproti DNA vakcíne, ktorá musí použiť prerobený vírus alebo iný transportný mechanizmus, aby prešla cez membránu, ktorá chráni jadro bunky. RNA sa nemusí dostať do jadra. Jednoducho ho treba dodať do dostupnejšej vonkajšej oblasti buniek, cytoplazmy, kde sa tvoria proteíny.

Vakcíny Pfizer-BioNTech a Moderna to robia zapuzdrením mRNA do malých olejových kapsúl, známych ako lipidové nanočastice. Moderna pracovala 10 rokov na zlepšení svojich nanočastíc. To mu poskytlo jednu výhodu oproti Pfizer-BioNTech: jeho častice boli stabilnejšie a nemuseli sa skladovať pri extrémne nízkych teplotách.

Do novembra sa výsledky posledných skúšok Pfizer-BioNTech a Moderna vrátili s jasnými zisteniami: obe vakcíny boli účinné na viac ako 90 %. O niekoľko týždňov neskôr, keď sa COVID-19 opäť rozhojnil vo veľkej časti sveta, dostali núdzové povolenie od amerického Úradu pre potraviny a liečivá a stali sa predvojom biotechnologického úsilia poraziť pandémiu.

Schopnosť kódovať messenger RNA, aby vykonala naše príkazy, zmení medicínu. Rovnako ako v prípade vakcín proti COVID môžeme mRNA prikázať, aby naše bunky vytvorili antigény a molekuly, ktoré stimulujú náš imunitný systém, a ktoré by nás mohli chrániť pred mnohými vírusmi, baktériami alebo inými patogénmi, ktoré spôsobujú infekčné ochorenia. Okrem toho by sa mRNA mohla v budúcnosti použiť, keďže BioNTech a Moderna sú priekopníkmi, na boj proti rakovine. Využitím procesu nazývaného imunoterapia môže byť mRNA kódovaná tak, aby produkovala molekuly, ktoré spôsobia, že imunitný systém tela identifikuje a zabije rakovinové bunky.

Ako zistila Jennifer Doudna a iní, RNA môže byť tiež upravená tak, aby sa zamerala na gény na úpravu. Pomocou systému CRISPR adaptovaného z baktérií môže RNA viesť nožnicové enzýmy na špecifické sekvencie DNA s cieľom odstrániť alebo upraviť gén. Táto technika už bola použitá v pokusoch na liečbu kosáčikovitej anémie. Teraz sa používa aj vo vojne proti COVID. Doudna a ďalší vytvorili enzýmy riadené RNA, ktoré dokážu priamo detekovať SARS-CoV-2 a nakoniec by sa mohli použiť na jeho zničenie.

Ešte kontroverznejšie je, že CRISPR by sa mohol použiť na vytvorenie “dizajnérskych detí” s dedičnými genetickými zmenami. V roku 2018 použil mladý čínsky lekár CRISPR na vytvorenie dvojčiat dievčat, aby nemali receptor pre vírus, ktorý spôsobuje AIDS. Okamžite nastal výbuch úžasu a potom šok. Lekár bol odsúdený a objavili sa výzvy na medzinárodné moratórium na úpravy dedičných génov. Ale po pandémii sa môže stať, že genetické úpravy riadené RNA, aby sa náš druh stal menej vnímavým voči vírusom, sa jedného dňa môžu zdať prijateľnejšie.

Počas ľudskej histórie sme boli vystavení vlne za vlnou vírusových a bakteriálnych pliag. Jednou z prvých známych bola epidémia babylonskej chrípky okolo roku 1200 pred Kristom. Mor v Aténach v roku 429 pred Kr. zabil takmer 100 000 ľudí, Antoninov mor v 2. storočí zabil 5 miliónov, Justiniánov mor v 6. storočí zabil 50 miliónov a čierna smrť v 14. storočí si vyžiadala takmer 200 miliónov životov, takmer polovicu Európy ’. populácia.

