Informácie

Na akom konci dochádza k polymerizácii mikrotubulov?

Na akom konci dochádza k polymerizácii mikrotubulov?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Moja kniha hovorí, že k polymerizácii a depolumerizácii mikrotubulov dochádza na + konci, našiel som však poznámku, ktorá hovorí, že k depolymerizácii dochádza na - konci. Prosím o pomoc :) ďakujem


Z mojej učebnice Campbellovej biológie (deviate vydanie):

Kvôli orientácii tubulínových dimérov sú dva konce mikrotubulu mierne odlišné. Jeden koniec môže akumulovať alebo uvoľňovať tubulínové diméry oveľa vyššou rýchlosťou ako druhý, čím sa výrazne zväčšuje a zmenšuje počas bunkových aktivít. (Toto sa nazýva "plus koniec", nie preto, že môže pridať iba tubulínové proteíny, ale preto, že je to koniec, kde sú miery "zapnuté" aj "vypnuté" oveľa vyššie.)

Takže v súhrne: polymerizácia a depolymerizácia prebieha na oboch koncoch + a -. "+" a "-" iba označujú rýchlosť/účinnosť polymerizácie a depolymerizácie.


Prakticky povedané, nukleácia mikrotubulov nastáva na kladnom konci. Toto je dobre zavedené in vivo a in vitro. Je pozoruhodné, že mínusové konce vo väčšine buniek sú „uzavreté“, takže dynamika nenastáva (myslite na centrozóm).

Nedávno sa však objavila správa o polymerizácii MT na mínusovom konci v článku; toto je v súčasnosti ďaleko od konsenzu medzi odborníkmi a vyžaduje si to oveľa viac štúdia. Napriek tomu je rýchlosť akéhokoľvek rastu a zmršťovania na mínusovom konci výrazne pomalšia ako na plusovom konci, ako je uvedené vyššie.

Takže pre testovaciu otázku plus koniec je miesto polymerizácie.


Polymerizácia aj zmršťovanie mikrotubulov prebieha na plusovom konci a mínusovom konci je ukotvený v MTOC, teda dynamický koniec


Dynamika mikrotubulov a MAP

Mikrotubuly sú polyméry tubulínu zapojené do viacerých bunkových procesov, vrátane tvorby mitotického vretienka, bunkového transportu, cytokinézy, bunkovej motility, tvaru bunky a morfogenézy. Tento miniprehľad sa zameriava na všeobecné mechanizmy, ktoré riadia dynamiku mikrotubulov, so špeciálnym zameraním na to, ako dochádza k nukleácii mikrotubulov v MTOC (Microtubule Organizing centers) a ako proteíny spojené s mikrotubulami (MAPY) a ďalšie mechanizmy regulujú funkciu mikrotubulov.

Proteín viažuci mikrotubuly (kinezín, motorický proteín) viažuci sa na mikrotubuly

Objavte Cubix

Súhrn technológií 3D kultivácie buniek novej generácie.


Tvorba a lámanie mikrotubulov

Obrázok: Mikrotubuly sa zvyčajne skladajú z asi 13 protofilamentov vytvorených z párov tubulínových proteínov, ktoré sú usporiadané vedľa seba a pozdĺžne sa rozprestierajú, aby vytvorili steny valca. (Obrázok od Nogalesa a kolegov, Kenneth Downing lab)

Výskumníci po prvýkrát odhalili na molekulárnej úrovni formy, ktoré nadobúdajú prechodné štruktúry tubulínu (proteínu, z ktorého sa tvoria mikrotubuly) počas montáže a demontáže mikrotubulov. Podrobnosti týchto zvláštnych štruktúr ukazujú, ako väzba nukleotidu guanozíntrifosfátu, GTP, na tubulín, riadi aktivitu na rastúcom konci mikrotubulu. Eva Nogales a Hong-Wei Wang z Divízie biologických vied Národného laboratória Lawrence Berkeley ministerstva energetiky uvádzajú svoje zistenia vo vydaní časopisu zo 16. júna 2005 Príroda.

"Tubulín je hlavným cieľom protirakovinových liekov, ktoré môžu zabrániť prechodu z rastúceho do zmenšujúceho sa stavu alebo naopak," hovorí Nogales, ktorý je tiež členom divízie fyzikálnych biologických vied v Berkeley Lab, docentom biochémie a molekulárnej biológie. Kalifornskej univerzity v Berkeley a vyšetrovateľ lekárskeho inštitútu Howarda Hughesa. "Predtým sme vyrábali štruktúry stabilizovaných tubulínových štruktúr s vysokým rozlíšením, ale nikto nepoznal štruktúru prechodných stavov. Naším cieľom bolo pochopiť proces montáže a demontáže mikrotubulov."

Wang hovorí: "Naša súčasná práca v skutočnosti odhalila štruktúry rôznych tubulínových zostáv na samotných koncoch rastúcich mikrotubulov a depolymerizujúcich mikrotubulov. To umožňuje nové pochopenie mechanizmu dynamickej nestability mikrotubulov, otvárajúc príležitosti pre nové experimenty testujúce fyziologické úlohy týchto mikrotubulov." medziprodukty mikrotubulov v bunke."

Richard Rodewald, programový dôstojník a bunkový biológ z Národného inštitútu všeobecných lekárskych vied, ktorý výskum financoval, poznamenal, že „tieto štúdie poskytujú presvedčivý model, v elegantných atómových detailoch, ako vedie väzba GTP na konkrétne miesto v tubulíne. k ďalekosiahlym štrukturálnym zmenám, ktoré poháňajú rast mikrotubulov."

Budovanie mikrotubulu

Mikrotubuly sú polyméry, ktorých základnými jednotkami sú páry (diméry) podobných, ale nie identických tubulínových proteínov, nazývaných alfa a beta formy. Počas polymerizácie sa diméry naskladajú od konca k druhému, aby vytvorili protofilament. Asi trinásť protofilamentov je usporiadaných vedľa seba, rozprestierajúcich sa pozdĺžne, aby vytvorili steny valcového mikrotubulu.

Takzvaný mínusový koniec mikrotubulu rastie pomaly a je často ukotvený v bunkovej štruktúre. Druhý koniec, plusový koniec, je ohniskom aktivity. V prítomnosti GTP protofilamenty mikrotubulov získavajú viac tubulínových dimérov a celý mikrotubul sa rýchlo rozťahuje na mnoho milióntin metra, kým sa náhle vypne a znova sa zmrští.

Nukleotidy ako GTP sú najlepšie známe ako jednotky nukleových kyselín DNA a RNA, ktoré pozostávajú zo zásady (písmeno v genetickom kóde) plus cukru a troch fosfátových skupín. Ale tieto molekuly tiež regulujú aktivitu enzýmov a hrajú kľúčovú úlohu pri kontrole rastu mikrotubulov.

Keď sa GTP viaže na konkrétny lokus na beta tubulíne (E-miesto alebo vymeniteľné miesto), dochádza k polymerizácii: tubulínové diméry sa hromadia na protofilamentoch a mikrotubuly rastú. Ale prostredníctvom hydrolýzy (toto slovo znamená "štiepenie vody") sa GTP ľahko zmení na iný nukleotid, guanozíndifosfát alebo GDP. Tubulín naviazaný na GDP depolymerizuje mikrotubuly zvinutím protofilamentov na svojom plusovom konci a ich roztiahnutím.

Hoci bolo známe, že tubulín polymerizuje v prítomnosti GTP a depolymerizuje v prítomnosti GDP, pred Nogalesom a Wangom nebolo možné vizualizovať, čo sa štrukturálne dialo počas týchto rýchlych prechodných stavov. Potom, hovorí Nogales, "Hong-Wei našiel biochemické triky na spomalenie prechodov takmer až k ich zastaveniu."

Kryoelektrónová mikroskopia (kryo-EM) je schopná zachytiť takéto polymérne štruktúry bez toho, aby ich bolo potrebné rozložiť a kryštalizovať jednotlivé podjednotky na rôntgenovú difrakčnú analýzu. X‑difrakcia žiarenia by mohla umožniť vyššie rozlíšenie, ale stratila by všetky informácie týkajúce sa kontaktov medzi podjednotkami počas polymerizácie. "S cryo-EM sme zmenou parametrov mohli vidieť, ako sa rôzne polymérne formy konvertujú," hovorí Nogales.

Nogales a Wang sa najskôr zaoberali procesom depolymerizácie a sledovali, čo sa stane s mikrotubulami, keď je GDP naviazaný na tubulín. Počas tohto procesu sa protofilamenty tubulínu od konca mikrotubulu prudko zakrivujú a vytvárajú „šupky“ ako drevené hobliny, ktoré sa stáčajú z roviny. Wang našiel podmienky, pre ktoré sa kučery tubulínu naviazaného na GDP uzatvárajú do skúmaviek, pričom protofilamenty sú tesne ovinuté okolo osi skúmavky. Tieto rúry sú dvojvrstvové, čo je vlastnosť, ktorá prispieva k ich stabilite – no zároveň to projekt na dlhý čas brzdí.

"Kľúčom bolo uzamknúť zostavy tubulínu v správnych stavoch vhodných na štrukturálnu analýzu, ale ešte náročnejšie bolo nájsť algoritmus na rekonštrukciu dvojvrstvových trubíc GDP-tubulín," hovorí Wang.

„Vzhľadom na dvojvrstvové vlastnosti sme nemohli použiť klasické špirálové metódy rekonštrukcie,“ hovorí, „ale neboli k dispozícii žiadne iné metódy, keď sme s projektom začínali. Museli sme stráviť viac ako dva roky vývojom a implementáciou našich vlastný algoritmus. Keď bol pripravený, boli sme schopní získať správnu rekonštrukciu za menej ako tri mesiace.“

Ďalej sa výskumníci zaoberali procesom polymerizácie a sledovali, čo sa stane, keď sa GTP naviaže na molekuly tubulínu. Ak GDP nejakým spôsobom spôsobí, že sa protofilamenty tesne skrútia, GTP urobí opak, čo spôsobí, že se protofilamenty narovnajú a zostavia do mikrotubulov. Ale pretože GTP sa môže rýchlo hydrolyzovať na HDP, priame zachytenie prechodných stavov tubulínu viazaného na GTP bolo nepraktické.

Namiesto toho výskumníci pracovali s podobnou molekulou, GMPCPP, analógom GTP, ktorý sa viaže na rovnaké miesto, ale nie je náchylný na hydrolýzu. Pomocou cryo-EM boli schopní zachytiť tubulín naviazaný na GMPCPP počas počiatočných krokov rastu mikrotubulov.

Pri nízkych teplotách tubulín naviazaný na GMPCPP vytvára zakrivené pásiky niekoľkých protofilamentov vedľa seba, keď sa pásy rozširujú, uzatvárajú sa do veľmi veľkých špirálových rúrok s priemerom 500 angstromov namiesto tenkého mikrotubulu s priemerom 25 angstromov ( angstrom je desaťmiliardtina metra, čo je zhruba rozmer malého atómu).

Zvýšené na telesnú teplotu sa však protofilamentárne pásiky okamžite narovnajú a premenia na normálne mikrotubuly, čo naznačuje, že pásiky a jemne zakrivené listy zodpovedajú polymerizujúcim protofilamentom na konci rastúceho mikrotubulu.

V roku 1998, keď bola postdoktorandkou v laboratóriu Kennetha Downinga, vedúceho vedca v divízii biologických vied v Berkeley Lab, Nogalesová získala atómovú štruktúru tubulínu v jeho stabilnej, rovnej forme, pomocou metód elektrónovej kryštalografie, v ktorých boli použité dvojrozmerné polia tubulínových "plochých" polymérov boli študované pomocou kryo-EM a elektrónovej difrakcie.

„Zakotvením“ tohto kryštalografického modelu do štruktúr, ktoré teraz získali pre medziprodukty polymerizácie v skromnejšom rozlíšení, Nogales a Wang boli schopní vidieť zmeny v molekulách tubulínu, ako sa ich schopnosť interagovať s inými molekulami mení väzbou na GTP alebo GDP a ako tieto zmeny riadia ohýbanie a flexibilitu.

Zistili, že v tubulíne viazanom na GDP sú ovplyvnené kontakty medzi alfa a beta tubulínmi v rámci a medzi dimérmi, hoci výrazne odlišnými spôsobmi, čo vedie k zakrivenému protofilamentu, ktorý nemôže vytvárať bočné kontakty.

Naproti tomu v tubulíne, ktorý viaže GTP analóg GMPCPP, sú kontakty medzi podjednotkami dostatočne rovné, aby umožnili laterálnu interakciu medzi rastúcimi protofilamentmi. Nogales hovorí: "Takéto kontakty sa javia ako polokonzervované vzhľadom na tie, ktoré boli predtým pozorované v mikrotubuloch, a naznačujú mechanizmus, pomocou ktorého mikrotubuly najskôr vyrastú do otvorených listov, ktoré sú schopné rýchlo "zazipsovať" do uzavretej trubice."

Je zaujímavé, že v polymerizačných aj depolymerizujúcich prechodných stavoch sa protofilamenty zvyčajne vyskytujú v pároch. To je záhadné, pretože najbežnejší mikrotubul má 13 protofilamentov, čo poukazuje na zmenu v počte protofilamentov po hydrolýze GTP, zatiaľ nepochopeným mechanizmom.

Nové modely tubulínových prechodných stavov s vysokým rozlíšením sa použijú na pochopenie toho, ako mikrotubuly skúmajú svoje bunkové prostredie, aby našli svoje ciele – proces rozhodujúci napríklad pre presné nasadenie vretien počas delenia buniek – a ako môžu lieky byť navrhnutý a zameraný tak, aby vložil kľúč na opicu do rastu rakovinových buniek.

"Nukleotidovo závislá ohybová flexibilita tubulínu reguluje zostavovanie mikrotubulov," od Hong-Wei Wang a Eva Nogales, sa objavuje vo vydaní Nature zo 16. júna 2005.

