Informácie

Inhibičný účinok GABA prostredníctvom receptorov GABA(A).

Inhibičný účinok GABA prostredníctvom receptorov GABA(A).



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Na Wikipédii je v článku o GABA(A) receptoroch napísané nasledovné:

"Po aktivácii receptor GABA(A) selektívne vedie Cl- cez svoje póry. Cl- bude vytekať z bunky, ak je vnútorné napätie nižšie ako pokojový potenciál a Cl- bude prúdiť dovnútra, ak je vyššie ako pokojový potenciál. spôsobuje inhibičný účinok na neurotransmisiu tým, že znižuje šancu na úspešný akčný potenciál“. (https://en.wikipedia.org/wiki/GABAA_receptor, prístup: 22. mája 2018)

Na základe môjho chápania, ak má byť akčný potenciál inhibovaný, vnútorné napätie neurónu sa musí znížiť ďalej od napätia, pri ktorom sa otvárajú napäťovo riadené sodíkové kanály neurónu.

S týmto vedomím nesúhlasím s vyhlásenímCl- vytečie z článku, ak je vnútorné napätie nižšie ako pokojový potenciál…. Ak je vnútorné napätie menšie ako pokojový potenciál a Cl- vyteká z článku, potom sa vnútorné napätie zvýši, čím sa priblíži k akčnému potenciálu.

To by zvýšilo pravdepodobnosť dosiahnutia akčného potenciálu, nie ho znížilo, však?

Moja otázka: Má Wikipedia chybu, alebo som niečomu nerozumel?


Skvelá otázka! Tento zjavný rozpor zmiatol mnohých študentov neurovedy pred vami.

Stručná odpoveď:

Toto sa často nazýva "inhibícia posunu", najmä ak sú excitačné a inhibičné vodivosti mimo dendritov.

Dlhšia odpoveď:

Časť, ktorá je chybná, je táto (zvýrazním moje):

vnútorné napätie sa zvýši, čím sa priblíži k akčnému potenciálu. To by zvýšilo pravdepodobnosť dosiahnutia akčného potenciálu, nie ho znížilo, však?

Myšlienka, že „hyperpolarizácia je inhibičná, depolarizácia je excitačná“, je pravdivá len čiastočne. Je veľmi dôležité zvážiť aj to, čo je vrcholový prah, a premýšľať o tom reverzný potenciál pre daný iónový kanál (alebo všeobecnejšie to môžeme nazvať len „vodivosť“) a potom môžete toto vyhlásenie upraviť tak, aby povedalo toto:

Vodivosti s reverzný potenciál väčší ako bodový prah sú excitačné, vodivosti s reverzný potenciál menej ako vrcholový prah sú inhibičné.

Najčastejšie kanály na báze chloridov zapadajú do druhého tvrdenia: ich reverzný potenciál je menší ako prahová hodnota.

Ako funguje blokovanie posunu:

Kedykoľvek otvoríte kanál, posuniete membránový potenciál smerom k reverznému potenciálu pre tento kanál. Množstvo prúdu, ktorý preteká kanálom, závisí od „hnacej sily“: rozdielu napätia od potenciálu spätného chodu.

Uvažujme celkom typickú učebnicovú bunku s prahom špičky pri -50 mV, pokojovým potenciálom -65 mV a reverzným chloridom pri -60 mV.

Ak je bunka v pokoji a otvoríte chloridové kanály (napríklad s GABA cez GABA-A receptory), výsledný tok prúdu bude mať tendenciu tlačiť membránový potenciál smerom k -60 mV, takže bunka sa „depolarizuje“. Avšak bez ohľadu na to, akú veľkú chloridovú vodivosť otvoríte, nikdy neprekročíte -60 mV, takže nikdy nedosiahnete vrcholový prah.

Ak ste v tej istej bunke namiesto toho otvorili AMPA kanály, s obratom okolo 0 mV, dostanete tiež depolarizáciu, ale v tomto prípade, keď otvoríte viac AMPA kanálov, môžete potenciálne depolarizovať bunku až na 0 mV. Samozrejme, ak nemáte zablokované sodíkové kanály, získate akčný potenciál skôr, ako dosiahnete tento bod, ale to je kľúč: prekročíte prah, preto to nazývame excitačné.

Teraz uvažujme o treťom prípade, keď otvoríme kanály AMPA aj kanály GABA-A. Pokiaľ je membránový potenciál <-60 mV, oba kanály prispievajú k depolarizácii. Akonáhle je však membránový potenciál >-60 mV, chloridové ióny začnú prúdiť do bunky. Nazývame to inhibícia „posunovania“, pretože ak sa pozriete na súhrnný tok prúdu v bunke, bude sa zdať malý, pretože chloridové ióny prichádzajú v rovnakom čase ako sodíkové ióny, čo vedie k malej zmene membránového potenciálu napriek mnohým pohybujúcich sa iónov.

Výsledkom je, že GABA-A kanály, aj keď môžu depolarizovať bunku, ktorá je v pokoji, budú pôsobiť tak, že zabránia depolarizácii bunky dostatočne ďaleko na to, aby dosiahla prahovú hodnotu. Je dôležité brať do úvahy dynamiku membránového potenciálu, a nie uvažovať o membránovom potenciáli ako o niečom, čo sa jednoducho pridáva alebo odčítava okamžite.

Dôležité upozornenia:

Na koncentráciách iónov záleží! Ak koncentrácie chloridov nie sú „typické“ alebo ak je vrcholový prah zápornejší ako v „typickej“ bunke z učebnice, potom môžu byť vodivosti chloridov skutočne excitačné! V skutočnosti je dôležitý excitačný GABAergický prenos v určitých štádiách vývoja. Ak majú bunky v sebe príliš veľa chloridu, môže to tiež spôsobiť, že GABAergický prenos sa stane excitačným (alebo aspoň obmedzí účinnosť inhibície) a to môže viesť k epilepsii (pozri Cohen et al. 2002).

Môže tiež existovať časové okno, v ktorom je GABAergický prenos excitačný dokonca aj v typickej bunke: toto je obdobie, kedy sa GABA-A kanály uzavreli, ale membrána zostáva mierne depolarizovaná a nevrátila sa do pokoja. Excitácia, ktorá príde počas tejto doby, sa sčíta so zvyškovou depolarizáciou a neexistujú žiadne otvorené kanály GABA-A, ktoré by „odviedli“ prúd.


Alger, B.E., & Nicoll, R.A. (1979). GABA-sprostredkované dvojfázové inhibičné reakcie v hipokampe. Nature, 281 (5729), 315.

Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., & Miles, R. (2002). O pôvode interiktálnej aktivity pri epilepsii ľudského temporálneho laloku in vitro. Science, 298(5597), 1418-1421.

Purves, D., Augustine, G. J., Fitzpatrick, D., Hall, W. C., LaMantia, A. S., McNamara, J. O., & White, L. E. (2014). Neuroveda, 2008. De Boeck, Sinauer, Sunderland, Mass.


GABAA receptory a alkohol

Existujú podstatné dôkazy, že GABAergická neurotransmisia je dôležitá pre mnohé behaviorálne účinky etanolu a existujú správy z viac ako 30 rokov literatúry, ktoré ukazujú, že nízke až stredné (3� mM) koncentrácie etanolu zvyšujú GABAergickú neurotransmisiu. Kľúčovou otázkou je, ktoré podjednotky GABA receptora sú citlivé na nízke koncentrácie etanolu in vivo a in vitro. Nedávne dôkazy poukazujú na úlohu extrasynaptických receptorov. Ďalšou otázkou je, ktoré behaviorálne účinky alkoholu sú výsledkom zvýšenia GABAergickej neurotransmisie. Niektoré stopy sa začínajú objavovať zo štúdií knock-out a knock-in myší a z genetickej analýzy ľudských alkoholikov. Tieto prístupy sa približujú k úlohe GABAergických akcií pri regulácii konzumácie alkoholu a možno aj rozvoja alkoholizmu.


Pretože GABA je široko distribuovaná a využívaná v celom CNS, skoré GABAergické lieky mali veľmi všeobecné účinky na funkciu CNS. Vývoj selektívnejších činidiel viedol k identifikácii aspoň dvoch odlišných tried GABA receptora, GABAA a GABAB. Líšia sa svojimi farmakologickými, elektrofyziologickými a biochemickými vlastnosťami. Elektrofyziologické štúdie GABAA-receptorový komplex naznačujú, že sprostredkúva zvýšenie vodivosti membrány s rovnovážnym potenciálom blízko pokojovej hladiny � mV. Toto zvýšenie vodivosti je často sprevádzané hyperpolarizáciou membrány, čo vedie k zvýšeniu prahu spustenia a následne k zníženiu pravdepodobnosti iniciácie akčného potenciálu, čo spôsobuje inhibíciu neurónov. Toto zníženie membránovej rezistencie sa dosiahne GABA-závislým uľahčením prítoku iónov Cl− cez kanál spojený s receptorom. Na druhej strane zvýšená permeabilita Cl− môže depolarizovať cieľovú bunku za určitých podmienok vysokého intracelulárneho Cl−. To zase môže potenciálne vybudiť bunku, aby spustila alebo aktivovala vstup Ca2+ cez napäťovo riadené kanály a bolo navrhnuté ako fyziologicky relevantná udalosť, najmä v embryonálnych neurónoch.

Elektrofyziologické údaje [8] naznačujú, že na jednu GABA pripadajú dve miesta rozpoznávania GABAA-receptorový komplex. Zvýšenie koncentrácie GABA má za následok zvýšenie priemernej doby otvorenia kanála v dôsledku otvorenia dvojito ligandovaných receptorových foriem, ktoré vykazujú otvorené stavy s dlhým trvaním. S použitím membránového prípravku z mozgu potkana sa preukázalo, že zvýšenie iónovej permeability GABAA receptorový komplex je v pretrvávajúcej prítomnosti agonistu prechodný [9]. Tento jav je známy ako desenzibilizácia a je rýchlo reverzibilný. Molekulárny mechanizmus desenzibilizácie nie je známy a rôzne hypotézy zostávajú predmetom skúmania. Bola navrhnutá existencia GABA-väzbových miest špecifických pre iniciáciu desenzibilizácie a odlišných od miest sprostredkujúcich otvorenie Cl− kanála [9].


SÚHRN

GABA, hlavný inhibičný transmiter v dospelom mozgu, má počas vývoja množstvo rôznych funkcií a ovplyvňuje migráciu, proliferáciu a správny morfologický vývoj neurónov, ako aj načasovanie kritických období a potenciálne pripravuje najskoršie neurónové siete. Tieto účinky GABA sú prostredníctvom depolarizačných účinkov GABAA receptory. Okrem toho regulácia katión-chloridových transportérov NKCC1 a KCC2 závislá od vývoja riadi homeostázu Cl − a diktuje posun “GABA” v CNS. GABAergický systém zahŕňa kortikálne interneuróny, ako aj interneuróny bielej hmoty a spojenia s oligodendrogliálnymi bunkami. Posledné dve sa podieľajú na ochoreniach bielej hmoty, vrátane perinatálnych poranení bielej hmoty a schizofrénie. Špecifické úlohy GABAergických neurónov v patogenéze týchto chorôb nie sú dobre známe. Štúdie naznačujú, že najdramatickejšia patológia bielej hmoty pri schizofrénii spája jej patológiu so znížením GABAergického systému na fyziologickej aj genetickej úrovni. GABAergický systém sa tiež výrazne podieľa na patológii niekoľkých poranení mozgu v zrelom mozgu. Zvýšená inhibičná aktivita na GABAA Zdá sa, že receptory majú neuroprotektívnu úlohu pri prechodnej ischémii, zatiaľ čo tonická inhibičná aktivita pri extrasynaptickej GABAA receptory môžu hrať škodlivú úlohu v patológii mŕtvice. GABAA receptorom sprostredkovaná inhibícia poskytuje silné obmedzenie epileptoformnej aktivity, čo je bežný dôsledok traumatického poranenia mozgu. Celkovo je zaručené lepšie pochopenie GABAergického systému vo vyvíjajúcom sa mozgu, ako aj v patofyziologických podmienkach.

a. Zdá sa, že patológie traumatického poranenia mozgu (TBI) a mŕtvice zahŕňajú zvýšenú tonickú inhibíciu sprostredkovanú extrasynaptickou GABAA receptory (Clarkson et al. 2010 Mtchedlishvili et al. 2010). Zvýšená tonická inhibícia v TBI môže prispieť k následnému funkčnému poškodeniu (Mtchedlishvili et al. 2010). Zvýšená tonická inhibícia zhoršuje funkčné zotavenie po mŕtvici, toto zvýšenie môže byť výsledkom zníženej funkcie spätného vychytávania GABA sprostredkovaného transportérom GABA 3/4 (GAT 3/4) (Clarkson et al. 2010). b. Zvýšené uvoľňovanie GABA zvyšuje neuroprotektívny inhibičný prenos vo veľkých aspinových (LA) neurónoch (Li et al. 2009). Tento účinok je s najväčšou pravdepodobnosťou sprostredkovaný presynaptickou GABAA receptory, avšak presné umiestnenie týchto receptorov nie je známe. Expresia GAD sa zvýšila po ischémii, čo silne naznačuje zvýšenú syntézu GABA.

