We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Z toho, čo som pochopil, pojem operón je voľne definovaný ako súbor génov, ktoré sa nachádzajú v rovnakej blízkosti v genóme.
Niektoré definície presadzujú, že operón je regulovaný iba jedným promótorom a všetky gény sú transkribované spoločne.
Ak je vyššie uvedená definícia prísna, znamenalo by to niekoľko vecí
- Gény sú opačné vlákna, nemôžu byť v rovnakom operóne (pretože sa nedajú prepísať spolu)
- Prekrývajúce sa gény nemôžu byť v rovnakom operóne z rovnakého dôvodu.
Uvedomujem si, že časť problému s týmito definíciami pramení z prebiehajúceho vyšetrovania tohto javu. Existujú však prísne normy týkajúce sa definície operónu? Aká je minimálna definícia operónu?
Relevantné odkazy
Z Hendersonovho slovníka biológie 14 ed. Operón je: typ organizácie génov v baktériách, v ktorom sú gény kódujúce enzýmy metabolickej dráhy zoskupené v DNA a spolu prepísané do jednej mRNA. Táto mRNA sa potom preloží, čím sa získajú jednotlivé proteíny. Expresia všetkých génov v operóne je riadená jediným promótorom.
Nie som si istý, čo je to prekrývajúci sa gén, ale podľa tejto definície áno, gény v opačných smeroch promótora alebo rôznych lokusov nemôžu byť súčasťou operónu, pretože by neboli na rovnakej mRNA.
Regulácia aktivity enzýmov aktiváciou alebo inhibíciou | Biochémia
V súvislosti s tryptofánovým operónom, že prebytok tryptofánu môže spôsobiť represiu génov tohto operónu, čo vedie k zastaveniu syntézy enzýmov potrebných na tvorbu tryptofánu.
Okrem tejto možnosti represie veľmi často existuje spätná inhibícia, tj možnosť, že esenciálny metabolit (aminokyselina, nukleotid atď.), ktorý je konečným produktom série biosyntetických reakcií, inhibuje aktivitu enzýmu katalyzujúceho jedna z prvých reakcií tejto série.
Inhibovaný enzým je vo všeobecnosti ten, ktorý katalyzuje prvú reakciu vedúcu špecificky ku konečnému produktu, a nie enzým, ktorý katalyzuje reakciu spoločnú pre niekoľko metabolických dráh, je to enzým nachádzajúci sa na strategickom spojení, ktorého aktivita je inhibovaná konečným produktom.
Tento typ regulácie je charakteristický najmä tým, že efektor (látka, ktorá aktivuje alebo inhibuje enzým) a substrát tohto enzýmu vo všeobecnosti nie sú izosterické, tj nemajú štruktúrnu analógiu (na rozdiel od situácie pri kompetitívnej inhibícii). analógmi substrátu). Preto sa nazývajú alosterické efektory, pričom pod pojmom alosterické enzýmy sa označujú enzýmy, u ktorých je tento typ kontroly pozorovaný.
1. Všeobecné vlastnosti alosterických enzýmov:
V súvislosti s aspartát transkarbamylázou sú niektoré dôležité charakteristiky regulácie na úrovni alosterických enzýmov, ale tu je zaujímavé zhodnotiť hlavné vlastnosti.
A. Kinetika reakcií katalyzovaných alosterickými enzýmami:
Vo všeobecnosti majú alosterické enzýmy špeciálne kinetické vlastnosti a pri štúdiu zmeny rýchlosti ako funkcie koncentrácie substrátu sa nedosiahne vetva rovnostrannej hyperboly ako v prípade väčšiny enzýmov, ale sigmoidná krivka. Táto krivka v tvare S odráža kooperatívny účinok, t. j. skutočnosť, že najmenej 2 molekuly substrátu interagujú s enzýmom a že väzba prvej molekuly uľahčuje väzbu druhej.
Veľmi často sa takýto kooperatívny účinok prejavuje aj pri väzbe alosterických efektorov (pozri obr. 8-13), čo naznačuje, že väzba prvej molekuly alosterického aktivátora (alebo inhibítora) podporuje väzbu druhej. Tieto výsledky už naznačujú, že existuje viac ako jedno katalytické miesto a viac ako jedno alosterické miesto na molekulu enzýmu a naznačujú polymérnu alebo oligomérnu povahu alosterických enzýmov.
Neuviedli sme, kde sa alosterický efektor viaže, ale naše znalosti o špecifickosti interakcie enzým-substrát a naše pozorovania o absencii akejkoľvek štruktúrnej podobnosti medzi substrátom a efektorom naznačujú, že alosterické efektory sa neviažu na aktívne miesta, ale na rôzne miesta nazývané alosterické miesta.
Berúc do úvahy esovitú povahu kriviek vyjadrujúcich enzymatickú aktivitu ako funkciu buď substrátu, alebo alosterického inhibítora (pozri obr. 8-13), je teda prahový účinok, keď sa koncentrácia inhibítora zvýši alebo keď sa zvýši koncentrácia substrátu.
Pod prahovou hodnotou zvýšenie [S] (pozri obr. 2-12) alebo [I] nespôsobí významnú zmenu rýchlosti, ale za prahom sa rýchlosť značne líši pri relatívne malom zvýšení [S] alebo [I ]. To umožňuje bunke upraviť enzymatickú aktivitu podľa relatívne malých variácií [S] alebo [I], ktoré sa však vyskytujú v zóne kritickej koncentrácie, ktorá zodpovedá intracelulárnym koncentráciám zahrnutých metabolitov.
B. Pôsobenie alosterických efektorov:
Existujú rôzne typy alosterických inhibítorov a pomocou Lineweaver-Burkovho grafu sa zistilo, že niektoré alosterické inhibítory sú kompetitívneho typu a iné nekompetitívneho typu. Ale na rozdiel od toho, čo sme videli pri štúdiu kompetitívnej inhibície konvenčných enzýmov, neexistuje žiadna súťaž - v prípade alosterických enzýmov - medzi S a I o aktívne miesto enzýmu (pretože nemajú žiadnu štrukturálnu analógiu).
Dva typy inhibítorov sa viažu na alosterické miesta, odlišné od aktívnych miest, ako ukázali experimenty desenzibilizácie a frakcionácie podjednotiek. V prípade nekompetitívneho allosterického inhibítora teda väzba I na alosterické miesto enzýmu za vzniku E-I môže spôsobiť zmenu konformácie, ktorá stále umožňuje naviazanie S na E-S-I, ale 1/Vmax je zvýšená preto Vmax je nižšia.
Počas väzby kompetitívneho inhibítora na alosterické miesto dochádza k zmene konformácie, alosterickému prechodu, ktorý spôsobuje spätné účinky na aktívne miesto, na ktoré sa už S nemôže viazať. Dochádza k poklesu o -1/Kmt.j. zvýšenie o Kminými slovami zníženie afinity enzýmu k S. Existuje typ zmiešanej inhibície, charakterizovaný zvýšením o 1/Vmax tj pokles o Vmax, ako aj zvýšenie Kmt.j. zníženie afinity enzýmu k S.
Videli sme, ako alosterický prechod spôsobený väzbou aktivátora podporuje väzbu substrátu. Táto zmena konformácie enzýmu spôsobuje zníženie Kmt.j. zvýšenie afinity k S.
Krivka predstavujúca kinetiku reakcie sa môže zmeniť z esovitej formy na hyperbolickú formu (pozri krivku 2 na obrázku 2-12), ale treba byť veľmi opatrný, pretože sa v niektorých prípadoch ukázalo, že táto zmena poradia reakcia bola iba zdanlivá (bolo to spôsobené nepresnosťou v prvej časti krivky, ktorá nevykazovala sigmoidný charakter).
C. Desenzibilizácia a disociácia alosterických enzýmov:
Alosterické enzýmy sa môžu stať necitlivými voči alosterickým efektorom, buď po mutácii, alebo in vitro fyzikálnym alebo chemickým spracovaním: zmenami pH, teploty, pôsobením iónovej sily močoviny, ortuťových činidiel, proteolytických enzýmov atď.
Táto desenzibilizácia vo všeobecnosti neovplyvňuje katalytickú aktivitu, čo podporuje hypotézu oddelených katalytických a alosterických miest. Často sa prejavuje modifikáciou kinetiky, ktorá sa mení zo sigmoidnej formy na hyperbolickú “Michaelskú” formu. Skutočnosť, že enzým zachováva katalytickú aktivitu, ale už nie je citlivý na alosterické miesto, bola najprv interpretovaná ako znak zmeny alosterického miesta (desenzibilizačným činidlom), ktorá neovplyvňuje katalytické miesto.
V skutočnosti, aby sa prejavili regulačné účinky, musia byť nielen alosterické miesta neporušené a efektory schopné sa na tieto miesta viazať, ale musí byť zachovaná aj konformácia enzýmu, ktorá umožní alosterický prechod a najmä spätné pôsobenie – pri katalytické miesto – udalosti ovplyvňujúcej alosterické miesto.
