Informácie

Prečo extrahovať DNA z určitých bielych krviniek namiesto celej krvi?

Prečo extrahovať DNA z určitých bielych krviniek namiesto celej krvi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

V mojom laboratóriu sa ľudská DNA extrahuje zo vzoriek celej krvi.

V skutočnosti extrakcie nerobím a nepoznám konkrétny protokol, ale chápem, že krvné doštičky a červené krvinky nemajú jadrá, a preto nemajú DNA, takže predpokladám, že izolácia bielych krviniek vzorky je súčasťou postup.

Tiež chápem, že rôzne typy bielych krviniek majú viaclaločné jadrá, ale neviem, ako to ovplyvňuje DNA, ktorá sa z nich dá extrahovať.

Videl som niekoľko dokumentov, napríklad tento: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15113441, uvádzajú, že extrahovali DNA zo špecifických typov bielych krviniek; v tomto prípade lymfocyty. Tieto dokumenty sa nezameriavajú na imunitnú funkciu, ani sa ňou nezaoberajú.

Prečo extrahovať DNA iba z jedného typu bielych krviniek?

Obsahujú lymfocyty DNA, ktorá viac reprezentuje genóm pacienta ako iné typy bielych krviniek?

Sú niektoré typy bielych krviniek ľahšie izolovateľné ako iné?

Je to len štandardný postup extrakcie DNA z krvi alebo existuje viacero možností na výber v závislosti od vašich výskumných cieľov?


Existuje niekoľko dôvodov, prečo by sa laboratórium mohlo rozhodnúť získať DNA z lymfocytov namiesto celej krvi. Generovanie genómovej DNA z plnej krvi nie je nevyhnutne najlepší nápad, pretože v určitom okamihu je potrebné zbaviť sa všetkého prebytočného proteínu (hlavne hemoglobínu z červených krviniek). Zúžením vášho vstupu len na bunky, ktoré majú DNA, znížite množstvo bielkovín, ktoré potrebujete extrahovať, v porovnaní s celkovým množstvom prítomnej DNA.

Lymfocyty zahŕňajú T bunky, B bunky a NK bunky a relatívne ľahko sa rýchlo čistia, najmä v laboratóriu s potrebnými skúsenosťami a činidlami/vybavením. Zďaleka nie sú jediným typom bielych krviniek, z ktorých by sa dala prečistiť DNA – použiť sa dajú napríklad aj mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC). Obsahujú lymfocyty, ako aj iné typy buniek, ako sú monocyty, makrofágy, dendritické bunky atď. (Podľa mojich skúseností je ich čistenie z plnej krvi ešte jednoduchšie ako len lymfocyty, pretože ide v podstate o jednokrokový protokol s niekoľkými premytiami Konečný výsledok je však rovnaký – DNA z lymfy by mala byť rovnaká ako DNA z PBMC, granulocytov alebo neutrofilov.

Každá somatická jadrová bunka v tele obsahuje "reprezentatívny" DNA, okrem niekoľkých špecializovaných typov buniek, ako sú T a B bunky, ktoré prechádzajú genómovým preskupením za vzniku receptorov T- a B-buniek, všetky bunky od jednotlivca obsahujú rovnakú sekvenciu genómovej DNA. Krv je pomerne ľahké získať od pacientov a účastníkov klinických štúdií, a preto je často zdrojom DNA pre štúdie namiesto, povedzme, kožných úderov alebo ústnych tampónov.


Metódy extrakcie genómovej DNA zo vzoriek plnej krvi: súčasné perspektívy

Abstrakt: Extrakcia deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) sa značne vyvinula, pretože bola pôvodne vykonaná v roku 1869. Je to prvý krok potrebný pre mnohé dostupné následné aplikácie používané v oblasti molekulárnej biológie. Vzorky plnej krvi sú jedným z hlavných zdrojov používaných na získanie DNA a existuje veľa rôznych protokolov na vykonanie extrakcie nukleových kyselín z takýchto vzoriek. Tieto metódy sa líšia od veľmi základných manuálnych protokolov až po sofistikovanejšie metódy zahrnuté v automatických protokoloch extrakcie DNA. Na základe širokej škály dostupných možností by bolo ideálne určiť tie, ktoré fungujú najlepšie z hľadiska nákladovej a časovej efektívnosti. Preskúmali sme históriu extrakcie DNA a najbežnejšie používané metódy extrakcie DNA zo vzoriek plnej krvi, pričom sme zdôraznili ich individuálne výhody a nevýhody. Hľadali sme aj súčasnú vedeckú literatúru, aby sme našli štúdie porovnávajúce rôzne metódy extrakcie nukleových kyselín, aby sme určili najlepšiu dostupnú voľbu. Na základe nášho výskumu sme zistili, že neexistuje dostatok vedeckých dôkazov na podporu jednej konkrétnej metódy extrakcie DNA zo vzoriek plnej krvi. Výber vhodnej metódy je stále procesom, ktorý si vyžaduje zváženie mnohých rôznych faktorov a je potrebný ďalší výskum na overenie rozhodnutí uskutočnených v zariadeniach po celom svete.

Kľúčové slová: extrakcia genómovej DNA, vzorky plnej krvi, extrakcia DNA na báze roztoku, extrakcia DNA na pevnej fáze, nákladová efektívnosť, časová efektívnosť

Štúdie ľudského zdravia v oblasti molekulárnej biológie vyžadujú použitie vzoriek deoxyribonukleovej kyseliny (DNA), ribonukleovej kyseliny (RNA) a proteínov. Úspešné využitie dostupných následných aplikácií bude ťažiť z použitia veľkého množstva a vysokokvalitnej DNA. Preto je extrakcia nukleových kyselín kľúčovým krokom v laboratórnych postupoch potrebných na vykonávanie ďalších aplikácií molekulárneho výskumu. Je nevyhnutné zvoliť vhodnú metódu extrakcie a pri hodnotení dostupných možností je potrebné vziať do úvahy niekoľko úvah. Môžu zahŕňať technické požiadavky, časovú efektívnosť, nákladovú efektívnosť, ako aj biologické vzorky, ktoré sa majú použiť, a požiadavky na ich odber a skladovanie. 1

Plná krv je jedným z mnohých rôznych dostupných zdrojov na získanie genómovej DNA (gDNA) a široko sa používa v zariadeniach po celom svete. Preto sa zameriame na protokoly extrakcie DNA pomocou vzoriek plnej krvi. Otázky týkajúce sa odberu, skladovania a ručnej manipulácie so vzorkami ľudskej plnej krvi sú mimo rozsahu tejto publikácie a nebudú zahrnuté. Sú však dôležité a mali by sa zvážiť, pretože by mohli potenciálne ovplyvniť výkon a úspech akejkoľvek zvolenej techniky extrakcie DNA.