C. Endogénna GABA pôsobí pri GABAB receptory na sprostredkovanie neuroprotektívnych účinkov po anoxii-ischémii v bielej hmote (Fern et al. 1995). Možným cieľom rekrutovaného systému druhého posla PKC je výmenník Na+/Ca2+, ktorý je v anoxických podmienkach obrátený. Downregulácia Na+/Ca2+ výmenníka môže viesť k neuroprotektívnym účinkom (Fern et al. 1995). GABAB receptory tiež pôsobia na K+ a Ca2+ kanály (pozri text).

D. Abnormality šedej hmoty pozorované pri schizofrénii zahŕňajú zníženie expresie GAD a zníženie presynaptického uvoľňovania GABA (Costa et al. 2001 Akbarian a Huang 2006). Opätovné vychytávanie GABA cez GABA transportér 1 (GAT1) je znížené (Yu et al. 2013). Pomer expresie NKCC1/KCC2 je zvýšený u pacientov so schizofréniou, čo naznačuje abnormálne dozrievanie, pretože normálne dozrievanie je sprevádzané zvýšenou expresiou KCC2 a zníženou expresiou NKCC1 (Hyde et al. 2011).


Výsledky

Molekulárne zložky metabolizmu a signalizácie GABA v imunitnom systéme.

GABA je v sére prítomná v submikromolárnych hladinách (13). Pretože pôsobenie exogénnej GABA na zápal a endogénnej GABA na fázovú synaptickú inhibíciu sa vyskytujú v milimolárnych koncentráciách (5, 8, 9), predpokladali sme, že lokálne mechanizmy môžu pôsobiť aj v periférnom imunitnom systéme na zvýšenie hladín GABA v blízkosti zápalového ohniska. Najprv sme sa opýtali, či imunitné bunky majú syntetický mechanizmus na produkciu GABA metódou Western blotting pre GAD, hlavný syntetický enzým. Našli sme významné množstvá 65-kDa podtypu GAD (GAD-65) v dendritických bunkách (DC) a nižšie hladiny v makrofágoch (obr. 1A ). GAD-65 sa zvýšil, keď boli tieto bunky stimulované (obr. 1A DR vs. DS a MR vs. MS). Testy GABA v kondicionovanom médiu z purifikovaných kultúr DC, makrofágov a T buniek ukázali sekréciu GABA týmito typmi buniek (obr. 1B ). Na rozdiel od zmeny v GAD-65 so stimuláciou sa množstvo GABA zhromaždené v upravenom médiu nezmenilo (obr. 1B MR/DR/TR vs. MS/DS/TS). To by mohlo odrážať neschopnosť detegovať lokálne zmeny v množstve secernovanej GABA, najmä ak sa vylučuje lokálne v kvantách, alebo ak bola hromadná GABA ovplyvnená inými mechanizmami produkcie GABA, ako je GAD-67, alebo alternatívnymi cestami zahŕňajúcimi spätné vychytávanie, skladovanie GABA. a sekréciu.

V imunitnom systéme je prítomný GABAergický systém. (A) Makrofágy a DC boli purifikované a stimulované LPS a CD4 + T bunky boli stimulované α-CD3 a α-CD28 počas 24–48 hodín. Enzým GAD sa detegoval imunoblotovaním v pokojových (MR alebo DR alebo TR) alebo stimulovaných (MS alebo DS alebo TS) peritoneálnych makrofágoch, dendritických bunkách, respektíve T bunkách. Astrocyty (Ast) a mozgový extrakt (Br) sa použili ako pozitívne kontroly. (B) GABA vylučovaná do supernatantu kondicionovaného média cez purifikované imunitné bunky, stimulované ako je uvedené vyššie, sa merala pomocou dot blotu. Kontroly sú komerčne čistá GABA (2 uM) a rovnaké objemové rastové médiá používané bez buniek: bezsérové ​​RPMI používané na rast DC a makrofágov (Con1) alebo X-Vivo 20 používané na pestovanie T buniek (Con2). (C) Reprezentatívna stopa záznamu napäťovej svorky ukazujúca funkčné receptory GABA v peritoneálnych makrofágoch počas prvých 10 s záznamu (Hore) a ukazuje nedostatočnú odpoveď na aplikáciu GABA 20 minút po počiatočných odpovediach (Stredný). Spodná časť: Hippokampálne neuróny kultivované 14 dní in vitro sa použili ako kontrola. Šípky ukazujú na prúdy indukované fokálnou aplikáciou 100 μM GABA počas 1 s (označené plnými pruhmi) v peritoneálnych makrofágoch. Šípky ukazujú na prúdy GABA indukované fokálnou aplikáciou 100 μM GABA počas 0,5 s v hipokampálnych neurónoch. Okrem toho neuróny vykazujú spontánne IPSC, niektoré označené hviezdičkami. N = 11, n = 7 pre makrofágy a N = 3, n = 3 pre neuróny, kde N je celkový počet buniek a n je počet buniek vykazujúcich reakcie na aplikáciu GABA. (D–F) mRNA sa merala pomocou RT-PCR v imunitných bunkách stimulovaných ako v A. GABAT je enzým, ktorý degraduje GABA a GAT-2, transportér GABA. Ako kontroly sa použili mozog (Br), pečeň (Liv) a β-aktín.

Ďalej sme sa pýtali, či imunitné bunky majú funkčné receptory pre GABA. GABA-A-R sú heteropentaméry zložené z dvoch podjednotiek typu α (α1-6), dvoch podjednotiek typu β (β1-3) a jednej tretieho typu (zvyčajne ε/γ/δ/π), ktoré tvoria chloridový kanál v bunkovej membráne (14). Najprv sme sa snažili potvrdiť prítomnosť transkriptov GABA-A-R, ktoré videli iní (5-7) pomocou analýzy RT-PCR a našli sme dve spoločné podjednotky v makrofágoch (obr. S1). Aby sme určili, či tieto transkripty tvoria funkčné chloridové kanály GABA-A-R, vykonali sme celobunkové záznamy patch-clamp (obr. 1C ). Fokálna aplikácia 100 μM GABA na makrofágy pod napäťovou svorkou celej bunky vyvolala vnútorné prúdy podobné tým v hipokampálnych neurónoch, o ktorých je známe, že exprimujú funkčné GABA-A-R a boli použité ako pozitívna kontrola. GABA-evokované prúdy boli pozorované v 7 z 11 zaznamenaných makrofágov a mali menšiu amplitúdu (-48 pA, n = 6) a pomalšie stúpajú a klesajú ako neurónové reakcie. Amplitúda týchto prúdov sa zmenšila opakovanou aplikáciou GABA, pravdepodobne v dôsledku desenzibilizácie alebo endocytózy receptorov GABA (15, 16). Ohnisková aplikácia GABA nepriniesla žiadne prúdy, keď roztok kúpeľa obsahoval pikrotoxín (n = 4). Makrofágy boli zbavené synapsií a nevykazovali spontánne inhibičné postsynaptické prúdy (IPSC) spojené so spontánnym uvoľňovaním presynaptických vezikúl, čo je zrejmé z neurónových záznamov (obr. 1).C , hviezdičky). Kontrasty s neurónmi by mohli predstavovať rozdiely v zložení receptorových podjednotiek, povrchovej expresii alebo nesynaptických charakteristikách.

Vykonali sme experimenty RT-PCR, aby sme určili, či imunitné bunky obsahujú zložky katabolického systému GABA. Našli sme špecifické vysokoafinitné transportéry GABA (GAT) na spätné vychytávanie GABA z extracelulárneho priestoru do cytosolu a GABA transaminázu (GABAT), hlavný degradačný enzým, ktorý premieňa GABA na medziprodukty, ktoré sa majú recyklovať do Krebsovho cyklu. Tieto zložky sú prítomné v makrofágoch aj T bunkách (obr. 1 D a E ). Zo štyroch doteraz opísaných GAT (17) sme zistili, že GAT-2 je prítomný v imunitných bunkách (obr. 1D ).

GABAergné látky priamo ovplyvňujú bunky prezentujúce antigén.

Na ďalšiu charakterizáciu imunitného účinku GABA sme použili niekoľko mechanizmov manipulácie tohto endogénneho systému GABA v imunitnom systéme. GABAergné látky zahŕňali muscimol, GABA štruktúrny analóg topiramát, liek s agonistickou aktivitou GABA-A-R a ireverzibilné inhibítory GABAT, vigabatrín a gabakulín, ktoré znižujú degradáciu GABA, čím spôsobujú efektívne zvýšenie koncentrácií GABA (18, 19). Použili sme aj inhibítor GABA-A-R pikrotoxín, ktorý blokuje chloridový kanál (20, 21).

Aby sme študovali adaptívnu imunitnú odpoveď, testovali sme tieto GABAergné činidlá s použitím myší C57BL/6 transgénnych pre myelínový oligodendrogliálny proteínový (MOG) receptor T buniek (TCR), v ktorých veľká väčšina T buniek reaguje na MOG antigén. Naivné splenocyty myší transgénnych pre MOG TCR vystavených in vitro antigénu MOG 35-55 proliferujú a produkujú zápalové cytokíny. GABAergné látky pridané in vitro inhibujú tento účinok v závislosti od dávky (topiramát, obr. 2A vigabatrín, obr. S2). Ovplyvnené cytokíny zahŕňali IL17 a IFNy, primárne produkované T bunkami, a TNF, IL6 a IL10, ktoré môžu produkovať buď T bunky, alebo bunky prezentujúce antigén (APC), ako sú DC a makrofágy (pre IFNy, pozri obr. S3C s muscimolom a gabakulínom). Pri liečbe nedošlo k žiadnej zmene životaschopnosti splenocytov. Tieto reakcie v nefrakcionovaných splenocytoch by mohli odrážať priamy účinok buď na T bunky alebo APC, alebo na oboje.

GABAergné látky pôsobia priamo na APC prostredníctvom GABA-A-R a MAPK na potlačenie zápalu. (A) Naivné splenocyty z myší C57BL/6 transgénnych pre MOG TCR boli aktivované in vitro s 0–10 μg/ml MOG v prítomnosti vehikula alebo rôznych koncentrácií topiramátu: 2 μm, 20 μM alebo 200 μM. Údaje sú uvedené ako priemer ± SD sekrécie cytokínov (pg/ml) duplicitných kultúr meraných testom ELISA a sú reprezentatívne pre rozsah testovaných koncentrácií (*P < 0,05 **P < 0,005). (B a C) Purifikované kultúry T buniek sa aktivovali 0,1–1 μg/ml α-CD3 a α-CD28 naviazaným na platni. Miera šírenia (B) a produkcia cytokínov (pg/ml) (C) sa merali v prítomnosti vehikula, 200 uM topiramátu, 100 uM gabakulínu alebo 100 uM muscimolu. Údaje sú uvedené ako priemer ± SD z troch opakovaní a sú reprezentatívne pre rozsah testovaných koncentrácií. (D) Peritoneálne makrofágy boli purifikované z myší liečených vehikulom, vigabatrínom (400 mg/kg za deň) alebo topiramátom (100 mg/kg za deň) počas 1 týždňa a aktivované in vitro pomocou LPS. (E) Peritoneálne makrofágy boli stimulované 0–800 ng/ml LPS v prítomnosti GABAergných činidiel in vitro, 20–200 μM topiramátu, 500 μM vigabatrínu, 10–100 μM muscimolu alebo 50–500 μM a gabakulínu pre každý gabakulín činidlo s 10–100 μM pikrotoxínu, blokátor GABA-A kanála. Pre D a Eúdaje predstavujú produkciu IL-1p (pg/ml), priemer ± SD duplicitných kultúr (*P < 0,05 **P < 0,005) a sú uvedené pre reprezentatívnu koncentráciu. (F) Makrofágy alebo T bunky boli purifikované oddelene od MOG TCR transgénnych myší liečených vehikulom (-) alebo topiramátom (+) (100 mg/kg za deň) perorálne počas 1 týždňa. Makrofágy a T bunky sa recipročne zmiešali a kultúra sa stimulovala in vitro s 0–20 μg/ml MOG. Potom meraná produkcia cytokínov, znázornená ako priemer ± SD (pg/ml) duplicitných kultúr, je reprezentatívna pre rozsah koncentrácie MOG. *P < 0,05. (G) Peritoneálne makrofágy purifikované z myší ošetrených ako v D boli stimulované in vitro s LPS v rôznych časových bodoch, ako je ukázané. Uskutočnil sa Western blotting pre fosforylované proteíny p44/42 MAPK a p38/ERK a porovnal sa s nefosforylovanými formami a kontrolou β-aktínu.