V skutočnosti sa v niektorých prípadoch pozorovalo, že po desenzibilizácii sa efektor môže stále viazať na alosterické miesto, naopak, v dôsledku modifikácie priestorovej štruktúry enzýmu dochádza k vymiznutiu kooperatívnych interakcií medzi rôznymi katalytickými miestami. tej istej molekuly enzýmu, medzi jej rôznymi alosterickými miestami a medzi jej katalytickými a alosterickými miestami, čím sa zabráni alosterickému prechodu.
Tento alosterický prechod pozostáva z modifikácie väzieb spájajúcich promótory navzájom, čo umožňuje prechod enzýmu z uvoľneného stavu do obmedzeného stavu alebo naopak (pozri obr. 8-14).
Existencia oddelených miest pre substrát a inhibítor, potvrdená ex-hyperimentálne v mnohých prípadoch, je obzvlášť evidentná, keď je možné disociovať alosterický enzým v odlišných podjednotkách, z ktorých niektoré nesú katalytické miesta a iné nesú alosterické miesta.
To je prípad napríklad aspartáttranskarbamylázy, ktorá je inhibovaná CTP a aktivovaná ATP, môže byť znecitlivená teplom alebo močovinou, ale môže byť tiež disociovaná ortuťovými činidlami: natívny enzým (molekulová hmotnosť = 310 000) pozostáva zo 6 polypeptidové reťazce s katalytickou aktivitou (molekulová hmotnosť = 33 000), z ktorých každý má miesto pre väzbu substrátu, a 6 regulačných reťazcov (molekulová hmotnosť = 17 000), ktoré umožňujú väzbu 6 CTP.
Pri izolácii katalytických podjednotiek sa pozoruje, že ich špecifická aktivita (množstvo substrátu transformovaného za jednotku času, vztiahnuté na množstvo proteínu) je väčšia ako aktivita natívneho enzýmu, čo nie je prekvapujúce, pretože eliminácia regulačnej podjednotky -jednotky – neaktívne v procese katalýzy – je istým spôsobom čistenie enzýmu, ak sa vezme do úvahy iba katalytické hľadisko.
D. Model Monod, Wyman a Changeux:
Na vysvetlenie javov pozorovaných počas štúdia alosterických enzýmov títo autori navrhli model, ktorého dôležité charakteristiky sú nasledovné:
1. Alosterické enzýmy sú oligoméry, ktorých protoméry sú spojené tak, že molekula obsahuje aspoň jednu os symetrie (protomér je definovaný ako štruktúra, ktorá má väzbové miesto pre každý ligand, teda pre každú látku schopnú sa viazať – tj substrát , aktivátor a inhibítor – a nesmie sa zamieňať za podjednotku, ktorá je výsledkom disociácie enzýmu a môže obsahovať – ako v prípade aspartát-transkarbamylázy – iba jedno miesto, katalytické alebo alosterické)
2. Každý protomér má iba jedno miesto umožňujúce tvorbu jedného špecifického komplexu s každou kategóriou ligandu
3. Alosterický enzým môže mať rôzne, ale vzájomne konvertibilné konformácie. Často sa hovorí o uvoľnenom stave a obmedzenom stave. Tieto stavy sú v rovnováhe a líšia sa buď distribúciou a energiou väzieb medzi protomérmi (ktoré určujú obmedzenia uložené olejovým protomérom), alebo afinitou rôznych miest pre zodpovedajúce ligandy.
Obrázok 8-14 ukazuje jednoduchý diagram - iba s 2 protomérmi - na ilustráciu modelu. Najprv existuje rovnováha medzi uvoľnenou formou a obmedzenou formou, ak jeden z ligandov (napr. substrát) má väčšiu afinitu k jednej z týchto 2 foriem, relatívne malá koncentrácia tohto ligandu umožní väzbu substrátu. molekuly na protomér zabezpečenej formy, čo posunie rovnováhu v prospech tejto formy a uľahčí väzbu substrátu.
Ale zvýšenie koncentrácie antagonistického ligandu (tu inhibítora) stačí na to, aby sa rovnováha posunula opačným smerom. Alosterické javy sú reverzibilné a závisia od koncentrácií rôznych ligandov. Takýto model vysvetľuje skutočnosť, že sigmoidná krivka sa získa, keď je rýchlosť vyjadrená ako funkcia [S] alebo [I].
Schéma z obr. 8-14 platí pre alosterický enzým typu K. V tomto prípade je v neprítomnosti substrátu rovnováha v prospech formy s nízkou afinitou k substrátu. Ale ako bolo uvedené vyššie, keď sa [S] zväčší, rovnováha sa posunie v prospech formy, ktorá má väčšiu afinitu k S.
Naopak, rovnováha je posunutá inhibítorom v prospech formy s nízkou afinitou k S a alosterický prechod spočíva práve v tejto zmene rovnováhy. Inhibítor teda znižuje afinitu enzýmu k S (zvyšuje sa Ks) a naopak substrát znižuje afinitu enzýmu k inhibítoru (K, zvyšuje), z čoho pochádza názov enzým typu K.
Na vysvetlenie kinetických vlastností alosterických proteínov boli navrhnuté ďalšie modely. Podľa modelu indukovaného prispôsobenia navrhnutého Koshlandom, Nemethym a Filmerom existuje iba jedna konfigurácia proteínu v neprítomnosti ligandu, zdá sa, že väzba ligandu indukuje konformnú modifikáciu protoméru, ktorá transformuje interakcie medzi podjednotky a mení katalytické vlastnosti.
Zdá sa, že konformácia enzymatického proteínu, ktorý sme nazvali terciárna a kvartérna štruktúra, nie je výlučne určená primárnou štruktúrou. V skutočnosti sa pozoruje, že malé molekuly (substráty, aktivátory, inhibítory) sú schopné naviazaním na špecifické miesta spôsobiť mierne modifikácie priestorovej štruktúry proteínu.
2. Hlavné režimy nariadenia:
1. Inhibícia spätnou väzbou spočíva v inhibícii prvého enzýmu reakčnej série metabolitom, ktorý je konečným produktom tejto série. Intracelulárna koncentrácia tohto metabolitu teda riadi rýchlosť jeho vlastnej biosyntézy. V nasledujúcom texte uvažujeme o spätnej inhibícii v priamych a rozvetvených reakčných sériách.
2. Aktivácia enzýmu prekurzorom substrátu alebo substrátom samotným.
3. Aktivácia produktom degradácie terminálneho metabolitu spôsobujúca nové zvýšenie koncentrácie tohto metabolitu (čo môže byť napríklad látka s vysokým energetickým potenciálom).
4. Aktivácia enzýmu metabolickej série vedúcej k metabolitu A metabolitom B, ktorý je syntetizovaný nezávislou sériou, keď A aj B sú potrebné na syntézu rovnakých makromolekúl, čo umožňuje koordinovanú produkciu prekurzorov (v prípade nukleotidov).
Aktivita alosterického enzýmu môže byť riadená niekoľkými z týchto regulačných režimov. Aspartát transkarbamyláza, prvý enzým dráhy vedúcej k syntéze pyrimidínových nukleotidov, je teda spätnou väzbou inhibovaná terminálnym produktom (CTP), aktivovaná substrátom a tiež aktivovaná ATP, ribonukleozidtrifosfátom potrebným spoločne s UTP a CTP – pre biosyntézu RNA.
3. Inhibícia spätnej väzby v priamych a rozvetvených reakčných reťazcoch:
A. Inhibícia spätnej väzby v reťazcoch priamych reakcií:
V priamych metabolických sekvenciách je to vo všeobecnosti prvý enzým (E1), čo je regulačný enzým, t.j. enzým, ktorý podlieha kontrole alosterického typu. Pod pojmom “prvý enzým” treba vo všeobecnosti rozumieť enzýmu, ktorý katalyzuje prvú reakciu špecifickú pre príslušné metabolické dráhy.
Napríklad v prípade biosyntézy pyrimidínribozhynukleotidov je to aspartáttranskarbamyláza, ktorá podlieha spätnej kontrole a nie enzým umožňujúci syntézu karbamylfosfátu alebo aspartátu, tieto dve zlúčeniny môžu vstúpiť aj do iných metabolických dráh, pričom ich kombinácia dať karbamyl aspartát je naozaj prvá reakcia vedúca špecificky k pyrimidínovým nukleotidom. Prvý enzým reťazca je vo všeobecnosti jediný, ktorý je inhibovaný konečným produktom, jeho aktivita preto určuje fungovanie celého sledu reakcií.
Inhibícia tohto enzýmu konečným produktom reťazca reakcií je evidentne zaujímavá. Keď je tento konečný produkt v nadbytku, inhibičný účinok, ktorý má na prvý enzým, znižuje rýchlosť tejto prvej reakcie a následne obmedzuje jeho vlastnú biosyntézu. Keďže séria biosyntetických reakcií zvyčajne vyžaduje energiu, tento regulačný proces umožňuje bunke šetriť energiu.