Pandémia COVID-19, ktorá v roku 2020 zabila viac ako 1,8 milióna ľudí, nebude poslednou pliagou. Avšak vďaka novej technológii RNA bude naša obrana proti väčšine budúcich morov pravdepodobne nesmierne rýchlejšia a účinnejšia. Ako prichádzajú nové vírusy alebo ako súčasný koronavírus mutuje, výskumníci môžu rýchlo prekódovať mRNA vakcíny, aby sa zamerali na nové hrozby. “Bol to zlý deň pre vírusy,” predseda Moderny Afeyan hovorí o nedeli, keď dostal prvé slovo o výsledkoch klinických skúšok jeho spoločnosti. “Nastal náhly posun v evolučnej rovnováhe medzi tým, čo dokáže ľudská technológia, a tým, čo dokážu vírusy. Možno už nikdy nebudeme mať pandémiu.”

Vynález ľahko preprogramovateľných RNA vakcín bol bleskovo rýchlym triumfom ľudskej vynaliezavosti, ale bol založený na desaťročiach zvedavého výskumu jedného z najzákladnejších aspektov života na planéte Zem: ako sa gény prepisujú do RNA, ktorá hovorí bunkám. aké proteíny zostaviť. Podobne technológia úpravy génov CRISPR pochádza z pochopenia spôsobu, akým baktérie používajú útržky RNA na vedenie enzýmov na ničenie vírusov. Veľké vynálezy pochádzajú z pochopenia základnej vedy. Takto je príroda krásna.

Isaacson, bývalý redaktor TIME, je autorom knihy The Code Breaker: Jennifer Doudna, Gene Editing, and the Future of the Human Race, ktorá vyjde v marci. Po schválení vakcíny Pfizer sa rozhodol zostať v klinickom skúšaní a ešte nebol “oslepený.”


A prichádza tvrdenie, že vakcíny proti COVID-19 spôsobujú rakovinu

Zabudol som však na jedno bežné tvrdenie o antivakcíne. Je to tá, ktorú som ešte nevidel o vakcíne COVID-19, aj keď je to tvrdenie staré desaťročia o skorých verziách vakcíny proti detskej obrne používanej koncom 50. a začiatkom 60. rokov 20. storočia, konkrétne že vakcíny spôsobujú rakovinu . (Je to tvrdenie, ktoré sa premenilo a metastázovalo, aby vyvolalo “chronický zápal” — ktorý môže prispieť k rakovine — z vakcín vo všeobecnosti ako príčinu rakoviny.) Pamätáte si to staré tvrdenie, neviete, pretože skoré verzie vakcíny proti detskej obrne boli kontaminované vírusom (SV40), vakcíny proti detskej obrne podávané deťom pred viac ako 60 rokmi sú zodpovedné za vlnu rakoviny za posledné dve desaťročia. Vo svojich nenapodobiteľných detailoch som diskutoval o tom, ako bolo toto tvrdenie vyšetrené a ako sa zistilo, že nemá žiadny vedecký základ už v roku 2013. Teraz bolo toto tvrdenie znovu použité pre vakcínu COVID-19. Nie, antivaxxeri netvrdia, že vakcíny COVID-19 od Moderna, Pfizer/BioNTech alebo Johnson & Johnson sú kontaminované SV40. Svoje falošné tvrdenie, že vakcíny COVID-19 spôsobia v nasledujúcich desaťročiach vlnu rakoviny, sústreďujú skôr na dizajn týchto vakcín založených na mRNA a na čerešňovú štúdiu z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center z roku 2018 (aby sa vyjadrili dezinformácia patina vedeckej úctyhodnosti). Toto tvrdenie som (zatiaľ) nevidel široko rozšírené, ale ako vyštudovaný molekulárny biológ som si myslel, že sa ho pokúsim rozdrviť v zárodku skôr, ako príliš narastie.