Tento výskum financoval Národný inštitút všeobecných lekárskych vied v Národnom inštitúte zdravia. Laboratórium Evy Nogalesovej podporuje aj Ministerstvo energetiky a Lekársky inštitút Howarda Hughesa.


Atlas histológie rastlín a živočíchov

M mikrotubuly sú súčasťou cytoskeletu zapojeného do vnútornej organizácie eukaryotných buniek. Vykonávajú mnoho funkcií, ako je prispievanie k priestorovej organizácii organel, fungujú ako dráhy pre vezikulárny prenos, sú potrebné na delenie buniek tvoriacich mitotické vreteno, pomáhajú pri pohyboch buniek a sú kostrou mihalníc a bičíkov.

1. Štruktúra

Mikrotubuly sú dlhé a relatívne tuhé tubuly (obrázky 1 a 3). Ich stena sa skladá z mnohých dimérov globulárnych proteínov: &alfa- a &beta-tubulín (obrázok 2), ktoré sú usporiadané v dlhých radoch známych ako protofilamenty. V rámci protofilamentu neexistujú žiadne chemické väzby medzi susednými tubulínovými dimérmi. Mikrotubula sa zvyčajne skladá z 13 protofilamentov. &alfa- a &beta-tubulínové diméry sú orientované rovnakým spôsobom, takže na jednom konci protofilamentu je vždy &alfa-tubulín a na druhom &beta-tubulín. To znamená, že mikrotubuly sú polarizované štruktúry. Koniec tvorený &-tubulínom je známy ako mínus koniec a koniec tvorený &beta-tubulínom je známy ako plus koniec . Nové tubulínové diméry sa pridávajú hlavne do plusového konca, kde zvyčajne dochádza k rastu mikrotubulu, hoci dochádza aj k depolymerizácii. V mínusovom konci prevažuje depolymerizácia nad polymerizáciou. Týmto spôsobom mikrotubuly rastú na plusovom konci, zatiaľ čo na mínusovom konci dochádza k zmršťovaniu. Avšak plus end je veľmi dynamický a zvyčajne dochádza k striedaniu polymerizácie a depolymerizácie. V mínusovom konci je depolymerizácia častejšia.

Obrázok 1. Organizácia mikrotubulov v živočíšnej bunke v kultúre. Obrázok 2. Organizácia tubulínových dimérov vo vnútri jedného protofilamentu. Všimnite si, že &alfa-tubulín je orientovaný k mínusovému koncu, zatiaľ čo &beta-tubulín je orientovaný k plusovému koncu. Obrázok 3. Snímka z transmisnej elektrónovej mikroskopie zobrazujúca mikrotubuly vo vnútri dendritu neurónu. Mikrotubuly sú orientované rovnobežne s dlhou osou dendritu.

2. Dynamická nestabilita

Mikrotubuly sú vysoko dynamické štruktúry, ktoré nepretržite podliehajú polymerizácii a depolymerizácii, ktorá prebieha hlavne na kladnom konci. Medzi cytozolom a mikrotubulmi je stabilná výmena tubulínových dimérov. V typickom fibroblaste je polovica dostupného tubulínu voľná v cytosóle a druhá polovica tvorí časť mikrotubulov. Pridanie nových tubulínových dimérov do plusového konca spôsobí, že mikrotubuly narastú do dĺžky. Rast sa z času na čas zastaví a obdobia rastu sa striedajú s obdobiami zmršťovania. Depolymerizácia je niekedy taká silná, že môže zmiznúť celý mikrotubul. Častejšie však ide o nové polymerizačné (rastacie) obdobie. Striedanie medzi polymerizáciou a depolymerizáciou mikrotubulov je známe ako dynamická nestabilita.

Diméry voľného tubulínu sú spojené s dvoma molekulami GTP (obrázok 4). Po spojení tubulínového diméru s plusovým koncom mikrotubulu sa jeden GTP hydrolyzuje na ADP. Ak je rýchlosť pridávania GTP-GTP-tubulínových dimérov na plusový koniec vyššia ako rýchlosť hydrolýzy, vždy bude existovať skupina tubulínových dimérov s GTP-GTP na plusovom konci, ktorá je známa ako GTP-cap . GTP-cap stabilizuje kladný koniec mikrotubulu a podporuje polymerizáciu. Ak je rýchlosť pridávania nových GTP-GTP-tubulínových dimérov nízka, rýchlosť hydrolýzy môže prekonať rýchlosť polymerizácie. To znamená, že na plusovom konci sú diméry GTP-GDP-tubulín, čo spôsobuje, že protofilamenty k sebe slabo priľnú. V tejto situácii začína masívna depolymerizácia. Ak je kladný koniec stabilizovaný, mikrobula opäť rastie (obrázok 4). GTP-ADP-tubulínové diméry sa uvoľňujú do cytosólu a rýchlo fosforylujú na GTP-GTP-tubulínové diméry, ktoré sú pripravené spojiť sa s mikrotubulom plus koncom.

Obrázok 4. Na tomto obrázku sú znázornené diméry GTP-GTP a GTP-GDP-tubulín. V cytosóle sa GTP-GDP-tubulínové diméry transformujú na GTP-GTP-tubulínové diméry, zatiaľ čo GTP hydorlizácia prebieha v takzvanej hydrolytickej zóne steny mikrotubulov. Mikrotubuly sa zmenšujú, keď sú GTP-GDP-tubulínové diméry súčasťou plusového konca (neexistuje GTP čiapočka), a rastie, keď GTP-GTP-tubulínové diméry tvoria plusový koniec (existuje GTP čiapočka).

3. MAPY

Mikrotubuly priamo neinteragujú s inými bunkovými štruktúrami. Existujú však proteíny spojené s mikrotubulami (MAP), ktoré riadia organizáciu, stabilitu, rast a ďalšie aspekty správania mikrotubulov. MAP môžu interagovať s mikrotubulom plus koncom, čo ovplyvňuje dynamickú nestabilitu, buď zvýšením rastu alebo depolymerizáciou. Katanin vyvíja drastickejší účinok, pretože rozkladá mikrotubuly. MAP tiež umožňujú mikrotubulom interagovať s inými bunkovými prvkami, ako sú organely alebo cytosolické molekuly. Niektoré látky, ktoré ovplyvňujú polymerizáciu alebo depolymerizáciu mikrotubulov, sa používajú ako liečivá. Napríklad kolchicín inhibuje rast mikrotubulov, zatiaľ čo taxol sa silne viaže na mikrotubuly a bráni depolymerizácii.

4. Motorické proteíny

Tu sú proteíny, ktoré sa môžu pripojiť k mikrotubulom a pohybovať sa buď smerom k plusovému alebo mínusovému koncu. Sú známe ako motorické proteíny. Dyneíny a kinezíny sú dve rodiny motorických proteínov. Dyneíny sa pohybujú smerom k mínusovému koncu mikrotubulu a kinezíny k plusovému koncu. Obidve obsahujú globulárnu oblasť, ktorá viaže ATP a interaguje s mikrotubulom, a chvostovú doménu, ktorá rozpoznáva a viaže náklad, ktorý sa má prepravovať. Hydrolýza ATP v globulárnej doméne mení molekulárnu konformáciu a spôsobuje, že sa proteín pohybuje pozdĺž mikrotubulu.

5. MTOC

Koncentrácia cytosolických tubulínových dimérov nie je dostatočne vysoká na to, aby spontánne polymerizovala a vytvárala nové mikrotubuly. V bunke existujú molekulárne štruktúry známe ako centrá organizujúce mikrotubuly (MTOC), z ktorých sa tvoria mikrotubuly. Mínusový koniec nového mikrotubulu je zvyčajne ukotvený na MTOC, zatiaľ čo plusový koniec prerastá mikrotubul cez cytosol. Kruhy &gama-tubulínu, umiestnené na MOTC, sú molekulárne komplexy, ktoré fungujú ako templáty pre tvorbu jadra nových mikrotubulov. Iné proteíny, ako napríklad TPX2 a XMAP125, tiež prispievajú k tvorbe nových mikrotubulov, buď samostatne, alebo spolupracujú s &gama-tubulínovými kruhmi.

Centrozóm je hlavným MTOC v živočíšnych bunkách (obrázok 5). Je hlavným zodpovedným za počet, lokalizáciu a priestorovú organizáciu mikrotubulov. Vo väčšine živočíšnych buniek sa počas fáz G1 a G0 bunkového cyklu nachádza v blízkosti jadra jeden centrozóm na bunku. Megakaryocyty však obsahujú viacero centrozómov, zatiaľ čo svalovým vláknam centrozómy chýbajú. Centrozóm sa skladá z dvoch zložiek: pár ortogonálne orientovaných centriolov a okolitého pericentriolárneho materiálu. Každý centriol je valcovitá štruktúra so stenou tvorenou 9 tripletmi mikrotubulov.

Obrázok 5. V živočíšnych bunkách je centrozóm hlavný zodpovedný za tvorbu jadier a organizáciu mikrotubulového skeletu. Centrozóm obsahuje pár ortogonálne usporiadaných centriol obklopených pericentriolárnym materiálom. &gama-tubulínové krúžky, ktoré sú templátmi pre nukleáciu mikrotubulov, sú umiestnené v pericentriolárnom materiáli.

V pericentriolárnom materiáli je veľa molekúl &gama-tubulínu usporiadaných do kruhov, známych ako kruhy &gama-tubulínu, ktoré tvoria jadro mikrotubulov. Centrioly sa však nezúčastňujú na tvorbe mikrotubulov ani na ich priestorovej orientácii, s výnimkou distálnych a subdistálnych príveskov, čo sú štruktúry pripojené k zrelému centriolu, ktoré môžu nukleovať mikrotubuly. Funkcia centriolov je stále neznáma. Napríklad rastlinným bunkám chýbajú centrioly, ale dokážu bez problémov oddeliť chromozómy, rozdeliť sa na dve nové bunky a organizovať svoje mikrotubuly. Centrioly sú podobné bazálnym telieskam, štruktúram umiestneným v bazálnej časti mihalníc a bičíkov.

Bunkový cyklus a centrozóm

Centrozóm je dôležitý aj počas bunkového cyklu, pretože obsahuje veľa proteínov, ktoré sa podieľajú na priebehu bunkového cyklu a na organizácii mitotického vretienka. Napríklad duplikácia centrozómu pred mitózou je nevyhnutná na produkciu dvoch "zdravých" nových buniek.

Tu sú ďalšie bunkové miesta, kde môžu byť mikrotubuly nukleované. Blefaroplasty sú molekulárne komplexy nachádzajúce sa v rastlinných bunkách a v niektorých živočíšnych bunkách, ktoré môžu vytvárať jadrové mikrotubuly a niekedy môžu vytvárať aj centrioly a centrozómy. Rastlinným bunkám chýbajú centrioly a netvoria typické centrozómy, ale majú &gama-tubulínové kruhy spojené s jadrovým obalom, až po blefaroplasty a rozptýlené v cytoplazme. Rastlinné bunky nukleujú mikrotubuly častejšie v periférnej cytoplazme. Hlavným MTOC v kvasinkách je polárne teliesko, ktoré je vložené do jadrového obalu (mitotické vretienko je intranukleárne). Existujú aj iné mikrotubulárne nukleátory, ako sú chromozómy, ktoré môžu tvoriť mitotické vreteno bez centrozómov. V rastlinných bunkách je mitotické vretienko tvorené mikrotubulami s jadrami z chromozómov. Cisterny Golgiho aparátu tvoria jadrové mikrotubuly, ktoré pomáhajú udržiavať všeobecnú organizáciu organely.

6. Funkcia

Vnútrobunková organizácia

Mikrotubuly sú rozdelené do dvoch typov: stabilné mikrotubuly, ktoré sa nachádzajú v riasinkách a bičíkoch, a dynamické mikrotubuly, ktoré sa nachádzajú v cytosóle (obrázok 6). Cytosolické mikrotubuly sa okrem svojej úlohy pri tvorbe mitotického vretienka a segregácii chromozómov podieľajú aj na vnútornom pohybe organel, ako sú mitochondrie, lyzozómy, pigmentové inklúzie, lipidové kvapky atď. Sú tiež potrebné na obchodovanie s vezikulami. Keď sa bunky v kultúre pozorujú svetelnou mikroskopiou, organely vykazujú striedanie medzi rýchlym pohybom a pokojnými obdobiami. Toto správanie, známe ako soľný pohyb, nastáva, keď sa organely pohybujú pozdĺž mikrotubulov. Cytosolické mikrotubuly sa tiež podieľajú na tvare a umiestnení niektorých organel, ako je Golgiho komplex a endoplazmatické retikulum. Pridanie kolchicínu depolymerizuje mikrotubulárny systém bunky a obe organely sa zrútia a delia na malé vezikuly rozptýlené v cytoplazme. Keď sa odstráni kolchicín a umožní sa repolymerizácia mikrotubulov, obidve organely opäť získajú typickú morfológiu a bunkovú lokalizáciu. Organely a vezikuly sú poháňané pozdĺž mikrotubulov motorickými proteínmi.

Obrázok 6. Organizácia mikrotubulov sa líši podľa typu bunky. Určuje vnútornú organizáciu organel a vezikulárne obchodovanie. Symbol plus označuje plusový koniec mikrotubulov.

V rastlinných bunkách sa väčšina vnútrobunkových pohybov opiera o aktínové vlákna. Mikrotubuly sú distribuované v periférnej cytoplazme (obrázok 6), kde sa zdá, že ovplyvňujú orientáciu celulózových vlákien bunkovej steny a určujú rast a mechanickú odolnosť bunky.