Táto ekonomika je však menšia ako ekonomika dosiahnutá procesom represie: keď je látky X prebytočné, represia umožňuje bunke zbaviť sa nielen biosyntetických reakcií X, ale aj transkripcie a prepisovania génov do mRNA a translácie polycistrónovej mRNA do enzýmov potrebných na biosyntézu X, zatiaľ čo pri spätnej inhibícii sú potrebné enzýmy prítomné, ale nefungujú.
Naopak, inhibícia spätnou väzbou sa javí ako proces rýchlejší ako represia. Nadbytok látky X môže okamžite inhibovať prvý enzým reťazca reakcií vedúcich k X, zatiaľ čo účinky represie sa prejavia až po vymiznutí – prostredníctvom katabolizmu – molekúl enzýmov a mRNA existujúcich v bunke (a ktoré nie sú nahradené, pretože expresia zodpovedajúcich génov je blokovaná).
Inhibícia spätnej väzby, ktorá je založená – ako už bolo spomenuté vyššie – na fenoméne alosterického prechodu, tj na posune rovnovážneho stavu v prospech jednej z dvoch konformácií enzýmu, je ľahko reverzibilný proces, veľmi citlivý na malé odchýlky koncentrácie ligandov nad určitým prahom, a preto sa vyznačuje veľkou flexibilitou.
B. Inhibícia spätnej väzby v reťazcoch rozvetvených reakcií:
Inhibícia spätnej väzby spôsobuje zvláštne problémy v prípade rozvetvených reakčných reťazcov, kde sa možno a priori obávať, že prebytok konečného produktu jedného z rozvetvení spôsobí – ak inhibuje prvý enzým reťazca – zastavenie syntézy látok. produkované inými vetveniami, látky, ktoré nie sú nevyhnutne v nadbytku.
Na štúdium týchto problémov si vezmeme príklad biosyntézy aminokyselín pochádzajúcich z aspartátu, čo nám umožní študovať ich reguláciu pomocou zjednodušeného diagramu.
a) Inhibícia spätnej väzby obmedzená na pobočky:
Ako je znázornené na obrázku 8-15, aminokyselina, ktorá je konečným produktom vetvenia, môže inhibovať prvý krok sledu reakcií vedúcich len k jej biosyntéze. Biosyntéza iných aminokyselín teda nie je ovplyvnená. Lyzín inhibuje, dihydro-dipikolinátsyntetázu, treonín inhibuje homoserínkinázu (HK), metionín inhibuje sukcinyláciu homoserínu a izoleucín inhibuje treoníndeaminázu (TD).
b) izoenzýmová kontrola:
V E. coli boli identifikované tri aspartokinázy (AK), každá z nich je podrobená regulácii špecifickým represívnym mechanizmom a dve sú podrobené spätnej inhibícii, ktorá je tiež špecifická.
Okrem toho existujú aj 2 homoseríndehydrogenázy (HSDH), ktorých regulácia je identická s reguláciou prvých dvoch aspartokináz, ako ukazuje nasledujúca tabuľka:
Ukázalo sa, že dve katalytické aktivity AK I a HSDH I sú prenášané jedným a tým istým polypeptidovým reťazcom, to isté platí pre aktivity AK II a HSDH II. Je zrejmé, že existencia, napríklad v prípade aspartokinázy, 3 izoenzýmov, ktorých syntéza a aktivita sú riadené rôznymi terminálnymi produktmi, umožňuje bunke – v prípade represie biosyntézy alebo inhibície aktivity jednej z aspartokináz kvôli vysokej koncentrácii jednej aminokyseliny – pokračovať v syntéze ostatných aminokyselín odvodených z aspartátu vďaka ďalším dvom aspartokinázam, ktoré nie sú ovplyvnené. Existencia 3 izoenzýmov, ktoré katalyzujú túto prvú reakciu, umožňuje nezávislú reguláciu rôznymi terminálnymi produktmi (obr. 8-16).
c) Inhibícia zosúladenej alebo multivalentnej spätnej väzby:
V niektorých organizmoch rodu Rhodopseudomonas alebo Bacillus existuje iba jedna aspartokináza, ktorá nie je ovplyvnená nadbytkom iba jedného z terminálnych produktov (Lys, Thr, Ile), ale ktorá je spätne inhibovaná pri nadbytku lyzínu aj treonínu. . Táto zosúladená spätná inhibícia však nie je úplná, čo umožňuje syntézu metionínu.
Iné možnosti kontroly existujú v niektorých organizmoch v tomto rozvetvenom reťazci biosyntézy aminokyselín pochádzajúcich z aspartátu. Nemôžeme študovať všetky, ale typy regulácie, ktoré sme skúmali, ukazujú, že živé organizmy v priebehu evolúcie vybrali rôzne mechanizmy, aby vyriešili špeciálne problémy, ktoré predstavuje regulácia v metabolických dráhach, ktoré predstavujú vetvenia.
Výučba veľkých myšlienok biológie s modelmi operónov
Tento článok predstavuje aktivitu, ktorá zapája študentov do modelového uvažovania a vyžaduje, aby predpovedali správanie operónov trp a lac v rôznych podmienkach prostredia. Študentom je prezentovaných šesť scenárov pre trp operón a päť pre lac operón. Vo väčšine scenárov sa v genetických prvkoch systému vyskytli špecifické mutácie, ktoré menia správanie oproti norme. Študenti sú tiež vyzvaní, aby spojili svoje chápanie správania operónov s „veľkými myšlienkami“ homeostázy, evolúcie, informácií, interakcií a vznikajúcich vlastností. Používaním operónov na to, aby sme študentov naučili uvažovať s modelmi zložitých systémov a porozumieť širokým témam, ich vybavujeme výkonnými zručnosťami a nápadmi, ktoré tvoria pevný základ pre ich budúce učenie sa v biológii.
Denník
Americký učiteľ biológie &ndash University of California Press
Publikovaný: 1. januára 2015
Kľúčové slová: Kľúčové slová: biochémia biologické témy základné pojmy disciplinárne kľúčové myšlienky modelové uvažovanie molekulárna biológia operóny riešenie problémov
Nešpecifická väzba DNA proteínov regulujúcich genóm ako biologický kontrolný mechanizmus: 1. lac Operón: Aspekty rovnováhy
Regulačný systém laktózového operónu bol “modelovaný” súborom rovníc hmotnostnej akcie a konzervačných obmedzení, ktoré opisujú systém v rovnováhe. �se-set” hodnôt väzbových konštánt a celkových koncentrácií zložiek bol zostavený z dostupných experimentálnych údajov a simultánnych rovníc vyriešených počítačovými postupmi, aby sa získali rovnovážne koncentrácie všetkých relevantných molekulárnych druhov. Ak vezmeme do úvahy samotný systém operátor-represor-induktor, ukazuje sa, že in vivo bazálnych a indukovaných (derepresívnych) hladín lac syntéza enzýmov v divokom type aj v určitých mutantoch Escherichia coli možno započítať len vtedy, ak je väzba represorových komplexov a komplexov represor-induktor na nešpecifické miesta DNA zahrnutá do výpočtov ako integrálna súčasť kontrolného systému ovralu. Podobný prístup bol aplikovaný na systém RNA polymeráza-promótor, aby sa ukázalo, že sigma faktor môže modulovať všeobecnú úroveň transkripcie v bunke ȁindukciou” polymerázy z nešpecifických väzbových miest DNA, a tak ho sprístupniť promótorom. Konkurenčné a nekonkurenčné modely interakcie represora a polymerázy v lac operón možno v zásade rozlíšiť týmito výpočtovými postupmi, hoci údaje dostatočné na to, aby umožnili jednoznačné rozlíšenie medzi modelmi, v súčasnosti nie sú k dispozícii. Avšak pre akýkoľvek model kompetitívnej väzby výsledky ukazujú, že represia v celku (operátor-represor-RNA polymeráza-lac promótorový systém môže nastať len preto, že nešpecifická väzba regulačných proteínov znižuje koncentráciu voľnej polymerázy v porovnaní s koncentráciou represora na vhodné úrovne.