Začnime týmto Tweetom:

DNA sa v podstate replikuje z templátu DNA a výsledkom je dvojvláknová molekula, ktorá je veľmi stabilná, pretože má komplementárne sekvencie, ktoré sa navzájom pevne viažu sekvenčne špecifickým spôsobom. Tento DNA templát je odvíjaný enzýmami, ktoré používajú templát na vytvorenie reťazcov RNA, ktoré sú jednovláknové, ktoré potom ribozóm používa na vytvorenie proteínu z aminokyselín. Zjednodušene povedané, každý nukleotid sa rovná jednému písmenu kódu, každá trojnukleotidová sekvencia (kodón) sa rovná jednému “slovu”, ktoré sa prekladá na aminokyselinu. Vzhľadom na to, že existujú štyri nukleotidy, existuje 64 možných kodónov. Keďže existuje iba 20 aminokyselín, znamená to, že väčšina aminokyselín je kódovaná viac ako jednou kombináciou nukleotidov alebo viac ako jedným kodónom, t.j. genetický kód je nadbytočný. Samozrejme, je to zložitejšie, ako ukazuje tento diagram:

Po prelomení genetického kódu pred 60 rokmi sa čoskoro ukázalo, že RNA kódujúce proteíny často nie sú úplne vytvorené hneď po ich prepise. RNA často začína ako dlhšia prekurzorová RNA (pre-mRNA), ktorá je zostrihnutá na konečnú sekvenciu mRNA predtým, ako je transportovaná z jadra do cytoplazmy, aby sa použila na produkciu proteínu v cytoplazme. Stručne povedané, prekurzorová RNA, ktorá je pôvodne transkribovaná, obsahuje sekvencie známe ako “exóny” a “intróny”. V génoch exóny obsahujú nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú skutočný proteín, zatiaľ čo intróny obsahujú nukleotidové sekvencie, ktoré nič nekódujú, ale môžu mať dôležité sekvencie, ktoré regulujú produkciu a aktivitu génov. Tu je ilustrácia procesu spájania z Wikipédie:

Tento diagram je v skutočnosti pomerne jednoduchý, s dvoma exónmi a jedným intrónom. Niektoré gény majú veľa exónov a intrónov, ktoré si vyžadujú viacero zostrihov, ako na tomto diagrame:

Zabudol som spomenúť, že mRNA sú tiež spracované tak, aby mali “cap” na jednom konci a úsek As (poly-A chvost) na druhom konci? Poly-A chvost je veľmi dôležitý pri regulácii stability mRNA a tým aj jej polčasu v cytoplazme. V každom prípade, ako pri každom biologickom procese, aj pri týchto spájacích udalostiach sa veci môžu pokaziť. Mutácie miesta zostrihu môžu napríklad viesť k nesprávne zostrihaným mRNA a proteínom, ktorým chýbajú exóny:

Mohol by som pokračovať ďalej a ďalej a ďalej. Existujú normálne gény, ktoré môžu produkovať viac ako jeden proteín prostredníctvom alternatívneho zostrihu:

Niekedy, keď sa spájanie pokazí, môže to mať za následok skrátený proteín, ktorému chýba jeden koniec. Napríklad, ak je intrón ponechaný pripojený k dvom exónom, je pravdepodobné, že ribozóm (enzýmový komplex, ktorý premieňa mRNA na proteín) zasiahne “stop” kodón (trojnukleotidový kód, ktorý povie, aby sa transkripcia zastavila) dávno pred ním. dosiahne druhý koniec intrónu, v tomto bode sa transkripcia jednoducho zastaví. Toto všetko nepočíta ani ďalšie molekulárne modifikácie, ktoré môže RNA podstúpiť na svojej ceste od transkripcie k pre-mRNA cez zostrih až po finálnu “zrelú” mRNA.