Počiatočný vývoj techník extrakcie DNA

Friedrich Miescher bol prvým vedcom, ktorý izoloval DNA pri štúdiu chemického zloženia buniek. V roku 1869 použil leukocyty, ktoré odobral zo vzoriek na čerstvých chirurgických obväzoch, a vykonal experimenty na čistenie a klasifikáciu proteínov obsiahnutých v týchto bunkách. Počas svojich experimentov identifikoval novú látku v jadrách, ktorú nazval “nukleín”. 2 Potom vyvinul dva protokoly na oddelenie bunkových jadier od cytoplazmy a na izoláciu tejto novej zlúčeniny, dnes známej ako DNA, ktorá sa líšila od proteínov a iných bunkových látok. Toto vedecké zistenie spolu s použitými izolačnými protokolmi bolo publikované v roku 1871 v spolupráci s jeho mentorom Felixom Hoppe-Seylerom. 2,3 Avšak až v roku 1958 Meselson a Stahl 3,4 vyvinuli rutinný laboratórny postup na extrakciu DNA. Vykonali extrakciu DNA z bakteriálnych vzoriek Escherichia coli použitím protokolu centrifugácie s gradientom hustoty soli. Odvtedy boli techniky extrakcie DNA prispôsobené na vykonávanie extrakcií z mnohých rôznych typov biologických zdrojov.

Metódy extrakcie DNA sledujú niektoré bežné postupy, ktorých cieľom je dosiahnuť efektívne rozrušenie buniek, denaturáciu nukleoproteínových komplexov, inaktiváciu nukleáz a iných enzýmov, odstránenie biologických a chemických kontaminantov a nakoniec precipitáciu DNA. Väčšina z nich sa riadi podobnými základnými krokmi a zahŕňa použitie organických a neorganických činidiel a metód odstreďovania. Nakoniec sa vyvinuli do rôznych automatizovaných postupov a komerčne dostupných súprav. 1,5𔃅

Najprv budeme diskutovať o protokoloch a krokoch zameraných na dosiahnutie bunkovej lýzy, inaktivácie bunkových enzýmov, denaturácie bunkových komplexov a precipitácie DNA, ktoré si vyžadujú podobné postupy a/alebo činidlá počas extrakcie DNA zo vzoriek plnej krvi. Kľúčové rozdiely v krokoch zameraných na odstránenie biologických a chemických kontaminantov budú zdôraznené, keď budeme podrobne diskutovať o každom protokole.

Ako už bolo uvedené, lýza buniek je bežným krokom vo väčšine protokolov extrakcie DNA a bežne sa dosahuje použitím detergentov a enzýmov. Dodecylsulfát sodný (SDS) a Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) sú príklady populárnych detergentov používaných na solubilizáciu bunkových membrán. Enzýmy sa tiež kombinujú s detergentmi na zacielenie na bunkový povrch alebo cytosolické zložky. Proteináza K je bežne používaný enzým používaný v rôznych protokoloch na štiepenie glykoproteínov a inaktiváciu RNáz a DNáz. Iné denaturanty, ako je močovina, guanidíniové soli a chemické chaotropy, sa tiež použili na rozrušenie buniek a inaktiváciu bunkových enzýmov, ale tieto môžu mať vplyv na kvalitu a výťažok nukleových kyselín. 1,7𔃇

Precipitácia DNA sa dosiahne pridaním vysokých koncentrácií soli do roztokov obsahujúcich DNA, pretože katióny zo solí, ako je octan amónny, pôsobia proti odpudzovaniu spôsobenému negatívnym nábojom fosfátového hlavného reťazca. Zmes DNA a solí v prítomnosti rozpúšťadiel, ako je etanol (konečné koncentrácie 70%󈞼%) alebo izopropanol (konečné koncentrácie 40%󈞞%), spôsobuje vyzrážanie nukleových kyselín. Niektoré protokoly zahŕňajú premývacie kroky 70% etanolom na odstránenie nadbytočnej soli z DNA. Nakoniec sa nukleové kyseliny resuspendujú vo vode alebo TE pufri (10 mM Tris, 1 mM kyselina etyléndiamíntetraoctová [EDTA]). 7𔃇 TE pufer sa bežne používa na dlhodobé uchovávanie DNA, pretože zabraňuje jej poškodeniu nukleázami, neadekvátnym pH, ťažkými kovmi a oxidáciou voľnými radikálmi. Tris poskytuje bezpečné pH 7𔃆 a EDTA chelátuje dvojmocné ióny používané pri nukleázovej aktivite a pôsobí proti oxidačnému poškodeniu ťažkými kovmi. 9

Hlavné typy metód extrakcie DNA zo vzoriek plnej ľudskej krvi

Tabuľka 1 ukazuje hlavné kategórie a podkategórie metód extrakcie DNA zo vzoriek plnej krvi, ktoré sa všeobecne používajú vo výskumných zariadeniach na celom svete. Laboratórne činidlá bežne používané pre každý stupeň protokolu extrakcie nukleových kyselín sú zahrnuté v tejto tabuľke, aby sa zdôraznili podobnosti a rozdiely medzi nimi.

Techniky extrakcie DNA zahrnuté v tabuľke 1 budú podrobnejšie diskutované v nasledujúcich častiach spolu so stručným zhrnutím histórie a pozadia techniky. V posledných rokoch boli niektoré z týchto protokolov prispôsobené mikrozariadeniam, ktoré vyvíjajú miniaturizované systémy celkovej chemickej analýzy alebo mikrofluidné mikročipy genetickej analýzy. 7,10 Rozsah nášho prehľadu však obmedzíme na tie techniky, ktoré sú k dispozícii na extrakciu nukleových kyselín v makromeradle.

Tabuľka 1 Metódy extrakcie DNA bežne používané na extrakciu zo vzoriek plnej krvi
Skratky: DNA, deoxyribonukleová kyselina N/A, neaplikovateľná SDS, dodecylsulfát sodný.

Metódy extrakcie DNA na báze roztoku

Ako už bolo uvedené, protokoly založené na roztoku majú dva hlavné prístupy: 1) metódy založené na roztoku s použitím organických rozpúšťadiel a 2) metódy založené na technike vysolovania. Nasleduje ďalší popis oboch metód.

Metódy extrakcie DNA založené na roztoku s použitím organických rozpúšťadiel

Protokoly extrakcie DNA s použitím organických rozpúšťadiel pôvodne odvodených zo série príbuzných metód extrakcie RNA. Niektoré z hlavných krokov používaných v týchto metódach sú: 1) bunková lýza uskutočnená pridaním detergentu/roztoku obsahujúceho chaotropikum, vrátane SDS alebo N-lauroylsarkozínu 2) inaktivácia DNáz a RNáz, zvyčajne pomocou organických rozpúšťadiel 3) purifikácia DNA a odstránenie RNA, lipidov a proteínov a 4) resuspendovanie extrahovaných nukleových kyselín. 1,5,11

Táto metóda bola pôvodne vyvinutá v roku 1977, keď Ullrich a kol. 12 použili na izoláciu plazmidovej DNA techniku ​​extrakcie RNA s použitím guanidium izotyokyanátu. Táto technika bola neskôr modifikovaná Chirgwinom a kol. 13 v roku 1979. Vyžadovala si použitie guanidiumtiokyanátu a dlhé hodiny ultracentrifugácie cez vankúšik chloridu cézneho. V snahe zlepšiť túto metódu vyvinuli Chomczynski a Sacchi 14,15 v roku 1987 protokol na extrakciu RNA s použitím guanidiumtiokyanatanu–fenol–chloroformu a oveľa kratšieho odstreďovania. Tento posledný protokol extrakcie RNA dokázal izolovať RNA, DNA a proteíny, ale aby sa dal použiť ako technika extrakcie DNA, guanidiumtiokyanát–fenol–chloroform bol neskôr nahradený zmesou fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu. predchádzajúce rozpúšťadlo úplne neinhibovalo aktivitu RNázy. 11 Fenol je kyselina karbolová, ktorá rýchlo denaturuje proteíny, ale je vysoko žieravá, toxická a horľavá. Toto organické rozpúšťadlo sa zvyčajne pridáva do vzorky a potom sa pomocou odstredivej sily získa dvojfázová emulzia. Horná hydrofilná vrstva obsahuje zriedenú DNA a spodná hydrofóbna vrstva sa skladá z organických rozpúšťadiel, bunkových zvyškov, proteínov a iných hydrofóbnych zlúčenín. DNA sa potom po odstredení vyzráža pridaním vysokých koncentrácií soli, ako je octan sodný, a etanolu alebo izopropanolu v pomeroch 2:1 alebo 1:1. Nadbytočná soľ sa môže odstrániť pridaním 70 % etanolu a vzorka sa potom centrifuguje, aby sa zozbierala peleta DNA, ktorá sa môže resuspendovať v sterilnej destilovanej vode alebo TE pufri (10 mM Tris 1 mM EDTA pH 8,0). 1,5