Obsah
Rekapitulácia Edit
Rekapitulačná teória evolučného vývoja bola navrhnutá Étienne Serresom v rokoch 1824 – 26, v súlade s myšlienkami Johanna Friedricha Meckela z roku 1808. Tvrdili, že embryá „vyšších“ zvierat prešli alebo rekapitulovali sériu štádií, z ktorých každé pripomínalo zviera nižšie vo veľkom reťazci bytia. Napríklad mozog ľudského embrya vyzeral najprv ako mozog ryby, potom ako mozog plaza, vtáka a cicavca, než sa stal jasne človekom. Proti tomu sa postavil embryológ Karl Ernst von Baer, ktorý v roku 1828 tvrdil, že neexistuje lineárna postupnosť ako vo veľkom reťazci bytia, založená na jedinom telesnom pláne, ale ide o proces epigenézy, v ktorom sa štruktúry diferencujú. Von Baer namiesto toho rozpoznal štyri odlišné telesné plány zvierat: radiálne, ako mäkkýše hviezdice, ako artikulované mušle, ako homáre a stavovce ako ryby. Zoológovia potom do značnej miery upustili od rekapitulácie, hoci ju Ernst Haeckel v roku 1866 oživil. [2] [3] [4] [5] [6]
Evolučná morfológia Edit
Od začiatku 19. storočia až po väčšinu 20. storočia čelila embryológia záhade. Bolo vidieť, že zvieratá sa z vajíčka vyvinuli na dospelých jedincov s veľmi odlišným telesným plánom, často v podobných štádiách, ale zoológovia nevedeli takmer nič o tom, ako je embryonálny vývoj riadený na molekulárnej úrovni, a preto rovnako málo o tom, ako sa vývojové procesy vyvíjali. [7] Charles Darwin tvrdil, že zdieľaná embryonálna štruktúra implikuje spoločného predka. Ako príklad toho uviedol Darwin vo svojej knihe z roku 1859 O pôvode druhov garnáta podobná larve bradáča, ktorej dospelí prisadnutí nevyzerali ako iné článkonožce, ktoré Linnaeus a Cuvier klasifikovali ako mäkkýše. [8] [9] Darwin si tiež všimol zistenie Alexandra Kowalevského, že plášťovec tiež nebol mäkkýš, ale vo svojom larválnom štádiu mal notochordu a hltanové štrbiny, ktoré sa vyvinuli z rovnakých zárodočných vrstiev ako ekvivalentné štruktúry u stavovcov, a mali by preto sa s nimi zoskupujte ako strunatce. [8] [10] Zoológia 19. storočia tak premenila embryológiu na evolučnú vedu, spájajúcu fylogenézu s homológiami medzi zárodočnými vrstvami embryí. Zoológovia vrátane Fritza Müllera navrhli použitie embryológie na objavenie fylogenetických vzťahov medzi taxónmi. Müller preukázal, že kôrovce zdieľali larvu Nauplius, pričom identifikoval niekoľko parazitických druhov, ktoré neboli rozpoznané ako kôrovce. Müller tiež rozpoznal, že prirodzený výber musí pôsobiť na larvy, rovnako ako na dospelých, čo dáva klamstvo rekapitulácii, ktorá by vyžadovala, aby boli larválne formy chránené pred prirodzeným výberom. [8] Dve ďalšie Haeckelove myšlienky o vývoji vývoja dopadli lepšie ako rekapitulácia: v 70. rokoch 19. storočia tvrdil, že zmeny v načasovaní (heterochrónia) a zmeny v umiestnení v tele (heterotopia) aspektov embryonálneho vývoja budú viesť evolúcia zmenou tvaru tela potomka v porovnaní s predkom. Trvalo storočie, kým sa tieto myšlienky ukázali ako správne. [11] [12] [13] V roku 1917 napísal D'Arcy Thompson knihu o tvaroch zvierat, v ktorej jednoduchou matematikou ukázal, ako malé zmeny parametrov, ako sú uhly špirálovej škrupiny ulitníkov, môžu radikálne zmeniť stav zvieraťa. forme, hoci uprednostňoval mechanické pred evolučným vysvetlením. [14] [15] Ale na ďalšie storočie, bez molekulárnych dôkazov, sa pokrok zastavil. [8]
Moderná syntéza zo začiatku 20. storočia Edit
V takzvanej modernej syntéze na začiatku 20. storočia Ronald Fisher spojil Darwinovu evolučnú teóriu s jej dôrazom na prirodzený výber, dedičnosť a variácie a genetické zákony Gregora Mendela do koherentnej štruktúry pre evolučnú biológiu. Biológovia predpokladali, že organizmus je priamym odrazom génov, ktoré sú súčasťou jeho génov: génov kódovaných pre bielkoviny, ktoré stavali telo organizmu. Biochemické dráhy (a predpokladali, že nové druhy) sa vyvinuli prostredníctvom mutácií v týchto génoch. Bol to jednoduchý, jasný a takmer úplný obraz: nevysvetľoval však embryológiu. [8] [16]
Evolučný embryológ Gavin de Beer predvídal evolučnú vývojovú biológiu vo svojej knihe z roku 1930 Embryá a predkovia, [17] tým, že ukazuje, že evolúcia môže prebiehať heterochróniou, [18] ako napríklad pri zachovaní juvenilných znakov u dospelých. [11] De Beer tvrdil, že by to mohlo spôsobiť očividne náhle zmeny vo fosílnom zázname, pretože embryá slabo fosilizujú. Keďže medzery vo fosílnych záznamoch boli použité ako argument proti Darwinovej postupnej evolúcii, de Beerovo vysvetlenie podporilo darwinovský postoj. [19] Napriek de Beerovi však moderná syntéza do značnej miery ignorovala embryonálny vývoj, aby vysvetlila formu organizmov, pretože populačná genetika sa javila ako adekvátne vysvetlenie toho, ako sa formy vyvíjali. [20] [21] [a]
Operón lac Edit
V roku 1961 Jacques Monod, Jean-Pierre Changeux a François Jacob objavili lac operón v baktérii Escherichia coli. Bol to zhluk génov, usporiadaných do spätnoväzbovej riadiacej slučky tak, aby jeho produkty vznikali len vtedy, keď sa „zapnú“ podnetom z prostredia. Jedným z týchto produktov bol enzým, ktorý štiepi cukor, laktóza a samotná laktóza bola stimulom, ktorý zapínal gény. Bolo to odhalenie, pretože sa po prvýkrát ukázalo, že gény, dokonca aj v organizme tak malom ako baktéria, podliehajú jemnozrnnej kontrole. Dôsledkom bolo, že mnoho ďalších génov bolo tiež komplikovane regulovaných. [23]
Zrodenie evo-devo a druhá syntéza Edit
V roku 1977 sa začala revolúcia v myslení o evolúcii a vývojovej biológii s príchodom technológie rekombinantnej DNA do genetiky a prác Ontogenéza a fylogenéza od Stephena J. Goulda a Evolúcia drotárstvom od Françoisa Jacoba. Gould odložil Haeckelovu interpretáciu evolučnej embryológie, zatiaľ čo Jacob predložil alternatívnu teóriu. [8] To viedlo k druhej syntéze [24] [25], ktorá napokon zahŕňala embryológiu, ako aj molekulárnu genetiku, fylogenézu a evolučnú biológiu s cieľom vytvoriť evo-devo. [26] [27] V roku 1978 objavil Edward B. Lewis homeotické gény, ktoré regulujú embryonálny vývoj v r. Drosophila ovocné mušky, ktoré sú ako každý hmyz článkonožce, jeden z hlavných kmeňov bezstavovcov. [28] Bill McGinnis rýchlo objavil homeotické génové sekvencie, homeoboxy, u zvierat v iných kmeňoch, u stavovcov, ako sú žaby, vtáky a cicavce, boli neskôr nájdené aj v hubách, ako sú kvasinky, a v rastlinách. [29] [30] Existovali evidentne silné podobnosti v génoch, ktoré riadili vývoj vo všetkých eukaryotoch. [31] V roku 1980 Christiane Nüsslein-Volhard a Eric Wieschaus opísali medzerové gény, ktoré pomáhajú vytvoriť segmentačný vzor v embryách ovocných mušiek [32] [33] spolu s Lewisom získali Nobelovu cenu za svoju prácu v roku 1995. [29] [ 34]
Neskôr boli objavené konkrétnejšie podobnosti: napríklad v roku 1989 sa zistilo, že gén Distal-less sa podieľa na vývoji príveskov alebo končatín u ovocných mušiek, [35] plutvy rýb, krídla kurčiat, parapódia morské annelid červy, ampulky a sifóny plášťovcov a labky morských ježkov. Bolo evidentné, že gén musí byť prastarý, siahajúci až k poslednému spoločnému predkovi bilaterálnych zvierat (pred ediakarským obdobím, ktoré začalo asi pred 635 miliónmi rokov). Evo-devo začalo odhaľovať spôsoby, akými sa počas vývoja stavali všetky telá zvierat. [36] [37]
Hlboká homológia Edit