Nie je prekvapením, že ak sa tieto druhy chýb vyskytnú v génoch dôležitých pre procesy regulujúce rast buniek a inváziu, rakovina môže byť výsledkom buď nesprávneho zostrihu, odstránením regulačnej oblasti v proteíne, ktorá ho drží pod kontrolou, alebo produkciou proteínu, ktorý fungovať ako má. Príklady rakovín, ktoré sú spôsobené alebo urýchlené mutáciou v mieste zostrihu, sa hromadia. Práve túto poslednú možnosť, skrátený proteín, ktorý nefunguje, skúma papier, ktorý Wells nesprávne aplikoval. Proteíny kompromitované skrátením sú nádorové supresorové proteíny, ktorých funkciou je zastaviť rast alebo iné procesy, ktoré môžu viesť k rakovine, keď sú príliš aktívne.

Čo teda papier ukázal? Na tomto článku bolo zaujímavé, že ukázal existenciu chýb zostrihu v tumor supresorových génoch pri špecifickej rakovine, chronickej lymfocytovej leukémii, bez mutácií v miestach zostrihu, aby sa vysvetlilo, ako sa tieto proteíny skrátili v dôsledku chýb zostrihu, alebo, ako uvádzajú autori vložte to do rukopisu:

Objavili sme rozsiahlu upreguláciu skrátených mRNA a proteínov v primárnych CLL bunkách, ktoré neboli generované genetickými zmenami, ale namiesto toho sa vyskytli intrónovou polyadenyláciou

Skráteným proteínom generovaným intrónovou polyadenyláciou často chýbajú funkcie na potlačenie nádoru zodpovedajúcich proteínov plnej dĺžky (ako sú DICER a FOXN3) a niektoré dokonca pôsobili onkogénnym spôsobom (ako napríklad CARD11, MGA a CHST11). Pri CLL je inaktivácia tumor-supresorových génov aberantným spracovaním mRNA podstatne častejšia ako funkčná strata takýchto génov prostredníctvom genetických udalostí.

Čo to teda všetko znamená? Po prvé, aby sme to zopakovali a zjednodušili, autori detegovali skrátené mRNA a proteíny pre množstvo nádorových supresorových génov v CLL, ktoré nebolo možné vysvetliť mutáciami DNA v samotných génoch, ako sú mutácie miesta zostrihu. Urobili mnoho ďalších kontrol, ako napríklad uistenie sa, že vysvetlenie pre skrátené proteíny nebolo štiepenie proteázami, enzýmami, ktoré štiepia proteíny v špecifických aminokyselinových sekvenciách. Po vylúčení iných možností autori preukázali, že tieto mRNA a proteíny boli skrátené kvôli procesu nazývanému intrónová polyadenylácia. Ale čo to je?

Polyadenylácia je proces pridávania zväzku adenozínov (As) na 3′ koniec molekuly RNA. Takto sa poly-A chvost pridáva na koniec mRNA, ale ukázalo sa, že ide o bežný proces polyadenylácie, ktorý sa vyskytuje v intrónoch. Tento proces je veľmi rozšírený a bol ocenený pred viac ako desiatimi rokmi.Podieľa sa na diverzifikácii produktov mRNA imunitných buniek, proces sa vysvetľuje takto:

V literatúre o zostrihu sa izoformy generované rozpoznávaním signálu IpA často opisujú ako udalosti typu ‘alternatívne posledný exón’. Predpokladá sa, že gény, ktoré generujú izoformy IpA, nesú konkurenčné zostrihové a polyadenylačné signály, pričom produkujú mediátorovú RNA s plnou dĺžkou (mRNA), keď zostrih prekoná polyadenyláciu a inak produkuje skrátenú mRNA. Keďže definujúcou udalosťou je rozpoznanie signálu IpA, nazývame tieto transkripty izoformy IpA. Teraz je možné rozpoznať rozšírenú expresiu izoforiem IpA prostredníctvom analýzy 3'-koncových sekvenčných údajov.