Cilia a bičíky

Cilia a bičíky sú bunkové štruktúry vyčnievajúce z povrchu bunky, obsahujú mikrotubuly a sú ohraničené plazmatickou membránou. Bunky používajú riasinky a bičíky na pohyb okolitej tekutiny, na pohyb, ak sú voľné bunky, a ako zmyslové štruktúry. Cilia sú kratšie ako bičíky, početnejšie a ich pohyby poháňajú tekutinu rovnobežne s povrchom bunky. Bičíky pohybujú okolitou kvapalinou kolmo na povrch bunky.

Cilia a bičíky sú zložité štruktúry tvorené viac ako 250 rôznymi proteínmi (obrázky 7 a 8). Obidve majú centrálnu štruktúru mikrotubulov známych ako axonéma, ktoré sú obklopené plazmatickou membránou. Axonéma sa skladá z 9 vonkajších párov mikrotubulov plus centrálneho páru mikrotubulov. Táto organizácia je zapísaná ako 9x2+2 . Vonkajšie mikrotubuly axonémy vyrastajú z mikrotubulov bazálneho telieska. Základné teliesko má 9 tripletov mikrotubulov (t.j. 9x3+0). Organizácia axonémov je posilnená skeletom proteínov. Vonkajšie páry mikrotubulov axonémy sú medzi sebou spojené nexínovými proteínmi, zatiaľ čo proteínové lúče spájajú vonkajšie páry s centrálnym párom. Motorický proteín dyneín sa nachádza medzi vonkajšími pármi. Dyneín sa podieľa na pohybe mihalníc a bičíkov. Pohyb je dôsledkom kĺzania jedného vonkajšieho páru po druhom susednom, čo si vynúti ohnutie axonémy.

Obrázok 7. Molekulárne zložky riasiniek a bičíkov. V primárnom ciliu nie je prítomný centrálny pár mikrobutúl. Obrázok 8. Snímky z elektrónovej mikroskopie. Cilia a malé mikroklky v apikálnej časti buniek tvoriacich centrálny kanál miechy miechy (zobrazené v B).

Niektoré typy mihalníc sú známe ako primárne riasinky. Primárnym riasinkám chýba centrálny pár mikrotubulov, nemôžu sa pohybovať, sú vzácne a niekedy sa v bunkách objavujú samostatne. Aspoň jedno cilium je prítomné vo väčšine doteraz študovaných živočíšnych buniek. Primárne riasinky nesú vo svojich membránach mnoho receptorov a iónových kanálov, takže sa predpokladá ich senzorická úloha.

Ohi R, Zanic M. 2016. Pred krivkou: nové pohľady na dynamiku mikrotubulov. F1000Research. 5:314.


Tvorba a lámanie mikrotubulov

BERKELEY, CA – Mikrotubuly sú aktívne proteínové polyméry rozhodujúce pre štruktúru a funkciu buniek a proces bunkového delenia. V živej bunke sa ich rastúce konce neustále predlžujú a ustupujú v šialenom šialenstve polymerizácie a depolymerizácie, ako zvíjajúce sa hady vlasov Medusy. Tento pokračujúci rýchly rast a zmršťovanie je prozaicky známy ako “dynamická nestabilita”, je kľúčom k rôznorodému fungovaniu mikrotubulov v bunke.

Hong-Wei Wang a Eva Nogales z Berkeley Lab’s Life Sciences Division použili kryo-elektrónovú mikroskopiu na odhalenie na molekulárnej úrovni foriem, ktoré nadobúdajú prechodné štruktúry tubulínu počas zostavovania a rozoberania mikrotubulov. (Foto Roy Kaltschmidt)

Výskumníci po prvýkrát odhalili na molekulárnej úrovni formy, ktoré nadobúdajú prechodné štruktúry tubulínu (proteínu, z ktorého sa tvoria mikrotubuly) počas montáže a demontáže mikrotubulov. Podrobnosti týchto zvláštnych štruktúr ukazujú, ako väzba nukleotidu guanozíntrifosfátu, GTP, na tubulín, riadi aktivitu na rastúcom konci mikrotubulu. Eva Nogales a Hong-Wei Wang z Divízie biologických vied Ministerstva energetiky a Lawrence Berkeley National Laboratory hlásia svoje zistenia vo vydaní časopisu zo 16. júna 2005 Príroda.

“Tubulin je hlavným cieľom pre protirakovinové lieky, ktoré môžu zabrániť prechodu z rastúceho do zmenšujúceho sa stavu alebo naopak,” hovorí Nogales, ktorý je tiež členom divízie fyzikálnych biologických vied v Berkeley Lab, docent biochémie. a molekulárnej biológie na Kalifornskej univerzite v Berkeley a vyšetrovateľ lekárskeho inštitútu Howarda Hughesa. “Predtým sme vytvorili štruktúry stabilizovaných tubulínových štruktúr s vysokým rozlíšením, ale nikto nepoznal štruktúru prechodných stavov. Naším cieľom bolo pochopiť proces montáže a demontáže mikrotubulov.”

Hovorí Wang, “Naša súčasná práca skutočne odhalila štruktúry rôznych tubulínových zostáv na samotných koncoch rastúcich mikrotubulov a depolymerizujúcich mikrotubulov. To umožňuje nové pochopenie mechanizmu dynamickej nestability mikrotubulov a otvára príležitosti pre nové experimenty testujúce fyziologické úlohy týchto medziproduktov mikrotubulov v bunke.”

Richard Rodewald, programový dôstojník a bunkový biológ z Národného inštitútu všeobecných lekárskych vied, ktorý výskum financoval, poznamenal, že „tieto štúdie poskytujú presvedčivý model, v elegantných atómových detailoch, ako sa viaže GTP na konkrétne miesto v tubulíne. vedie k ďalekosiahlym štrukturálnym zmenám, ktoré poháňajú rast mikrotubulov.”

Budovanie mikrotubulu

Mikrotubuly sú polyméry, ktorých základnými jednotkami sú páry (diméry) podobných, ale nie identických tubulínových proteínov, nazývaných alfa a beta formy. Počas polymerizácie sa diméry naskladajú od konca k druhému, aby vytvorili protofilament. Asi trinásť protofilamentov je usporiadaných vedľa seba, rozprestierajúcich sa pozdĺžne, aby vytvorili steny valcového mikrotubulu.

Mikrotubuly zvyčajne pozostávajú z približne 13 protofilamentov vytvorených z párov tubulínových proteínov, ktoré sú usporiadané vedľa seba a pozdĺžne sa rozprestierajú tak, že tvoria steny valca. (Obrázok a mikrofotografie od Nogalesa a kolegov, Kenneth Downing lab)

Takzvaný mínusový koniec mikrotubulu rastie pomaly a je často ukotvený v bunkovej štruktúre. Druhý koniec, plusový koniec, je ohniskom aktivity. V prítomnosti GTP získavajú protofilamenty mikrotubulov viac tubulínových dimérov a celý mikrotubul sa rýchlo rozťahuje na mnoho milióntin metra, než sa náhle vypne a opäť zmrští.

Nukleotidy ako GTP sú najlepšie známe ako jednotky nukleových kyselín DNA a RNA, ktoré pozostávajú zo zásady (písmeno v genetickom kóde) plus cukru a troch fosfátových skupín. Ale tieto molekuly tiež regulujú aktivitu enzýmov a hrajú kľúčovú úlohu pri kontrole rastu mikrotubulov.

Keď sa GTP viaže na konkrétny lokus na beta tubulíne (E-miesto alebo vymeniteľné miesto), dochádza k polymerizácii: tubulínové diméry sa hromadia na protofilamentoch a mikrotubuly rastú. Ale prostredníctvom hydrolýzy (toto slovo znamená “rozdelenie vody”) sa GTP ľahko zmení na iný nukleotid, guanozíndifosfát alebo GDP. Tubulín naviazaný na GDP depolymerizuje mikrotubuly zvinutím protofilamentov na svojom plusovom konci a ich roztiahnutím.

Zmrazenie šialenstva

Hoci bolo známe, že tubulín polymerizuje v prítomnosti GTP a depolymerizuje v prítomnosti GDP, pred Nogalesom a Wangom nebolo možné vizualizovať, čo sa štrukturálne dialo počas týchto rýchlych prechodných stavov. Potom, hovorí Nogales, “Hong-Wei našiel biochemické triky na spomalenie prechodov takmer do bodu, keď ich zastavíme.”

Kryoelektrónová mikroskopia (kryo-EM) je schopná zachytiť takéto polymérne štruktúry bez toho, aby ich bolo potrebné rozložiť a kryštalizovať jednotlivé podjednotky na rôntgenovú difrakčnú analýzu. Röntgenová difrakcia by mohla umožniť vyššie rozlíšenie, ale stratila by všetky informácie týkajúce sa kontaktov medzi podjednotkami počas polymerizácie. “S cryo-EM sme zmenou parametrov mohli vidieť, ako sa rôzne polymérne formy premieňajú,” hovorí Nogales.

Nogales a Wang sa najskôr zaoberali procesom depolymerizácie a sledovali, čo sa stane s mikrotubulami, keď je GDP naviazaný na tubulín. Počas tohto procesu sa protofilamenty tubulínu ostro zakrivujú od konca mikrotubulu a vytvárajú „šupinky“ ako drevené hobliny, ktoré sa stáčajú z roviny. Wang našiel podmienky, pre ktoré sa kučery tubulínu naviazaného na GDP uzatvárajú do skúmaviek, pričom protofilamenty sú tesne ovinuté okolo osi skúmavky. Tieto rúrky sú dvojvrstvové, čo je vlastnosť, ktorá prispieva k ich stabilite – no zároveň to brzdí projekt na dlhú dobu.

Počas demontáže mikrotubulov sa vytvoria trubice s dvojitou stenou, vyrobené z prstencov tubulínov spojených s nukleotidom GDP. (Obrázok a mikrofotografie od Wanga a Nogalesa)

“Kľúčom bolo zamknúť tubulínové zostavy v správnych stavoch vhodných na štrukturálnu analýzu, ale ešte náročnejšie bolo nájsť algoritmus na rekonštrukciu dvojvrstvových GDP-tubulínových trubíc,” hovorí Wang.

“Vzhľadom na dvojvrstvovú vlastnosť sme nemohli použiť klasické špirálové metódy rekonštrukcie,” hovorí, “ale pri spustení projektu neboli k dispozícii žiadne iné metódy. Vývojom a implementáciou vlastného algoritmu sme museli stráviť viac ako dva roky. Keď to bolo hotové, mohli sme dostať správnu rekonštrukciu za menej ako tri mesiace.”

Ďalej sa výskumníci zaoberali procesom polymerizácie a sledovali, čo sa stane, keď sa GTP naviaže na molekuly tubulínu. Ak GDP nejakým spôsobom spôsobí, že sa protofilamenty tesne skrútia, GTP urobí opak, čo spôsobí, že se protofilamenty narovnajú a zostavia do mikrotubulov. Ale pretože GTP sa môže rýchlo hydrolyzovať na HDP, priame zachytenie prechodných stavov tubulínu viazaného na GTP bolo nepraktické.

Namiesto toho výskumníci pracovali s podobnou molekulou, GMPCPP, analógom GTP, ktorý sa viaže na rovnaké miesto, ale nie je náchylný na hydrolýzu. Pomocou cryo-EM boli schopní zachytiť tubulín naviazaný na GMPCPP počas počiatočných krokov rastu mikrotubulov.

Listy tubulínu spojené s GMPCPP, nehydrolyzujúcim analógom kľúčového nukleotidu GTP, sa ľahko narovnávajú, aby vytvorili mikrotubuly, čo naznačuje, že tubulín spojený s GTP sleduje počas zostavovania mikrotubulov podobnú cestu. (Obrázok a mikrofotografie od Wanga a Nogalesa)

Pri nízkych teplotách tubulín naviazaný na GMPCPP vytvára zakrivené pásiky niekoľkých protofilamentov vedľa seba, keď sa pásy rozširujú, uzatvárajú sa do veľmi veľkých špirálových rúrok s priemerom 500 angstromov namiesto tenkého mikrotubulu s priemerom 25 angstromov ( angstrom je desaťmiliardtina metra, čo je zhruba rozmer malého atómu).

Zvýšené na telesnú teplotu sa však protofilamentárne pásiky okamžite narovnajú a premenia na normálne mikrotubuly, čo naznačuje, že pásiky a jemne zakrivené listy zodpovedajú polymerizujúcim protofilamentom na konci rastúceho mikrotubulu.

Nadväzovanie kontaktov

V roku 1998, keď bola postdoktorandkou v laboratóriu Kennetha Downinga, vedúceho vedca v divízii biologických vied v Berkeley Lab, Nogalesová získala atómovú štruktúru tubulínu v jeho stabilnej, rovnej forme pomocou metód elektrónovej kryštalografie, v ktorých boli -rozmerné polia tubulínových “plochých” polymérov boli študované pomocou kryo-EM a elektrónovej difrakcie.

Zapojením tohto kryštalografického modelu do štruktúr, ktoré teraz získali pre polymerizačné medziprodukty v skromnejšom rozlíšení, Nogales a Wang boli schopní vidieť zmeny v molekulách tubulínu, ako sa mení ich schopnosť interagovať s inými molekulami. väzby na GTP alebo GDP a ako tieto zmeny riadia ohýbanie a flexibilitu.

Zistili, že v tubulíne viazanom na GDP sú ovplyvnené kontakty medzi alfa a beta tubulínmi v rámci a medzi dimérmi, hoci výrazne odlišnými spôsobmi, čo vedie k zakrivenému protofilamentu, ktorý nemôže vytvárať bočné kontakty.

Naproti tomu v tubulíne, ktorý viaže GTP analóg GMPCPP, sú kontakty medzi podjednotkami dostatočne rovné, aby umožnili laterálnu interakciu medzi rastúcimi protofilamentmi. Hovorí Nogales, „Takéto kontakty sa zdajú byť polokonzervované v porovnaní s tými, ktoré sa predtým vyskytovali v mikrotubuloch, a naznačujú mechanizmus, pomocou ktorého mikrotubuly najskôr vyrastú do otvorených listov, ktoré sú schopné rýchlo ‘zipsovať’ do uzavretej trubice.”