Zhruba guľovité vajíčka rôznych zvierat dávajú vznik mimoriadne odlišným telám, od medúz cez homáre, motýle až po slony. Mnohé z týchto organizmov zdieľajú rovnaké štrukturálne gény pre proteíny na stavbu tela, ako je kolagén a enzýmy, ale biológovia očakávali, že každá skupina zvierat bude mať svoje vlastné pravidlá vývoja. Prekvapením evo-devo je, že tvarovanie tela je riadené pomerne malým percentom génov a že tieto regulačné gény sú prastaré a zdieľajú ich všetky zvieratá. Žirafa nemá gén pre dlhý krk, rovnako ako slon má gén pre veľké telo. Ich telá sú vzorované systémom prepínania, ktorý spôsobuje, že vývoj rôznych čŕt začína skôr alebo neskôr, vyskytuje sa v tej či onej časti embrya a pokračuje viac či menej času. [7]
Hádanka o tom, ako bol embryonálny vývoj kontrolovaný, sa začala riešiť pomocou ovocnej mušky Drosophila melanogaster ako modelový organizmus. Postupná kontrola jeho embryogenézy bola vizualizovaná pripojením fluorescenčných farbív rôznych farieb na špecifické typy proteínov vytvorených génmi exprimovanými v embryu. [7] Farbivo, ako je zelený fluorescenčný proteín, pôvodne z medúzy, bolo zvyčajne naviazané na protilátku špecifickú pre proteín ovocnej mušky, čím sa vytvoril presný indikátor toho, kde a kedy sa tento proteín objavil v živom embryu. [38]
Použitím takejto techniky v roku 1994 Walter Gehring zistil, že číslo-6 gén, ktorý je životne dôležitý pre tvorbu očí ovocných mušiek, sa presne zhoduje s génom pre tvorbu očí u myší a ľudí. Rovnaký gén bol rýchlo nájdený v mnohých ďalších skupinách zvierat, ako je napríklad chobotnica, hlavonožec. Biológovia vrátane Ernsta Mayra verili, že oči vznikli v živočíšnej ríši najmenej 40-krát, pretože anatómia rôznych typov očí sa značne líši. [7] Napríklad zložené oko ovocnej mušky je tvorené stovkami malých šošovkovitých štruktúr (ommatídia), ľudské oko má slepú škvrnu, kde zrakový nerv vstupuje do oka a nervové vlákna prebiehajú po povrchu sietnice, takže svetlo musí prejsť vrstvou nervových vlákien, kým sa dostane k detekčným bunkám v sietnici, takže štruktúra je efektívne „hore nohami“, na rozdiel od toho oko hlavonožca má sietnicu, potom vrstvu nervových vlákien, potom stenu oko "správnym smerom". [39] Dôkazy o číslo-6, však bolo, že rovnaké gény riadili vývoj očí všetkých týchto zvierat, čo naznačuje, že sa všetky vyvinuli zo spoločného predka. [7] Staroveké gény boli počas miliónov rokov evolúcie konzervované, aby sa vytvorili odlišné štruktúry pre podobné funkcie, čo demonštruje hlbokú homológiu medzi štruktúrami, ktoré sa kedysi považovali za čisto analogické. [40] [41] Tento pojem sa neskôr rozšíril na evolúciu embryogenézy [42] a spôsobil radikálnu revíziu významu homológie v evolučnej biológii. [40] [41] [43]
Gene Toolkit Edit
Malá časť génov v genóme organizmu riadi vývoj organizmu. Tieto gény sa nazývajú vývojovo-genetické nástroje. Medzi fylami sú vysoko konzervované, čo znamená, že sú staré a veľmi podobné v široko oddelených skupinách zvierat. Rozdiely v nasadení génov súpravy nástrojov ovplyvňujú plán tela a počet, identitu a vzor častí tela. Väčšina génov súpravy nástrojov je súčasťou signálnych dráh: kódujú transkripčné faktory, proteíny bunkovej adhézie, proteíny receptorov bunkového povrchu a signálne ligandy, ktoré sa na ne viažu, a vylučované morfogény, ktoré difundujú cez embryo. To všetko pomáha definovať osud nediferencovaných buniek v embryu. Spoločne vytvárajú vzory v čase a priestore, ktoré formujú embryo a v konečnom dôsledku tvoria telesný plán organizmu. Medzi najdôležitejšie gény súpravy nástrojov patria Hox génov. Tieto transkripčné faktory obsahujú motív DNA viažuci proteín homeoboxu, ktorý sa nachádza aj v iných génoch súpravy nástrojov, a vytvárajú základný vzor tela pozdĺž jeho osi spredu dozadu. [43] Hox gény určujú, kde vo vyvíjajúcom sa embryu alebo larve budú rásť opakujúce sa časti, ako napríklad mnohé stavce hadov. [7] Pax-6, už spomenutý, je klasickým nástrojovým génom. [44] Hoci sa pri vytváraní rastlinného telesného plánu podieľajú aj iné gény súpravy nástrojov, [45] gény homeoboxu sa nachádzajú aj v rastlinách, čo znamená, že sú spoločné pre všetky eukaryoty. [46] [47] [48]
Regulačné siete embrya Edit
Proteínové produkty regulačnej sady nástrojov sa opätovne nevyužívajú duplikáciou a modifikáciou, ale komplexnou mozaikou pleiotropie, ktorá sa používa nezmenená v mnohých nezávislých vývojových procesoch, čím sa vytvára vzor pre mnohé odlišné telesné štruktúry.[43] Lokusy týchto pleiotropných génov súpravy nástrojov majú veľké, komplikované a modulárne cis-regulačné prvky. Napríklad, zatiaľ čo nepleiotropný rodopsínový gén v ovocnej muške má cis-regulačný element dlhý len niekoľko stoviek bázových párov, pleiotropná bezočivá cis-regulačná oblasť obsahuje 6 cis-regulačných elementov vo viac ako 7000 bázových pároch. [43] Príslušné regulačné siete sú často veľmi rozsiahle. Každý regulačný proteín riadi "skóre až stovky" cis-regulačných prvkov. Napríklad 67 transkripčných faktorov ovocných mušiek kontrolovalo v priemere 124 cieľových génov. [43] Celá táto zložitosť umožňuje, aby sa gény podieľajúce sa na vývoji embrya zapínali a vypínali presne v správny čas a na presne tých správnych miestach. Niektoré z týchto génov sú štrukturálne, priamo tvoriace enzýmy, tkanivá a orgány embrya. Ale mnohé ďalšie sú samotné regulačné gény, takže to, čo sa zapína, je často presne načasovaná kaskáda prepínania, ktorá zahŕňa zapnutie jedného vývojového procesu za druhým vo vyvíjajúcom sa embryu. [43]
Takáto kaskádovitá regulačná sieť bola podrobne študovaná pri vývoji embrya ovocnej mušky. Mladé embryo má oválny tvar ako rugbyová lopta. Malý počet génov produkuje messengerové RNA, ktoré vytvárajú koncentračné gradienty pozdĺž dlhej osi embrya. V ranom embryu, bicoid a hrbatý gény sú vo vysokej koncentrácii blízko predného konca a dávajú vzor budúcej hlave a hrudníku kaudálny a nano gény sú vo vysokej koncentrácii blízko zadného konca a poskytujú vzor najzadnejším brušným segmentom. Účinky týchto génov sa vzájomne ovplyvňujú, napríklad bikoidný proteín blokuje transláciu kaudálny's messenger RNA, takže koncentrácia kaudálneho proteínu sa na prednom konci zníži. Caudal neskôr zapne gény, ktoré vytvárajú najzadnejšie segmenty muchy, ale iba na zadnom konci, kde je najviac koncentrovaný. [49] [50]
Proteíny Bicoid, Hunchback a Caudal zase regulujú transkripciu medzerových génov, ako napr. obor, knirps, Krüppel, a bezchvostý v pruhovanom vzore, čím sa vytvorí prvá úroveň štruktúr, ktoré sa stanú segmentmi. [32] Proteíny z nich zase kontrolujú gény s párovým pravidlom, ktoré v ďalšom štádiu vytvárajú 7 pásov pozdĺž dlhej osi embrya. Nakoniec gény polarity segmentov ako napr zarytý rozdeliť každé zo 7 pásiem na dve, čím vznikne 14 budúcich segmentov. [49] [50]
Tento proces vysvetľuje presnú konzerváciu génových sekvencií súpravy nástrojov, čo má za následok hlbokú homológiu a funkčnú ekvivalenciu proteínov súpravy nástrojov u odlišných zvierat (pozorované napríklad, keď myšací proteín riadi vývoj ovocných mušiek). Interakcie transkripčných faktorov a cis-regulačných prvkov alebo signálnych proteínov a receptorov sa zablokujú prostredníctvom viacnásobného použitia, čím sa takmer každá mutácia stáva škodlivou, a teda eliminovaná prirodzeným výberom. [43]
Medzi prekvapivejšie a možno aj kontraintuitívne (z neodarwinistického hľadiska) výsledky nedávneho výskumu evolučnej vývojovej biológie patrí, že rozmanitosť telesných plánov a morfológie organizmov v mnohých kmeňoch sa nevyhnutne neodráža v rozmanitosti na úrovni sekvencie génov, vrátane sekvencií vývojového genetického súboru nástrojov a iných génov zapojených do vývoja. V skutočnosti, ako poznamenali John Gerhart a Marc Kirschner, existuje zjavný paradox: „tam, kde najviac očakávame, že nájdeme variácie, nájdeme ochranu, nedostatok zmien“. [51] Ak teda pozorovaná morfologická novosť medzi rôznymi kladmi nepochádza zo zmien v sekvenciách génov (napríklad mutáciou), odkiaľ pochádza? Novinkou môžu byť zmeny v génovej regulácii spôsobené mutáciami. [43] [52] [53] [54]