Pretože tieto techniky zahŕňajú použitie toxických a korozívnych organických rozpúšťadiel, bezpečnosť je hlavným problémom. Vyžadujú sa osobné ochranné prostriedky, bezpečnostné opatrenia zahŕňajúce používanie digestora a školenia. Fenol–chloroform je potrebné ekvilibrovať na primerané pH a podmienky protokolu by sa mali optimalizovať. 7 V snahe zlepšiť bezpečnosť a jednoduchosť používania týchto protokolov boli zavedené určité úpravy, aby sa zabránilo fyzickému kontaktu s rozpúšťadlami. Tieto zahŕňajú začlenenie silikagélového polyméru 16 alebo nahradenie rozpúšťadiel inými látkami, ako je benzylalkohol. 17

Metódy extrakcie DNA založené na roztoku s použitím vysolovania

V priebehu rokov boli vyvinuté aj niektoré techniky extrakcie nukleových kyselín, ktoré sa vyhýbajú použitiu organických rozpúšťadiel. 1,6,11 V roku 1988 Miller a kol. 18 publikovali protokol, ktorý dosiahol purifikáciu DNA precipitáciou proteínov pri vysokej koncentrácii soli. Tradičný protokol zahŕňa počiatočné rozrušenie buniek a štiepenie proteínázou K SDS–, po ktorom nasleduje pridanie vysokých koncentrácií solí, zvyčajne 6 M chloridu sodného. Zmes sa potom centrifuguje, aby sa proteíny vyzrážali na dne, pričom supernatant obsahujúci DNA sa potom prenesie do novej liekovky. DNA sa potom vyzráža s použitím etanolu alebo izopropanolu rovnakým spôsobom, ako je opísané pre metódy organického rozpúšťadla. 1,18󈞀

Použitie proteinázy K však môže byť časovo náročné a drahé v porovnaní s inými činidlami používanými v rôznych prístupoch založených na roztokoch, takže sa uskutočnilo niekoľko pokusov nájsť alternatívne činidlá na deproteinizáciu DNA. 21󈞄 V roku 1991 Lahiri a Nurnberger 21 vyvinuli protokol extrakcie DNA zo vzoriek krvi, ktorý eliminoval použitie organických rozpúšťadiel a predĺženú inkubáciu s proteinázou K. Ich protokol používal Nonidet™ P-40 (NP-40 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) na lýzu krvných buniek a pufrov s vysokým obsahom solí a 10% SDS na inaktiváciu a odstránenie kontaminantov. Ďalším protokolom je modifikovaná metóda vysolovania publikovaná v roku 2005 Nasirim et al, 25 ktorá nahradila štiepenie proteinázou K použitím pracieho prášku. Táto modifikovaná technika bola úspešne použitá ako protokol extrakcie DNA v mnohých zariadeniach po celom svete. 26󈞎

Metódy extrakcie DNA na pevnej fáze

Čistenie DNA pomocou prístupu kvapalina/pevná fáza možno vysledovať do roku 1979, keď Vogelstein a Gillespie 35 použili vo svojom protokole oxid kremičitý vo forme skleneného prášku na čistenie fragmentov DNA, ktoré boli predtým oddelené elektroforézou na agarózovom géli. Metódy extrakcie DNA na tuhej fáze zo vzoriek krvi pôvodne opísal v roku 1989 McCormick, 36 ktorý publikoval techniku ​​využívajúcu nerozpustné častice na báze kremíka, chemicky podobné fenolu, ktoré interagujú s proteínmi a umožňujú čistenie DNA. Odvtedy sa vyvinulo množstvo rôznych postupov využívajúcich prístup extrakcie DNA kvapalina/pevná látka, ktoré sa používajú vo väčšine komerčne dostupných extrakčných súprav.

Tieto techniky budú absorbovať DNA za určitých podmienok pH a obsahu soli prostredníctvom ktoréhokoľvek z nasledujúcich princípov: 1) vodíková väzba v prítomnosti chaotropného činidla na hydrofilnú matricu, 2) iónová výmena s použitím aniónomeniča vo vodných podmienkach a 3) afinitné a veľkostné vylučovacie mechanizmy. 5,7 Väčšina týchto metód sleduje sériu podobných krokov, aby sa dosiahlo rozrušenie buniek, adsorpcia DNA, premytie nukleových kyselín a konečná elúcia. Väčšina techník na pevnej fáze využíva rotačnú kolónu na viazanie nukleovej kyseliny pod odstredivou silou. Rotačné kolóny sú vyrobené z matríc oxidu kremičitého, sklenených častíc alebo prášku, kremeliny alebo aniónomeničových nosičov a tieto zlúčeniny je vo všeobecnosti potrebné upraviť pomocou tlmivých roztokov pri špecifickom pH, aby sa premenili na požadovanú chemickú formu. Krvné bunky predtým degradované s použitím konkrétnych lyzačných pufrov sa aplikujú na kolóny a odstredia sa a DNA sa naviaže na kolónu za pomoci podmienok pH a koncentrácie solí, ktoré poskytujú väzbové roztoky. Niektoré proteíny a iné biochemické zlúčeniny sa môžu tiež viazať na kolónu a neskôr sa odstránia pomocou premývacích pufrov obsahujúcich kompetitívne činidlá počas série premývacích krokov. DNA sa nakoniec eluuje v sterilnej destilovanej vode alebo TE pufri. 1,5,7

Metódy extrakcie DNA využívajúce oxid kremičitý a kremičité matrice

Silikátové matrice majú jedinečné vlastnosti pre väzbu DNA. Sú pozitívne nabité a majú vysokú afinitu k negatívnemu náboju kostry DNA. Vysoké soľné podmienky a pH sa dosahujú použitím sodných katiónov, ktoré sa pevne viažu na negatívne nabitý kyslík vo fosfátovej kostre DNA. Kontaminanty sa odstránia sériou premývacích krokov, po ktorých nasleduje elúcia DNA pri nízkej iónovej sile (pH 𕟹) s použitím TE pufra alebo sterilnej destilovanej vody. Komerčne dostupné súpravy využívajúce prístup na báze oxidu kremičitého vyrába Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA (NucleoSpin™) MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA (UltraClean ® BloodSpin ® ) QIAGEN Pty Ltd, Victoria, Austrália (QIAamp ®), Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA (Wizard ®) Epoch Life Science, Missouri City, TX, USA (EconoSpin ®) a Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA (GenElute™), okrem iného. V týchto protokoloch sa vzorky krvi inkubujú niekoľko minút s lyzačným pufrom. Väčšina protokolov trvá približne 40 minút až 1 hodinu, kým sa dokončí, čím sa získajú vysoké výťažky DNA s minimálnou kontamináciou. 1,5,7