Na stanovenie špecifických typov buniek ovplyvnených GABA sme samostatne testovali T bunky a APC (obr. 2 B–G ). Purifikované T bunky boli priamo stimulované s anti-CD3 a anti-CD28 in vitro, čím došlo k polyklonálnej expanzii. GABAergné látky nemali priamy vplyv na proliferáciu T buniek alebo produkciu IFNy, TNF, IL-17 alebo IL6 (obr. 2 B a C ). Purifikované APC boli priamo stimulované LPS. Na rozdiel od T buniek, ale podobne ako nefrakcionované splenocyty (obr. 2A a Obr. S2), purifikované APC reagovali na liečbu GABAergnými liekmi zníženou produkciou zápalových cytokínov, IL1β a IL6 (makrofágy, Obr. 2D DC, obr. S3A ). Inhibičný účinok GABAergných činidiel bol závislý od dávky (obr. S3B ) a zvrátené pikrotoxínom, čo naznačuje zapojenie GABA-A-R (obr. 2E ). Podobný zvrat bol pozorovaný u nefrakcionovaných splenocytov (obr. S3C ).

Tieto štúdie naznačujú, že GABA systém imunitného systému môže byť modulovaný GABAergnými činidlami. Účinok vigabatrínu a gabakulínu by sa mohol vyskytnúť zvýšením lokálnych koncentrácií GABA v zápalovom ohnisku na hladiny, ktoré spôsobujú aktiváciu GABA-A-R v APC prostredníctvom blokovania GABAT prítomného v imunitných bunkách (obr. 1E ). Lokálne koncentrácie GABA sa zvyšujú sekundárnym účinkom blokovania GABAT, čo spôsobuje zvrátenie spätného vychytávania prostredníctvom GAT, ktoré existujú v imunitných bunkách (obr. 1C). GABA sa vylučuje týmto spôsobom cez GAT-1 (22, 23). Hoci pikrotoxín môže blokovať iné chloridové kanály ako GABA-A-R, z ktorých niektoré sú imunomodulačné (24), významné účinky pikrotoxínu na produkciu cytokínov sme zaznamenali iba pri manipulácii so signalizáciou GABA, nie v kultúrach ošetrených vehikulom (obr. 2).E ), čo naznačuje, že pikrotoxín pôsobil špecificky na zvrátenie GABA účinku týchto činidiel. Hoci topiramát, muscimol, gabakulín a vigabatrín majú každý rôzne súbory off-site a nešpecifických účinkov, spoločnou funkciou je ich GABAergická aktivita. Podobný účinok týchto činidiel na APC a zvrátenie s pikrotoxínom in vitro podporujú záver, že tieto liečivá pôsobia prostredníctvom GABA dráhy.

Aby sme určili, či je GABAergický účinok na APC dostatočný na zmenu adaptívnej odpovede pozorovanej v nefrakcionovaných splenocytoch, skúmali sme aktiváciu T buniek špecifickú pre MOG, keď boli topiramátu vystavené iba makrofágy alebo T bunky. Makrofágy boli purifikované z myší liečených topiramátom alebo vehikulom. Recipročným spôsobom boli kultivované in vitro s T bunkami exprimujúcimi MOG TCR purifikovaný z myší ošetrených topiramátom alebo vehikulom a vystavených MOG. Ošetrenie makrofágov topiramátom znížilo produkciu IFNy T bunkami a TNF (ktorý môžu produkovať makrofágy aj T bunky) v spoločných kultúrach (obr. 2).F ). Liečba samotnými T bunkami nemala tento účinok. Okrem toho v kultúrach, v ktorých sa odobrali makrofágy aj T bunky zvieratám ošetreným topiramátom, ošetrenie T buniek nevyvolalo žiadny ďalší účinok.

MAPK sa podieľajú na neskorších krokoch signalizácie GABA-A-R a sú rozhodujúce v imunitnej odpovedi (25 – 28). MAPK interagujú s imunomodulátormi, ako je signálny prevodník a aktivátor transkripčných molekúl, ktoré up-regulujú cytokínové gény v APC, a konkrétne, p38 MAPK môže zvýšiť transkripciu IL6 a IL1β a p44/42 MAPK ovplyvňuje IL6 (29). Pretože GABAergné látky znížili produkciu týchto cytokínov v APC (obr. 2E a Obr. S3 A a B ), predpokladali sme, že modulujú fosforyláciu MAPK. Stimulovali sme makrofágy ošetrené vigabatrínom a topiramátom pomocou LPS in vitro a porovnali sme ich s makrofágmi ošetrenými vehikulom. Vigabatrín skutočne znížil fosforyláciu p38 MAPK a p44/42 ERK počas stimulácie LPS o 30 % a 12 % a topiramát o 53 % a 45 % (obr. 2E ). GABAergné činidlá teda modulujú funkciu APC prostredníctvom fosforylácie GABA-A-R a MAPK, ale nepôsobia priamo na T bunky a tento účinok je dostatočný na inhibíciu produkcie zápalových cytokínov v odpovediach T buniek počas zápalu.

GABAergné činidlá zlepšujú EAE.

Ďalej sme testovali, či zvýšená GABAergická aktivita môže ovplyvniť EAE. Podali sme topiramát a vigabatrín v denných perorálnych dávkach podobných ekvivalentným ľudským dávkam pri súčasnom používaní, merané pre myši podľa akceptovaných pokynov (www.fda.gov/downloads/Drugs/. /Guidances/UCM078932.pdf). SJL/J myši boli imunizované myelínovým peptidovým proteolipidovým proteínom (PLP) 139-151 na vyvolanie EAE. V tomto modeli EAE imunizácia vyvoláva charakteristický syndróm vzostupnej paralýzy, ktorý začína paralýzou chvosta a postupne zahŕňa zadné a predné končatiny a potom mozog. Keď sa GABAergické látky začali podávať v čase imunizácie, zabránili a oddialili nástup EAE a znížili závažnosť symptómov v závislosti od dávky (obr. 3A a Obr. S4 kvantifikované v tabuľke S1). Kontrolné a liečené skupiny sa usmrtili na konci experimentu (37. deň) a mozgy a miechy sa histologicky vyšetrili. Došlo k výraznému zníženiu počtu zápalových ložísk parenchýmu (obr. 3 D–F a Obr. S5 kvantifikované v tabuľke S1). Nedávno sa ukázalo, že odpovede T pomocných buniek Th1 a Th17 sú dôležité pri vývoji EAE. Preto sme skúmali bunky sleziny a lymfatických uzlín liečených myší na Th1 cytokíny, IL12 a IFNy, a Th17 cytokíny, IL6 a IL17, v odpovediach pamäťových T buniek na restimuláciu s PLP 139-151 ex vivo 10 dní po imunizácii a zistili sme významné zníženie týchto cytokínov a proliferácie v liečených skupinách (obr. 4 A a B a Obr. S6). To je v súlade s výsledkami našich štúdií in vitro na neprimovaných naivných splenocytoch (obr. 2 A a F a Obr. S2 a S3C ). Obidve látky tiež zvrátili paralýzu, keď sa liečba začala po vzniku EAE (obr. 3 B a C ) a znížil počet recidív (tabuľka S1, miera recidív bola stanovená pre každé zviera).

GABAergné látky zlepšujú EAE. (A–C) SJL/J myši boli imunizované 100 ug PLP139-151 v CFA. Grafy predstavujú prevenciu EAE (A) perorálnou liečbou topiramátom (100 mg/kg denne) alebo vigabatrínom (400 mg/kg denne) počnúc v čase imunizácie, ako je naznačené šípkou, a liečbou potvrdenej EAE (B a C) perorálnym topiramátom (100 mg/kg denne) alebo vigabatrínom (400 mg/kg denne) počnúc vrcholom ochorenia, ako je naznačené šípkou. Údaje predstavujú klinické skóre, ako je opísané v Materiály a metódy , priemer ± SEM, reprezentatívny pre dva nezávislé experimenty, n = 10 na skupinu. *P < 0,05, Mann-Whitney analýza. In B a Cboli myši liečené denne s výnimkou dní 32 až 42, ako je naznačené plným stĺpcom, keď boli liečené každé 3 dni. (D–F) H&E zafarbené priečne rezy miechy myší usmrtených na konci experimentu (deň 37 A). Reprezentatívna kontrola (D), topiramát- (Ea zvieratá liečené vigabatrínom (F) Sú zobrazené. *Parenchymálne zápalové ložiská + meningeálne zápalové ložiská. 125× zväčšenie.

GABAergné látky zlepšujú EAE prostredníctvom účinku na imunitný systém. (A a B) SJL/J myši boli imunizované PLP139-151 (PLP) a liečené vehikulom (PBS), topiramátom (100 mg/kg za deň) alebo vigabatrínom (400 mg/kg za deň) počas 10 dní po imunizácii. Potom sa odobrali splenocyty a restimulovali sa ex vivo s 0–25 μg/ml PLP. Cytokínové odpovede (A) a miery šírenia (B) buniek na opätovné nanesenie 10 ug/ml PLP sú znázornené ako priemer ± SD trojitých kultivačných jamiek. *P < 0,05 **P < 0,005. Výsledky reprezentujú tri nezávislé experimenty a rozsah koncentrácie PLP. (C) Splenocyty boli odobraté z PLP-imunizovaných SJL/J darcovských myší liečených topiramátom, vigabatrínom alebo vehikulom počas 10 dní ako v A a B a adoptívne prenesené do neliečených naivných recipientných myší SJL/J. EAE indukovaná adoptívne u príjemcov je znázornená ako priemerné klinické skóre ± SEM, n = 7–10 na skupinu. *P < 0,05, Mann-Whitney analýza.

GABAergný účinok na imunitný systém je dostatočný na zlepšenie EAE.

Tieto GABAergné látky prechádzajú hematoencefalickou bariérou. Preto môžu zlepšovať EAE prostredníctvom účinku na imunitný kompartment (ktorý zahŕňa periférny imunitný systém a imunitné bunky v CNS) alebo neurónový kompartment alebo oboje. Aby sme to ďalej objasnili, imunizovali sme darcovské myši SJL / J a liečili sme ich topiramátom alebo vigabatrínom počas 10 dní. Potom sme zhromaždili bunky sleziny a lymfatických uzlín a restimulovali sa s PLP139-151 ex vivo. Tieto bunky sme injikovali i.v. do naivných recipientných myší na vyvolanie EAE, neliečiť recipientné myši žiadnymi GABAergnými činidlami. U recipientných myší, ktorým boli injikované imunitné bunky ošetrené topiramátom alebo vigabatrínom, bol nástup EAE oneskorený a závažnosť významne klesla (obr. 4C ). To naznačuje, že priamy účinok týchto činidiel na kompartment imunitných buniek in vivo je dostatočný na zlepšenie EAE.


Obsah

Agonisti Edit

PAMs Upraviť

    (napr. etanol, izopropanol) (napr. ivermektín) (napr. fenobarbital) (napr. diazepam, alprazolam) (napr. bromid draselný) (napr. meprobamát, karisoprodol), chloralóza, petrichloral a iné 2,2,2- trichlóretanolové proliečivá (napr. ergoloid (dihydroergotoxín))
  • 2-substituované fenoly (napr. tymol, eugenol) (napr. etomidát) (nachádza sa v kava) (napr. alopregnanolón, ganaxolón) (napr. zaleplon, zolpidem, zopiklón, eszopiklón) (napr. glutetimid, metyprylon) (napr. ) (napr. metakvalon) zložky
  • Disulfonylalkány (napr. sulfónmetán, tetronal, trión) zložky (napr. kyselina valérová, kyselina valerénová) (napr. chloroform, dietyléter, sevofluran)

Agonisti Edit

PAMs Upraviť

Agonisti Edit

PAMs Upraviť

Mnoho bežne používaných sedatív a anxiolytických liekov, ktoré ovplyvňujú komplex receptorov GABA, nie sú agonistami. Tieto lieky namiesto toho pôsobia ako pozitívne alosterické modulátory (PAM) a hoci sa viažu na receptory GABA, viažu sa na alosterické miesto na receptore a nemôžu vyvolať odpoveď z neurónu bez prítomnosti skutočného agonistu. Lieky, ktoré patria do tejto triedy, prejavujú svoj farmakodynamický účinok zvýšením účinkov, ktoré má agonista, keď sa dosiahne potenciácia.

Väčšina všeobecných anestetík sú PAM receptora GABA-A. Pozitívne alosterické modulátory fungujú tak, že zvyšujú frekvenciu, s ktorou sa chloridový kanál otvára, keď sa agonista viaže na svoje vlastné miesto na GABA receptore. Výsledné zvýšenie koncentrácie iónov Cl- v postsynaptickom neuróne okamžite hyperpolarizuje tento neurón, čím sa stáva menej excitabilným a tým inhibuje možnosť akčného potenciálu. Niektoré celkové anestetiká ako propofol a vysoké dávky barbiturátov však nemusia byť len pozitívnymi alosterickými modulátormi GABA-A receptorov, ale aj priamymi agonistami týchto receptorov.