Variácie v súprave nástrojov Upraviť
Variácie v súbore nástrojov mohli spôsobiť veľkú časť morfologického vývoja zvierat. Súbor nástrojov môže viesť evolúciu dvoma spôsobmi. Gén súpravy nástrojov môže byť vyjadrený iným spôsobom, ako keď bol zobák Darwinovho veľkého zemolezca zväčšený BMP gén, [55] alebo keď hady prišli o nohy ako distálne-menej sa nedostatočne alebo vôbec neprejavili na miestach, kde ostatné plazy naďalej tvorili svoje končatiny. [56] Alebo gén súboru nástrojov môže získať novú funkciu, ako je vidieť v mnohých funkciách toho istého génu, distálne-menej, ktorý ovláda také rôznorodé štruktúry, ako je čeľusť u stavovcov, [57] [58] nohy a tykadlá u ovocnej mušky [59] a vzor škvŕn v motýlích krídlach. [60] Vzhľadom na to, že malé zmeny v génoch sady nástrojov môžu spôsobiť významné zmeny v štruktúre tela, často umožnili rovnakú funkciu konvergentne alebo paralelne. distálne-menej vytvára vzory krídel v motýľoch Heliconius erato a Heliconius melpomene, čo sú müllerovské mimikry. V takzvanej facilitovanej variácii [61] ich vzory krídel vznikli v rôznych evolučných udalostiach, ale sú riadené rovnakými génmi. [62] Vývojové zmeny môžu priamo prispieť k speciácii. [63]
Konsolidácia epigenetických zmien Edit
Evolučná inovácia môže niekedy začať v lamarckovskom štýle s epigenetickými zmenami génovej regulácie alebo generovania fenotypov, následne konsolidovaných zmenami na génovej úrovni. Epigenetické zmeny zahŕňajú modifikáciu DNA reverzibilnou metyláciou [64], ako aj neprogramované pretvarovanie organizmu fyzikálnymi a inými vplyvmi prostredia v dôsledku prirodzenej plasticity vývojových mechanizmov. [65] Biológovia Stuart A. Newman a Gerd B. Müller navrhli, že organizmy na začiatku histórie mnohobunkového života boli náchylnejšie na túto druhú kategóriu epigenetických determinácií ako moderné organizmy, čo poskytuje základ pre skoré makroevolučné zmeny. [66]
Vývojová zaujatosť Edit
Vývoj v špecifických líniách môže byť ovplyvnený buď pozitívne, smerom k danej trajektórii alebo fenotypu, [b] alebo negatívne, preč od vytvárania určitých typov zmien, buď môže byť absolútny (zmena je vždy alebo nikdy vytvorená) alebo relatívna. Dôkazy o akomkoľvek takomto smerovaní evolúcie je však ťažké získať a môžu byť tiež výsledkom vývojových obmedzení, ktoré obmedzujú diverzifikáciu. [68] Napríklad u ulitníkov je ulita slimáka vždy vytvorená ako rúrka, ktorá rastie do dĺžky aj do priemeru, výber vytvoril širokú škálu tvarov ulít, ako sú ploché špirály, cowry a špirály vysokých vežičiek v nich obmedzenia. Medzi stonožkami má Lithobiomorpha v dospelosti vždy 15 segmentov trupu, pravdepodobne výsledkom vývojovej zaujatosti smerom k nepárnemu počtu segmentov trupu. Ďalší rad stonožiek, Geophilomorpha, sa počet segmentov u rôznych druhov pohybuje medzi 27 a 191, ale počet je vždy nepárny, čo z neho robí absolútne obmedzenie, takmer všetky nepárne čísla v tomto rozsahu sú obsadené jedným alebo iným druhom. [67] [69] [70]
Ekologická evolučná vývojová biológia (eco-evo-devo) integruje výskum z vývojovej biológie a ekológie s cieľom preskúmať ich vzťah s evolučnou teóriou. [71] Výskumníci študujú koncepty a mechanizmy, ako je vývojová plasticita, epigenetická dedičnosť, genetická asimilácia, konštrukcia výklenku a symbióza. [72] [73]
Záver
Používaním operónov na to, aby sme študentov naučili uvažovať s modelmi zložitých systémov a porozumieť širokým témam, ich vybavujeme výkonnými zručnosťami a nápadmi, ktoré tvoria pevný základ pre ich budúce učenie sa v biológii. Tieto zručnosti a nápady majú široké uplatnenie v biológii, ale potenciálne majú uplatnenie aj v iných oblastiach. Konštrukty, ako je negatívna spätná väzba a prirodzený výber, ktoré sa používajú na vysvetlenie meniacich sa a samoorganizujúcich sa systémov, predstavujú to, čo Ohlsson (1993) označuje ako „abstraktné schémy“, ktoré kódujú skôr štruktúru diskurzu než jeho obsah. Ich abstraktný charakter umožňuje možnosť prenosu medzi doménami. Napríklad schéma negatívnej spätnej väzby bola pôvodne vyvinutá v kontexte špecifických technických problémov a neskôr sa zistilo, že má uplatnenie v biológii. Podobne bol vyvinutý prirodzený výber na vysvetlenie pôvodu adaptácií v organizmoch, ale následne sa aplikoval na vývoj imunitného a nervového systému, počítačové programovanie a umelú inteligenciu. Zvládnutie abstraktných schém umožňuje študentom stať sa zrelými mysliteľmi so silnou mysľou, ktorí si dokážu predstaviť riešenia budúcich problémov sveta.
Syntetické génové okruhy pre metabolickú kontrolu: navrhnite kompromisy a obmedzenia
Veľkou výzvou v syntetickej biológii je posunúť návrh biomolekulových okruhov z čisto genetických konštruktov smerom k systémom, ktoré prepájajú rôzne úrovne bunkového aparátu, vrátane signalizačných sietí a metabolických dráh. V tomto článku sa zameriavame na genetický okruh pre reguláciu spätnej väzby nerozvetvených metabolických dráh. Cieľom tohto systému spätnej väzby je tlmiť účinok porúch toku spôsobených zmenami bunkových požiadaviek alebo upravenými dráhami spotrebúvajúcimi metabolické medziprodukty. Uvažujeme o matematickom modeli riadiaceho obvodu s operónovou architektúrou, pričom expresia všetkých enzýmov dráhy je transkripčne potlačená metabolickým produktom. Venujeme sa existencii a stabilite rovnovážneho stavu, dynamickej odozve siete pri poruchách a ich závislosti od bežných laditeľných gombíkov, ako je charakteristika promótora a sily väzbového miesta ribozómu (RBS). Naša analýza odhaľuje kompromisy medzi ustáleným stavom enzýmov a medziproduktov, spolu s princípom separácie medzi promótorom a dizajnom RBS. Ukazujeme, že enzymatická saturácia ukladá limity na návrhový priestor parametrov, ktorý musí byť splnený, aby sa zabránilo akumulácii metabolitov a zaručila sa stabilita siete. Použitie promótorov so širokým dynamickým rozsahom a malým deravým výrazom zväčšuje dizajnový priestor. Výsledky simulácie s realistickými hodnotami parametrov tiež naznačujú, že riadiaci obvod môže účinne regulovať produkciu enzýmov, aby sa kompenzovali poruchy toku.
1. Úvod
Syntetická biológia sa zameriava na inžinierstvo bunkových systémov na vykonávanie prispôsobených a programovateľných biologických funkcií. Kľúčové práce publikované v roku 2000 [1,2] odštartovali vývoj širokej škály génových obvodov s predpísanými funkciami, vrátane bakteriálnych logických brán [3], mechanizmov na programovanú komunikáciu medzi bunkami [4] a svetelných- responzívne moduly [5]. Po tomto pokroku nedávno nasledovala takzvaná „druhá vlna“ syntetickej biológie [6], ktorej cieľom je rozšíriť návrhy z jednotlivých genetických modulov na celé bunkové systémy, ktoré fungujú naprieč rôznymi vrstvami bunkovej regulácie, vrátane signálnych sietí a metabolických dráh [7,8].
Jednou z najvýznamnejších aplikácií syntetickej biológie je manipulácia bakteriálneho metabolizmu na chemickú výrobu v sektoroch ako energetika, biomedicína a potravinárske technológie [6]. Účinná kontrola metabolizmu závisí od schopnosti upregulovať alebo downregulovať dráhy v reakcii na zmeny v intracelulárnych podmienkach, bunkových požiadavkách alebo environmentálnych poruchách [9]. Tieto požiadavky vyžadujú dynamické kontrolné stratégie, ktoré môžu modulovať expresiu enzýmov spôsobom závislým od metabolitov [10,11]. Jednou z kľúčových prekážok v tomto ohľade je naše obmedzené pochopenie toho, ako gombíky genetického dizajnu modulujú metabolické reakcie.