Látka, ktorá obsahuje vysoké množstvo oxidu kremičitého (až 94%) známa ako kremelina, diatomit alebo kremelina, sa tiež použila na čistenie DNA. Pôvodne ho opísal Boom et al 8 v roku 1990. Viaže DNA v prítomnosti chaotropných činidiel, nasleduje premytie tlmivým roztokom obsahujúcim alkohol a nakoniec sa DNA eluuje v tlmivom roztoku s nízkym obsahom soli alebo v sterilnej destilovanej vode. Quantum Prep ® (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) je príkladom produktu extrakcie DNA vyvinutého pomocou kremeliny. 7

Súpravy na extrakciu DNA sa tiež vyvinuli a sú začlenené do polo- a plne automatizovaných zariadení schopných vykonávať protokoly od lýzy vzorky až po niektoré následné aplikácie, ako je polymerázová reťazová reakcia (PCR), ako sú BioRobot EZ1 ® Advanced (QIAGEN) a Biomek ® 4000 Laboratory Automation Workstation (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Medzi výhody týchto zariadení patrí menšie riziko chyby pri pipetovaní, znížený počet prenosov vzoriek a kratší protokolový čas. Mali by sa však starostlivo zvážiť vzhľadom na vysoké náklady na niektoré dostupné možnosti vybavenia. Boli tiež začlenené do miniaturizovaných systémov celkovej chemickej analýzy, ktorými sú silikónové mikročipy, kde sa dosahuje separácia a detekcia purifikácie DNA. 7

Extrakcia DNA pomocou anexových živíc

Pozitívne nabité chemické látky schopné viazať sa na negatívne nabité nukleové kyseliny alebo kontaminanty alebo enzýmy, ako sú nukleázy, sa nazývajú aniónomeničové živice a používajú sa aj ako súčasť protokolov extrakcie DNA zo vzoriek krvi. 9

Živica Chelex ® 100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) je vyrobená z kopolymérov styrénu a divinylbenzénu, ktoré obsahujú párové iminodiacetátové ióny. Používa sa v protokoloch extrakcie DNA ako chelatačná iónomeničová živica, ktorá viaže polyvalentné ióny kovov, ako sú nukleázy bežne používané pri extrakcii DNA z forenzných vzoriek. Počiatočný laboratórny protokol, využívajúci krv ako biologický zdroj, opísal Walsh a kol. 37 v roku 1991. Na základe tohto počiatočného prístupu boli vyvinuté ďalšie protokoly na uskutočnenie extrakcie nukleovej kyseliny zo vzoriek plnej krvi. Vyžadujú malé objemy vzoriek (pod 1 ml krvi) a zvyčajne sa vykonávajú v jednej skúmavke s rôznymi krokmi a použitými činidlami. Vzorky krvi mohli byť lyzované pomocou proteinázy K a/alebo inkubáciou pri vysokej teplote a odstránenie kontaminantov sa dosiahlo pridaním živice Chelex ® 100, ktorá ich vyzráža. Získa sa jednovláknová DNA, ktorá zostane suspendovaná v supernatante, ktorý sa môže okamžite použiť v následnej aplikácii alebo sa môže preniesť do novej liekovky na dlhodobé skladovanie. 37󈞓

Seligson a kol. 40 použili materiály na výmenu aniónov ako súčasť svojho vynálezu na izoláciu vzoriek nukleových kyselín z rôznych zdrojov, vrátane vzoriek plnej krvi. Protokol Seligsona a spol. používa kolónu obsahujúcu živicu s kladne nabitými skupinami dietylaminoetylcelulózy na jej povrchu na viazanie záporne nabitých fosfátov hlavného reťazca DNA. Sila väzby DNA na kolónu, ako aj RNA a iné nečistoty, sa môžu meniť pomocou koncentrácií solí a podmienok pH pufrov použitých v tomto protokole na izoláciu nukleových kyselín. Kontaminanty, ako je proteín a RNA, sa môžu z kolóny obsahujúcej DNA vymyť pomocou pufrov so strednými soľami. 5,40

Metódy extrakcie DNA pomocou magnetických guľôčok

Techniky extrakcie nukleových kyselín využívajúce magnetickú separáciu sa objavujú od začiatku 90. rokov 20. storočia. Pôvodne ich použili na extrakciu plazmidovej DNA z lyzátov bakteriálnych buniek Hawkins a kol. 41 v roku 1994 a v roku 2006 Saiyed a kol., 42,43, ktorí vyvinuli a overili protokol využívajúci nanočastice magnetických nanočastíc na extrakciu genómovej DNA zo vzoriek plnej krvi.

Magnetické častice sú vyrobené z jedného alebo niekoľkých magnetických jadier, ako je magnetit (Fe3O4) alebo maghemit (gama Fe2O3), potiahnutých matricou z polymérov, oxidu kremičitého alebo hydroxyapatitu s koncovými funkcionalizovanými skupinami. V protokole vyvinutom Saiyedom a spol. sa 42,43 30 μ l plnej krvi zmieša s rovnakým objemom 1% (hmotnosť/objem [w/v]) roztoku SDS. Skúmavka sa premieša prevrátením dvakrát alebo trikrát a inkubuje sa pri teplote miestnosti počas 1 minúty. Do tejto zmesi sa pridá 10 mikrolitrov magnetických nanočastíc, potom sa pridá 75 μl väzbového pufra (1,25 M chlorid sodný a 10 μ37 polyetylénglykol 6000). Roztok sa premieša prevrátením a nechá sa odpočívať 3 minúty pri teplote miestnosti a magnetická peleta sa imobilizuje pomocou externého magnetu, aby sa odstránil supernatant. Magnetická peleta sa premyje 70% etanolom a suší sa. Magnetická peleta sa resuspenduje v 50 ± 956 1 TE pufra a magnetické častice naviazané na DNA sa eluujú inkubáciou pri 65 °C 176 °C za stáleho miešania. 42,43

Výber vhodného protokolu

Ideálna metóda extrakcie by mala spĺňať nasledujúce kritériá: mala by byť citlivá, konzistentná, rýchla a ľahko použiteľná av závislosti od krajiny, v ktorej sa používa, môže byť dôležité minimalizovať špecializované vybavenie alebo biochemické znalosti. Malo by tiež predstavovať minimálne riziko pre používateľov, ako aj zabrániť možnej krížovej kontaminácii vzoriek. Nakoniec, a čo je najdôležitejšie, zvolená technika extrakcie DNA by mala byť schopná dodať čisté vzorky DNA pripravené na použitie v následných molekulárnych aplikáciách. 7,8,44

Kvalita a množstvo genómovej DNA extrahovanej zo vzoriek krvi je kľúčovou vlastnosťou, ktorú väčšina zariadení zvažuje pri výbere protokolu. Meranie absorbancie ultrafialového svetla pomocou spektrofotometrie pri rôznych vlnových dĺžkach (230 nm, 240 nm, 260 nm a 280 nm) je počiatočný rýchly a účinný spôsob stanovenia čistoty a koncentrácie vzoriek nukleových kyselín. Koncentrácia sa zvyčajne vypočítava z odčítania absorbancie DNA pri 260 nm pomocou Beer–Lambertovho zákona. Čistota vzoriek nukleových kyselín sa hodnotí v pomere absorbancie 260/280 a hodnoty v rozsahu 1,8𔃀,0 sa všeobecne považujú za prijateľné. Pomery absorbancie 260/230 medzi 2,0 a 2,2 sa tiež považujú za primerané ako sekundárne meranie čistoty DNA. 11,45󈞛

Lahiri et al 44 publikovali štúdiu v roku 1991, v ktorej porovnávali desať metód extrakcie DNA na báze roztoku s použitím plnej krvi ako zdroja. Porovnali protokol, ktorý predtým vyvinula ich skupina (metóda 10a a 10b), 21 ktorý nevyžadoval žiadne použitie organických rozpúšťadiel ani štiepenie enzýmami, s deviatimi ďalšími metódami, ktoré boli predtým publikované a používané na extrakciu DNA z krvi. Vo svojej štúdii Lahiri et al 44 extrahovali vzorky plnej krvi od piatich jedincov v troch vyhotoveniach pomocou vyššie uvedených metód. Stanovili koncentráciu DNA zo vzoriek pomocou spektrofotometrického odčítania absorbancie pri 260 nm a kvalitu hodnotili pomocou pomeru absorbancie 260/280 a elektroforézou na agarózovom géli, ako aj obmedzením štiepenia enzýmom a Southern blotom. Súhrn niektorých funkcií protokolu, ako aj zistení, je uvedený v tabuľke 2.

Tabuľka 2 Súhrn porovnávacej štúdie metód extrakcie DNA od Lahiriho et al 44
Skratky: DNA, deoxyribonukleová kyselina RNáza, ribonukleová kyselina.

Všetky testované protokoly boli schopné izolovať DNA s relatívne dobrou čistotou (pomery 260/280 od 1,7 do 1,94), ale DNA získaná metódami 2, 5 a 6 vykazovala rôzne množstvá degradácie preukázané gélovou elektroforézou. Sedem z testovaných protokolov, metódy 3𔃇, vyžadovalo použitie organických rozpúšťadiel a/alebo nebezpečných látok, ako je fenol–chloroform alebo chloroform. Metódy 1 a 2 nepoužívali organické zlúčeniny, ale metóda 1 bola časovo najnáročnejšia. Vyžadovalo si to inkubáciu cez noc s proteinázou K, problém vyriešený v protokole 2 inkubáciou vzoriek počas 30 minút s proteinázou K aj RNázou A, čím sa skrátil čas extrakcie DNA na 5 hodín. Metóda 10 (verzia a a b) bola najrýchlejšia zo všetkých metód izolácie DNA (1 hodina) a odstránila štiepenie enzýmom a použitie organických rozpúšťadiel/nebezpečných látok. Obe verzie tohto protokolu boli schopné získať podobné alebo vyššie výťažky DNA ako ostatné testované protokoly s približne porovnateľnými pomermi 260/280. Na základe zistení štúdie Lahiri et al 44 boli schopní dospieť k záveru, že metóda extrakcie DNA, ktorú vyvinuli, bola najrýchlejšia a najbezpečnejšia z testovaných metód založených na riešení, pričom bola získaná DNA porovnateľnej kvality a množstva.

Abd El-Aal et al 48 porovnávali kombináciu manuálnych a automatických extrakčných metód na extrakciu DNA zo vzoriek plnej krvi. Ich štúdia zahŕňala šesť techník: purifikáciu fenol–chloroformom, extrakciu DNA pomocou mikrovlnného tepelného šoku, extrakciu DNA pomocou súpravy Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation), magnetickú separáciu (LC MagNA Pure Compact Instrument Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Nemecko) manuálne aj čiastočne automatizovali pomocou procesora Precision™ XS Microplate Sample od Biotek Instruments (Vermont, USA) a nakoniec upravili súpravu Wizard SV 96 Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation), pričom ju skombinovali s magnetickou separáciou pomocou purifikačnej metódy MagNA Pure. Odobrali 96 vzoriek krvi a použili 100 μL ako počiatočný objem. Neuviedli však, koľko vzoriek bolo extrahovaných pomocou každej metódy a počet vykonaných experimentálnych replikácií. Ich výsledky ukázali DNA extrahovanú pre každý protokol s konečnými koncentráciami v rozmedzí od 0,50 μg/μL do 0,98 μg/μL. Hoci fenol–chloroform, manuálna magnetická separácia a kombinovaná metóda Promega–MagNA Pure vykazovali relatívne podobné koncentrácie DNA (0,72𔂾,79 μg/μL), magnetická separácia a mikrovlnná technika dosiahli najvyššie a najnižšie koncentrácie DNA, 0,98 μg/μL a 0,50 μg/μL. Vo svojich porovnaniach stanovili päť kategórií pre jednoduchosť extrakcie: extrémne jednoduché, jednoduché, menej jednoduché, jednoduchšie a zložité, ale ich systém môže byť mätúci, pretože nedokázali prezentovať kritériá použité pre každú kategóriu. Avšak kategorizovali fenol–chloroform ako náročný a automatizovaný MagNA Pure ako extrémne jednoduchý, pomocou ich vyššie uvedeného systému kategórií. Majú tiež päť kategórií nákladov na každý protokol, pričom automatizovaná technika MagNA Pure je najdrahšia a mikrovlnná rúra je najlacnejšou metódou. Neboli definované ani ich kategórie nákladov a v ich štúdii nie je žiadna skutočná zmienka o konkrétnych nákladoch pre každú metódu. Na základe vyššie uvedených zistení dospeli k záveru, že magnetická separácia pomocou automatizovaného protokolu funguje najlepšie z hľadiska jednoduchosti extrakcie, čistoty extrahovanej DNA a rýchlosti, aj keď je to tá s najvyššími nákladmi. Dospeli tiež k záveru, že je nevyhnutné optimalizovať akúkoľvek zvolenú metódu a odporučili použitie magnetickej separácie, pretože vyžadovala minimálny počiatočný materiál a bola nákladovo efektívna a užívateľsky prívetivá. Ako však už bolo uvedené, nie je tam žiadna zmienka o tom, ako bola stanovená nákladová efektívnosť. 48

Lee et al 49 extrahovali DNA z 22 vzoriek plnej krvi pomocou troch automatizovaných extrakčných systémov. Všetky tri porovnávané protokoly boli založené na extrakčných technikách na pevnej fáze: QIAamp ® Blood Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Nemecko) s QIAcube ®, ktorý využíva kremičitú membránu a živice v rotačnej kolóne na viazanie DNA, a dva ďalšie protokoly, ktoré sú založené na technikách izolácie DNA na magnetickej báze MagNA Pure LC Nucleic Acid Isolation Kit I s MagNA Pure LC (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko) a Magtration-Magnazorb DNA Common Kit-200N s Magtration System 12GC (Precision System Science Co, Ltd, Tokio, Japonsko). Koncentrácia DNA bola meraná spektrofotometriou a čistota bola hodnotená pomerom 260/280, DNA elektroforézou na agarózovom géli a PCR. Na overenie výsledkov štúdie sa vykonala štatistická analýza a sú zhrnuté v tabuľke 3.