Alkohol je nepriamy agonista GABA. GABA je hlavný inhibičný neurotransmiter v mozgu a lieky podobné GABA sa používajú na potlačenie kŕčov. Predpokladá sa, že alkohol napodobňuje účinok GABA v mozgu, viaže sa na receptory GABA a inhibuje neurónovú signalizáciu.


Ako sa správa GABA cítiť?

Keď vyrovnávate hladiny GABA v mozgu, cítite sa uvoľnene a pokojne. Ale mnohí neurohackeri, ktorí skúšajú používať GABA ako doplnok, nepociťujú účinky. Pretože niektoré výskumy ukazujú, že molekula GABA je príliš veľká na to, aby prekročila hematoencefalická bariéra[viii]

Ak pocítite upokojujúce účinky GABA do ½ hodiny po užití to môže znamenať, že máte a „netesná“ hematoencefalická bariéra. Nie je to dobrá vec.[ix] Pretože keby GABA môže prejsť, všetky druhy škaredých vecí môžu prejsť tiež. Vrátane toxínov, nestrávených čiastočiek jedla a čohokoľvek iného vo vašom krvnom obehu, čo by nemalo byť vo vašom mozgu.

Ako opraviť „netesnú“ hematoencefalickú bariéru sa môžete dozvedieť v tomto článku tu > Ako vyliečiť netesnú krvno-mozgovú bariéru. Ale dobrá správa je, že doplnková GABA môže prospieť aj iným funkciám vo vašom tele.

GABA sa nachádza vo vašich nadobličkách, hypofýze, pankrease a vašich pohlavných orgánoch.[x] GABA je tiež protizápalový a má priaznivý účinok na imunitu. Keď to všetko funguje optimálne, budete sa cítiť dobre.

Pozrieme sa aj na ďalšie spôsoby vylepšenia GABA hladiny v našom mozgu v „Dostupné formuláre“ časť tohto článku.


Anderson, S. M., De Souza, R. J. a Cross, A. J. (1993). Bunková línia ľudského neuroblastómu IMR-32 má GABAA receptor, ktorému chýba benzodiazepínové modulačné miesto. Neurofarmakológia 32, 455�. doi: 10.1016/0028-3908(93)90169-4

Andreeva, L. A., Nagaev, I. Y., Mezentseva, M. V., Shapoval, I. M., Podchernyaeva, R. Y., Shcherbenko, V. E. a kol. (2010). Antivírusové vlastnosti štruktúrnych fragmentov peptidu Selank. Dokl. Biol. Sci. 431, 79�. doi: 10.1134/S0012496610020031

Ashmarin, I. P. (2007). Glyprolíny v regulačných tripeptidoch. Neurochem J. 1, 173�. doi: 10.1134/S1819712407030014

Ashmarin, I. P., Samonina, G. E., Lyapina, L. A., Kamenskii, A. A., Levitskaya, N. G., Grivennikov, I. A. a kol. (2005). Prírodné a hybridné (𠇌himeric”) stabilné regulačné glyprolínové peptidy. Patofyziológia 11, 179�. doi: 10.1016/j.pathophys.2004.10.001

Bymaster, F. P., Calligaro, D. O., Falcone, J. F., Marsh, R. D., Moore, N. A., Tye, N. C. a kol. (1996). Profil väzby na rádioreceptory atypického antipsychotika olanzapínu. Neuropsychofarmakológia 14, 87�. doi: 10.1016/0893-133X(94)00129-N

Czabak-Garbacz, R., Cygan, B., Wolanski, L. a Kozlovsky, I. (2006). Vplyv dlhodobej liečby analógom tuftsínu TP-7 na úzkostno-fóbne stavy a telesnú hmotnosť. Pharmacol. Rep. 58, 562�.

Dolotov, O. V., Eremin, K. O., Andreeva, L. A., Novosadova, E. V., Raevskii, K. S., Myasoedov, N. F., et al. (2015). Semax zabraňuje smrti neurónov pozitívnych na tyrozínhydroxylázu v zmiešanej kultúre neurogliálnych buniek odvodenej z embryonálneho krysieho mezencefalu v modeli neurotoxicity indukovanej 6-hydroxydopamínom. Neurochem. J. 9, 295�. doi: 10.1134/S1819712415040066

Ershov, F. I., Uchakin, P. N., Uchakina, O. N., Mezentseva, M. V., Alekseeva, L. A. a Miasoedov, N. F. (2009). Antivírusová aktivita imunomodulátora Selank pri experimentálnej chrípkovej infekcii. Vopr. Virusol. 54, 19�.

Fraser, C. M. a Lee, N. H. (1995). Regulácia expresie muskarínových receptorov zmenami stability mRNA. Life Sci. 56, 899�. doi: 10.1016/0024-3205(95)00026-3

Fu, Y., Zhu, Z. T., Chen, L. J., Yu, L. P. a Jin, G. Z. (2000). Charakteristiky správania olanzapínu: atypické neuroleptikum. Acta Pharmacol. Sin. 21, 329�.

Gopalakrishnan, S.M., Philip, B.M., Gronlien, J.H., Malysz, J., Anderson, D.J., Gopalakrishnan, M., et al. (2011). Funkčná charakterizácia a vysokovýkonný skríning pozitívnych alosterických modulátorov alfa7 nikotínových acetylcholínových receptorov v bunkách neuroblastómu IMR-32. Assay Drug Dev. Technol. 9, 635�. doi: 10.1089/adt.2010.0319

Gusev, E. I., Skvortsova, V. I., and Chukanova, E. I. (2005). Semax v prevencii progresie ochorenia a rozvoja exacerbácií u pacientov s cerebrovaskulárnou insuficienciou. Zh. Nevrol. Psikhiatr. Im. S S Korsáková 105, 35�.

Gusev, E. I., Skvortsova, V. I., Miasoedov, N. F., Nezavibat'ko, V. N., Zhuravleva, EIu., and Vanichkin, A. V. (1997).Účinnosť semaxu v akútnom období hemisférickej ischemickej mozgovej príhody (klinická a elektrofyziologická štúdia). Zh. Nevrol. Psikhiatr. Im. S S Korsáková 97, 26�.

Inoue, T., Tsuchiya, K. a Koyama, T. (1996). Účinky typických a atypických antipsychotík na mrazivé správanie vyvolané podmieneným strachom. Pharmacol. Biochem. Správaj sa. 55, 195�. doi: 10.1016/S0091-3057(96)00064-0

Inozemtseva, L. S., Karpenko, E. A., Dolotov, O. V., Levitskaya, N. G., Kamensky, A. A., Andreeva, L. A. a kol. (2008). Intranazálne podávanie peptidu Selank reguluje expresiu BDNF v hipokampe potkanov in vivo. Dokl. Biol. Sci. 421, 241�. doi: 10.1134/S0012496608040066

Ivanov Iu, V. a Iasnetsov, V. V. (2000). Účinok semaxu a mexidolu na priebeh akútnej pankreatitídy u potkanov. Eksp. Klin. Farmakol. 63, 41�.

Kolomin, T.A., Shadrina, M.I., Agniullin, Y.V., Shram, S.I., Slominskii, P.A., Limborska, S.A., et al. (2010). Transkriptomická odpoveď potkanieho hipokampu a buniek sleziny na jednorazové a chronické podávanie peptidu Selank. Dokl. Biochem. Biophys. 430, 5𠄶. doi: 10.1134/S1607672910010023

Kolomin, T., Morozova, M., Volkova, A., Shadrina, M., Andreeva, L., Slominsky, P., et al. (2014). Dočasná dynamika expresie génov súvisiacich so zápalom pri pôsobení tuftsínového analógu Selank. Mol. Immunol. 58, 50�. doi: 10.1016/j.molimm.2013.11.002

Kolomin, T., Shadrina, M., Andreeva, L., Slominsky, P., Limborska, S. a Myasoedov, N. (2011). Expresia génov súvisiacich so zápalom v myšacej slezine pod analógom tuftsínu Selank. Regul. Pept. 170, 18�. doi: 10.1016/j.regpep.2011.05.001

Marx, C. E., Duncan, G. E., Gilmore, J. H., Lieberman, J. A. a Morrow, A. L. (2000). Olanzapín zvyšuje alopregnanolón v mozgovej kôre potkanov. Biol. Psychiatria 47, 1000�. doi: 10.1016/S0006-3223(99)00305-4

Marx, C. E., VanDoren, M. J., Duncan, G. E., Lieberman, J. A. a Morrow, A. L. (2003). Olanzapín a klozapín zvyšujú GABAergný neuroaktívny steroid alopregnanolón u hlodavcov. Neuropsychofarmakológia 28, 1�. doi: 10.1038/sj.npp.1300015

Moore, N. A., Tye, N. C., Axton, M. S. a Risius, F. C. (1992). Behaviorálna farmakológia olanzapínu, nového ȁkatypického” antipsychotika. J. Pharmacol. Exp. Ther. 262, 545�.

Nemeroff, C. B. (2005). Použitie atypických antipsychotík pri refraktérnej depresii a úzkosti. J. Clin. Psychiatria 66 (Doplnok 8), 13�.

Noble, P. J., Anderson, S. M., De Souza, R. J., Cross, A. J. a Stephenson, F. A. (1993). Identifikácia GABAA podjednotka receptora alfa 3 v bunkovej línii neuroblastómu IMR-32. J. Neurochem. 61, 752�. doi: 10.1111/j.1471-4159.1993.tb02182.x

Paul, S. M. a Purdy, R. H. (1992). Neuroaktívne steroidy. FASEB J. 6, 2311�.

Rudolph, U. a Knoflach, F. (2011). Okrem klasických benzodiazepínov: nový terapeutický potenciál GABAA podtypy receptorov. Nat. Drug Discov. 10, 685�. doi: 10.1038/nrd3502

Sapp, D. W. a Yeh, H. H. (2000). Heterogenita reakcií sprostredkovaných receptorom GABA(A) v bunkovej línii ľudského neuroblastómu IMR-32. J. Neurosci. Res. 60, 504�. doi: 10.1002/(SICI)1097-4547(20000515)60:4𼔄::AID-JNR9ϣ.0.CO2-Y

Semenova, T. P., Kozlovskaya, M. M., Zuikov, A. V., Kozlovskii, I. I., Zakharova, N. M. a Andreeva, L. A. (2008). Použitie Selanku na korekciu meraní integračnej mozgovej aktivity a hladín biogénnych amínov u dospelých potkanov v dôsledku prenatálnej hypoxie. Neurosci. Správaj sa. Physiol. 38, 203�. doi: 10.1007/s11055-008-0030-2

Seredenin, S. B., Blednov Yu, A., Badyshtov, B. A., Gordey, M. L. a Nagovitsina, Y. A. (1990). Farmakogenetická analýza mechanizmov emočného stresu: účinky benzodiazepínov. Ann. Ist. Super. Sanita 26, 81�.

Seredenin, S. B., Kozlovskaia, M. M., Blednov Iu, A., Kozlovskii, I. I., Semenova, T. P., Czabak-Garbacz, R., et al. (1998). Anxiolytický účinok analógu endogénneho peptidu tuftsínu na inbredné myši s rôznymi fenotypmi reakcie na emočný stres. Zh. Vyšš. Nerv. Deiat. Im. I P Pavlova 48, 153�.

Sieghart, W. (1995). Štruktúra a farmakológia podtypov receptora gama-aminomaslovej kyselinyA. Pharmacol. Rev. 47, 181�.

Skilbeck, K.J., O'Reilly, J.N., Johnston, G.A., and Hinton, T. (2007). Účinky antipsychotík na GABAA väzba receptora závisí od obdobia liečby liekom a skúmaného väzobného miesta. Schizophr. Res. 90, 76�. doi: 10.1016/j.schres.2006.11.009

Skilbeck, K.J., O'Reilly, J.N., Johnston, G.A., and Hinton, T. (2008). Podávanie antipsychotík rozdielne ovplyvňuje [3H]muscimol a [3H]flunitrazepam GABAA väzbové miesta receptora. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatria 32, 492�. doi: 10.1016/j.pnpbp.2007.10.003

Twyman, R. E. a MacDonald, R. L. (1992). Neurosteroidná regulácia GABAA jednokanálové kinetické vlastnosti receptora myších miechových neurónov v kultúre. J. Physiol. 456, 215�. doi: 10.1113/jphysiol.1992.sp019334

Volkova, A., Shadrina, M., Kolomin, T., Andreeva, L., Limborska, S., Myasoedov, N., et al. (2016). Podávanie Selanku ovplyvňuje expresiu niektorých génov zapojených do GABAergickej neurotransmisie. Predné. Pharmacol. 7:31. doi: 10.3389/fphar.2016.00031

V'yunova, T. V., Andreeva, L. A., Shevchenko, K. V., Shevchenko, V. P. a Myasoedov, N. F. (2014). Peptidová regulácia špecifických interakcií ligand-receptor GABA s plazmatickými membránami nervových buniek. Neurochem. J. 8, 259�. doi: 10.1134/S1819712414040114

Zezula, J., Slaný, A. a Sieghart, W. (1996). Interakcia alosterických ligandov s GABAA receptory obsahujúce jednu, dve alebo tri rôzne podjednotky. Eur. J. Pharmacol. 301, 207�. doi: 10.1016/0014-2999(96)00066-0

Kľúčové slová: Selank, GABA, olanzapín, bunky IMR-32, génová expresia

Citácia: Filatova E, Kasian A, Kolomin T, Rybalkina E, Alieva A, Andreeva L, Limborska S, Myasoedov N, Pavlova G, Slominsky P a Shadrina M (2017) GABA, Selank a Olanzapine ovplyvňujú expresiu génov zapojených do GABAergická neurotransmisia v bunkách IMR-32. Predné. Pharmacol. 8:89. doi: 10.3389/fphar.2017.00089

Prijaté: 27. júna 2016 Prijaté: 13. februára 2017
Zverejnené: 28.2.2017.