Cieľom tohto článku je odhaliť nové pohľady na dizajnové obmedzenia a kompromisy vyplývajúce zo súhry medzi génovými okruhmi a metabolickými dráhami. Za týmto účelom analyzujeme dynamický model pre systém spätnej väzby zahŕňajúci nelineárne kinetické rovnice pre metabolické druhy spolu s expresiou enzýmu závislou od produktu riadenou okruhom syntetických génov. Zameriavame sa na existenciu a stabilitu ustáleného stavu, dynamickú odozvu siete pri poruchách a ich závislosť od návrhových gombíkov obvodu syntetického génu.
Dve významné implementácie geneticko-metabolických okruhov sú genetická kontrola produkcie lykopénu [12] a metabolický oscilátor opísaný vo Fung. a kol. [13]. Na tieto práce nadviazala nedávna štúdia Zhanga a kol. [14], čím autori ohlásili prvú úspešnú implementáciu genetického kontrolného okruhu na zvýšenie produkcie biopalív. Spôsobom podobným technologickým systémom vytvoreným človekom hrá využitie spätnej väzby kľúčovú úlohu pri „robustizácii“ dynamiky dráhy v meniacich sa podmienkach prostredia, variabilite medzi bunkami a biochemickom šume. Napriek všadeprítomnosti metód riadiaceho inžinierstva [15] len niekoľko prác dôsledne riešilo problém návrhu genetickej spätnej väzby na základe matematických modelov. Najmä Anesiadis a kol. [16] demonštrovali použitie genetického prepínača [2] ako ON-OFF regulátora pre metabolizmus, zatiaľ čo Dunlop a kol. [17] skúmali rôzne architektúry genetickej kontroly výroby biopalív.
Z hľadiska riadiaceho inžinierstva pôsobia katalytické enzýmy ako vstupy do metabolickej dráhy s cieľom riadiť dynamiku metabolitov (t. j. výstupy). Výstupy dráhy sú potom snímané molekulami reagujúcimi na metabolit, ktoré môžu modulovať hladiny expresie enzýmov (napr. transkripčné faktory (TF) alebo riboswitche [18]). V žargóne riadiaceho inžinierstva možno tento spätnoväzbový systém vnímať ako „rastlinu“ (t. j. dráhu, ktorá má byť kontrolovaná) a „regulátor“ (t. j. génový regulačný obvod kontrolujúci expresiu katalytických enzýmov), pozri obrázok 1a. Návrh genetického regulátora potom musí zodpovedať dvom komplementárnym kontrolným cieľom: po prvé, musí dynamicky upravovať aktivitu dráhy tak, aby zodpovedala bunkovej potrebe produktu a udržiavať homeostatickú rovnováhu natívnych bunkových procesov. Po druhé, bežnou stratégiou v metabolickom inžinierstve je modifikácia hostiteľských mikróbov expresiou heterológnych enzýmov, ktoré premieňajú metabolické medziprodukty na požadovanú chemikáliu [19]. Spotreba medziproduktov odvádza časť toku prideleného hostiteľským natívnym procesom (obrázok 1b), a preto musí regulátor tiež zmierniť vplyv týchto upravených dráh na prirodzený tok. 
Obrázok 1. Návrh kontroly pre metabolické dráhy. (a) Transkripčná regulácia metabolických dráh vnímaná ako systém kontroly spätnej väzby: efektorové molekuly (ako sú transkripčné faktory) snímajú koncentrácie metabolitov a modulujú expresiu katalytických enzýmov, ktoré pôsobia ako vstupy do dráhy. (b) Upravené cesty môžu odkloniť časť prirodzeného metabolického toku na produkciu cudzích zlúčenín. (Online verzia vo farbe.)
V tomto článku študujeme nerozvetvenú metabolickú dráhu pri transkripčnej represii z produktu. Syntetický okruh pozostáva z operónu kódujúceho všetky katalytické enzýmy, ktorý je potláčaný TF reagujúcim na produkt (§2). Architektúra operónovej spätnej väzby napodobňuje prirodzené obvody umožňujúce bunkové adaptácie na environmentálne poruchy (napr. metabolizmus bakteriálnych aminokyselín [20] a príjem živín [21]). Aby sme zachovali všeobecnú analýzu, nešpecifikujeme kinetiku metabolického modelu, ale skôr pracujeme s generickou triedou rýchlostí premeny enzýmov, ktoré spĺňajú mierne predpoklady. Tieto sú uspokojované širokým rozsahom kinetiky saturovateľných enzýmov, vrátane Michaelis-Mentenovej kinetiky a kooperatívneho správania opísaného sigmoidálnou kinetikou [22]. Genetický model parametrizujeme z hľadiska charakteristiky promótora a sily ribozómového väzbového miesta (RBS), čo sú typické konštrukčné prvky používané ako laditeľné gombíky v aplikáciách syntetickej biológie. Rovnako ako v prípade kinetiky enzýmov nefixujeme tvar charakteristiky promótora, ale skôr uvažujeme o generickej triede represívnych funkcií, ktoré zodpovedajú najmä štandardnému modelu Hillovej rovnice pre transkripčnú represiu [23].
Analýza modelu odhalila, že enzymatická saturácia a presakujúca expresia promótora obmedzujú priestor návrhu sily RBS (§3.1). Tieto obmedzenia musia byť splnené, aby sa zaručila existencia bodu rovnováhy, aby sa zabránilo akumulácii metabolitov a aby sa zabezpečila stabilita siete pri malých poruchách. Uskutočniteľný súbor síl RBS kriticky závisí od netesnosti promótora a dostupnosti substrátu. V rámci uskutočniteľného súboru možno sily RBS použiť na jemné doladenie rovnováhy medzi strednými hladinami metabolitov a záťažou génovej expresie uloženej na hostiteľskú bunku. Získali sme tiež analytické vzorce pre režimy systému spätnej väzby, ktoré ukázali, že architektúra operónu vedie k pomalým pevným režimom a navrhuje princíp oddelenia medzi účinkom silných stránok RBS a charakteristikou promótora (§ 3.2).
Ukazujeme tiež, že skonštruované cesty, ktoré spotrebúvajú medziprodukt, pridávajú ďalšie obmedzenia do priestoru dizajnu silných stránok RBS, ktoré možno uvoľniť pomocou promótorov s vysokým dynamickým rozsahom a malou netesnosťou (§ 4.1). Vykonali sme numerické simulácie modelu s fyziologicky realistickými parametrami v Escherichia coli (§§ 3.2 a 4.2). Simulácie ukazujú, že riadiaci obvod môže účinne upregulovať produkciu enzýmov, aby kompenzoval zvýšenie prirodzeného dopytu bunky po produkte a vplyv upravených dráh. Tieto tiež naznačujú, že pokiaľ ide o tok aj homeostázu produktu, syntetický okruh vždy prekoná nekontrolovanú dráhu (t. j. s konštantnými hladinami enzýmov), čím sa zdôrazňujú výhody použitia stratégie dynamickej spätnej väzby.
2. Nerozvetvená dráha pod reguláciou transkripčnej spätnej väzby
Uvažujeme o nerozvetvenej metabolickej dráhe ako na obrázku 2b, kde s0 označuje koncentráciu substrátu, s1 a s2 sú intermediárne metabolity a s3 je produktom metabolizmu. Metabolické reakcie prebiehajú rýchlosťou vi (každý katalyzovaný enzýmom s koncentráciou ei) a d označuje rýchlosť spotreby produktu bunkou.Metabolické gény sú kódované v jedinom operóne riadenom TF reagujúcim na produkt, ktorý potláča expresiu enzýmu. Tento druh transkripčnej spätnej väzby je bežný napríklad v bakteriálnych systémoch príjmu živín (napr. laktózový operón [21]) a metabolizme aminokyselín (napr. tryptofánový operón [20]). 
Obrázok 2. Generický model pre nerozvetvenú metabolickú dráhu pri transkripčnej represii z produktu. Enzýmy ei katalyzovať reakcie rýchlosťou via bunka spotrebuje produkt rýchlosťou d. Enzýmy sú kódované v operóne pod kontrolou jediného promótora, ktorý je potláčaný TF. (Online verzia vo farbe.)
2.1. Metabolická dráha
Sieť na obrázku 2 si vymieňa hmotu s prostredím a/alebo inými sieťami v bunke. Model počíta s touto interakciou prostredníctvom vstupného substrátu s0 a miera spotreby produktu d. Zaujímajú nás biologicky významné fenotypy, a preto to predpokladáme s0 je konštantná, aby sa zabezpečilo, že sieť môže dosiahnuť nenulový ustálený stav [24]. Všimnite si, že ak sa substrát časom rozpadne, sieť nakoniec dosiahne nulovú rovnováhu, čím sa substrát, medziproduktové metabolity a produkt úplne vyčerpajú. Konštantný predpoklad substrátu je vhodný aj pre scenáre, kde s0 je zásoba extracelulárnych substrátov zdieľaná populáciou buniek s nízkou hustotou (takže účinky kompetície medzi bunkami sú zanedbateľné).