Je zaujímavé, že v polymerizačných aj depolymerizujúcich prechodných stavoch sa protofilamenty zvyčajne vyskytujú v pároch. To je záhadné, pretože najbežnejší mikrotubul má 13 protofilamentov, čo poukazuje na zmenu v počte protofilamentov po hydrolýze GTP, zatiaľ nepochopeným mechanizmom.

Nové modely tubulínových prechodných stavov s vysokým rozlíšením sa použijú na pochopenie toho, ako mikrotubuly skúmajú svoje bunkové prostredie, aby našli svoje ciele – napríklad proces rozhodujúci pre presné nasadenie vretien počas delenia buniek – a ako možno navrhnúť a zacieliť lieky. dať kľúč na opicu do rastu rakovinových buniek.

“Nukleotidovo závislá ohybová flexibilita tubulínu reguluje zostavovanie mikrotubulov,” od Hong-Wei Wang a Eva Nogales, sa objavuje vo vydaní 16. júna 2005 Príroda.

Tento výskum financoval Národný inštitút všeobecných lekárskych vied v Národnom inštitúte zdravia. Laboratórium Evy Nogalesovej podporuje aj Ministerstvo energetiky a Lekársky inštitút Howarda Hughesa.


Čo je to dynamická nestabilita mikrotubulov?

Vo väčšine bunkových typov sa trinásť protofilamentov spája laterálne a vytvára mikrotubuly. V niekoľkých prípadoch mikrotubuly obsahujú viac alebo menej protofilamentov [1]. Početné interakcie medzi podjednotkami dávajú mikrotubulom ich tuhosť a odolnosť voči ohybovým silám. Bočné interakcie medzi protofilamentami sú však pomerne slabé a výsledkom je, že plusový koniec mikrotubulov má často „rozstrapkaný“ vzhľad [1] [2].

(A) Intracelulárna koncentrácia tubulínu nachádzajúca sa vo väčšine buniek (10-20 & mikroM) podporuje zostavenie mikrotubulov na plusovom konci. Tento koniec sa môže zdať rozstrapkaný v pomaly rastúcich filamentoch v dôsledku menšieho počtu laterálnych interakcií medzi protofilamentami a preto, že HDP-tubulínové diméry majú inherentnú krivku. (B) Pri vysokých koncentráciách voľného GTP-tubulínového diméru je hydrolýza prekonaná rýchlym zostavením na kladnom konci, čím sa vytvorí pevný GTP-cap. (C) Súvislá hydrolýza GTP na plusovom konci oslabuje interakcie tubulínového diméru a protofilamenty sa rýchlo rozkladajú.

Mikrotubuly sú vysoko dynamické a často budú rásť a zmenšovať sa rýchlou, ale konštantnou rýchlosťou. Počas tohto javu, známeho ako „dynamická nestabilita“, sa podjednotky tubulínu budú spájať a disociovať z plusového konca protofilamentu [3]. Dynamiku tvorby mikrotubulov reguluje množstvo faktorov, avšak primárnym determinantom toho, či mikrotubuly rastú alebo sa zmenšujú, je rýchlosť hydrolýzy GTP, faktor, ktorý je vnútorný aj podstatný pre zostavenie vlákna [3]. Vo svojom stabilnom stave sú mikrotubuly duté, valcovité štruktúry zložené prevažne z beta-tubulínových protofilamentov viazaných na HDP. Pretože protofilamenty viazané na GTP sú priame, s viacerými laterálnymi kontaktmi, montáž do konečnej valcovej konformácie je preto závislá od hydrolýzy GTP. Bez toho by zostava viedla k plochej listovej mriežke tubulínových protofilamentov.

Zatiaľ čo GTP hydrolýza beta-tubulínu je preto nevyhnutná pri výrobe filamentov, je potrebné poznamenať, že rýchlosť zostavovania často prevyšuje rýchlosť hydrolýzy.Keď k tomu dôjde, vytvorí sa tupý koniec alebo GTP-klobúčik, ktorý účinne obmedzí zakrivenie protofilamentov [4]. Keď dôjde k hydrolýze, obmedzenie sa odstráni a protofilamenty sa stanú vysoko nestabilnými, pretože sa uvoľní energia uložená v mriežke. To má za následok rýchle zmršťovanie mikrotubulov. Typický mikrotubulus bude kolísať každých pár minút medzi rastom a zmršťovaním.


Funkcia mikrotubulov

Pohyb buniek

Mikrotubuly dávajú štruktúru ako riasinky a bičíky. Cilia sú malé výbežky bunky. U ľudí sa nachádzajú na bunkách lemujúcich priedušnicu, kde bránia materiálom ako hlien a nečistoty vstúpiť do pľúc. Nachádzajú sa aj vo vajcovodoch ženského reprodukčného systému, kde pomáhajú presunúť vajíčko, ktoré sa uvoľní z vaječníka do maternice. Bičíky sú chvostové prívesky, ktoré umožňujú pohyb buniek. Nachádzajú sa v niektorých baktériách a ľudské spermie sa tiež pohybujú cez bičíky. Mikrotubuly tiež umožňujú celým bunkám „plaziť sa“ alebo migrovať z jedného miesta na druhé kontrahovaním na jednom konci bunky a rozširovaním na druhom.

Bunkové delenie

Tri podskupiny mikrotubulov pomáhajú v procese mitózy: astrálne, polárne a kinetochorové mikrotubuly. Astrálne mikrotubuly vyžarujú z MTOC bunky do bunkovej membrány, čím udržujú mitotické vreteno na mieste. Polárne mikrotubuly sa prepletajú medzi dvoma MTOC a pomáhajú oddeľovať chromozómy. (Všetky mikrotubuly sú polárne, tieto sa len špecificky nazývajú polárne mikrotubuly.) Kinetochorové mikrotubuly sa pripájajú k chromozómom, aby ich pomohli oddeliť, chromozómy sú pripojené k mikrotubulom komplexom proteínov nazývaným kinetochór.

Bunková doprava

Ako súčasť cytoskeletu pomáhajú mikrotubuly presúvať organely vo vnútri bunkovej cytoplazmy, čo je celý obsah bunky okrem jej jadra. Pomáhajú tiež rôznym oblastiam bunky navzájom komunikovať. Avšak aj keď mikrotubuly pomáhajú komponentom bunky pohybovať sa, zároveň poskytujú bunke tvar a štruktúru.


Nová trieda proteínov spojených s mikrotubulami v rastlinách

V rastlinách sa na bunkovej morfogenéze podieľajú tri mikrotubulové polia, ktoré nemajú ekvivalent v živočíšnych bunkách. U zvierat sú mikrotubuly zdobené ďalšou triedou proteínov – štruktúrnymi MAPS – ktoré slúžia na stabilizáciu mikrotubulov a pomáhajú pri ich organizácii. Najlepšie študovanými členmi tejto triedy v rastlinách sú proteíny MAP-65, ktoré je možné purifikovať spolu s rastlinnými mikrotubulami po niekoľkých cykloch polymerizácie a depolymerizácie. Tu identifikujeme tri podobné MAP-65 komplementárne DNA reprezentujúce malú génovú rodinu s názvom NtMAP65-1, ktorá kóduje nový súbor proteínov, spoločne nazývaných NtMAP65-1. Ukazujeme, že proteín NtMAP65-1 sa lokalizuje do oblastí prekrývajúcich sa mikrotubulov, čo naznačuje, že môže fungovať v správaní antiparalelných mikrotubulov v mitotickom vretienku a cytokinetickom fragmoplaste.


Časť 2: Samoorganizácia meiotických vretien

00:00:00.00 Vitajte späť. Budem pokračovať v tejto diskusii o sebaorganizácii,
00:00:03.22 ale teraz prejdi trochu viac do detailov.
00:00:07.08 A ja. To, o čo som sa snažil v poslednej prednáške, bolo naozaj
00:00:10.19 dávam vám môj prehľad o tom, kde sa molekuly stávajú živými systémami.
00:00:16.00 Ale teraz sa pokúsime dostať naozaj. pozri trochu viac
00:00:20.22 o tom, ako to robia skutočné molekuly?
00:00:23.28 A ja tu použijem tento príklad meiotického vretena.
00:00:27.19 Opäť tu je niekoľko náčrtov a konceptov, ktoré teraz nebudem čítať.
00:00:32.07 Všetky príklady, ktoré použijem, sú v kontexte delenia buniek,
00:00:38.01 a myslel som si, že by bolo pekné začať to úplne prvým popisom bunkového delenia
00:00:41.19 od Flemminga v roku 1882 -- pred viac ako 100 rokmi.
00:00:47.10 A pozrel sa na zafixované a zafarbené salamandrové bunky
00:00:50.16 a nakreslil tieto absolútne nádherné obrázky.
00:00:52.01 A tu môžete vidieť, tieto čiary sú mitotické vreteno,
00:00:57.13 a Flemming si uvedomil, čo je úlohou vretena,
00:01:01.06 ktorá mala rozdeliť chromozómy do dvoch skupín.
00:01:03.20 Môžete ich tu vidieť, ako sú rozdelené v anafáze
00:01:06.19 aby dve dcérske bunky dostali rovnaké čísla.
00:01:10.02 Čo Flemming, samozrejme, nevedel
00:01:11.14 preto je také dôležité rozdeliť chromozómy na dva.
00:01:14.06 Teraz vieme, že tam je DNA.
00:01:16.24 Je dôležité, aby každá bunka v našom tele dostala identickú kópiu genómu,
00:01:20.18 takže mitotické vreteno musí veľmi presne rozdeliť chromozómy na dva.
00:01:26.12 Tu je o niečo aktualizovanejší pohľad na vec.
00:01:31.10 Toto je film delenia buniek tkanivovej kultúry.
00:01:35.12 Chromozómy sú tieto tmavé objekty v strede,
00:01:38.12 a tu môžete vidieť, že sú zoradené v strede.
00:01:40.11 A v tomto filme ich uvidíte rozdelených na dve časti,
00:01:43.03 a sily pochádzajú z mitotického vretienka.
00:01:46.08 Toto je film, ktorý som natočil -- vlastne v roku 1988 --
00:01:48.18 Vzal som sa, keď som dostal svoj prvý mikroskop v mojom prvom laboratóriu v San Franciscu.
00:01:53.04 Tento film mám veľmi rád.
00:01:54.23 Myslím, že to ukazuje proces celkom pekne.
00:01:58.00 A potom, po chromozómoch, sa toto zvieranie nazýva cytokinéza.
00:02:02.11 Tu sa bunka vlastne delí na dve časti.
00:02:05.02 Na tomto obrázku som super uložil fázový kontrast.
00:02:08.19 Toto nie je tá istá bunka. Toto je oveľa neskorší obrázok, ale je to rovnaký typ bunky.
00:02:12.26 Tu môžete vidieť chromozómy zafarbené na červeno,
00:02:15.05 a mikrotubuly, ktoré pôsobia silou na chromozómy
00:02:17.26 zafarbený na zeleno. Toto je obrázok od Julie Canman a Teda Salmona.
00:02:20.18 Mikrotubuly a DNA.
00:02:24.29 A ešte trochu terminológie.
00:02:28.10 Pre tento bod použijem slovo vretenový stĺp,
00:02:30.25 kde končí mínus -- mikrotubuly sú polárne --
00:02:34.13 všetky mínusové konce sa zhromažďujú tu na vretenovej tyči.
00:02:37.15 A v niektorých typoch vretien tu máte centrozóm --
00:02:40.15 nukleačné miesto.
00:02:42.06 A potom v tomto bode tu, plusové konce niektorých mikrotubulov
00:02:45.10 -- vlastne podmnožina --
00:02:46.08 stretávajú chromozómy na kinetochóroch.
00:02:48.23 Toto je miesto, kde sa vytvára veľká sila na skutočný pohyb chromozómov.
00:02:52.22 Budem používať tieto slová.
00:02:56.06 Nebudem sa v tejto diskusii zameriavať na to, ako sú chromozómy segregované.
00:03:00.18 ako je to tak presné.
00:03:02.21 To je fascinujúca téma a veľa ľudí na tom robí krásnu prácu.
00:03:06.09 Zostanem viac pri otázke, ako si sami organizujete tento tvar
00:03:11.16 a ako získava svoje životné vlastnosti.
00:03:14.00 Systém, ktorý moje laboratórium používalo na to veľa
00:03:20 sú tu vajíčka. Môžete vidieť, ako sa žabie vajce rozdeľuje,
00:03:24 a tieto žabie vajcia pochádzajú z Xenopus laevis,
00:03:27.06 ropucha pazúrová,
00:03:30.19 čo je obojživelník, ktorému neprekáža, že rastie v laboratóriu.
00:03:34.03 Žijú veky v laboratóriu. Nie sú zranení.
00:03:37.02 Kladú vajíčka a potom ich necháme zotaviť sa a potom o niekoľko mesiacov znova znášajú vajíčka.
00:03:42.18 A vidíte, že sa to krásne delí.
00:03:45.08 A tak toto je systém, ktorý sa mi veľmi páči na štúdium bunkového delenia.
00:03:49.22 A študujeme jeden konkrétny typ vretena v týchto vajciach
00:03:56.14 čo je vlastne vreteno meiózy II.
00:03:59.07 A môžete to vidieť na tomto obrázku tu.
00:04:02.13 Toto je neoplodnené žabie vajíčko, táto veľká guľa.
00:04:05.09 A meiózne vreteno je tento malý malý bod hore tam hore.
00:04:10 A tento obrázok sa mi veľmi páči.
00:04:12.24 Mám ho obrovský. Martin Wuhr, môj študent, ktorý urobil tento obrázok,
00:04:16.14 vyhodili do vzduchu jeden z nich, aby mal priemer 4 stopy,
00:04:19.02 a visí pred mojou kanceláriou.
00:04:20.23 Je to akýsi symbol môjho života.
00:04:22.28 Tu je svet bunky a ja som strávil príliš veľa rokov
00:04:26.21 študujem tento jeden malý bod tu hore.
00:04:29.27 Ak však priblížite. oh, a dovoľte mi zdôrazniť aj veľkosť.
00:04:33.18 Žabie vajce -- vajíčka Xenopus -- majú priemer 1,2 mm,
00:04:37.11 čo skutočne zdôrazňuje výzvu
00:04:42.02 skutočná organizácia takého veľkého vajíčka.
00:04:44.27 Tu je priblíženie meiotického vretena.
00:04:49.11 Má priemer asi 30 mikrónov. V strede môžete vidieť DNA.
00:04:52.25 A práca tohto malého vretena tu
00:04:58.28 je dokončiť ženskú meiózu.
00:05:01.02 Takže, keď je vajíčko oplodnené, oddelí dve kópie materského genómu --
00:05:05.15 ich rozdeľuje na dve časti.
00:05:07.06 Jedna kópia sa vyhodí a druhá kópia sa stretne s otcovským genómom,
00:05:10.28 ktorý prichádza . spermia by prišla v niečom takomto.
00:05:13.29 A jadro spermie sa presunie do stredu
00:05:16.16 a stretáva sa s jednou polovicou ženského genómu.
00:05:19.26 Takže úlohou tohto vretena je v podstate vyhodiť jednu kópiu
00:05:25.21 materského genómu a ten druhý si ponechajte, aby bol haploidný.
00:05:30.00 A malá recenzia tu:
00:05:34.05 Ukázal som vám somatické delenie vretena -- to vreteno PTK2.
00:05:38.24 Tie vretená tu majú centrozómy.
00:05:41.15 Ale vreteno, na ktoré sa zameriame -- tieto vaječné meiotické vretená
00:05:44.22 sú organizované trochu inak.
00:05:46.00 Nemajú centrozómy.
00:05:47.12 Niekedy sa im hovorí anastrálne vretená,
00:05:50.07 a iné organizmy vytvárajú vretená týmto spôsobom.
00:05:55.07 Napríklad vyšším rastlinám chýbajú centrozómy,
00:05:57.17 a majú vretená, ktoré sa veľmi podobajú týmto vaječným meiotickým vretienkam.
00:06:01.18 Teraz vajcia Xenopus, aj keď sa delia
00:06:05.10 krásne, sú veľké a nepriehľadné, čo sťažuje vizualizáciu
00:06:08.29 čo sa deje s mikroskopom a som si istý, že je to už teraz každému jasné
00:06:12.28 že je to najobľúbenejšia vec v mojom laboratóriu, moja najobľúbenejšia vec
00:06:16.18 v biológii je pozerať sa na veci cez mikroskop, keď sa dejú.
00:06:20.15 A ukázalo sa, že tento problém dokážeme obísť
00:06:23.25 opacity vajíčka prípravou extraktu z vajíčka
00:06:30.02 a použitie tohto extraktu na rekapituláciu biologických procesov
00:06:34.07 buď v skúmavke alebo pod mikroskopickým sklíčkom.
00:06:37.03 A keď urobíte extrakt, okrem toho, že je lepší pre mikroskopiu,
00:06:42.04 je to skvelé pre biochémiu.
00:06:43.24 Môžete pridávať a odoberať komponenty a vykonávať mnoho druhov manipulácií
00:06:48.03 čo nie je možné v živom systéme.
00:06:50.05 Takže toto je experimentálny systém, ktorý je môjmu srdcu veľmi drahý.
00:06:55.01 Samica žaby znáša vajíčka - sú jej vstreknuté hormóny - znáša vajíčka
00:06:59.29 a keď to urobí, vráti sa do kolónie, aby sa zotavila.
00:07:02.29 Zbierame tie vajíčka. Umyjeme ich. Balíme ich do centrifugačnej skúmavky
00:07:06.09 aby sme vytlačili všetku vodu z jazierka, ktorá by ich zriedila (alebo tlmivý roztok, ktorým sme ich umyli).
00:07:11.03 Potom sme odstredivku naštartovali na 10 000 xg.
00:07:14.26 To dáva veľkú silu, ktorá rozdrví vajíčka
00:07:17.21 a tiež tu oddeľuje ich vnútorný obsah.
00:07:20.13 Takže žĺtok je dole. Navrchu je nejaký tuk.
00:07:23.17 A tu je druh tekutej časti vajíčka -- cytoplazma --
00:07:28.18 a toto je v podstate neriedené. Toto je druh 1x cytoplazmy.
00:07:32.20 Toto je metóda, ktorú vyvinul Andrew Murray, keď bol v laboratóriu Marca Kirschnera
00:07:36.19 a vlastne môj úplne prvý doktorand, Ken Sawin,
00:07:40.11 implementoval tento systém na štúdium zostavy meiotického vretienka.
00:07:46.01 Tento extrakt, ako hovorím, je to naozaj cytoplazma.
00:07:50.26 Obsahuje bohaté organely, mitochondrie, ER atď.
00:07:55.06 Obsahuje tiež glykogén, zdroj energie, ribozómy na tvorbu bielkovín.
00:07:59.22 naozaj všetko v bunke, okrem jadier.
00:08:03.03 Je metabolicky aktívny. V skutočnosti spotrebuje asi 1 mM ATP za minútu,
00:08:08.26 ktorý prerába.
00:08:10.17 A mitochondrie vyčerpávajú kyslík, čo sa ukazuje ako veľmi dobré pre fluorescenčné zobrazovanie
00:08:15.18 pretože kyslík má tendenciu bieliť fluorochrómy.
00:08:20.29 A nakoniec, stav bunkového cyklu možno presne kontrolovať,
00:08:24.15 čo je nevyhnutné pre tieto experimenty.
00:08:26.26 Takže som vás chcel previesť veľmi typickým experimentom s extraktom.
00:08:31.10 A toto je druh experimentu, dúfam, že ho budem robiť neskôr popoludní
00:08:35.13 vo Woods Hole.
00:08:37.19 Takže prvá vec je pripraviť tento extrakt.
00:08:39.16 A v typický deň by sme napríklad zbierali vajíčka pred obedom,
00:08:45.26 a extrakt by bol hotový po obede.
00:08:49.09 A môžete ho uložiť na ľade až 8 hodín.
00:08:51.17 Môžete to zmraziť a rozmraziť, ale nefunguje to tak dobre,
00:08:54.17 takže ak môžeme, vždy to radšej robíme čerstvé.
00:08:58.07 Ak chcete, môžete proteín, ktorý vás zaujíma, odstrániť protilátkou.
00:09:01.17 Takmer vždy pridávame fluorescenčné proteíny, aby sme mohli robiť zobrazovanie.
00:09:04.19 Veľa experimentov, ktoré vám ukážem, pridajte tubulín označený rodamínom,
00:09:09.27 takže môžeme vidieť rast mikrotubulov.
00:09:11.25 Zvyčajne pridávame jadro, alebo vám ukážem nejaké experimenty s DNA na guľôčkach
00:09:15.28 na spustenie zostavy vretena.
00:09:18.03 Môžete pridať liek, inhibičné činidlo, niečo také.
00:09:21.22 Potom zvyčajne vezmete niekoľko mikrolitrov, položíte to na sklíčko,
00:09:26.14 na vrch nahoďte krycie sklíčko, zalepte ho voskom,
00:09:28.29 a potom obraz pomocou živej fluorescenčnej mikroskopie.
00:09:31.22 A potom veľmi podstatná časť, keď dostanete dobrý film.
00:09:34.22 Neskôr. Nie v ten istý deň. Máte uložený film a urobili by ste kvantitatívnu analýzu obrazu
00:09:40.03 zistiť, čo sa stalo, a kvantifikovať, čo ste znepokojili
00:09:44.13 v porovnaní s divokým typom.
00:09:46.05 A celý tento postup, odtiaľto nadol,
00:09:49.24 trvá menej ako hodinu.
00:09:51.18 Jedným z dôvodov, prečo milujem tento systém, je, že môžete prísť na extrakt
00:09:54.07 o 1 hodine popoludní s nejakou veľkou teóriou,
00:09:57.21 a do 3 hodín ste už túto teóriu vyvrátili,
00:10:00.23 a všetci ste zúfalí. Skús ešte pár vecí,
00:10:02.24 a potom o 7. hodine večer máte nejakú novú teóriu,
00:10:06.01 a vy bláznivo pracujete do noci, aby ste zistili, či je to správne.
00:10:09.15 Takže to má veľmi rýchle tempo,
00:10:12.26 ktoré jednoducho milujem. Samozrejme, musíte
00:10:16.02 vopred pripravte veľa činidiel
00:10:18.10 aby tieto experimenty mohli ísť tak rýchlo.
00:10:21.23 A môžeme rekapitulovať aspoň dva druhy mikrotubulov.
00:10:26.07 Dnes naozaj budem hovoriť len o týchto vretenách meiózy II.
00:10:29.18 Rekapitulujeme to malé vreteno, ktoré žilo na vrchu vajíčka.
00:10:33.24 Ukážem vám jeden film. Stále viac pracujeme aj na mikrotubulových astry,
00:10:39.10 čo je nový smer pre moju skupinu.
00:10:42.07 Sú funkčné, tieto vretená.
00:10:45.04 Ukážem vám jeden film vretena, ktoré skutočne oddeľuje chromozómy.
00:10:48.20 Chromozómy tu nie sú zobrazené, ale červené --
00:10:50.29 Dúfam, že budete môcť vidieť, že tieto malé červené bodky sú kinetochory.
00:10:54.03 A na spustenie anafázy pridáme trochu vápnika.
00:10:58.22 Keď spermie vstúpi do vajíčka, vytvorí vápnikový pulz
00:11:01.25 ktorý prechádza cez cytoplazmu.
00:11:03 A to je to, čo prirodzene spúšťa anafázu
00:11:05.10 vretena meiózy II.
00:11:07.19 A tu môžete vidieť, tento film sa tu bude opakovať.
00:11:11.18 Sú tam nejaké kinetochory, sú ťahané a nakoniec sa dajú do pohybu.
00:11:15.05 Nechám to zacykliť ešte raz.
00:11:17.13 Takže toto robí meiotické vreteno
00:11:19.05 svoju prácu a nie teraz v živom vajci,
00:11:21.28 ale medzi sklíčkom a krycím sklíčkom.
00:11:23.26 A to urobil dobrý priateľ Paul Maddox,
00:11:26.21 ktorý bol skutočným šibalom s mikroskopom s rotujúcim diskom.
00:11:30.06 Takže tie druhy otázok, ktoré sme sa pýtali my a ďalší ľudia, ktorí študujú systém,
00:11:35.21 Aké signály spúšťajú montáž vretena?
00:11:37.21 Fascinovalo ma, ako sa mikrotubuly správajú vo vretienkach.
00:11:40.22 Z úvodu môžete vidieť, že som študentom dynamiky mikrotubulov.
00:11:45.25 A potom, ako sú vretená priestorovo usporiadané?
00:11:49.04 A týmto sa budem stručne venovať a dám vám nejaké referencie
00:11:53.14 ak sa do nich chcete dostať hlbšie.
00:11:55.09 Takže po prvé, čo spúšťa montáž vretena?
00:11:58.12 Táto otázka, čo reguluje montáž vretena, sa dá rozobrať
00:12:02.19 do časovej otázky -- čo sa spustí, keď sa objaví vreteno --
00:12:06.14 a potom vesmírna otázka -- kde sa vyskytuje.
00:12:09.17 A nič z toho nie je práca z môjho laboratória.
00:12:13.03 Časová otázka. Na spustenie zostavy vretena musí vstúpiť cytoplazma
00:12:16.28 mitotický stav a k tomu dochádza aktiváciou Cdk1
00:12:20.21 kináza (kináza Cdc2.CyclinB).
00:12:23.20 Toto je hlavná kináza, ktorá zapína celú mitózu.
00:12:26.27 To sú všetko učebnicové veci.
00:12:28.20 A je to manipuláciou tohto systému, ktorý ovládame
00:12:33.22 či je extrakt v interfáze alebo mitóze.
00:12:36.04 Vesmírna otázka je naozaj prečo to máte
00:12:39.08 meiotické vreteno priamo tu vo vajci
00:12:42.11 a nie niekde inde?
00:12:43.22 Prečo práve na jednom mieste? A toto je presné
00:12:45.24 severný pól vajíčka, že je tam zostava vretena.
00:12:48.23 Čo je zvláštne na tom mieste, ktoré tvorí vreteno
00:12:52.15 tam a nikde inde?
00:12:55.17 A čo je na tom mieste zvláštne
to je miesto, kde je DNA -- materský genóm.
00:13:03.08 To je miesto, kde sú kondenzované chromozómy materského genómu.
A teraz si myslíme, že vreteno sa tvorí okolo DNA.
00:13:12.26 A toto bol skutočne objav a súčasť životnej práce môjho dobrého priateľa Erica Karsentiho.
00:13:18.19 Tu je pár klasických odkazov.
Kedysi, vlastne ešte keď som bol postgraduálny študent, bol v laboratóriu Marca Kirschnera,
00:13:26.09 a vstrekoval DNA do vajec a sledoval, čo sa stalo.
00:13:29.14 A všimol si, že ak by ste vstrekli DNA, vytvorili by sa okolo nich ektopicky vretená.
00:13:34.10 A už v roku 1984 predpokladal, že DNA tu vysiela nejaký signál,
00:13:38.29 ktorý si predstavoval, že bude akýmsi gradientom -- vysoko v DNA
00:13:42.24 a klesajúci inde -- to by spustilo montáž vretena
00:13:47.17 priamo tam na vrchu vajíčka
00:13:49 a nie nikde inde.
00:13:51.00 A po mnoho rokov bola povaha tohto signálu úplne záhadná,
00:13:56.28 ale teraz poznáme z molekulárneho hľadiska aspoň dva signály.
A bol to krásny experiment, ktorý to dokázal, že spúšťačom je DNA,
00:14:06.25 urobila Rebecca Heald, keď bola post-doktorandkou v laboratóriu Erica Karsentiho.
00:14:10.15 Vzala úplne náhodnú sekvenciu DNA z bakteriofága
00:14:15.02 ho spojili s plastovými guľôčkami pomocou magnetických guľôčok, pretože sa s nimi pohodlne manipuluje,
00:14:19.15 vložil ich do extraktu a zistil, že sa spustili
00:14:22.19 polymerizácia mikrotubulov a zostava vretena.
00:14:25.01 A opäť je tu jedno ich vreteno.
00:14:27.25 Takže je to naozaj len klasický dôkaz koncepcie Karsenti
00:14:31.26 že DNA je priestorovým spúšťačom.
00:14:33.28 Ukážem vám o tom film, ktorý natočili tu vo Wood's Hole Aaron Groen a Tom Maresca
00:14:41.07 v systéme vaječného extraktu. Toto je tu mierka.
00:14:46.25 Dúfam, že tu vidíte, tento zhluk kruhov sú guľôčky DNA.
00:14:50.23 A môžete vidieť, že mikrotubuly sa najprv tvoria dosť náhodne okolo guľôčok
00:14:54.24 a postupne sa organizujú -- tu sa hrajú hodiny a sekundy --
00:14:59.22 do tejto charakteristickej bipolárnej štruktúry.
00:15:02.16 Tento druh vretena v skutočnosti nedokáže oddeliť guľôčky,
Viete, na rozdiel od chromozómov ich nemôžete rozdeliť na dve časti.
00:15:09.05 Ale veríme, že skutočný proces montáže využíva všetky rovnaké faktory a je
00:15:13.17 v mnohom podobné.
00:15:16.13 Náš obraz samoorganizácie meiotických vretien je
00:15:21.29 že začnete s DNA, zostavenou do chromozómov. Hovoríme tomu chromatín.
00:15:26.02 To spustí nukleáciu mikrotubulov v blízkosti DNA.
00:15:29.14 Mikrotubuly sa potom vytriedia a zbalia,
00:15:32.08 a na to sú dôležité motorické bielkoviny. O chvíľu k nim prídem.
00:15:36.22 Ale je tiež veľmi dôležité vrátiť sa k témam môjho úvodu,
00:15:42.07 aby sme to nepovažovali len za lineárnu cestu,
00:15:44.25 pretože akonáhle máte toto vreteno, montáž nie je dokončená,
00:15:47.21 táto stavba sa neustále prestavuje.
00:15:50.07 Takže stále prebieha ten istý proces, takže sa neustále buduje.
00:15:55.22 To je ustálený stav.
00:15:57.15 DNA vysiela nejaký signál. Aký je charakter tohto signálu?
00:16:02.29 A myslím si, že Eric už na začiatku cítil, že by to bolo pravdepodobne to, čo by sme mohli nazvať systémom difúzie reakcie.
00:16:09.10 To je niečo, kde miestny zdroj, prilepený na DNA alebo na chromatín,
00:16:13.25 vytvára nejakú nestabilnú molekulu, ktorá môže difundovať preč.
00:16:18.04 Tá molekula je nestabilná, pretože ju rozkladá druhý enzým.
00:16:22.24 A ak máte taký reakčno-difúzny systém,
00:16:26.17 to spôsobí priestorový gradient koncentrácie
00:16:30.11 signálu. A tí z vás, ktorí sú matematicky naladení, by mohli prísť na to
00:16:33.28 aký je tvar tejto krivky -- aká by to bola matematická funkcia
00:16:37.18 pre bodový zdroj.
00:16:40.04 Tu stačí, že signál je vysoký v DNA a potom sa zníži
00:16:44.15 kvôli kombinácii výroby, difúzie a rozpadu.
00:16:50.09 A tento koncept je v skutočnosti veľmi podobný konceptu morfogénu
00:16:54.11 vo vývojovej biológii -- molekula, ktorá difunduje do tvaru embrya.
00:16:59.11 Rozdiel je v tom, že namiesto difúzie medzi bunkami,
00:17:02.03 šíri sa vo vnútri bunky.
00:17:04.12 A myslím si, že vretenové morfogény, ak chcete použiť tento výraz,
00:17:09.24 difúzia od DNA je jedným z najlepších príkladov, ktoré máme
00:17:12.16 reakčno-difúzneho systému fungujúceho vo vnútri živej bunky.
00:17:17.05 Takže nebudem zachádzať do celej histórie.
00:17:21.21 V skutočnosti teraz poznáme dva signály vysielané DNA.
00:17:24.18 Jedna je malá GTPáza, Ran, vo forme GTP,
00:17:29.07 a ďalšou je fosforylácia proteínov. Signál Ran je vytvorený pomocou
00:17:34.09 Spustil GEF a potom sa rozložil lokálne na chromozóme,
00:17:38.06 a potom GAP. toto [GEF] je výmenný faktor GTP.
00:17:40.09 Toto [GAP] je proteín aktivujúci GTPázu.
00:17:43.06 Fosforylačný gradient generuje Aurora B kináza
00:17:46.16 a potom globálne oponované fosfatázami.
00:17:49.19 Je tu recenzia pre ľudí, ktorí sa o tom chcú dozvedieť viac.
00:17:53.19 Dnes budem hovoriť len o gradiente Ran.
00:17:57.09 Prepáčte, toto. Ale tento fosforylačný gradient je tiež veľmi dôležitý.
00:18:02.09 Snažím sa to tu urobiť čo najjednoduchšie.
00:18:04.16 Tu je karikatúra systému Ran. Faktor výmeny GTP
00:18:12.03 je lokalizovaný na DNA. Ran-GDP – to je neaktívna forma tejto malej GTPázy –
00:18:18.10 sa potom katalyticky zapne (výmena GTPázy) pomocou Rcc1.
00:18:23.24 Toto [Ran-GTP] je aktívny faktor, ktorý spúšťa montáž vretena.
00:18:26.20 Potom sa Ran-GTP premení späť na Ran-GDP proteínom aktivujúcim GTPázu
00:18:32 to je globálne.
00:18:34.07 A toto objavila partia ľudí. Dal som tam nejaké mená.
00:18:37.18 Moje laboratórium nebolo jedným z nich. Myslím si, že toto je úplne úžasná biológia.
00:18:42.12 Ešte jedna informácia. Toto je presne ten istý systém, ktorý poháňa jadrový dovoz
00:18:50.09 počas medzifázy. Takže toto je systém, ktorý poháňa dopravu závislú od NLS
00:18:54.24 cez jadrové póry, aj keď o tom dnes nebudem hovoriť.
00:18:58.19 A čo robí Ran -- Ran-GTP. Existujú dôležité molekuly zostavy vretena
00:19:05.22 (tu je jeden, nazývaný TPX2), ktoré sú sekvestrované.
00:19:09.03 Sú sekvestrované väzbou na molekulu nazývanú importín,
00:19:12.17 čo je alfa-beta heterodimér.
00:19:16.16 Takže TPX je tu neaktívny, pretože je sekvestrovaný.
00:19:19.17 Ran-GTP sa viaže na importín-beta a rozdeľuje tento komplex na tri časti.
00:19:24.12 Teraz môže TPX vykonávať svoju prácu, ktorou je organizovanie vretien.
00:19:30.06 TPX2 je vlastne jeden z proteínov, na ktorých pracoval Eric Karsenti a na ktorých pracuje moje laboratórium.
00:19:34.00 V skutočnosti presne nevieme, ako to funguje.
00:19:36.21 Vieme, že je to kľúčový faktor montáže vretena.
00:19:39.12 Takže toto je biochémia.
00:19:42.19 A jednu otázku, ktorú by ste sa podľa mňa veľmi prirodzene chceli opýtať, je,
00:19:49.04 Dobre, tvrdím, že existuje priestorový gradient, ktorý spúšťa túto samoorganizáciu
Ukázal som vám okolo guľôčok DNA, ale môžeme skutočne vidieť ten priestorový gradient?
00:19:57.25 Vieme si to predstaviť?
00:19:59.01 Je to veľmi ťažké urobiť, pretože ak ste napríklad fixovali bunku na imunofluorescenciu,
00:20:04.06 toto sú údajne rozpustné molekuly,
00:20:07.16 pravdepodobne by sa všetci pohybovali počas vášho spracovania.
00:20:10.15 Takže toto je veľmi náročná výzva.
00:20:13.22 A túto výzvu vyriešili Rebecca Healdová a Karsten Weiss.
Heald bol študentom Karsentiho, ktorý robil ten experiment s guľôčkami DNA.
00:20:21.19 Postavili elegantný biosenzor FRET. Ide o fluorescenčný rezonančný prenos.
00:20:29.20 A toto je druh biosenzora, ktorý ľudia používajú
00:20:32.29 pre množstvo aplikácií v dnešnej bunkovej biológii,
00:20:35.28 čo nám umožní vidieť zmeny v chemickom stave cytoplazmy mikroskopom.
00:20:42.05 A spôsob, akým to funguje, je, že doména viažuca Ran je tu zobrazená zelenou farbou.
00:20:47.26 Tu je to lepšie vidieť.
00:20:49.15 Zlúčené na N alebo C konci (nie som si istý, ktorý je ktorý,
00:20:52.28 Odkaz som dal sem, ak by to ľudí zaujímalo)
00:20:55.17 na CFP a YFP.
00:20:59.11 A keď je táto molekula sama o sebe,
00:21:01.07 CFP a YFP sú dostatočne blízko pri sebe, aby získali efektívny FRET --
00:21:04.13 prenos fluorescenčnej rezonančnej energie -- z CFP do YFP.
00:21:09.03 Takže signál FRET je vysoký.
00:21:10.22 Teda ak je Ran vo forme HDP.
00:21:13.06 Ak je Ran vo forme GTP, viaže sa na doménu viažucu Ran,
00:21:16.11 akosi oddeľuje dve polovice tejto molekuly vo vesmíre a signál FRET klesá.
00:21:22.00 A toto je jedna z dvoch rôznych sond, ktoré vyvinuli Heald a Weiss.
00:21:26.18 A tu je ich senzor, ktorý robí svoju prácu.
00:21:31.06 Takže je to viacfarebný experiment živého zobrazovania.
00:21:33.06 Tu vidíme mikrotubuly s fluorescenčným tubulínom.
00:21:37.09 Tu vidíme signál YFP zo sondy.
00:21:41.08 Tu je signál CFP a tu signál FRET.
00:21:44.11 A táto farba tu znamená, že toto je nízka hodnota FRET.
00:21:48.04 Ak sa vrátime späť, nízka hodnota. Toto je vysoká hodnota, toto je nízka hodnota.
00:21:52.14 To je miesto, kde je Ran-GTP, kde je vypnutý FRET.
00:21:55.14 A tak tu môžete vidieť túto nízku hodnotu v gradiente
00:21:58.27 naznačuje, že je tu vysoká koncentrácia Ran-GTP.
00:22:02.01 Takže tu vlastne vizualizujeme, naživo v úryvku,
00:22:06.26 tento reakčno-difúzny gradient Ran-GTP,
00:22:11.19 čo si myslím, že je naozaj pozoruhodná vec.
00:22:14.10 Ako som už spomenul, myslím si, že toto je jeden z najlepších príkladov
00:22:16.27 reakčno-difúzneho gradientu v bunkách.
00:22:19.26 V tejto súvislosti je veľa otázok.
00:22:22.06 Jedna vec, ktorú si všimnete, je, že tvar priestoru v extrakte, ktorý má vysoký Ran-GTP
00:22:27.28 koncentrácia nemá rovnaký tvar ako mikrotubuly.
00:22:33.03 Takže dokonca, aj keď veríme v túto vysokú oblasť Ran-GTP
00:22:36.03 tu je spúšťacia zostava mikrotubulov,
00:22:38.24 myslíme si, že to nemôže diktovať presný tvar mikrotubulov
00:22:44.07 alebo napríklad presná dĺžka vretena.
00:22:47.01 A ako sú organizované, myslím, bude viac vychádzať z
00:22:51.11 samotné mikrotubuly a motorické proteíny, o ktorých budem hovoriť o chvíľu.
00:22:56.05 Ako sa správajú mikrotubuly vo vretene?
00:22:59.13 Takže druhá téma, ktorej sa chcem venovať.
00:23:02.11 V úvode som teda hovoril o tom, ako sa vreteno neustále prestavuje --
00:23:05.28 výmena podjednotiek s cytoplazmou.
00:23:09.01 To vieme už dlho.
00:23:10.23 Ale aká je povaha tej nepretržitej prestavby?
00:23:13.14 Len aby som vám dal predstavu o mikrotubuloch,
00:23:16.23 toto je elektrónový mikrosnímok vretena.
00:23:19 A tu je kreslená predstava.
00:23:22.06 Jedna z vecí, na ktoré chcem poukázať, je, že v týchto vretienkach vaječného extraktu,
00:23:25.15 veľká väčšina mikrotubulov je tu tohto druhu,
00:23:29.04 sa pripája na kinetochory a len asi 5 % molekúl sa pripája na chromozómy.
00:23:35.16 Keď hovorím o správaní mikrotubulov,
00:23:37.18 pomocou druhu hromadných opatrení, ktoré ukážem,
00:23:39.27 Hovorím o týchto takzvaných nekinetochórových mikrotubuloch.
00:23:43.16 To sú mikrotubuly, ktoré dávajú vretienku jeho veľkosť a tvar.
00:23:48.02 Nie sú to mikrotubuly, ktoré v skutočnosti oddeľujú chromozómy,
00:23:51.15 ale sú to najdôležitejšie mikrotubuly na rozprávanie o probléme samoorganizácie.
00:23:57.18 Takže jedna vec, ktorú vieme, je, že mikrotubuly sa obracajú veľmi rýchlo, ako som naznačil
00:24:03.13 v karikatúre.
00:24:06.07 Klasický experiment, ktorý sa robil, keď som bol ešte doktorandom
00:24:10.29 od Teda Salmona, Dicka McIntosha a spolupracovníkov
00:24:14.27 je experiment obnovy fluorescenčného fotobielenia.
00:24:18.00 Toto je rok 1984, takže to bolo urobené pomocou videokamery, nie modernej digitálnej kamery,
00:24:24.20 takže to vyzerá trochu rozmazane.
00:24:26.13 Ale myšlienka v tomto experimente je, že máte vreteno obsahujúce fluorescenčný tubulín.
00:24:31.14 Toto je mikroinjektovaný tubulín značený fluoresceínom.
00:24:33.19 Na bielenie jednej polovice vretena bol použitý laser.
00:24:36.26 A kľúčom k tomuto experimentu je, že v skutočnosti nepoškodíte vreteno,
00:24:40.04 práve vypínate fluorescenciu.
00:24:41.18 A potom, o pár sekúnd neskôr, tu môžete vidieť zotavenie.
00:24:45.17 A môžete nakresliť krivku zotavenia.
00:24:48.20 A v skutočnosti je polčas zotavenia asi 19 sekúnd.
00:24:51.01 Takže Salmon a McIntosh usúdili, že podjednotky sa dostatočne vymieňajú
00:24:55.19 rýchlo, že za 19 sekúnd sa polovica mikrotubulov vo vretene obrátila
00:25:02.10 a osviežení. Takže aj keď vreteno môže trvať hodiny,
00:25:05.04 podjednotky v ňom pretrvávajú iba pre
00:25:08.07 desiatky sekúnd vo vnútri vretena.
00:25:11.05 A to je naozaj veľmi charakteristické pre vreteno
00:25:14.05 a dôležité pre tie vlastnosti, o ktorých som hovoril v úvodnom materiáli.
00:25:19.00 Teraz vám to ukážem. je toho veľa. Strávil som dlhý čas...
00:25:22.24 ja a moji spolupracovníci -- študujeme správanie mikrotubulov a vretená.
Ukážem vám jeden nedávny experiment, ktorý vykonali Dan Needleman a Aaron Groen,
00:25:30.14 čo je zobrazovanie s jednou molekulou.
00:25:32.17 Takže zobrazovanie prešlo od tohto článku z roku 1984 dlhú cestu.
00:25:35.25 Teraz pomocou konfokálneho rotujúceho disku
00:25:39.09 a veľmi citlivá kamera, môžeme tu vidieť tieto bodky.
Ukázalo sa, že ide o jednotlivé molekuly tubulínu.
00:25:46.00 A to, čo sme tu urobili, je, že sme zvýšili veľmi nízku koncentráciu
00:25:50.20 fluorescenčného tubulínu do vretena, takže iba 1 z každých 200 000
00:25:55.19 je približne fluorescenčný.
00:25:57.20 To znamená, že jeden mikrotubulus bude mať v priemere len 1 fluorescenčnú škvrnu.
00:26:02.18 A ak odstúpim a prehrám film,
00:26:07.10 Dúfam, že tu vidíte tieto bodky.
00:26:09.21 Zvyčajne naše oči najviac priťahuje skutočnosť, že tieto škvrny sa pohybujú.
Všetky sa akosi šmýkajú, ak sa pozorne pozriete. Tie v južnej polovici sa posúvajú na juh,
00:26:21.02 a tie v severnej polovici sa posúvajú na sever.
00:26:23.17 Ale ak sa pozorne pozriete na každú bodku a pokúsite sa ju sledovať,
00:26:27.14 si všimnete, že zmizne alebo sa objaví nový.
00:26:30.14 A tu je zobrazená naša interpretácia tohto filmu.
00:26:36.19 Takže, keď molekula tubulínu len difunduje v roztoku.
00:26:41.17 V bunkách približne polovica tubulínu typicky v somatickej bunke
00:26:47.22 je rozpustný a asi polovica je v polyméri.
00:26:50.10 Tu v extrakte je veľká väčšina rozpustná.
00:26:53.09 Rozpustná molekula tubulínu veľmi rýchlo difunduje.
00:26:57.18 Získanie obrazu na kamere trvá približne 500 milisekúnd.
00:27:02.16 Za ten čas sa rozpustná molekula len rozptýli a rozmaže sa.
00:27:06.06 Ak je táto molekula zachytená rastúcim mikrotubulom,
00:27:11.02 teraz sa pohybuje oveľa pomalšie a teraz si to môžeme predstaviť.
00:27:13.01 Môžeme ho zobrazovať tak dlho, ako je v mikrotubule.
00:27:17.13 Keď mikrotubuly opäť depolymerizuje, vráti sa späť do rozpustnosti.
00:27:20.04 Takže môžeme. Práve som to tu uviedol.
00:27:24.15 V skutočnosti môžeme merať životnosť v polyméri jednej molekuly tubulínu
00:27:29.18 tým, že uvidíme, ako dlho to môžeme sledovať.
00:27:31.08 A potom, ak budete sledovať pohyb miesta --
00:27:33.16 Tu som ukázal pohyb smerom ku mne --
00:27:36.13 môžeme tiež sledovať kĺzanie celého mikrotubulu.Je to druh referenčnej značky, ak chcete
00:27:41.10 pre kĺzanie mikrotubulov.
00:27:43.24 Je ľahšie vidieť obrat -- jednotlivé miesta prichádzajú a odchádzajú --
00:27:49.09 ak blokujete sklz.
00:27:50.17 V tomto experimente bolo kĺzanie blokované liekom, ktorý zmrazuje kinezín-5,
00:27:55.18 motor vo vretene budem hovoriť.
00:27:58.10 Teraz sa škvrny neposúvajú, môžete ich vidieť takmer blikať.
00:28:01.14 To blikanie je, že každé miesto príde, pretrváva niekoľko sekúnd,
00:28:06.11 a znova zmizne. A tento experiment tiež ukazuje, že kĺzanie môžete odpojiť
00:28:11.05 z dynamiky polymerizácie.
00:28:13.21 A tie škvrny sú dostatočne svetlé a dobre oddelené
00:28:19.26 že ich možno sledovať pomocou automatického softvéru.
00:28:22.18 Toto je práca Dana Needlemana s použitím softvéru prevzatého z fyzikálnych laboratórií
00:28:26.24 ktorí študujú pohyb častíc.
00:28:28.29 Tu môžete vidieť trajektórie -- to sú zvislé čiary.
00:28:33.15 Toto je kontrolné vreteno, toto je jedno z tých vretien zmrazených liekmi.
00:28:36.22 Takže je tam všetko zamrznuté.
00:28:38.13 A pomocou tohto druhu softvéru môžete kvantifikovať
00:28:42.11 ako kĺzanie, tak aj to, ako dlho každé miesto pretrváva,
00:28:46.29 čo je životnosť toho miesta v polyméri.
00:28:51.08 A tu je zápletka na celý život.
00:28:53.16 Takže tu je, ako dlho môže byť spot zobrazený,
00:28:56.13 verzus zlomok spotov a je tu asi 16 000 individuálnych spotov
00:29:00.21 ktoré sa dostali do tohto grafu.
00:29:03.12 A modré body sú tu údaje. Červená čiara tu zodpovedá teoretickej krivke.
00:29:12.16 t na -3/2 [krát] e na -t nad tau.
00:29:16.11 Je tu 1 nastaviteľný parameter - tento parameter tau.
00:29:20.18 A potom je tu priemerná životnosť 16 sekúnd, takže stred tohto rozdelenia.
00:29:26.20 Tu je pár bodov: tu je týchto 16 sekúnd, dúfam, že poznáte,
00:29:31.10 nápadne podobné klasickému číslu lososa a McIntosha v morských ježkoch.
00:29:36.10 Takže táto rýchlosť obratu s touto sofistikovanejšou modernou metódou
00:29:40 skutočne potvrdzuje zhruba starú hodnotu.
00:29:42.29 Táto rovnica je tu. Musím povedať, že toto je najkomplikovanejšia rovnica
00:29:47.20 Už som niekedy narazil vo svojej vlastnej práci.
00:29:49.19 Trvalo mi dlho, kým som to pochopil.
00:29:51.07 Aká je v skutočnosti táto rovnica, ak sa vrátim späť,
00:29:53.27 na túto snímku tu. Toto je prvý čas prechodu jednorozmernej náhodnej prechádzky.
00:30:01.07 Je to očakávaný čas, ak špička mikrotubulu robí náhodnú prechádzku
00:30:05.28 v pozícii. 1. čas prechodu prichádza z červeného bodu späť do červeného bodu.
00:30:12.04 Takže, toto je presne tá krivka, ktorú by ste očakávali, keby znak + skončil
00:30:19.06 mikrotubuly robia náhodnú prechádzku.
00:30:20.27 A tento proces dynamickej nestability -- tieto veľké výkyvy dĺžky --
00:30:23.29 veríme, že je to forma náhodnej prechádzky.
00:30:25.26 Takže toto je uspokojivá zhoda s teóriou, čo je podľa mňa dosť komplikovaná rovnica.
00:30:34.18 Povedal by som, že to nie je také jednoduché.
00:30:37.22 A ak ľudí viac zaujíma kvantifikácia, veľa sme sa pohádali s recenzentmi
00:30:43.18 článku o tom, ako presne to interpretovať,
00:30:46.28 a odkázal by som ľudí na noviny Dana Needlemana
00:30:49.19 v MBC v roku 2010, ak o to majú záujem.
00:30:55.29 Takže keď zhrnieme veľa práce tohto druhu,
00:30:58.26 obrázok vretena, ktoré sa vynorí, je tu, kde je žltá
00:31:02.11 tyčinky sú nejaký druh nukleačnej štruktúry, zelená je mikrotubul,
00:31:06.15 a biele šípky sú posuvný pohyb.
00:31:08.18 Takže mikrotubuly sú jadrové v celom vretene,
00:31:11.13 ich plusové konce rastú a zmenšujú sa dynamickou nestabilitou, ktorá má charakter náhodnej chôdze.
00:31:16.17 V priemere žijú 16 sekúnd,
00:31:19.17 a rastú na dĺžku asi 5 mikrónov.
00:31:21.23 A potom sa posúvajú smerom k pólom, väčšinou premenlivým tempom.
00:31:26.24 Takže je tu taký posuvný jav.
00:31:29.03 Takže mikrotubuly sú v priemere o niečo kratšie
00:31:32.09 ako samotné vreteno a všetky sa posúvajú.
00:31:35.10 Takže toto, myslím, teraz zodpovedá obrázku, ktorý som dal v úvode
00:31:40.26 vretena sa neustále obnovujú,
00:31:44.02 a ukazuje nám, ako sa správajú mikrotubuly.
00:31:46.19 Samozrejme to vedie k mnohým ďalším otázkam.
Jedna otázka, ktorá nás veľmi zaujíma, je, ako sú tieto krátke mikrotubuly organizované?
00:31:52.10 Prečo sa všetky šmýkajú? A ja vám na to odpoviem.
00:31:56.13 A ako sú potom jadrové?
00:31:57.28 A čo sú tieto žlté skrinky, ktoré iniciujú mikrotubuly?
00:32:02.26 Toto je nevyriešený problém, na ktorom my a iní momentálne pracujeme.
00:32:06.17 Vieme, že pre organizáciu sklzu je to veľmi dôležitá úloha
00:32:12.09 pre motorické proteíny -- motorické proteíny ATPázy, ktoré predstavím
00:32:15.10 za sekundu o niečo viac.
00:32:17.02 Vieme to hlavne z experimentov s inhibíciou alebo vyčerpaním.
00:32:20.04 Tu je séria inhibičných experimentov, ktoré boli vykonané tu vo Woods Hole v roku 2000.
00:32:24.09 Tu je niekoľko kontrolných vretien z polarizačnej mikroskopie.
00:32:27.17 Tu sme inhibovali motorický cytoplazmatický dyneín orientovaný na mínus koniec.
00:32:31.16 A dúfam, že môžete vidieť, že tyče namiesto toho, aby boli sústredené ako pri kontrolách,
00:32:35.16 sú všetky akési roztiahnuté.
00:32:37.06 Dúfam, že v tomto je to veľmi jasné.
00:32:39.14 Tu sme inhibovali kinesín smerujúci do plusového konca, o ktorom budem hovoriť za sekundu,
00:32:43.00 nazývaný Eg5 alebo kinesin-5.
00:32:45.00 Teraz sú žrde zložené dohromady.
00:32:47.12 Tento tvar je tu radiálne zoskupenie mikrotubulov alebo aster.
00:32:51.07 Fascinujúce a v skutočnosti tomu vôbec nerozumieme,
00:32:54.11 ak zablokujete oba motory, štruktúra sa opraví sama.
00:32:58.18 Vyzerá to trochu ako kontrola, aj keď sú oveľa krehkejšie.
00:33:01.03 Ľahšie sa rozpadajú, najmä ak do nich strčíte.
00:33:04.09 A tento druh experimentu nám dal takýto obrázok vretena,
00:33:09.22 kde motory orientované na mínus koniec pomáhajú zoskupovať póly dohromady.
00:33:12.28 Takže, ak sa ich zbavíte, tyč sa roztiahne.
00:33:15.01 A motory smerujúce do plusového konca pomáhajú udržiavať vreteno bipolárne.
00:33:19.13 V tomto probléme sme strávili veľa času na motore smerovanom do plusového konca, kinesin-5.
00:33:25.18 Je to tetramérny kinezín zameraný na koniec,
00:33:28.05 a homológy tohto motora sú potrebné na montáž vretena u väčšiny eukaryotov,
00:33:33.00 až po kvasinky a až po rastliny.
00:33:35.21 Kreslím to takto.
00:33:37.07 Toto sú štyri motorické domény a sú tu dve vinuté cievky
00:33:40.23 ktoré na seba vzájomne pôsobia antiparalelným spôsobom.
00:33:43.19 Tu je jeho karikatúra.
00:33:46.17 Tu je film kinesínu kráčajúceho po mikrotubuloch od môjho kolegu Rona Valea a jeho laboratória,
00:33:53.07 na základe štruktúr kryštálovej a elektrónovej mikroskopie.
00:33:56.12 Toto je nakreslené pre konvenčný kinesín,
00:33:59.12 ale ak si predstavíte, že toto je jeden koniec Eg5
00:34:01.22 a potom druhý koniec je tu hore,
00:34:04.07 a dva konce sú rovnaké, takže je samozrejme príťažlivé predpokladať
00:34:08.16 že interagujú s dvoma rôznymi mikrotubulami
00:34:11.14 a krížnym mostíkom. A túto myšlienku ako prvý navrhol Jon Scholey,
00:34:14.28 už dávno --
00:34:16.14 kolegu v teréne.
00:34:20.09 A jeden dôvod, prečo sme boli schopní pracovať na kinezíne-5 v našom vretenovom systéme pomerne ľahko
00:34:24.23 máme nejaké pekné inhibítory s malými molekulami -- lieky.
00:34:26.28 A tieto lieky viažu. toto je vrecko viažuce ATP
00:34:32.17 v hlave kinesinu-5.
00:34:35.08 Toto je pekné vrecko na viazanie drog.
00:34:37.18 Prvý liek, ktorý sme skutočne našli a ktorý sa zmestí do vrecka
00:34:41.07 je liek nazývaný monastrol,
00:34:42.22 ktoré sme našli chemickým skríningom ešte v roku 1999.
00:34:47.00 Odvtedy boli vyvinuté oveľa účinnejšie a špecifickejšie inhibítory
00:34:51.02 priemyselnými skupinami v nádeji, že budú užitočné pri liečbe pacientov s rakovinou.
00:34:58.04 To je vlastne celý príbeh.
00:35:00.08 Naše inhibítory kinezínu-5 zatiaľ neboli úspešné pri liečbe rakoviny,
00:35:03.24 a prečo to tak je, myslím si, je zaujímavý príbeh, o ktorom dnes nebudem hovoriť.
00:35:08.03 Táto trieda liekov zachytáva motor v stave so slabou afinitou k mikrotubulu
00:35:13.12 takže je to ako odstrániť motor.
A môžeme robiť také experimenty, ktoré sú tu uvedené.
00:35:17.28 Tu je kontrolné vreteno, kde sa tu objavujú tieto škvrnky
00:35:21.19 sú . môžete vidieť posúvanie mikrotubulu.
00:35:24.04 Tu je rovnaký druh vretena ošetrený inhibítorom kinezínu-5.
00:35:26.17 A ak odstúpim, dúfam, že uvidíte, ako sa mikrotubuly v tomto neustále oddeľujú,
00:35:31.27 zatiaľ čo tu sú statické.
00:35:34.19 A z tohto druhu filmu získame tento obraz,
00:35:40.14 veľmi podobný pôvodnej hypotéze Jona Scholeyho.
00:35:42.24 Kinezín-5 tu premosťuje dva antiparalelné mikrotubuly.
00:35:47.00 Tento koniec smeruje k plusovým koncom,
00:35:49.27 tento koniec smeruje k plusovým koncom.
00:35:51.21 To vytvára silu na mikrotubuly znázornené zelenou farbou
00:35:54.20 čo ich od seba oddeľuje
00:35:56.22 a akosi tlačí dva póly vretena od seba.
00:35:59.27 A to je aktuálny pohľad na to, ako kinesin-5 funguje v teréne.
00:36:06.19 A tu je tento druh motorom poháňaného posuvného poľa,
00:36:10.08 a chcem to dať do súvislosti s obrázkom, ktorý som ukázal v úvode,
00:36:12.21 kde som hovoril o tlačení a ťahaní tyčí
00:36:16.22 a teraz priveďte špecifické molekuly.
00:36:18.04 Takže dyneín tak trochu sústreďuje póly dohromady,
00:36:21.09 a potiahnutím dovnútra ich kinesin-5 vytlačí von.
00:36:24.12 A tie motory prichádzajú a odchádzajú z vretien.
Sú ako tubulín -- veľmi rýchlo sa prevracajú.
00:36:29.13 A tak vreteno neustále mení polohu motorov
00:36:34.20 a opätovné vyváženie síl.
00:36:36.14 A opäť je to súčasť tohto dynamického ustáleného stavu
00:36:39.19 čo dáva vretenu jeho životné vlastnosti.
00:36:43.05 Takže veľa detailov. Dúfam, že to bolo zaujímavé.
00:36:49.03 Dovoľte mi ich rýchlo zhrnúť.
00:36:50.12 Meiotické vretená vajíčok sa organizujú samy
00:36:52.24 v blízkosti DNA, spustený reakciou-difúziou
00:36:55.17 Ran-GTP a tiež kinázový gradient.
00:36:58.04 Sú postavené z relatívne krátkych mikrotubulov
00:37:00.29 ktorých plusové konce podliehajú neustálej dynamickej nestabilite.
00:37:03.29 Sú organizované týmito motorickými proteínmi,
00:37:06.28 plusové a mínusové motory, ktoré podporujú kĺzanie a zoskupovanie.
00:37:10.16 A čo by som namietal, hoci tomu úplne nerozumieme,
00:37:14.05 tieto reakcie spolu vytvárajú tento veľmi dynamický ustálený stav
00:37:17.26 vo veľkosti a tvare, ktorý sa neustále prestavuje,
00:37:20.28 neustále upravujú sily tak, aby boli v rovnováhe,
00:37:24.06 a to je to, čo dáva týmto veľmi živým silám.
00:37:27.27 Takže, ak sa vrátime k tomuto filmu, ktorý som ukázal v úvode
00:37:30.16 tavenie dvoch vretien,
00:37:32.00 čo pre mňa viac než čokoľvek ukazuje zvláštne vlastnosti tejto štruktúry,
00:37:37.27 v porovnaní napríklad s bakteriofágom,
00:37:39.18 čo by to určite neurobilo,
Dúfam, že ten molekulárnejší druh obrazu
00:37:43.29 vám môže pomôcť začať určovať, ako to funguje,
00:37:47.04 aj keď v žiadnom prípade nechcem predstierať, že ide o vyriešený problém.
00:37:51.18 Existuje veľa otázok do budúcnosti.
00:37:54.02 Konkrétne, ako sa tvoria mikrotubuly?
00:37:56.01 Veľkosť a tvar vretena sa veľmi riadi
00:37:58.21 kde sú nukleované mikrotubuly,
00:38:00.24 a to je biochemicky nevyriešený problém.
00:38:03.21 Vieme, že je to po prúde od gradientu Ran,
00:38:06.00 ale čo to je z molekulárneho hľadiska, nevieme.
00:38:09.00 Chceli by sme a určite budeme potrebovať pomoc od fyzikov
00:38:13.00 a tu matematici, aby sme rozvinuli kvantitatívne pochopenie,
00:38:16.13 takže môžeme vlastne vysvetliť veľkosť a tvar.
00:38:19.16 tieto a tiež časové škály z kvantitatívneho hľadiska.
00:38:22.22 A nechám vám tu posledný bod.
00:38:26.00 Sú to medzifázové mikrotubuly.
00:38:27.28 Takže ak zmeníte bunkový cyklus, všetko sa zmení.
00:38:30.02 A po mnoho rokov sme sa sústredili len na mitózu.
00:38:33.19 Teraz nás začala veľmi zaujímať medzifáza.
00:38:36.02 A to je celý seminár, ale dovoľte mi to
00:38:37.27 dám vám tu jeden úryvok.
00:38:39.03 Toto je práca Ani Nguyenovej a Christine Fieldovej.
00:38:42.16 Toto je podobný druh mikroskopie, menšie zväčšenie.
00:38:48.17 Toto je veľmi nízke mag -- celé toto pole má 600 x 800 mikrónov.
00:38:52.04 Takmer milimeter.
00:38:53.09 Modré sú tu jadrá spermií.
00:38:56.24 Zelenou farbou sú mikrotubuly.
A to, čo tu robíme, je, že napodobňujeme oplodnenie.
00:39:01.21 Dostávame spermie a vápnik súčasne
00:39:04.02 aby extrakt prešiel do medzifázy.
00:39:06.28 Takže spermie postavia túto veľkú astru, ktorú používajú
00:39:10.11 za organizáciu vajíčka, ktoré je podobné astre zebričky
00:39:14.06 ktoré som vám ukázal veľmi skoro v úvode.
00:39:17.23 A čo uvidíte, keď sa tento film spustí
00:39:19.29 tieto astry sa môžu pohybovať a môžu vyriešiť určitý druh geometrického problému
00:39:24.03 rozostupu.
00:39:26.01 Takže sa trochu stiahnem, aby ste videli
00:39:28.25 vyrastajúce mikrotubuly,
00:39:30.15 interakcie tu, plus-end na plus-end.
00:39:33.01 A dúfam, že vidíte, že v skutočnosti sú
00:39:35.16 riešenie fascinujúceho geometrického problému
00:39:38.06 rovnomerného rozostupu v poli.
00:39:40.26 Ako to funguje a úloha v biológii
00:39:45.09 oplodnenie a skorý vývoj je úplne iná téma.
00:39:49.25 A ak vám tam chcem niečo nechať,
00:39:52.11 je to tak, že je tu ešte veľa skvelých problémov so sebaorganizáciou, ktoré treba študovať.
00:39:57.29 Takže, dovoľte mi vrátiť sa k snímke
00:40:01.06 ktoré som tu použil vo svojom úvode,
00:40:03.22 kde je komplexný a krásny bakteriofág
00:40:07.25 ktorý má nemennú veľkosť a tvar, ktorý je akosi priamo zakódovaný génmi.
00:40:13.08 Meiotické vreteno, o ktorom som veľa času hovoril
00:40:15.17 teraz, kde cesta samoorganizácie vedie k oveľa dynamickejšej zostave
00:40:20.26 ktorý je v rovnovážnom stave, neustále sa obnovuje,
00:40:24.08 neustále vyvažovanie síl,
00:40:26.12 a to mu dáva schopnosť prispôsobiť sa veľkosti,
00:40:29.27 na opravu škôd a tieto ďalšie druhy životných vlastností.
00:40:34.08 Obe krásne, ale v princípe trochu iné.
00:40:38.01 A pre mňa, viete, tento je naozaj živý.
00:40:42.16 Dúfam, že to slovo môžem použiť.
00:40:45.02 A dovoľte mi na záver poďakovať
00:40:47.23 množstvo úžasných študentov a postdoktorandov
00:40:49.17 Pracoval som s nimi. Neurobil som si zoznam.
00:40:50.24 Dúfam, že som v diskusii spomenul mnohých z nich menovite.
00:40:53.04 Najmä môjmu dobrému priateľovi Tedovi Salmonovi, s ktorým pracujem s MBL už mnoho rokov
00:40:58.05 ako MBL Cell Division Group. Ukázal som niekoľko filmov natočených tu na MBL.
00:41:02.26 Tiež inšpiratívni kolegovia, najmä Marc Kirschner, môj doktorandský poradca,
00:41:07.12 Eric Karsenti, ktorý objavil myšlienku DNA organizujúcej vreteno,
00:41:12.21 Shinya Inoue, ktorá . naozaj jeden z prvých a najpremyslenejších študentov sebaorganizácie.
00:41:18.10 NIH-GM, ktorý financoval väčšinu tejto práce.
00:41:22.17 Sú hlavnými podporovateľmi základného biologického výskumu v USA.
00:41:28.13 Choď, GM! Minulý rok mali tuším 50 rokov.
00:41:30.29 A nakoniec, samozrejme, žaby, ktoré toto všetko umožnili.
00:41:35.15 Ďakujem.
00:41:37.29

  • Časť 1: Samoorganizácia mikrotubulových zostáv

Používanie kvasiniek už viedlo k objaveniu procesov súvisiacich so starnutím človeka. Tento projekt bude zahŕňať mutantné kmene kvasiniek, ktoré mali g.

Jadrová membrána okolo jadra dcérskych buniek sa rozpadne a uvoľní chromozóm. Znovu sa začnú tvoriť meiotické vretená a centri.

Akonáhle sú bunky úspešne skontrolované a pripravené v interfáze, bunka pokračuje do prvej časti mitózy. V Prophase sa chromozómy stočia.

V anafáze I sa homológne páry oddelia a presunú k pólom bunky. Počas telofázy I a cytokinézy sa bunka zmení na dve. V profáze II, a.

Bunkové delenie je komplexná biologická metóda, pri ktorej sa rodičovská bunka delí na dve alebo viac dcérskych buniek, v závislosti od toho, či je toto delenie mit alebo nie.

Keď dôjde k rozdeleniu, jednotlivé chromozómy sú ťahané k opačným pólom bunky. Oddelenie chromozómov je spôsobené mitotickým vretienkom.

Metafáza I je, keď sa páry chromozómov zoradia pozdĺž vretena. Anafáza I je, keď sa páry chromozómov rozdelia. Sesterské chromatidy zostávajú na.

Je to spôsobené schopnosťou kvasiniek absorbovať exogénnu DNA umelo aj prirodzene (Mitrikeski 2013). Kvasinky sú schopné prijať exogénnu DNA a stať sa.

Toto predstavuje jednu divíziu, ktorá pozostáva z procesov profázy, metafázy anafázy a telefázy. Zásadným kontrastom je, že meióza invol.

Replikácia DNA deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) a ribonukleovej kyseliny (RNA) je, keď sa bunka delí a každá nová bunka má kópiu ori.