Ashok Kumar z Floridskej univerzity, USA

Xiaogang Wu, Inštitút systémovej biológie, USA
Yi Hu, Shengjing Hospital, China Medical University, Čína

Copyright © 2017 Filatova, Kasian, Kolomin, Rybalkina, Alieva, Andreeva, Limborska, Myasoedov, Pavlova, Slominsky and Shadrina. Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný v súlade s podmienkami licencie Creative Commons Attribution License (CC BY). Použitie, distribúcia alebo reprodukcia na iných fórach je povolená za predpokladu, že je uvedený pôvodný autor (autori) alebo poskytovateľ licencie a že je citovaná pôvodná publikácia v tomto časopise v súlade s uznávanou akademickou praxou. Nie je povolené žiadne použitie, distribúcia alebo reprodukcia, ktorá nie je v súlade s týmito podmienkami.


Model CIE a jeho vzťah k ľudskému alkoholizmu

CIE: 1991–2006

Zistilo sa, že režim CIE na hlodavcoch s 5–6 g/kg EtOH podávaným potkanom sondou denne počas najmenej 40 dní (40–60 dní) [111] znižuje prah záchvatov na GABAergné konvulzívne liečivo pentyléntetrazol (PTZ , GABAAblokátor R-chloridového kanála) a táto zmena trvala najmenej 40 dní po zastavení EtOH (obr. 1), čo je dôležité, pretrvávanie zmien (podpaľovanie) bol závislý od prerušovaného režimu s opakovaným cyklickým útlmom CNS a rebound hyperexcitabilným miniodťahom (obr. 1a): nepretržité podávanie ekvivalentného množstva EtOH bez opakovaného prerušovaného vysadenia viedlo k jedinému vážnemu vysadeniu so záchvatmi, ale v priebehu niekoľkých dní došlo k na zviera na rozdiel od režimu CIE (obr. 1b). Iní pracovníci preukázali, že prerušované podávanie EtOH, vrátane období deprivácie, môže zvýšiť dobrovoľnú spotrebu [113, 114].

Časový priebeh behaviorálneho stavu a prah záchvatov PTZ u potkanov, ktorým bol podávaný EtOH sondou. a. Kreslené znázornenie stavu správania v priebehu času po podaní EtOH orálnou intubáciou (žalúdočnou sondou) u potkanov. EtOH vykazuje maximálnu absorpciu do mozgu

2 h, sprevádzané depresiou správania. Keď EtOH opustí mozog, aktivita (ľubovoľné jednotky, amplitúda závisí od dávky) sa vráti do normálu. Predtým, než je EtOH dokonca eliminovaný, behaviorálna aktivita sa vráti do normálu a prekročí, aby sa vytvorila odrazová hyperexcitabilita (stiahnutie), potom sa vráti do normálu do 24 hodín (modré kosoštvorce). CIE po 5 dávkach (ružové štvorce) znižuje počiatočnú depresiu (toleranciu) a spomaľuje návrat do normálu so zvýšenou závažnosťou rebound hyperexcitability. Po 60 dávkach (prázdne trojuholníky) u potkanov (30 u myší) sa zvýšený abstinenčný syndróm nevráti do normálu a zostáva zvýšený najmenej 40 – 120 dní, možno doživotne [109]. Toto je „zapálený“ stav CIE. b. Účinok CIE na prah záchvatov PTZ: pretrvávajúci pokles po ukončení liečby EtOH. EtOH, 5,0 g/kg/48 h, bol podaný orálnou intubáciou Prah PTZ záchvatu bol meraný 18 h po EtOH. CIV potkany testované v rovnakých časoch ako CIE potkany nevykazovali žiadne významné zmeny v PTZ záchvatoch. Vodorovné stĺpce označujú priemerný prah záchvatu PTZ. ** p < 0,01. Reprodukované z Kokka et al. (1993) [109] s povolením. * p < 0,05

Chronické opakovanie malých odberov vedie k pretrvávajúcemu stavu AWS, v ktorom sa odbery stávajú závažnejšími a dlhodobejšími, prípadne trvalými. Inými slovami, opakovanie mení relatívne normálnu mozgovú aktivitu zahŕňajúcu plasticitu na patologický stav nekontrolovanej hyperaktivity. Pripomína to fenomén vznietenia vo výskume epilepsie, pri ktorom môžu byť záchvaty vyvolané subkonvulzívnymi stimulmi po tom, čo sa opakovane opakujú [115, 116], v konečnom dôsledku sa záchvaty môžu stať spontánnymi, a keď sa tak stane, môžu sa vyskytnúť zvyšok života človeka. Jedným z aspektov ľudskej závislosti od alkoholu je zvýšená náchylnosť na záchvaty a delirium tremens a úprimné záchvaty sú spúšťané abstinenčným príjmom EtOH u veľmi silných abúzistov [117]. Väčšia náchylnosť a/alebo závažnosť záchvatov je spôsobená dlhšími obdobiami zneužívania EtOH a predchádzajúcimi abstinenčnými a/alebo abstinenčnými záchvatmi. Keď počet predchádzajúcich expozícií a abstinenčných epizód dosiahne určitú hranicu, závažný abstinenčný syndróm (AWS) [118] sa stane trvalým, možno trvalým. To viedlo k záveru o fenoméne podobnému zápalu v závislosti od ľudského EtOH [107, 112, 119, 120]. Významné zníženie prahu záchvatov však možno merať počas miniatúrnych odberov u potkanov po podaní EtOH [109, 121]. To naznačuje, že náchylnosť na záchvaty je v prvom rade neoddeliteľnou súčasťou abstinenčného syndrómu. Po druhé, zvýšená závažnosť a pretrvávanie náchylnosti na záchvaty sú znakmi a kritickými zložkami závislosti od alkoholu. Početné zvieracie modely využívajú tento režim podobný podpaľovaniu prerušovaných epizód intoxikácie a odvykania EtOH, tzv. chronický intermitentný etanol (CIE) [113, 122,123,124,125].

Ukázali sme to v CIE, GABAAVäzba R nebola veľmi ovplyvnená v celom mozgu, ale GABAAR funkcia, hodnotená neurochemickým testom stimulácie GABA 36 Tok Cl - v mozgových rezoch bol narušený špecificky pri formácii hipokampu, ale nie v dolnom colliculus, niekoľkých lalokoch kôry, talame, striate alebo mozočku. Použitím extracelulárneho záznamu elektród v hipokampálnych rezoch v spolupráci s Dr. Igorom Spigelmanom sme preukázali paralelné zníženie inhibície párových impulzov [126], ktoré bolo v súlade so zvýšením náchylnosti k záchvatom. Veatch a Gonzalez [127] predložili podobný dôkaz, že prerušovaný EtOH s viacnásobnými odbermi viedol k zvýšenej excitabilite špecificky v hipokampe, ako sa zistilo elektroencefalografiou (EEG). Ďalej sme ukázali malé zmeny v BZ modulácii GABAAVäzba R rádioligandu sprevádzaná významným zvýšením GABAAR α4 podjednotka mRNA hodnotená in situ hybridizačnou histochémiou, nárast bol relatívne väčší v hipokampe ako v talame, napriek vyšším hladinám podjednotky v talame [128]. To je v súlade so zvýšenou BZ-necitlivou GABAAR a behaviorálna a bunková tolerancia voči BZ. S intracelulárnymi ostrými elektródovými záznamami v hipokampálnych rezoch sme skutočne ukázali zníženie alosterickej modulácie GABAAR-sprostredkované postsynaptické potenciály BZ a steroidov, ale nie EtOH. Zvýšenie EtOH evokovaných synaptických potenciálov bolo, ak vôbec niečo, zvýšené [126, 129]. In situ hybridizácia a reverzná transkriptáza-polymerázová reťazová reakcia (RT-PCR) odhalili niekoľko zmien v GABAAR podjednotky v mozgu potkanov CIE, vrátane zvýšeného γ2S v hipokampe a zvýšenej väzby imidazo-benzodiazepínového rádioligandu [3H]Ro15–4513 na miesta necitlivé na diazepam v mozočku a prednom mozgu, o ktorých sa predpokladá, že zahŕňajú podjednotky α6 a α4. ukázal GABAAÚroveň mRNA podjednotky R sa mení v súlade so zmenenou expresiou [130].

Expozícia EtOH spôsobuje zmeny v GABA mozgu hlodavcovAZloženie a funkcia podjednotky R, ktorá hrá kľúčovú úlohu pri abstinenčných príznakoch a závislosti od EtOH. Ukázali sme [81, 131, 132], že liečba CIE a abstinenčné príznaky vedú k zníženiu GABA obsahujúcej podjednotku δ vylepšenú EtOHAR-sprostredkovaný extrasynaptický prúd (obr. 2a) koreloval s down-regulovanou δ podjednotkou (obr. 2b). To je sprevádzané zvýšenou citlivosťou GABA na EtOHAR miniatúrne postsynaptické prúdy (mIPSC, obr. 2a) korelovali s hipokampálnymi podtypmi α4βγ2 vrátane up-regulovaného α4 (obr. 2b) a synaptickou lokalizáciou demonštrovaná elektrónovou mikroskopiou so značením imunozlata po vložení (obr. 2c-d).

Plastické zmeny v GABAAR podjednotky a prúdy v hipokampálnej tvorbe potkanov indukované CIE. A. EtOH-vylepšené mIPSC pozorované v hipokampálnych rezoch z CIE vs. CIV. Vľavo hore na A, záznamy z CIV a CIE, vrátane vystavenia rôznym koncentráciám EtOH v záznamovej komore. Vpravo hore a, spriemerované mIPSC z každej periódy odozvy na aplikácie EtOH počas záznamov (vľavo od a). Dno a, Súhrn plochy mIPSC a tonického prúdu pre EtOH vs. pre-EtOH aplikáciu. Prekreslený z Liang et al., [81]. b. Horná časť: Súhrn analýz Western blot hipokampálnej GABAAPeptidy podjednotky R po CIE v porovnaní s CIV. Údaje sú prezentované ako percentuálne zmeny od priemeru hladín kontrolného peptidu ± SEM. (n = 10

12 potkanov). ** p < 0,01, t-test. b Dolná: GABAAHladiny mRNA podjednotky R testované pomocou PCR, normalizované na nezmenený referenčný gén GADPH. Údaje sú vyjadrené ako percento CIV skupiny (kontrola) priemer ± SEM, ** p < 0,01, t-test. c. Značenie imunozlatom po vložení odhaľuje zmenu v umiestnení α4, ale nie v umiestnení podjednotky δ z perisynaptických na synaptické miesta v molekulárnej vrstve DG po CIE. V CIV (horná a stredná časť c), značenie podjednotky a4 koloidným zlatom (šípky) bolo prítomné na alebo blízko plazmatickej membrány dendritov, ktoré boli v kontakte s axónovými terminálmi (T). Častice zlata sa nachádzali prevažne na vonkajších okrajoch symetrických synapsií (šípky), ale nie v strede týchto synapsií (šípky). Po CIE (spodná časť c), označenie pre α4 sa našlo hlavne v strede symetrických synapsií (šípky). d. Kvantitatívna analýza ukázala, že perisynaptické značenie sa našlo na 93 % synapsií značených a4 (prázdny stĺpec) v CIV (n = 3). V CIE (n = 3), perisynaptické značenie bolo pozorované pri 22 % (prázdny stĺpec) označených synapsií, ale synaptické označenie bolo evidentné pri 78 % označených synapsií (čierny stĺpec). * p < 0,001 vs. CIV. Na rozdiel od značenia α4 bolo označenie δ podjednotky (šípka) v CIE prítomné na perisynaptických miestach, ale nie v synaptickom kontakte (šípka). Obr. a, c, a d sú reprodukované z Liang et al. [81] s dovolením. Obr. b sú prekreslené z Cagetti et al. [131]

Pomocou podjednotkových špecifických protilátok sme merali GABAAR podjednotky pomocou Western blottingu v hipokampe potkanov CIE a preukázali významné, pretrvávajúce zvýšenie v podjednotkách α4 a γ2 s poklesom α1 a δ – inými slovami, čistý „prepínač podjednotiek“ α1 na α4 a δ na γ2. Použitím testov reverznej transkripčnej polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR) sme zistili, že CIE viedla k zvýšeným hladinám mRNA pre y2S, ale nie pre y2L, ako aj u zvierat liečených y1 podjednotkou, ale nie s α2 CIE, vykazovali zvýšenú úzkosť u zvýšených plus bludisko a tolerancia správania voči sedatívnym účinkom EtOH, BZ a neurosteroidov [131]. Steroidy a BZ vykazovali znížené zvýšenie GABAAR synaptické a tonické inhibičné prúdy v hipokampálnych neurónoch zaznamenané pomocou patch-clamp elektród v rezoch z potkanov CIE [132].

Nezdá sa, že by zmeny zistené po liečbe CIE zahŕňali žiadnu hrubú patológiu v mozgu alebo pečeni [126]. Mikroskopické vyšetrenie tkanivových rezov neodhalilo žiadne evidentné zmeny v morfológii a umiestnení neurónov syntetizujúcich GABA v hipokampe, talame alebo neokortexe [128]. Neovplyvnené stereologické počty buniek v nucleus accumbens rezov zafarbených NeuN neukázali žiadne rozdiely medzi CIE, jednodávkovým EtOH a zvieratami ošetrenými vehikulom (I Spigelman, N Ahmad, J Liang a RW Olsen, nepublikované).Tento výsledok nie je v súlade s dôkazom, že expozícia jednej veľmi vysokej dávke EtOH s hladinami v krvi nad 300 mg/dl, ako je to u ľudí pri nadmernom pití, alebo veľmi vysokej úrovni kumulatívnej expozície alkoholu, ako pri ľudskom chronickom alkohole zneužívanie spôsobilo významnú smrť neurónových buniek [133, 134]. Nenašli sme žiadne dôkazy o významnom zvýšení novorodených neurónov alebo o smrti kmeňových buniek v dentate gyrus (DG) potkanov CIE oproti normálnym kontrolám (I Spigelman, J Liang, RW Olsen a F Crews, nepublikované). V našich rukách teda vysoké hladiny EtOH v krvi podávané sondou, presahujúce 250 mg/dl počas niekoľkých hodín, ale nepresahujúce 275 mg/dl [65], boli nedostatočné alebo príliš krátke na to, aby spôsobili poškodenie hlásené pri iných extrémnych expozíciách EtOH. Napriek tomu je liečba CIE určite vážnym, abnormálnym stresom pre mozog.

Potkany CIE vykazujú zhoršené deficity priestorového učenia špecifické pre hippocampal [135], pravdepodobne v dôsledku znížených hladín neurosteroidov. Neurosteroidy (endogénne neuroaktívne steroidy pôsobiace ako GABAAR-PAM: Smith [58]) môže byť zvýšený akútnym EtOH a znížený chronickým EtOH [136, 137], a tak by sa mohol podieľať na GABAAR plastické zmeny vyvolané EtOH [59, 138]. Nebolo pozorované, že by hlodavce CIE vykazovali spontánne záchvaty, ale nebolo to študované s dostatočnou starostlivosťou, aby sa dospelo k záveru, že žiadne neexistujú.

CIE: 2007–2017

S pozorovaniami pozoruhodných GABAAR plasticitu vyvolanú CIE sme sa pokúsili naučiť molekulárne mechanizmy a funkčnú relevanciu prostredníctvom štúdií, aby sme určili minimálnu dávku, trvanie a frekvenciu podávania EtOH, ktoré sú potrebné na vyvolanie zmien. Zistili sme, že jediná vysoká, opojná dávka EtOH podaná žalúdočnou sondou bola schopná vyvolať mnohé z rovnakých zmien v správaní, GABAAZloženie podjednotky R a farmakológia hipokampálnych neurónov pozorované pri CIE, ale zmeny boli prechodné [65]. Ukázali sme teda, že do 1 hodiny sa podjednotky a4 a 5, ale nie podjednotky a1 alebo y2, znížili na bunkovom povrchu, čo bolo sprevádzané stratou zosilnenia EtOH tonických inhibičných prúdov, ale bez zmeny v synaptickej farmakológii. Prvým cieľom pôsobenia EtOH je teda extrasynaptická δ podjednotka obsahujúca GABAARs [68] sú prví, ktorí reagujú plastickými zmenami. Po 24 hodinách, ale nie po 1 hodine, bolo možné detegovať zvýšený povrch bunky a zvýšené celkové hladiny podjednotiek γ2 a α4, znížené hladiny podjednotky α1 a toleranciu na zvýšenie BZ extrasynaptických aj synaptických prúdov (obr. 3a, b) . Tieto zmeny sú pravdepodobne výsledkom zmenenej génovej expresie a môžu byť nejakým spôsobom spustené zníženou tonickou inhibíciou alebo dokonca zníženou synaptickou inhibíciou pozorovanou niekoľko hodín po EtOH. Zmenená syntéza proteínov môže byť tiež iniciovaná samotnou expozíciou EtOH, ale vyžaduje dlhší čas na dosiahnutie experimentálnej detegovateľnosti. O 12

Po 24 hodinách vykazovali zvieratá toleranciu voči strate vzpriamovacieho reflexu (LORR) indukovanej BZ a vysokou dávkou EtOH a synaptické prúdy sa stali citlivejšími na EtOH (ako v CIE), ale v priebehu niekoľkých dní sa vrátili do normálu. To zahŕňalo podjednotku 5, ktorá zostala nízka po dobu 1

2 dni a potom sa vrátil do normálu [65]. Všetky zmeny vyžadujú, aby sa režim CIE stal trvalejším, našťastie pre užívateľov alkoholu, ktorí majú možnosť zdržať sa chronického užívania. Ak tak neurobíte, nazýva sa AUD.

EtOH-indukovaná plasticita GABAAR podjednotky a prúdy u potkanov po jednodávkovom EtOH, CIE a dvojpulzovom EtOH. a: Súhrn zmien v mIPSC a b: inhibičné tonické prúdy po jednodávkovej aplikácii EtOH vs. pred aplikáciou EtOH (prekreslené z Liang et al. [65]). Jedna dávka EtOH indukuje stratu tonického prúdu citlivého na EtOH a zisk mIPSC citlivých na EtOH. Priemer ± SEM je znázornený ako % kontrol ošetrených vehikulom (červená prerušovaná čiara, n = 4–6. * p < 0,05). c: Biochemická analýza GABAAPlasticita podjednotky R u potkana DG do 24 hodín po jednorazovej dávke EtOH v porovnaní so zmenami vyvolanými CIE, 40-dňové stiahnutie. Hladiny povrchových bielkovín GABAAR podjednotky merané pomocou proteínového zosieťovania a Western blottingu. Priemer ± SEM ako % kontrol ošetrených vehikulom (červená prerušovaná čiara, n = 4–6. * p < 0,05). Expresia podjednotiek α2 a γ1 na bunkovom povrchu je up-regulovaná jednodávkovým EtOH aj CIE, celkový peptid γ1 je up-regulovaný, ale nie α2 a partnerstvá heteropentamérnych podjednotiek sú up-regulované α4βγ2 a α2β1γ1. d, Horný panel: Protokol experimentu s dvojitou dávkou EtOH. d, Dolný panel: Priemerná hodnota mIPSC z každého časového bodu odozvy na aplikácie EtOH počas záznamov. e: Súhrn akútnych EtOH-indukovaných zmien tonického prúdu a mIPSC (n = 5). f: Kvantifikácia povrchových hladín GABAAR (n = 4–6) pomocou Western blotov pre GABAARa4 a y1 po zosieťovaní v rezoch. g: Úzkosť testovaná pomocou EPM (n = 6). Doba trvania, počas ktorej potkany zostali v náručí (% z celkového počtu 5 minút). e,f,g: všetky stĺpce sú porovnané s kontrolou (hodnota E0 pre tento parameter): * p , 0.05 † p < 0,05. In e, kontrolná úroveň (prerušovaná červená čiara, pri 100 %) sa vzťahuje len na mIPSC v fčervená čiara sa vzťahuje na kontrolu (100 %) pre obe podjednotky v g, prerušovaná červená čiara zodpovedá bodu E0 pre otvorené alebo zatvorené ramená. c,d,e,f,g: od Lindemeyer et al., [30] so súhlasom

GABAAR plasticita indukovaná CIE preukázala koreláciu medzi stupňom tolerancie indukovanej pre sériu GABAergických sedatív-hypnotických liekov na produkciu LORR a stupňom tolerancie indukovanej pre rovnaké lieky na zvýšenie GABAAR-sprostredkované tonické inhibičné prúdy v hipokampálnych neurónoch [139]. Na druhej strane, antikonvulzívne a anxiolytické účinky GABAAR PAM (EtOH, neurosteroidy, propofol, barbituráty, ako aj GABA analóg gaboxadol vykazujú malú toleranciu [81, 131, 132, 135, 139]).

Hlodavce CIE a zvieratá ošetrené jednou dávkou EtOH však vykazujú zvýšenú citlivosť na GABAAR-sprostredkované mIPSC k modulácii nízkym mM EtOH v záznamovej komore [81]. V CIE sme pozorovali zvýšenie α4βγ2 GABAARs, vrátane pohybu α4 do postsynaptickej membrány. δ podjednotka nebola zvýšená a nehromadila sa v synaptickej membráne a zvýšená EtOH modulácia mIPSC bola tiež pozorovaná u myší s knockoutom bez alkoholu (KO) pre obe GABA.APodjednotka Rα4 [140] a podjednotka δ (J Liang, RW Olsen a I Spigelman (2002), nepublikované) a môže byť príčinou nedostatočnej redukcie mnohých EtOH správania u týchto myší [141,142,143]. Ďalej sme predpokladali, že tieto GABA citlivé na EtOHARs sú zjavne upregulované liečbou EtOH a môžu byť umiestnené v miestach mozgu, kde môžu sprostredkovať pokračujúcu citlivosť na EtOH v oblastiach potrebných na pozitívna odmena za posilnenie, ako aj anxiolytická účinnosť EtOH u závislého jedinca, zvieraťa alebo človeka. Preto sme sa pýtali: aké by mohlo byť zloženie podjednotiek GABAARs zodpovedné za túto zvýšenú citlivosť na EtOH mIPSC? Nižšie popisujeme náš objav GABAAR podtyp, ktorý spĺňa tieto požiadavky.

Model CIE sme rozšírili aj na myš [111] myš vyžadovala mierne upravený režim podávania EtOH kvôli vyššiemu metabolizmu, ale podarilo sa nám dosiahnuť podobný EtOH-indukovaný GABAAR plasticita ako u potkanov. Cieľom je vytvoriť myšací model s krátkodobým prerušovaným EtOH (SIE) na replikáciu informácií nájdených v zavedenom modeli chronického prerušovaného EtOH (CIE). V porovnaní s modelom CIE je možné myšací model SIE ľahšie kombinovať s genetickou technológiou pre hĺbkové štúdie základných mechanizmov alkoholizmu. Myši C57Bl/6 boli rozdelené do skupín s krátkym prerušovaným vehikulom (SIV) a SIE. Myšiam SIV a SIE bola podávaná sondou pitná voda alebo etanol každý druhý deň v piatich dávkach a od 11. dňa raz denne počas 30 dní. Myši SIV slúžili ako kontrolná skupina. Hodnotili sme zmeny v správaní po dvoch dňoch a 40 dňoch odňatia zo SIE a porovnali sme ich s CIE. Výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi správami a naznačujú, že myši SIE, podobne ako potkany CIE, majú väčšiu úzkosť, hyperexcitabilitu a toleranciu voči akútnemu LORR vyvolanému EtOH ako SIV [111]. Potom sme analyzovali geneticky upravené zvieratá pomocou GABAAR podjednotky knock out, in, alebo down [30, 140, 141, 144, 145]. Myš a4KO vykazovala zníženú GABAAR-sprostredkovaná tonická inhibícia v celom mozgu a znížené elektrofyziologické a behaviorálne účinky gaboxadolu [144], vrátane tiež zníženej modulácie tonických prúdov nízkym mM EtOH [140], ale bohužiaľ normálne behaviorálne reakcie na EtOH [141, 142]. V predbežnom hodnotení sme zistili, že myši α4KO vykazovali a otupený účinok liečby CIE, najmä eliminácia rozvoja tolerancie k intoxikačným účinkom EtOH, vrátane sedatívnych-hypnotických, motoricko-inkoordinačných účinkov [146]. Rozšírili sme model na primárne kultivované hipokampálne neuróny [147], kde mohli byť určité premenné kontrolované prísnejšie ako u zvieraťa. Expozícia kultivovaných neurónov (kultivovaných v embryonálnom veku 18 dní a študovaných ≥ 15 dní in vitro (DIV), ale nie skôr, v tom čase vykazovali expresiu podjednotiek δ aj tonické inhibičné prúdy zosilnené EtOH. rýchla down-regulácia tonických inhibičných prúdov zosilnených EtOH, ako aj down-regulácia ô podjednotky, napodobňujúca účinok EtOH in vivo [147].

Kovalentná biotinylácia proteínov bunkového povrchu (technika najvhodnejšia pre kultivované monodisperzné bunky) a zosieťovanie proteínov bunkového povrchu na ich vylúčenie z gélu SDS počas elektroforézy (technika najvhodnejšia pre mozgové rezy), ktorá rýchlo, v priebehu niekoľkých hodín a pravdepodobne minút down-regulácia a4βδ GABAARs vystavením EtOH zahŕňa internalizáciu proteínov (endocytózu). V prípade podjednotky δ je to závislé od klatrínu [71]. To je v súlade, ako je opísané vyššie, s extrasynaptickou 8 podjednotkou obsahujúcou GABAAR ako skoré odpovedajúce osoby na nízky milimolárny EtOH a pravdepodobne vyžaduje konformačnú zmenu v intracelulárnej doméne 5, aby sa mohla viazať na doplnkovú podjednotku klatrínu, keď GABAAR proteín viaže GABA „príliš dlho“, ako keď je koncentrácia GABA predĺžená pri vysokej koncentrácii alebo prítomnosťou PAM, ako je EtOH, aby sa zvýšila väzba GABA. Terunuma a kol. [56] ukázali, že počas status epilepticus sa predpokladá masívne uvoľnenie synaptickej GABA a väzba na synaptickú (α1, 2 a 3) podjednotku GABA.AMolekuly R vykazujú internalizáciu spúšťanú predĺženou aktivovanou proteínovou konformáciou, pričom podjednotka p3 sa stáva substrátom pre fosfatázu, ktorá odstraňuje fosfát a umožňuje endocytózu. Tento mechanizmus bol vylúčený pre GABA obsahujúcu ôAR [71]. Zníženie regulácie ô-GABAARs sa vráti do normálu po niekoľkých hodinách až dňoch odstránenia EtOH, ale nedokáže sa normalizovať po viacdávkovom režime CIE [65, 81]. Tvrdili sme, že to pravdepodobne nie je spôsobené smrťou alebo poškodením buniek. Jednou zvažovanou možnosťou je možná strata proteínového faktora stabilizujúceho polohu povrchu membrány, buď krehkého proteínu X FMRX alebo iného proteínu vykazujúceho zvýšenú transláciu regulovanú FMRX. Zistilo sa, že myši bez FMRX strácajú GABA na povrchu buniekAR 5 podjednotka bez zmeny celkového ô proteínu [148].

Hoci bola vykonaná väčšina meraní, odôvodnené zmenami GABA špecifickými pre daný regiónAR farmakológia a expresia súvisiaca s pôsobením EtOH, v hipokampálnej formácii, zmeny v GABA citlivom na EtOHAR s v celom CNS sú pravdepodobné (bazolaterálna amygdala: [149,150,151] ventrálna tegmentálna oblasť: [152], nucleus accumbens: [153]), čo ovplyvňuje mnohé druhy správania. Očakávalo by sa, že budú vykazovať regionálnu a bunkovú špecifickosť, ak závisia od prítomnosti GABAASubtypy R, ktoré sme našli, sú down-regulované (δ, α1) alebo up-regulované (α4, α2) expozíciou EtOH. Navrhujeme, aby plastické zmeny v hipokampe boli modelom pre zmeny v iných regiónoch a mohli by zahŕňať oblasti/okruhy kritické pre systém odmeňovania dopamínu (ventrálne striatum/nucleus accumbens a ventrálna tegmentálna oblasť), ako aj pre udržiavanú anxiolýzu (amygdala, hippocampus) u jedinca závislého od EtOH, hlodavca alebo človeka.

Najnovšie novinky o modeli hlodavcov CIE od AUD

Akútna a chronická intoxikácia EtOH u potkanov zvýšila povrchové hladiny GABAAProteín podjednotiek R a2 a y1 v hipokampe pomocou zosieťovania a Western blotov. Podávanie CIE a jednodávkového EtOH zvyšuje GABAARs zložené z α2β1γ1 podjednotiek, ktoré sa viažu na gefyrín, demonštrované koimunoprecipitačnými (co-IP) experimentmi [30]. Aby sa určilo, ktoré podjednotky sú partnermi y1, ko-IP γ1 aj y2 (pozitívna kontrola), Western bloty boli testované na al, α2, α4 a α5. Na rozdiel od γ2, o ktorom sa zistilo, že sa spája s rôznymi α podjednotkami, γ1 je primárne spoluzostavený s α2 podjednotkou (obr. 3c). yl protilátka neko-IP y2 a naopak. Výhodný partner podjednotky p pre GABA obsahujúci a2y1ARs bol identifikovaný pomocou ko-IP s β1-, β2- alebo β3-špecifickými protilátkami, sondovaním na y1 a y2. γ1 prednostne tvoril receptorový komplex s β1 podjednotkou, v malom rozsahu s β3 a bez β2. Naproti tomu γ2 sa rovnako spájal s β1 a β3 a o niečo menej s β2. Tieto údaje identifikujú GABAARs zložené z α2, β1 a γ1 podjednotiek v hipokampálnych CA1 a DG oblastiach, o ktorých sa zistilo, že sú up-regulované po CIE a jednodávkovej expozícii EtOH (obr. 4). Selektívne spojenie y1 s a2 umožňuje použitie y1 ako markera pre up-regulovaný súbor bunkových povrchových a2 podjednotiek (menší podtyp a2, ktorý prednostne spolupracuje s y2). Western blotting s gefyrínovou protilátkou naznačuje aspoň určitú postsynaptickú lokalizáciu receptorov obsahujúcich y1 na inhibičných synapsiách. Štúdiami co-IP na solubilizovaných membránových proteínoch z hipokampu potkanov liečených CIE sme tiež ukázali, že predtým opísané [81] up-regulované podjednotky α4 a γ2 a downregulované podjednotky α1 a δ sú sprevádzané sieťovým prepínačom v partnerstve α4 z δ na γ2 a spojenie γ2 z α1 do α4 je nový α2 selektívne spojený s γ1, β1 a gefyrínom [30]. To ukazuje, že up-regulovaná GABAAR subtypy sú a4pγ2 a alp1y1. Tieto upregulované podtypy sú pravdepodobne uspokojivé na nahradenie stratených synaptických a extrasynaptických inhibičných prúdov normálne sprostredkovaných EtOH-indukovanou GABAAR podtypy [67].

Kinetické vzorce mIPSC buniek hipokampu pre GABAAR podtypy u potkanov CIE a myší a4KO. A: mIPSC vzorky stôp potkanov liečených CIE vs. CIV a a4KO a WT myší v hipokampálnych DG bunkách. B: Spriemerované vzory tvaru mIPSC zistené pomocou DataView odhalili 3–4 relatívne hojné odlišné šablóny. V CIV boli detegované mIPSC vzory „a“, „c“ a „d“. Vzor „a“ je štandardný tvar, typické vzory kinetiky vzostupu a rozpadu „c“ a „c“ sú vzory pomalého vzostupu a pomalého rozpadu, ktoré hojne korelujú (tu nie sú uvedené) s podtypmi podjednotiek a2. V CIE boli tiež zistené tri vzory mIPSC, ale vzor „a“ nebol v CIE videný a nahradený vzorom pomalšieho rozpadu „b“. Pozri text na interpretáciu, že „a“ je hlavne α1 a „b“ sú hlavne podjednotky α4 (ako v Liang et al., 2006). Vzory mIPSC u myší WT a a4KO sú podobné ako u potkanov CIV, s vrcholmi „a“, „c“ a „d“. Množstvo vzoru „d“ sa však zvýšilo v CIE v porovnaní s CIV a u myši α4ko v porovnaní s WT. Pretože myš CIE, ale nie CIV a myš a4KO, ale nie WT, vykazovali mIPSC vylepšené EtOH, skúmali sme záznamy týchto štyroch skupín zvierat s 50 mM EtOH (E50, prerušovaná čiara) v porovnaní s bez EtOH (E0, plná čiara) v zázname. komora. Vrcholový vzor „a“ nebol významne posilnený EtOH, ale „b“, „c“ a „d“ boli vylepšené. Vrchol „b“ v CIE koreluje s upregulovaným α4 a nie je viditeľný u myši α4KO. Vrchol „d“ je up-regulovaný u potkanov CIE aj u myší α4KO, rovnako ako povrchová expresia podjednotky α2, a vrchol „d“ má pomalú kinetiku konzistentnú s podtypmi podjednotky α2. Jeho zvýšenie abundancie koreluje so zvýšenou priemernou stimuláciou EtOH v záznamovej komore pre CIE aj α4KO. Reprodukované z Lindemeyer et al. [30] so súhlasom

Časovo závislé zmeny GABA obsahujúceho α4 a α2γ1ASubtypy R sú úzko korelované s up- a down-reguláciou mIPSC citlivých na EtOH a úzkosťou z vysadenia po jednej alebo dvoch dávkach EtOH. Subtypy α2β1γ1 a α4βγ2 receptora majú podobný, ťažko rozlíšiteľný farmakologický profil, takže sme ich nemohli jednoznačne rozlíšiť na základe farmakológie. Aby sme lepšie porozumeli procesu synaptickej reštrukturalizácie vyvolanej CIE, študovali sme účinky na potkany, ktorým bola podaná jedna dávka a dvojitá dávka EtOH (obr. 3d, e, f, g). Zvieratá, ktorým bola podaná jedna dávka EtOH (5 g/kg) opakovane po 48 hodinách, ukážu do 1

2 ha paralelná strata α4 a γ1 (marker pre α2), strata mIPSC vylepšených EtOH v záznamoch náplasťových svoriek hipokampálnych rezov a strata abstinenčných príznakov pozorovaných 48 hodín po prvej dávke EtOH (tolerancia na EtOH a BZ -LORR zvýšil úzkosť pomocou techniky zvýšeného plusového bludiska (EPM) a citlivosť na záchvaty PTZ. Opätovné testovanie 48 hodín po 2. dávke EtOH ukázalo návrat paralelne so všetkými vyššie uvedenými: úzkosť, mIPSC citlivé na EtOH a up-regulované a2 a a4 (obr. 3d, e, f, g). Takže buď a2 alebo a4 môžu sprostredkovať mIPSC citlivé na EtOH.Štyridsaťosem hodín po 1. dávke EtOH („jednodávka“) sú viditeľné už opísané zmeny (abstinenčné správanie vrátane tolerancie na EtOH a BZ sedáciu a LORR zvýšená hyperaktivita vrátane zvýšenej citlivosti na PTZ záchvaty a zvýšená úzkosť pri strate EPM EtOH-posilnený tonický inhibičný GABAAR prúdy, ale objavenie sa mIPSC vylepšených EtOH a down-regulácia δ a al a začiatok up-regulácie α4βγ2 GABAAR. Teraz sa podá 2. EtOH. Do 1

Po 2 hodinách zmizli mIPSC citlivé na EtOH zvýšený povrch α4 a γ1 (marker pre podskupinu α2-GABAAR, podtyp α2β1γ1) sú preč a úzkosť z vysadenia je znížená. 48 hodín po 2. dávke EtOH sa všetky tieto parametre vracajú na úrovne pozorované 48 hodín po 1. dávke EtOH: sú prítomné mIPSC citlivé na EtOH α4 a sú prítomné podjednotky γ1(α2) je prítomná abstinenčná úzkosť (obr. 5). Teda GABA s obsahom a4 aj a2ASubtypy R sa rýchlo menia hore a dole po EtOH, jednej alebo dvoch dávkach, a tento prístup nedokáže rozlíšiť, čo môže byť dôležitejšie pre mIPSC citlivé na EtOH, možno sú dôležité oba [30].

Rozumná hypotéza GABAAPlasticita podjednotky R indukovaná do dvoch dní jednou dávkou EtOH. Podávanie EtOH potkanom vedie k zmenám fyzikálno-farmakologických vlastností v inhibičnom synaptickom prenose sprostredkovanom GABAergným ionotropným receptorom v hipokampe. Text vpravo na obrázku vysvetľuje časový priebeh plasticity vyvolanej EtOH a ako tieto isté zmeny pretrvávajú po ošetrení CIE. Reprodukované z Lindemeyer et al. [30] so súhlasom

CIE indukuje up-reguláciu jedného alebo viacerých GABAAR podtypy s pomalou kinetikou rozpadu mIPSC. Aby sme lepšie pochopili, ako zmeny v kombináciách podjednotiek menia GABAAFunkciu R a citlivosť na akútny EtOH sme merali mIPSC v DGC z hipokampálnych rezov potkanov liečených CIV (kontrola) a CIE (obr. 4A) a analyzovali sme ich na tvarové vzory pomocou optimálne škálovanej šablónovej metódy [154] implementovanej v DataView softvér na identifikáciu kinetických vzorcov mIPSC (napr. rýchly vzostup a rýchly rozpad, pomalý vzostup a pomalý rozpad). Potom sme tieto identifikované vzory použili ako šablóny na detekciu odlišne tvarovaných mIPSC v záznamových stopách. Bola nastavená prijateľná úroveň chyby, čo je stupeň podobnosti udalosti so šablónami, aby bola zahrnutá do výsledkov vyhľadávania. Zistili sme, že mIPSC vykazovali v záznamoch niekoľko relatívne konzistentných vzorov vĺn. Zistené vzory vrcholov mIPSC sa spriemerovali, vzory mIPSC sa klasifikovali (obr. 4B, a, b, c a d) a určili sa ich kinetické rozpadové konštanty τ a spočítalo sa % abundancia každého templátu (nie je znázornené na obrázku ) v dostatočne veľkej epoche záznamov ako na obr. 4A.

Zdôvodnili sme to rôznymi GABAAO subtypoch R sa tvrdilo, že sú rozpoznateľné ako rôzne subtypy obsahujúce podjednotky na základe kinetiky mIPSC. Natívna alebo rekombinantná GABA obsahujúca rôzne a podjednotkyAR s αβγ2 [155,156,157] bolo možné od seba odlíšiť, α1 rýchlejšie ako α2 a možno ich detegovať v neurónoch podľa tvarov vrcholov ich mIPSC, ktoré poskytujú „odtlačok prsta“ pre jednotlivé podjednotky α vrátane α2. Rekombinantné α4β2γ2 majú zrýchlenú deaktiváciu v porovnaní s ich náprotivkami α1 alebo α5, čo koreluje s up-regulovanou α4 podjednotkou v hyperexcitabilnom modeli skúmajúcom hipokampálne rezy u potkanov, ktorým boli odobraté neurosteroidy [158]. Tiež receptory obsahujúce podjednotku y1 (najmä s a2) vykazujú pomalšiu rýchlosť aktivácie a deaktivácie ako príslušné GABA obsahujúce y2ARs vyjadrené v upravených synapsiách [159]. Čas nábehu mIPSC je citlivý na viaceré fyzikálne premenné synaptického prenosu iné ako zloženie podjednotiek receptora [160] Čas rozpadu je však na tieto premenné menej citlivý, pretože sú skôr náhodné, ale citlivejšie na povahu postsynaptických receptorových kanálov, ako je rýchlosť uzatvárania kanála a disociácie agonistu [161], tvar mIPSC je vysoko citlivý na synapticky uvoľnené maximálne koncentrácie GABA a trvanie [162], ale [citovať], „diferenciálna expresia GABAAR α podtypy s premenlivým alebo konštantným pomerom medzi synapsiou a synapsiou a bunkou k bunke im umožňujú splniť individuálne bunkové požiadavky v dynamike siete“ [163].

CIV zvieratá vykazovali tri odlišné vzory mIPSC vĺn (obr. 4B): jeden štandardný vzor („a“, hojnosť

48 %) a ďalšie dve vykazujú pomalší vzor rozpadu („c“,

16 %). Zvieratá CIE tiež vykazovali tri odlišné tvary mIPSC, ale jeden sa zmenil: „rýchly“ vzor rozpadu (vrcholový vzor „b“,

42 %) a dva zjavne podobné vzorom CIV s pomalým rozpadom (vrcholový vzor „c“,

22 %) a vzor veľmi pomalého rozpadu (vrcholový vzor „d“,

36 %). Štandardný vzor vrcholu „a“ pozorovaný v CIV zmizol v CIE, zatiaľ čo pomer „c“ k „d“ sa obrátil, od

2:3 (CIE). Čo je tiež dôležité, vzor „d“ sa jasne zvýšil v hojnosti, zatiaľ čo „c“ sa mohol znížiť [30].

Aby sme lepšie porozumeli rôznym vzorom vrcholov, ktoré môžu niesť konkrétne GABAAR podtypy sme rozšírili túto analýzu na geneticky upravené α4KO myši (obr. 4B). Vzory mIPSC u myší WT, neošetrené. „a“, abundancia 46 % „c“, abundancia 36 % „d“, 18 % sú podobné CIV potkanom, zatiaľ čo myši α4KO vykazujú vzory mIPSC tvaru „a“ (hojnosť

35 %), so zvýšeným výskytom „d“ (

29 %) (obr. 4B [množstvo nie je znázornené na obrázku]).

EtOH (50 mM) perfundovaný do záznamovej komory zosilnil mIPSC predĺžením doby rozpadu a/alebo zvýšením prenosu náboja (plocha pod krivkou), ako bolo predtým pozorované Liangom a kol., [81]. U potkanov CIE sme preto skúmali, či aplikácia EtOH (50 mM) zvýšila prúd rôznych typov detekovaných mIPSC (obr. 4B). Zistili sme, že akútny EtOH zosilnil niektoré špecifické GABAAR mIPSC. Plocha mIPSC sa značne zvýšila v CIE vzore „d“ s EtOH v záznamovej komore (obr. 4B), rovnako ako jeho množstvo ako zlomok celkových mIPSC v záznamovej stope. In vitro citlivosť na moduláciu EtOH korelovala v čase s up- a down-reguláciou α4- a najmä α2-obsahujúcej GABAADruhy subtypu R (obr. 4B). Vzorec vrcholov mIPSC „a“ predtým [81] koreloval s down-regulovanými podtypmi α1 a vzor vrcholu „b“ koreloval so synaptickým podtypom α4 regulovaným CIE. Ale čo GABAAPodtypy R predstavujú vrcholy „c“ a „d“? Tieto bunky tiež obsahujú a2- a a5-GABAAR podtypy. α2 sa považujú za synaptické a α5 za primárne extrasynaptické [164, 165]. Vrchol „d“ je takmer určite upregulovaný podtyp α2. Aby som to zhrnul, dve nové GABAASubtypy R sú up-regulované po akútnej liečbe EtOH a CIE. Hladiny bunkového povrchu oboch podtypov sú tesne synchronizované pri podávaní jednej alebo dvoch dávok EtOH so zmenami v úzkostnom správaní a množstvom mIPSC vylepšených EtOH. Priamo sme súviseli so zmenami v povrchovej expresii GABAAR podjednotky (down-regulácia α1 a δ, up-regulácia α4, α2, γ1 a γ2) s poklesom heteropentamérnych extrasynaptických α4βδ- a synaptických α1βγ2-obsahujúcich GABAARs a zvýšenie postsynaptických GABA obsahujúcich α4βγ2 a α2β1γ1ARs v hipokampálnych neurónoch (obr. 5).

Up-regulované a2 podtypy korelovali s výskytom synaptických prúdov zosilnených EtOH (>10 mM). EtOH-enhanced mIPSCs boli tiež pozorované u neliečených a4KO myší [140, 145], v ktorých EtOH-senzitívny podtyp nemôže obsahovať a4. α2 podjednotka je lokalizovaná spolu s gefyrínom a presynaptickou dekarboxylázou kyseliny glutámovej (GAD) v telách buniek DGC aj v počiatočných segmentoch axónov [163] a je up-regulovaná v hipokampe myší α4KO [140, 145]. Pokles α1βγ2- a zisk α4βγ2- a α2β1γ1-obsahujúcich GABAARs menia kinetiku a farmakologické vlastnosti mIPSC. Už predtým sme zistili znížené zvýšenie konštánt rozpadu mIPSC diazepamom alebo zolpidemom a výrazne zväčšenú plochu parciálnym inverzným agonistom imidazobenzodiazepínu Ro15–4513 v hipokampálnych rezoch po CIE [65, 81, 131, 132, 139] a jednodávkovej liečbe vivo [65]. Tieto farmakologické a podjednotkové zmeny sa reprodukovali v primárnych kultivovaných embryonálnych hipokampálnych neurónoch po 15 dňoch in vitro, 24 hodín po 30-minútovej expozícii EtOH (50 mM) [147].

Obr. 5 ukazuje rozumnú hypotézu GABAAR plasticita indukovaná EtOH v potkanom hipokampe (aktualizované z Liang et al., [65]). To ukazuje, ako synaptická a extrasynaptická GABAAPodtypy R sa rýchlo menia v povrchovej expresii po in vivo expozícii EtOH a že plastické zmeny sa stávajú perzistentnými po ošetrení CIE. Všimnite si, že v tejto zjednodušenej karikatúre sme zoskupili všetkých hráčov hry do jednej synapsie, čo pravdepodobne nebude skutočná situácia.

AUD ako aberantný fenomén plasticity GABAAR v mozgu [67]

EtOH indukuje down-reguláciu receptorov prvej odozvy, čo spôsobuje akútnu toleranciu voči EtOH a tiež spúšťa stratu ďalšej GABAAR podtypy, ktoré vedú k hyperexcitabilite. Adaptácie na korekciu tejto zmeny síce obnovia inhibíciu, ale je to abnormálne a zvieratá zostávajú hyperexcitabilné. Hoci EtOH-sedatíva GABAAR sú preč, náhrada GABAARs vykazujú synaptickú GABA vylepšenú EtOHAR inhibičné prúdy [81]. Potkany liečené CIE, ktoré vykazujú „podnecovanie“ GABAAZáchvaty vyvolané PTZ konvulzívnym liekom blokujúcim R kanál [109] a zvýšená úzkosť [131] a tolerancia na sedatívno-hypnotické účinky vyvolané EtOH, BZ a všetkými GABAergickými spánkovými pomôckami (a pravdepodobne insomnia rezistentná na lieky u človeka) [139 ], nevykazujú toleranciu voči anxiolytickému účinku EtOH u závislých potkanov CIE [81] a pravdepodobne u závislých ľudí. Domnievame sa, že zachovaná citlivosť na anxiolytické účinky EtOH je dôležitá pre rozvoj abstinenčného pitia. Charakteristickým znakom závislosti od alkoholu je zvýšené pitie, čo mnohí preukázali ako výsledok liečby CIE u hlodavcov [113, 124]. Všetky tieto behaviorálne znaky závislosti od alkoholu pretrvávajú 4

12 mesiacov a pravdepodobne na celý život [67, 109]. Dozvedeli sme sa, že nová synaptická GABA vylepšená EtOHAR v CIE sú up-regulované α4βγ2 a najmä α2β1γ1.

Zmeny správania AWS možno vysvetliť trvalo zníženou GABAAR-sprostredkovaná inhibícia v dôsledku plasticity GABA indukovanej EtOHARs. Keď sa to stane trvalým v dôsledku liečby CIE, možno to nazvať „aberantná plasticita“ [109]. Receptory pre veľmi dôležité rýchle neurotransmitery glutamát, a najmä GABA, sú náchylné na aberantnú plasticitu a sú schopné spôsobiť najväčšie škody [166]. V prípade CIE má liečený jedinec všetky príznaky AWS, čo je extrémny hyperexcitabilný stav, ktorý prispieva k zvýšenej spotrebe EtOH. Úzkosť (pocit stresu), nespavosť a zvýšená náchylnosť na záchvaty (zapálenie?), tiež aspekty AWS, sa zdajú byť kritickými aspektmi rozvoja závislosti [67, 107, 120, 167]. Nevieme však, aké ďalšie faktory vrátane génov náchylnosti, ak nejaké existujú, sú potrebné na vytvorenie skutočnej závislosti (alkoholizmu).


Ubikvitinácia, proteazómy a GABAA receptory

Inhibičná neurotransmisia kyselinou γ-aminomaslovou (GABA) je regulovaná počtom a subcelulárnou lokalizáciou GABAA receptory v membráne cieľového neurónu. Nová štúdia naznačuje, že proteín Plic-1 podobný ubikvitínu stabilizuje intracelulárnu GABAA receptorov a podporuje ich akumuláciu v plazmatickej membráne.

Jednoduchá stratégia na úpravu odozvy na GABA je zmeniť počet GABAA receptory nachádzajúce sa na bunkovom povrchu, najmä na postsynaptických miestach. Tieto receptory sú heteropentamérne iónové kanály zložené z rôznych kombinácií variantov podjednotky a a p v kombinácii s tretím typom podjednotky, najčastejšie podjednotkou y2. V snahe hľadať proteíny, ktoré riadia membránový prenos GABAA Bedford a spolupracovníci použili kvasinkový dvojhybridný systém na izoláciu novej GABAA-partneri viažuci sa na receptory. Izolovali Plic-1, potkaní proteín s relatívnou molekulovou hmotnosťou 67 000 (Mr 67K), ktoré boli predtým opísané u iných druhov a vyznačujúce sa amino-koncom podobným ubikvitínu a doménou spojenou s ubikvitínom (UBA)1,3. Plic-1 špecificky interaguje s druhou intracelulárnou slučkou väčšiny, ak nie všetkých variantov podjednotky a a p prostredníctvom svojej domény UBA. Toto zistenie naznačuje, že Plic-1 sa spája so všetkými prirodzene sa vyskytujúcimi podtypmi GABAA receptor, bez ohľadu na ich podjednotkové zloženie a konečné miesto určenia na povrchu nervových buniek.