Alebo, jednoduchšie povedané, to, či existuje skrátený proteín alebo proteín plnej dĺžky, závisí od rovnováhy zostrihu na polyadenyláciu v mieste intrónu. Ak dôjde k väčšej aktivite zostrihu, získate oveľa viac celého proteínu. Ak dôjde k väčšej polyadenylácii, získate oveľa viac skráteného proteínu. Laboratórium Mayr’s zistilo, že príliš veľa polyadenylácie môže viesť k skráteným tumor-supresorovým proteínom v CLL, čo prispieva k rozvoju rakoviny, a preto podľa tlačovej správy MSKCC, ktorá tieto zistenia celkom dobre vysvetľuje:

Tieto zistenia pomáhajú vysvetliť dlhotrvajúcu hádanku, ktorou je, že bunky CLL majú relatívne málo známych mutácií DNA. Niektorým bunkám CLL chýbajú dokonca známe mutácie. V skutočnosti by zmeny mRNA, ktoré objavil tím Dr. Mayra, mohli zodpovedať za chýbajúce mutácie DNA.

Pretože CLL je taká pomaly rastúca rakovina a ľudia s CLL často žijú mnoho rokov, je príliš skoro povedať, či tieto zmeny mRNA súvisia s horšou prognózou.

Existuje niekoľko dôležitých rozdielov medzi zmenami mRNA a mutáciou DNA v dobrej viere. Najdôležitejšie je, že inaktivácia nádorových supresorov prostredníctvom mRNA je zvyčajne len čiastočná, len asi polovica relevantných proteínových molekúl v nádorových bunkách je skrátená. Ale v mnohých prípadoch to stačí na úplné potlačenie funkcie bežných verzií, ktoré sú k dispozícii. A pretože toto skrátenie by sa mohlo týkať 100 rôznych génov naraz, zmeny sa môžu sčítať.

Prečo teda nič z toho nemá nič spoločné s vakcínami na báze mRNA, ktoré spôsobujú rakovinu? Som rád, že ste sa opýtali, a dúfam, že vám nebude vadiť, že som využil túto príležitosť a trochu som sa vybláznil v zmysle molekulárnej biológie. Biológia, ktorú Wells zneužil, je v skutočnosti dosť zložitá a fascinujúca a už sa o čistej molekulárnej biológii veľmi často nebavím. Dúfam, že som týmto vysvetlením nestratil príliš veľa čitateľov, ale tiež sa stavím, že viacerí z vás už prišli na to, prečo je to, čo Wells predáva, úplný nezmysel. Ak nie, poďme na to.


MRNA vakcína proti chrípke

Vakcína proti chrípke vyrobená zo stabilizovanej mRNA môže umožniť návrh a výrobu vakcíny držať krok s vývojom vírusu.

Vo svete infekčných chorôb zostáva chrípka pretrvávajúcou pohromou. Genetická mutabilita vírusu zaisťuje nekonečnú hru imunologickej mačky a myši, ktorá si vyžaduje komplexný monitorovací systém na stíhanie vírusových zmien. Jedným zo spôsobov, ako čeliť plasticite vírusu chrípky, by bolo zvýšiť plasticitu dizajnu a výroby vakcín. V tomto čísle Petsch a kol. 1 naznačuje, že by sa to dalo dosiahnuť použitím mRNA vakcín, ktoré možno rýchlo modifikovať a vyrobiť. Prvá aplikácia mRNA vakcín na infekčné ochorenie, štúdia demonštruje ochranu proti chrípke na niekoľkých zvieracích modeloch, čím pripravuje pôdu pre budúce klinické hodnotenie.


Pozri si video: Jak se vakcíny proti Covid-19 liší? (Smieť 2022).


Komentáre:

  1. Kagarr

    Granted, this is information fun

  2. Earl

    I am not worried.

  3. Catterick

    V ňom niečo je. Ďakujeme za vysvetlenie, teraz neuznávam takúto chybu.

  4. Xochitl

    Je poddajný, obdivuhodný kúsok



Napíšte správu