Tabuľka 3 Súhrn výsledkov z porovnávacej štúdie techník extrakcie DNA od Lee et al 49
Skratky: DNA, deoxyribonukleová kyselina min, minimum max, maximum SD, štandardná odchýlka.

Results showed no statistical difference between DNA concentrations obtained among the three commercial methods, but DNA purity was slightly lower for the Magtration-Magnazorb DNA Common Kit-200N when compared with the other two methods. DNA extracted was of similar quality based on results from PCR and electrophoresis on agarose gel. Therefore, they concluded that effectiveness for all systems was equivalent and that they all produced acceptable nucleic acid isolation. 49

Table 4 was adapted from a review published by Carpi et al 1 in 2011, where they reviewed DNA extraction methods used in a wide range of biological sources, including six methods used on whole blood samples. A summary of the three evaluated features for nucleic acid isolation methods, such as use of toxic compounds, cost per sample, and time required, is shown in Table 4.

Table 4 Summary of features evaluated for deoxyribonucleic acid (DNA) extraction methods reviewed by Carpi et al 1

Based on the methods included in Table 4, it can be noted that the magnetic bead-based method is the quickest DNA extraction protocol, requiring over 30 minutes to be performed, whereas all the other protocols require more than 3 hours. Also, the magnetic bead-based method is the most expensive one, costing more than ŭ per sample extracted. However, there is no mention in this review of the differences when comparing quality and quantity of nucleic acid isolated for each method. 1

Chacon-Cortes et al 50 evaluated cost-effectiveness and time efficiency of three available DNA extraction techniques from whole blood samples: a traditional salting out method, a modified salting out method, and a commercially available kit based on a solid-phase DNA extraction method QIAamp ® DNA blood maxi kits (QIAGEN ® Pty Ltd, Clifton Hill, VIC, Australia). The modified salting out protocol 25 replaced the sample overnight incubation step from the traditional salting out method, 18 required for contaminant removal using proteinase K, with the use of laundry detergent to reduce time of extraction to about 1 hour. Five microliters of whole blood from six breast cancer patients was manually extracted using each protocol, and techniques were compared in terms of quality and quantity of DNA extracted, as well as cost and time required. DNA quantity was measured using spectrophotometry, and DNA quality was assessed by both 260/280 ratio and agarose gel electrophoresis of PCR product. A summary of findings is presented in Table 5. 50

Table 5 Summary of results from comparative study of DNA extraction methods by Chacon-Cortes et al 50
Abbreviations: AUD, Australian dollars gDNA, genomic deoxyribonucleic acid.

As shown in Table 5, QIAGEN QIAamp DNA Blood Maxi Kits produced the highest yield and 260/280 ratio from all methods evaluated, with an average measure of 61.86 μg and 2.02, respectively, but traditional and modified salting out protocols both produced similar results in terms of DNA yield and 260/280 ratios. However, statistical analysis using analysis of variance showed that DNA yield and 260/280 ratio results were not significantly different for all three methods (P-value of 0.110 and 0.05, respectively). On the other hand, the traditional salting out method required an overnight incubation step, and the QIAGEN QIAamp DNA Blood Maxi Kit was the most expensive of all the methods included, costing about 12.30 Australian dollars, almost seven times the modified salting out protocol. Therefore, based on these findings, the modified salting out protocol developed by Nasiri et al 25 proved to be the most cost-effective and time-efficient technique to isolate gDNA from whole blood samples. 50 Unfortunately, no other solid-phase extraction methods for DNA extraction were included in this study.

DNA extraction has evolved for the past 145 years and has developed into a diversity of laboratory techniques. This review highlights the currently available methods for DNA extraction from whole blood samples, and it summarizes comparison studies using different nucleic acid extraction approaches published to date. DNA extraction has evolved from solution and solid-phase manual techniques initially performed manually into incorporating these into automated methods. There is no consensus on a gold standard method for DNA extraction from whole blood samples, and they all differ in many different aspects. Studies comparing extraction techniques and highlighting their strengths and weaknesses are limited, and to our knowledge there is no publication that evaluates all approaches in terms of all possible features. Therefore, it is very difficult to determine the best choice available. Facilities around the world usually choose a method based on the availability of equipment, samples, and reagents, as well as considering speed, extraction efficiency and quality, technical requirements, and cost, but based on our review findings there is not enough scientific evidence to support these choices.

The authors of this publication certify that there are no conflicts of interest with any financial or scientific organization regarding the material discussed in the manuscript.

Carpi FM, Di Pietro F, Vincenzetti S, Mignini F, Napolioni V. Human DNA extraction methods: patents and applications. Recent Pat DNA Gene Seq. 20115(1):1𔃅.

Dahm R. Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Dev Biol. 2005278(2):274�.

Holmes FL. Meselson, Stahl, and the Replication of DNA: A History of the Most Beautiful Experiment in Biology. New Haven, CT: Yale University Press 2001.

Meselson M, Stahl FW. The replication of DNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 195844(7):671�.

Tan SC, Yiap BC. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 20092009:574398.

Greene JJ, Rao VB, editors. Recombinant DNA Principles and Methodologies. 1. vyd. New York: Marcel Dekker, Inc. 1998.

Price CW, Leslie DC, Landers JP. Nucleic acid extraction techniques and application to the microchip. Lab Chip. 20099(17):2484�.

Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 199028(3):495�.

Herzer S. DNA purification. Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide. New York: John Wiley & Sons, Inc. 2001:167�.

Duarte GR, Price CW, Littlewood JL, et al. Characterization of dynamic solid phase DNA extraction from blood with magnetically controlled silica beads. Analyst. 2010135(3):531�.

Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.

Ullrich A, Shine J, Chirgwin J, et al. Rat insulin genes: construction of plasmids containing the coding sequences. Veda. 1977196(4296):1313�.

Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochémia. 197918(24):5294�.

Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987162(1):156�.

Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 20061(2):581�.

Thomas S, Tilzer L, Moreno R, Inventors. Use of silica gel for DNA extraction with organic solvents. US patent US 5175271. December 29, 1992.

Ness JV, Cimler BM, Rich B, Meyer J, Vermeulen NMJ, Inventors. Non toxic compositions and methods useful for the extraction of nucleic acids. US patent US 5393672. February 28, 1995.

Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 198816(3):1215.

Greene F, Balch C, Haller D, Morrow M. AJCC Cancer Staging Manual. 6th Ed. New York: Springer 2002.

Grimberg J, Nawoschik S, Belluscio L, McKee R, Turck A, Eisenberg A. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 198917(20):8390.

Lahiri DK, Nurnberger JI Jr. A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies. Nucleic Acids Res. 199119(19):5444.

Bahl A, Pfenninger M. A rapid method of DNA isolation using laundry detergent. Nucleic Acids Res. 199624(8):1587�.

Drabek J, Petrek M. A sugar, laundry detergent, and salt method for extraction of deoxyribonucleic acid from blood. Biomed Pap Med Fac Univ Palacký Olomouc Česká republika. 2002146(2):37󈞓.

Gaaib JN, Nassief AF, Al-Assi AH. Simple salting-out method for genomic DNA extraction from whole blood. Tikrit Journal of Pure Science. 201116(2):9󈝷.

Nasiri H, Forouzandeh M, Rasaee MJ, Rahbarizadeh F. Modified salting-out method: high-yield, high-quality genomic DNA extraction from whole blood using laundry detergent. J Clin Lab Anal. 200519(6):229�.

Arévalo-Herrera M, Soto L, Perlaza BL, et al. Antibody-mediated and cellular immune responses induced in naive volunteers by vaccination with long synthetic peptides derived from the plasmodium vivax circumsporozoite protein. Am J Trop Med Hyg. 201184(Suppl 2):35󈞖.

Garcia-Sepulveda C, Carrillo-Acuña E, Guerra-Palomares S, Barriga-Moreno M. Maxiprep genomic DNA extractions for molecular epidemiology studies and biorepositories. Mol Biol Rep. 201037(4):1883�.

Iri-Sofla FJ, Rahbarizadeh F, Ahmadvand D, Rasaee MJ. Nanobody-based chimeric receptor gene integration in Jurkat cells mediated by PhiC31 integrase. Exp Cell Res. 2011317(18):2630�.

Liu B, Zhang Y, Jin M, et al. Association of selected polymorphisms of CCND1, p21, and caspase8 with colorectal cancer risk. Mol Carcinog. 201049(1):75󈟀.

Liu H, Jiang X, Zhang M-W, et al. Association of CASP9, CASP10 gene polymorphisms and tea drinking with colorectal cancer risk in the Han Chinese population. J Zhejiang Univ Sci B. 201314(1):47󈞥.

Trejo-de la OA, Torres J, Pérez-Rodríguez M, et al. TLR4 single-nucleotide polymorphisms alter mucosal cytokine and chemokine patterns in Mexican patients with Helicobacter pylori-associated gastroduodenal diseases. Clin Immunol. 2008129(2):333�.

Wu Y, Jin M, Liu B, et al. The association of XPC polymorphisms and tea drinking with colorectal cancer risk in a Chinese population. Mol Carcinog. 201150(3):189�.

Zhang Y, Jin M, Liu B, et al. Association between H-RAS T81C genetic polymorphism and gastrointestinal cancer risk: a population based case-control study in China. BMC Cancer. 20088:256.

Zhang Y, Liu B, Jin M, et al. Genetic polymorphisms of transforming growth factor-⓵ and its receptors and colorectal cancer susceptibility: A population-based case-control study in China. Cancer Letters. 2009275(1):102�.

Vogelstein B, Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc Natl Acad Sci USA. 197976(2):615�.

McCormick RM. A solid-phase extraction procedure for DNA purification. Anal Biochem. 1989181(1):66󈞶.

Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechnika. 199110(4):506�.

DNA Analyst Training-Laboratory Training Manual Protocol 3.05 Chelex ® 100 Non Differential Extraction. National Forensic Science Technology Center 2006.

Butler JM. DNA Extraction from Forensic Samples Using Chelex. Cold Spring Harbor Protocols. 20094(6).

Seligson DB, Shrawder EJ, Inventors Syngene, Inc, assignee. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples. US patent 4,935,342. June 19, 1990.

Hawkins TL, O’Connor-Morin T, Roy A, Santillan C. DNA purification and isolation using a solid-phase. Nucleic Acids Res. 199422(21):4543�.

Saiyed ZM, Bochiwal C, Gorasia H, Telang SD, Ramchand CN. Application of magnetic particles (Fe3O4) for isolation of genomic DNA from mammalian cells. Anal Biochem. 2006356(2):306�.

Saiyed ZM, Ramchand CN, Telang SD. Isolation of genomic DNA using magnetic nanoparticles as a solid-phase support. J Phys Condens Matter. 200820(20):204153.

Lahiri DK, Bye S, Nurnberger JI Jr, Hodes ME, Crisp M. A non-organic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested. J Biochem Biophys Methods. 199225(4):193�.

Huberman JA. Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 and 280 nm. Biotechnika. 199518(4):636.

Troutman T, Prasauckas KA, Kennedy MA, Stevens J, Davies MG, Dadd AT. How to properly use and maintain laboratory equipment. Molecular Biology Problem Solver: New York: John Wiley & Sons, Inc. 2002:49�.

Sahota A, Brooks AI, Tischfield JA. Preparing DNA from Mammalian sources for genotyping. CSH Protoc. 20072007:pdb.top19.

Abd El-Aal AA, Abd Elghany NA, Mohamadin AM, El-Badry AA. Comparative study of five methods for DNA extraction from whole blood samples. International Journal of Health Science. 2010III(1):285�.

Lee J-H, Park Y, Choi JR, Lee EK, Kim H-S. Comparisons of three automated systems for genomic DNA extraction in a clinical diagnostic laboratory. Yonsei Med J. 201051(1):104�.

Chacon-Cortes D, Haupt L, Lea R, Griffiths L. Comparison of genomic DNA extraction techniques from whole blood samples: a time, cost and quality evaluation study. Mol Biol Rep. 201239:5961�.

/>This work is published and licensed by Dove Medical Press Limited. The full terms of this license are available at https://www.dovepress.com/terms.php and incorporate the Creative Commons Attribution - Non Commercial (unported, v3.0) License. By accessing the work you hereby accept the Terms. Non-commercial uses of the work are permitted without any further permission from Dove Medical Press Limited, provided the work is properly attributed. For permission for commercial use of this work, please see paragraphs 4.2 and 5 of our Terms.

© Copyright 2021 &býk Dove Press Ltd &bull software development by maffey.com &bull Web Design by Adhesion

The opinions expressed in all articles published here are those of the specific author(s), and do not necessarily reflect the views of Dove Medical Press Ltd or any of its employees.

Dove Medical Press is part of Taylor & Francis Group, the Academic Publishing Division of Informa PLC
Copyright 2017 Informa PLC. Všetky práva vyhradené. This site is owned and operated by Informa PLC ( “Informa”) whose registered office is 5 Howick Place, London SW1P 1WG. Registered in England and Wales. Number 3099067. UK VAT Group: GB 365 4626 36

In order to provide our website visitors and registered users with a service tailored to their individual preferences we use cookies to analyse visitor traffic and personalise content. You can learn about our use of cookies by reading our Privacy Policy. We also retain data in relation to our visitors and registered users for internal purposes and for sharing information with our business partners. You can learn about what data of yours we retain, how it is processed, who it is shared with and your right to have your data deleted by reading our Privacy Policy.

If you agree to our use of cookies and the contents of our Privacy Policy please click 'accept'.


A universal, rapid, and inexpensive method for genomic DNA isolation from the whole blood of mammals and birds

There is no ‘one’ procedure for extracting DNA from the whole blood of both mammals and birds, since each species has a unique property that require different methods to release its own DNA. Therefore, to obtain genomic DNA, a universal, rapid, and noncostly method was developed. A very simple biological basis is followed in this procedure, in which, when the blood is placed in water, it rapidly enters the RBCs by osmosis and causes cells to burst by hemolysis. The validity of extracting genomic DNA was confirmed by several molecular biological experiments. It was found that this method provides an efficient and versatile alternative for extracting bulk amounts of highly-qualified DNA from the blood of a wide range of species. This is the first manuscript that describes use of distilled water as the only eliminator of RBCs among all other known DNA extraction techniques.

Toto je ukážka obsahu predplatného, ​​prístup cez vašu inštitúciu.


Step 3: Some Protease.

Now that we've busted open the cells, they've spilled their guts all over the place in our saliva solution. in this step we try and get rid of as much of the protein part of those guts as we can.

A protease is a type of enzyme that can break down other enzymes. Meat tenderizer, pineapple juice, and soft contact lens cleaning solution all contain (different) proteases. A tiny bit of any of those should reduce the amount of protein that precipitates out with our DNA later on.


Option 1: Most Realistic Looking Blood Model

5A. To make a model that looks a bit more like blood than the below two models,

  • pour 1/2 cup of corn syrup into a clear plastic cup (or use a jar with a lid if you want the children to keep it). This will be the plasma.
  • Add a scant 1/2 cup of red Fruit Loops for the red blood cells. If you are doing this for a large group, you could instead use Cheerios dyed red.
  • Add 1 cotton ball for the white blood cell.
  • Add a sprinkle of Fruit Loop crumbs for the platelets.

YOU WILL NEED PER CHILD: 1 clear plastic cup or jar, 1 plastic spoon, 1/2 cup of corn syrup,scant 1/2 cup of red Fruit Loops or Cheerios dyed red, 1 cotton ball, and a sprinkle of Fruit Loop or Cheerio crumbs


The extraction of DNA is pivotal to biotechnology. It is the starting point for numerous applications, ranging from fundamental research to routine diagnostic and therapeutic decision-making. Extraction and purification are also essential to determining the unique characteristics of DNA, including its size, shape and function.

DNA was first isolated by the Swiss physician, Friedrich Miescher, in 1869 while working in the laboratory of the biochemist Felix Hoppe-Seyler. This he did as part of a project to determine the chemical composition of cells which he saw as the means to unravelling the fundamental principles of the life of cells. Initially, he began this research by using lymphocytes drawn from lymph nodes but was unable to get sufficient quantities for analysis so switched to using leucocytes, white blood cells, which he gathered from pus found on fresh surgical bandages collected from a nearby surgical clinic. In the course of his work on leucocytes he noticed the precipitation of a substance when acid was added and that this dissolved following the addition of alkali. Mierscher decided to call the new substance 'nuclein' by virtue of its presence in the nuclei of the cell. Upon further analysis, Miescher noted that the chemical composition of the substance differed from proteins and other known molecules. He speculated that it played a central role in cells and was involved in the division of cells. Following this, Miescher developed a method for isolating nuclein from salmon sperm. Many advances have been made to the methods for extracting and purifying DNA since Miescher's time. From the 1950s routine laboratory extraction of DNA became reliant on the use of density gradient centrifuges. Until very recently most methods for extracting DNA remained complex, labour-intensive and time-consuming. They also provided only small quantities of DNA. Today there are many specialised extraction methods. These are generally either solution-based or column-based. The extraction of DNA has become much easier with the emergence of commercial kits and the automation of the process. Such changes have both sped up production and increased the yield of DNA.


Monocytes can be further separated from lymphocytes using density gradient centrifugation because they are less dense and slightly larger. In other words, monocytes are faster to float during centrifugation in a density gradient than lymphocytes. This separation can be done with either the combination of two different density layers 3 or one layer 4 . Following centrifugation, the monocytes should be found in a layer above the leukocytes and any other components of the whole blood that was included.

A few tips for isolating mononuclear cells:

  1. Avoid too much vortexing. This may activate or kill the cells.
  2. There may be residual RBCs following centrifugation. Use hypotonic lysis to remove these RBCs.

1. Get a sample of DNA

DNA is found in most cells of the body, including white blood cells, semen, hair roots and body tissue. Traces of DNA can also be detected in body fluids, such as saliva and perspiration because they also contain epithelial cells. Forensic scientists and Police officers collect samples of DNA from crime scenes. DNA can also be collected directly from a person using a mouth swab (which collects inner cheek cells). Find out more in the article Crime scene evidence.

2. Extract the DNA

DNA is contained within the nucleus of cells. Chemicals are added to break open the cells, extract the DNA and isolate it from other cell components.

3. Copy the DNA

Often only small amounts of DNA are available for forensic analysis so the STRs at each genetic locus are copied many times using the polymerase chain reaction (PCR) to get enough DNA to make a profile. Find out more in the article What is PCR?

Specific primers are used during PCR that attach a fluorescent tag to the copied STRs.

4. Determine the size of the STRs

The size of the STRs at each genetic locus is determined using a genetic analyser. The genetic analyser separates the copied DNA by gel electrophoresis and can detect the fluorescent dye on each STR. This is the same piece of equipment used in the lab for DNA sequencing.

5. Is there a match?

The number of times a nucleotide sequence is repeated in each STR can be calculated from the size of the STRs. A forensic scientist can use this information to determine if a body fluid sample comes from a particular person.

If two DNA profiles from different samples are the same, the chance that the samples came from different people is low. This provides strong evidence that the samples have a common source.


Ameriky

Site will be displayed in English.

We use these cookies to ensure our site functions securely and properly they are necessary for our services to function and cannot be switched off in our systems. They are usually only set in response to actions made by you which amount to a request for services, such as logging in, using a shopping cart or filling in forms. You can set your browser to block or alert you about these cookies, but some parts of our services will not work without them. Like the other cookies we use, strictly necessary cookies may be either first-party cookies or third - party cookies.

We use these cookies to remember your settings and preferences. For example, we may use these cookies to remember your language preferences.
Allow Preference Cookies

We use these cookies to collect information about how you interact with our services and to help us measure and improve them. For example, we may use these cookies to determine if you have interacted with a certain page.
Allow Performance/Statistics Cookies

We and our advertising partners use these cookies to deliver advertisements, to make them more relevant and meaningful to you, and to track the efficiency of our advertising campaigns, both on our services and on other websites and social media.
Allow Marketing Cookies


Čo sa stane s DNA darcu pri transfúzii krvi?

Štúdie ukázali, že darcovská DNA u príjemcov krvnej transfúzie pretrváva niekoľko dní, niekedy aj dlhšie, ale je nepravdepodobné, že by jej prítomnosť významne zmenila genetické testy. Červené krvinky, primárna zložka transfúzií, nemajú jadro ani DNA. Krv po transfúzii však obsahuje značné množstvo bielych krviniek obsahujúcich DNA alebo leukocytov – približne miliardu buniek na jednotku (približne jednu pintu) krvi. Dokonca aj zložky krvi, ktoré boli filtrované na odstránenie darcovských bielych krviniek, môžu mať milióny leukocytov na jednotku.

Vyšetrovatelia odhalili darcovskú DNA po transfúzii procesom nazývaným polymerázová reťazová reakcia (PCR), ktorá amplifikuje nepatrné množstvá genetického materiálu na detekciu a identifikáciu špecifických génov. Štúdie využívajúce PCR na amplifikáciu mužských génov u žien príjemcov transfúzií od mužských darcov preukázali, že darcovská DNA vydrží u príjemcov až sedem dní. A štúdia u pacientok s traumou, ktoré dostávali veľké transfúzie, ukázala prítomnosť darcovských leukocytov až rok a pol.

Všetky tieto výsledky sa však našli použitím veľmi citlivých techník, pri ktorých bola darcovská DNA selektívne amplifikovaná oproti bohatšej recipientnej DNA. V štúdiách, kde sa amplifikovali gény spoločné pre darcov aj príjemcov, výsledky odrážali dominanciu vlastnej DNA príjemcu transfúzie, čo ukazuje, že DNA darcu je relatívne bezvýznamným interlokom.

Poznámka: Túto otázku predložil W. McFarland, Winter Springs, Florida a vytlačila ju vo februári 2009 Scientific American