V ceste s n reakcie a n metabolitov, rýchlosť zmeny koncentrácií metabolitov možno opísať pomocou
Miera spotreby produktu d(sn) je typicky modelovaná ako saturovateľná funkcia typu Michaelis-Menten [20], ale pre všeobecnosť budeme uvažovať o generickej saturovateľnej funkcii. d(sn) uspokojujúce d(0) = 0 a (porovnaj predpoklady (2.3) a (2.4) pre miery obratu). Bunkový dopyt po produkte závisí od koncentrácie enzýmu katalyzujúceho produkt (ktorý nie je explicitne modelovaný v (2.1)). Pre typickú kinetiku spotreby, ako je Michaelis-Menten alebo Hillova rovnica, maximálna miera spotreby dmax je úmerná koncentrácii enzýmu, a preto v našom modeli môžeme opísať zmeny v bunkovom dopyte ako zmeny parametra dmax.
2.2. Syntetický génový obvod
V architektúre operónov sú všetky enzýmy riadené jedným promótorom (prípad s viacerými promótormi pozri [26]), a preto modelujeme expresiu katalytických enzýmov ako
— Charakteristika promótora. Popisuje regulačný účinok TF na génovú transkripciu. Funkcia závisí od špecifických molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom interakcií produkt-TF a TF-promótor. Aby sme zachovali všeobecný popis regulačného účinku a parametrizovali model z hľadiska experimentálne dostupných parametrov návrhu, volíme fenomenologický popis charakteristiky promótora. Preto uvažujeme funkciu, ktorá priamo závisí od koncentrácie produktu a predstavuje čistý účinok produktu na rýchlosť transkripcie. Génová transkripcia pod pôsobením represívneho promótora sa typicky modeluje pomocou Hillových funkcií, ale aby bola analýza všeobecná, považujeme generické funkcie represie transkripcie za uspokojivé. σ(0) = 1 a . 
Obrázok 3. Laditeľné gombíky v ovládacom obvode syntetického operónu. (a) Charakteristika promótora a sily RBS modulujú rýchlosť transkripcie a translácie génu (symboly sú opísané v legende na obrázku 2). (b) Sigmoidálna charakteristika represívneho promótora. (Online verzia vo farbe.)
Promótory sú typicky opísané z hľadiska ich tesnosť (κ 0) a silu (κ 1) pozri obrázok 3b. Tesnosť sa vzťahuje na úroveň základnej transkripcie (t. j. pri úplnej represii produktom), zatiaľ čo sila je rozdiel medzi ON a OFF úrovňami transkripcie. Sila promótora sa kvantifikuje v zmysle dynamický rozsahμ,
— Sily väzbového miesta ribozómu. RBS sú sekvencie mRNA, ktoré sú viazané ribozómami na spustenie translácie [10]. Rýchlosť translácie enzýmov sa potom môže modifikovať výberom sekvencií RBS s rôznymi afinitami k väzbe na ribozómy [28]. Modelujeme vplyv silných stránok RBS na rýchlosť expresie enzýmu prostredníctvom parametrov bi.
S vyššie uvedenými predpokladmi a definíciami môžeme napísať kompletný model pre systém spätnej väzby ako
3. Návrh obvodu pre bunkové požiadavky
3.1. Kompromisy a obmedzenia pri navrhovaní sily väzbových miest ribozómov
Okruh operónu musí byť schopný udržať metabolický tok, ktorý dodáva produkt do následných prirodzených procesov hostiteľa. V tejto časti ukážeme, ako sa táto základná požiadavka premieta do obmedzení priestoru návrhu pevnosti RBS.
Koncentrácie metabolitov v ustálenom stave, koncentrácie enzýmov a reakčné rýchlosti budeme označovať ako , resp. Najprv si všimneme, že koncentrácie enzýmov v rovnovážnom stave možno získať nastavením v (2.7), čo vedie k
Rovnovážne koncentrácie medziproduktov možno získať nastavením pre i ≥ 2,
— Účinok charakteristiky promótora. Z rovnice ustáleného stavu v (3.2) môžeme vypočítať (pozri prílohu A.1 pre podrobné odvodenie) citlivosť koncentrácie produktu na zmeny tesnosti promótora. κ 0, sila promótora κ 1 alebo sila RBS b1,
— Vplyv silných stránok RBS. Pomocou (3.1) môžeme zapísať ustálený stav downstream enzýmov ako
Vo vyššie uvedenej diskusii sme implicitne predpokladali, že riešenie rovníc (3.2) a (3.3) existuje. Avšak kvôli saturovateľnej charakteristike miery spotreby produktu (d) a kinetika enzýmov (gi), obom rovniciam môže chýbať riešenie. Po prvé, riešenie (3.2) možno vypočítať ako priesečník dvoch kriviek znázornených na obrázku 4. Z týchto grafov môžeme vidieť, že priesečník existuje iba vtedy, keď dmax/g1(s0 ) > b1κ 0 /γalebo ekvivalentne
Obrázok 4. Existencia metabolického toku, produktu a koncentrácie prvého enzýmu. (a) Riešenie rovnice v ustálenom stave (3.2) možno vidieť ako priesečník dvoch kriviek, h1(X) = d(x)/g1(s0) a h2(X) = b1(κ 0 + κ 1 σ(X))/γ. (b) Priesečník neexistuje, keď podmienka (3.9) zlyhá.
Po druhé, keďže rýchlosť premeny enzýmu sa nasýti pri , rovnica (3.3) má konečné riešenie za predpokladu, že
ktorý definuje obmedzenie na bi/b1 pomer. Celkovo vzaté, podmienky (3.9) a (3.10) definujú realizovateľný región v priestore návrhu silných stránok RBS, ktorý zabraňuje akumulácii medziproduktov a produktu (obrázok 5b). Ak nie je splnená podmienka v (3.9), substrát bude spotrebovaný vyššou rýchlosťou ako je maximálna spotreba produktu, a preto návrh povedie k nekonečnému hromadeniu produktu. Podobne porušenie aspoň jednej z hraníc v (3.10) spôsobí enzymatickú saturáciu a povedie k nekonečnej akumulácii medziproduktu.
Obrázok 5. Navrhnite kompromisy a obmedzenia pre silné stránky RBS. (a) Dizajnový kompromis: nízka bi/b1 pomer poskytuje nízke hladiny enzýmov v ustálenom stave a vysoké stredné hladiny v ustálenom stave, zatiaľ čo vysoké pomery zvyšujú koncentrácie enzýmov v prospech nižších koncentrácií medziproduktov. (b) Konštrukčné obmedzenie: realizovateľná oblasť RBS bráni hromadeniu medziproduktov a produktov, oblasť je definovaná podmienkami (3.9) a (3.10). (c) Prísnejšie promótory zväčšujú realizovateľný región, zatiaľ čo (d) netesnejšie promótory alebo vyššie koncentrácie substrátu sprísňujú obmedzenia. (Online verzia vo farbe.)
Podmienky (3.9) a (3.10) spájajú genetické a metabolické parametre (sila RBS bi a tesnosť promótora κ 0 spolu s dostupnosťou substrátu s0 a saturácia enzýmu ), a preto objasňujú, ako sa objavujú konštrukčné obmedzenia v dôsledku súhry medzi metabolickou a dynamikou expresie enzýmov. Na obrázku 5c,d, ilustrujeme vplyv tesnosti promótora a dostupnosti substrátu na uskutočniteľnú oblasť pre sily RBS. Silnejšie promótory uvoľňujú stav (3.9), a preto zväčšujú realizovateľnú oblasť (obrázok 5c). V limitnom prípade dokonalého promótora bez úniku (t.j. κ 0 = 0), podmienka (3.9) neobmedzuje silu RBS prvého enzýmu. Naopak, pri podmienkach (3.9) a (3.10) má vyšší substrát tendenciu utiahnuť realizovateľnú oblasť (obrázok 5d).
3.2. Adaptácia na zmeny bunkového dopytu
Jedným z účelov okruhu genetickej spätnej väzby je udržať fungovanie dráhy pri zmenách bunkového dopytu po produkte. Z hľadiska riadiaceho inžinierstva možno zmenu v bunkovom dopyte považovať za poruchový signál pôsobiaci na sieť. Užitočný prístup k štúdiu dynamických systémov pri poruchách spočíva v skúmaní ich lineárnej aproximácie okolo ich rovnovážnych bodov. Ak zapíšeme model (2.7) ako a vypočítame jeho jakobiovskú maticu ( ), potom trajektórie začínajúce v malej blízkosti ustáleného stavu možno aproximovať ako
V prípade spätnoväzbového systému v (2.7) môžeme využiť štruktúru Jacobiánskej matice na získanie analytických výrazov pre jej vlastné hodnoty v zmysle návrhových gombíkov génového obvodu (podrobnosti pozri v prílohe A.2). Zistili sme, že 2n vlastné hodnoty možno rozdeliť do troch kategórií λpevné, λRBSi a λstužková. Systém má nasledovné:
