Informácie

9.11: Hlavné enzýmy – biológia

9.11: Hlavné enzýmy – biológia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Výsledky vzdelávania

Identifikujte hlavné enzýmy, ktoré hrajú úlohu pri replikácii DNA

Proces z replikácia DNA je katalyzovaný druhom enzýmu tzv DNA polymeráza (poly znamená veľa, mer čo znamená kúsky a –ase znamená enzým; teda enzým, ktorý pripája veľa kúskov DNA). Počas replikácie sa dva reťazce DNA oddelia vo viacerých bodoch pozdĺž dĺžky chromozómu. Tieto miesta sa nazývajú počiatky replikácie, pretože replikácia začína v týchto bodoch. Všimnite si obrázok 1: dvojitá špirála pôvodnej molekuly DNA sa oddelí (modrá) a vytvoria sa nové vlákna tak, aby zodpovedali oddeleným vláknam. Výsledkom budú dve molekuly DNA, z ktorých každá obsahuje staré a nové vlákno. Preto sa replikácia DNA nazýva semikonzervatívna. Termín polokonzervatívne sa týka skutočnosti, že polovica pôvodnej molekuly (jedno z dvoch vlákien v dvojitej špirále) je „zakonzervovaná“ v novej molekule. Pôvodný prameň sa označuje ako šablónový prameň pretože poskytuje informácie alebo šablónu pre novo syntetizované vlákno.

DNA polymeráza potrebuje „kotvu“ na začatie pridávania nukleotidov: krátka sekvencia DNA alebo RNA, ktorá je komplementárna k templátovému vláknu, bude fungovať tak, aby poskytla voľný 3′ koniec. Táto postupnosť sa nazýva a primer (Obrázok 2).

Ako to robí DNA polymeráza viete v akom poradí pridávať nukleotidy? Špecifické párovanie báz v DNA je kľúčom ku kopírovaniu DNA: ak poznáte sekvenciu jedného vlákna, môžete použiť pravidlá párovania báz na vytvorenie druhého vlákna. Bázy tvoria páry (základové páry) veľmi špecifickým spôsobom.

Cvičné otázky

Pravda/Nepravda: Replikácia DNA vyžaduje enzým.

[practice-area rows=”1″][/practice-area]
[reveal-answer q="527189″]Zobraziť odpoveď[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”527189″]Pravda. Väčšina biologických reakcií sa spolieha na to, že enzým urýchli reakciu. V prípade replikácie DNA je týmto enzýmom DNA polymeráza.

[/hidden-answer]

Aké sú stavebné kamene DNA?

  1. Deoxyribonukleotidy
  2. Mastné kyseliny
  3. Ribonukleotidy
  4. Aminokyseliny

[reveal-answer q="93495″]Zobraziť odpoveď[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”93495″]Odpoveď a. DNA je dvojitá špirála zložená z dvoch dlhých reťazcov deoxyribonukleotidov.

[/hidden-answer]

Pravda/Nepravda: Replikácia DNA vyžaduje energiu.

[practice-area rows=”1″][/practice-area]
[reveal-answer q="62103″]Zobraziť odpoveď[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”62103″]Pravda. Výroba veľkých molekúl z malých podjednotiek (anabolizmus) vyžaduje energiu. Čo dodáva energiu? Samotné stavebné bloky slúžia ako zdroj energie. Keď sa začlenia do polyméru DNA, dve fosfátové skupiny sa odlomia, aby sa uvoľnila energia, z ktorých niektoré sa používajú na výrobu polyméru. Deoxyribonukleotidy sa líšia od nukleotidov ako ATP iba ​​jedným chýbajúcim atómom kyslíka.

[/hidden-answer]

Máme stavebné kamene, zdroj energie a katalyzátor. Čo chýba? Potrebujeme inštrukcie o poradí nukleotidov v novom polyméri. Ktorá molekula poskytuje tieto inštrukcie?

  1. Proteín
  2. DNA
  3. Sacharid
  4. Lipid

[reveal-answer q="494506″]Zobraziť odpoveď[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”494506″]Odpoveď b. Túto DNA označujeme ako templát. Pôvodná informácia uložená v poradí báz bude riadiť syntézu novej DNA prostredníctvom párovania báz.

[/hidden-answer]

DNA polymeráza vyžaduje ešte jednu vec. Nemôže len začať vytvárať DNA kópiu templátového vlákna; potrebuje krátky kúsok DNA alebo RNA s voľnou hydroxylovou skupinou na správnom mieste na pripojenie nukleotidov. (Pamätajte, že syntéza vždy prebieha jedným smerom – na 3′ koniec sa pridávajú nové stavebné bloky.) Táto zložka začína proces tým, že dáva DNA polymeráze niečo, na čo sa môže viazať. Ako by ste mohli nazvať tento krátky kúsok nukleovej kyseliny?

  1. Rozpúšťadlo
  2. Základný náter
  3. Konvertor
  4. Tesniaci prostriedok

[reveal-answer q="529681″]Zobraziť odpoveď[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”529681″]Odpoveď b. Na spustenie tohto procesu sa používa primér, ktorý dáva DNA polymeráze niečo, na čo sa má naviazať nový nukleotid.[/hidden-answer]

Teraz, keď ste pochopili základy replikácia DNA, môžeme pridať trochu zložitosti. Dve vlákna DNA musia byť od seba dočasne oddelené; túto úlohu vykonáva špeciálny enzým, helikáza, ktorý pomáha uvoľniť a oddeliť skrutkovice DNA (obrázok 4). Ďalším problémom je, že DNA polymeráza funguje iba v jednom smere pozdĺž vlákna (5 'až 3 '), ale dvojvláknová DNA má dve vlákna orientované v opačných smeroch. Tento problém je vyriešený syntézou dvoch vlákien trochu inak: jeden nový reťazec rastie nepretržite, druhý po kúskoch. Vedúci prameň neustále rastie a zaostávajúci prameň sa skladá z krátkych kúskov nazývaných Okazakiho fragmenty. Tieto fragmenty sú spojené a spojené dohromady enzýmom nazývaným DNA ligáza. Krátke fragmenty RNA sa používajú ako priméry pre DNA polymerázu.

Cvičné otázky

Ktoré z nich oddeľuje dva komplementárne reťazce DNA?

  1. DNA polymeráza
  2. helikáza
  3. RNA primer
  4. jednovláknový väzbový proteín

[reveal-answer q="197431″]Zobraziť odpoveď[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”197431″]Odpoveď b. Helikáza prerušuje vodíkové väzby, ktoré držia pohromade dve vlákna DNA.

[/hidden-answer]

Ktorá z nich pripája komplementárne bázy k templátovému vláknu?

  1. DNA polymeráza
  2. helikáza
  3. RNA primer
  4. jednovláknový väzbový proteín

[reveal-answer q="381621″]Zobraziť odpoveď[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”381621″]Odpoveď a. DNA polymeráza vytvára nové vlákno DNA.

[/hidden-answer]

Ktoré z nich sa neskôr nahradia bázami DNA?

  1. DNA polymeráza
  2. helikáza
  3. RNA primer
  4. jednovláknový väzbový proteín

[reveal-answer q="2143″]Zobraziť odpovede[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”2143″]Odpoveď c. RNA primer sa nahradí nukleotidmi DNA.[/hidden-answer]

V súhrne: Hlavné enzýmy

Replikácia v eukaryotoch začína na viacerých počiatkoch replikácie. Na začatie syntézy je potrebný primér, ktorý sa potom predĺži DNA polymerázou, keď pridáva nukleotidy jeden po druhom do rastúceho reťazca. Vedúci reťazec sa syntetizuje nepretržite, zatiaľ čo zaostávajúci reťazec sa syntetizuje v krátkych úsekoch nazývaných Okazakiho fragmenty. RNA priméry sú nahradené nukleotidmi DNA; DNA zostáva jedným súvislým reťazcom spojením fragmentov DNA s DNA ligázou.


Typy a funkcie tráviacich enzýmov

Robert Burakoff, MD, MPH, má atestáciu z gastroentrológie. Je podpredsedom pre ambulantné služby na oddelení medicíny na Weill Cornell Medical College v New Yorku.

Tráviace enzýmy sú látky vylučované slinnými žľazami a bunkami lemujúcimi žalúdok, pankreas a tenké črevo na pomoc pri trávení potravy.

Robia to tak, že rozdeľujú veľké, zložité molekuly, ktoré tvoria bielkoviny, sacharidy a tuky (makronutrienty) na menšie, čo umožňuje, aby sa živiny z týchto potravín ľahko vstrebávali do krvného obehu a prenášali sa do celého tela.

Tráviace enzýmy sa uvoľňujú tak v očakávaní jedla, keď jedlo prvýkrát ovoniame a ochutnáme, ako aj počas celého procesu trávenia. Niektoré potraviny majú prirodzene sa vyskytujúce tráviace enzýmy, ktoré prispievajú k rozkladu určitých špecifických živín.

Nedostatky tráviacich enzýmov sú spojené s rôznymi zdravotnými stavmi, najmä s tými, ktoré postihujú pankreas, pretože vylučuje niekoľko kľúčových enzýmov.

Často sa tieto nedostatky dajú vyriešiť zmenami v stravovaní, ako je obmedzenie určitých potravín alebo pridanie tých s prirodzene sa vyskytujúcimi tráviacimi enzýmami, alebo užívaním enzýmových doplnkov na predpis alebo voľne predajných (OTC).


Úvod

Časti rastlín sa od nepamäti používajú na liečbu a zvládanie bolesti a zápalu. Predchádzajúca a prebiehajúca práca s rastlinnými extraktmi identifikovala niektoré sľubné antinociceptívne zlúčeniny, napr. C-glykozylované flavóny (CGF), o ktorých sa ukázalo, že vykazujú analgetickú aktivitu v čiastočne čistých extraktoch 1,2 a purifikovaných formách 3,4. CGF obsahujú jednu alebo viac cukrových skupín viazaných na aglykónový skelet prostredníctvom priamej glykozidickej väzby C – C (doplnkový obrázok 1). V porovnaní s inými triedami flavónov a úzko súvisiacimi O-glykozylované flavonoidy, menej známe o C-glykozylované flavonoidy, pokiaľ ide o ich distribučný vzor v rastlinnej ríši, evolučnú históriu génov špecifických pre dráhu a ich farmakologický mechanizmus antinociceptívnej aktivity a ďalšie biologické funkcie.

Ako jeden z najbohatších zdrojov prírodných flavonoidov poskytujú rastliny z čeľade tráv širokú škálu chemicky rôznorodých CGF vo svojich jedlých a nejedlých častiach. Za posledné polstoročie obrovské fytochemické štúdie na poľnohospodársky dôležitých plodinách, t. C-glykozidy v listoch, šupkách a zrnách, zastúpené vitexínom (Vit), orientínom (Ori), schaftozidom, karlinozidom a maysínom (doplnková tabuľka 1). Bambus, aj keď sa nepestuje na výrobu potravín, je tiež jedným z členov čeľade tráv, ktorá je vo svete široko rozšírená a má rôzne produkty užitočné pre ľudí. Jedlé časti bambusových výhonkov a semien sa bežne konzumujú vo východnej a južnej Ázii ako bohatý zdroj vlákniny a živín, ako aj fenolických metabolitov špecifických pre rastliny12,13. Avšak, ako je to v prípade mnohých potravinárskych plodín, nejedlé listy bambusu bohaté na CGF sú zvyčajne považované za oveľa menej hodnotné a väčšinou opustené. Aj keď starí Číňania verili, že niektoré ľudové lieky alebo bylinkový čaj vyrobený z bambusových listov môže pomôcť odstrániť „toxické teplo“, čo vedie k zmierneniu zápalu a bolesti 14 , nedostatočné pochopenie biosyntetického mechanizmu CGF v bambusoch a nedostatočné definované farmakologické mechanizmy vážne bránili efektívnemu a rozsiahlemu používaniu bambusových listov ako analgetík.

Biosyntéza CGF in planta (obr. 1) bola doteraz čiastočne etablovaná v niekoľkých jednoklíčnolistových a dvojklíčnolistových rastlinách15,16,17,18,19,20,21,22,23. Predpokladá sa, že dráha zahŕňa upstream biosyntézu prekurzorov a niekoľko downstream modifikačných enzýmov vrátane cytochrómu P450 a glykozyltransferáz. Po vytvorení kondenzáciou p-kumaroyl-CoA z fenylalanínovej dráhy a malonyl-CoA z biosyntézy mastných kyselín, naringenín (Nar), spoločný štartér všetkých flavonoidov, je odklonený na hydroxyláciu na flavanónovom skelete dvomi P450 oxygenázami, flavanón 2-hydroxylázami (F2H) a flavanón 3′-hydroxylázy (F3′H). Zatiaľ čo F3′H sú vo všeobecnosti prítomné vo väčšine rastlín, F2H sú vysoko špecifické pre CGF dráhy a len niekoľko prípadov je hlásených v obilninách19,20,24. Následne a C- glykozyltransferáza (CGT), ktorá pôsobí na formu 2-hydroxylovaného medziproduktu s otvoreným kruhom, je kľúčom k C-tvorba glykozidov (obr. 1). CGT patria do rodiny UDP-dependentných glykozyltransferáz (UGT), ktoré využívajú aktivované UDP-cukry ako donor. Napriek tomu priamemu C-glykozylácia na konečnom flavonoidnom skelete boli doložené v r Pueraria lobate 25 , Gentiana triflora 26 a Trollius chinensis 27, ostatné existujúce CGT pochádzajú výlučne z podrodiny UGT708 a glykozylované 2-hydroxylované medziprodukty s UDP-glukózou (UDP-Glc). Vzhľadom na chemickú diverzitu známych CGF nesúcich rôzne cukry a rôzne vzory glykozylácie iné ako substitúcia glukozylom, stále existuje obrovská priepasť medzi známymi CGT a rôznymi štruktúrami CGF. The C-glukozylované medziprodukty sú nestabilné, a preto podliehajú spontánnej dehydratácii v kyslom rozpúšťadle (obr. 1), čo vedie k zmesi Vit (apigenín 8-C-β-d-glukozid)/izovitexín (Isovit, apigenín 6-C-β-d-glukozid) a Ori (luteolín 8-C-β-d-glukozid)/izoorientín (Isoori, luteolín 6-C-β-d-glukozid).

Sivé šípky predstavujú hlavné enzýmy zodpovedné za biosyntézu naringenínu. Modré šípky sú flavanón-2-hydroxylázy (F2H) a flavanón-3'-hydroxylázy (F3'H), ktoré zdobia kostru flavanónu. C-glykozyltransferázy (CGT) sú označené červenými šípkami. Po vytvorení C-glykozylované medziprodukty, dehydratačná reakcia nastáva spontánne v kyslom rozpúšťadle (žlté šípky), pričom vzniká zmes 6-C- alebo 8-C-glukozidy. TAL tyrozín amoniak lyáza, 4CL 4-kumarát CoA ligáza, CHS chalkónsyntáza, CHI chalkón izomeráza, Nar naringenín, Eri eriodictyol, 2OHNar 2-hydroxylnaringenín, 2OHEri, 2-hydroxylerioditextyol, orientitintexoritextyol, orientinteinteín.

Lepšie pochopenie biosyntetickej dráhy CGF spolu s rozborom farmakologických cieľov biologickej aktivity môže umožniť efektívnejšie využitie klasicky vyradených častí bambusu a plodín, ako aj urýchliť udržateľnú produkciu CGF prostredníctvom syntetickej biológie. V tejto štúdii sme využili nedávnu dostupnosť genómov v rodine tráv na úplné odhalenie génov CGT a P450 zapojených do biosyntézy CGF. Prostredníctvom komparatívnych genomických a biochemických prístupov bifunkčné C-arabinozyl/C- glukozyltransferujúce enzýmy, predtým neznáma vetva v CGT z obilnín a bambusov, boli funkčne profilované. Preukázali sme tiež úspech heterológnej expresie proteínov pochádzajúcich z bambusu metabolickým inžinierstvom v an Escherichia coli šasi a ďalej hodnotili účinnosť hlavných CGF z bambusov na myšom modeli in vivo.


Divízia ponúka tým, ktorí neštudujú hlavný odbor v biológii, možnosť získať titul Minor zo všeobecnej biológie. Divízia biologických vied ponúka jednu maloletú osobu bez odbornosti.

Divízia biologických vied ponúka súvislý BS / MS program vedúci k titulu Master of Science v biológii. Súvislý program je navrhnutý špeciálne pre vybraných študentov bakalárskeho štúdia UC San Diego, ktorí sú zapísaní v niektorom z odborov biológie, ktoré ponúka Divízia biologických vied. Kvalifikovaní študenti sa prihlasujú do programu na začiatku posledného ročníka ako vysokoškolský študent. Študenti prijatí do programu, ktorí úspešne splnia všetky požiadavky, môžu získať titul M.S. do troch až piatich štvrťrokov od prijatia BS.


Kinase

Naši redaktori skontrolujú, čo ste odoslali, a rozhodnú, či článok upravia.

kinase, enzým, ktorý pridáva fosfátové skupiny (PO4 3−) na iné molekuly. Existuje veľké množstvo kináz – ľudský genóm obsahuje najmenej 500 génov kódujúcich kinázy. Medzi ciele týchto enzýmov na pridanie fosfátových skupín (fosforyláciu) patria proteíny, lipidy a nukleové kyseliny.

Pre proteínové ciele môžu kinázy fosforylovať aminokyseliny serín, treonín a tyrozín. Reverzibilná fosforylácia proteínov antagonistickým (protichodným) pôsobením kináz a fosfatáz je dôležitou zložkou bunkovej signalizácie, pretože fosforylované a nefosforylované stavy cieľového proteínu môžu mať rôzne úrovne aktivity. Edwin Gerhard Krebs a Edmond H. Fischer dostali v roku 1992 Nobelovu cenu za fyziológiu alebo medicínu za prácu pri vytváraní tejto paradigmy.

Fosforylácia molekúl lipidov kinázami je dôležitá pre riadenie molekulárneho zloženia membrán v bunkách, čo pomáha špecifikovať fyzikálne a chemické vlastnosti rôznych membrán. Inositol, zlúčenina podobná štruktúre uhľohydrátu, je fosforylovaný kinázami, aby sa vytvorila rôznorodá sústava fosfoinozitolových a fosfoinozitidových lipidov. Tieto molekuly potom fungujú ako druhí poslovia na šírenie signálnych informácií v bunke.

Nukleotidy, základné jednotky RNA (ribonukleová kyselina) a DNA (deoxyribonukleová kyselina), obsahujú fosfátovú molekulu pripojenú na nukleozid, zlúčeninu tvorenú ribózovou skupinou a purínovou alebo pyrimidínovou bázou. V polyméroch RNA a DNA je kostra zložená z opakujúcich sa fosforibózových jednotiek. Kinázy pripájajú fosfát na nukleozid, čím vytvárajú nukleotidmonofosfát. Napríklad enzým nazývaný nukleozidová fosforyláza plní túto úlohu, keď bunky prechádzajú na syntézu nukleotidov z recyklovaných purínov namiesto z nových východiskových materiálov. Mutácie v géne kódujúcom nukleozid fosforylázu môžu spôsobiť závažnú formu imunitnej nedostatočnosti.

Metabolizmus cukrov v potrave (glykolýza) zahŕňa niekoľko rôznych krokov fosforylácie rôznymi kinázami. Tieto fosfátové skupiny sa nakoniec používajú na vytvorenie vysokoenergetickej zlúčeniny známej ako ATP (adenozíntrifosfát).

Inhibítory kináz môžu byť dôležitou liečbou ľudských chorôb, pri ktorých je potrebné tlmiť hyperaktívne procesy. Napríklad jedna forma ľudskej leukémie, CML (chronická myeloidná leukémia), je spôsobená nadmernou aktivitou Abelsonovej tyrozínkinázy. Imatinib (Gleevec) je chemikália, ktorá sa viaže na aktívne miesto tejto kinázy, čím blokuje schopnosť enzýmu fosforylovať ciele. Imatinib bol užitočný pri počiatočnej liečbe CML, avšak v mnohých prípadoch enzým kináza mutuje, čím sa liek stáva neúčinným.


Rozpoznanie nukleozómu chromatínovými faktormi a enzýmami

Teraz máme dlho očakávané štruktúry chromatínových faktorov viazaných na nukleozóm.

Štruktúry zdôrazňujú úlohu multivalencie pri rozpoznávaní nukleozómov.

Motív arginínovej kotvy sa objavuje ako paradigma pre väzbu nukleozómov.

Dynamická expresia genómu vyžaduje koordinované viazanie chromatínových faktorov a enzýmov, ktoré vykonávajú procesy podľa genómu. Až donedávna zostali molekulárne mechanizmy, ktoré riadia, ako tieto faktory a enzýmy rozpoznávajú a pôsobia na základnú jednotku chromatínu, jadrovú časticu nukleozómu, záhadou. Malý, ale stále rastúci súbor štruktúr nukleozómu v komplexe s chromatínovými faktormi a enzýmami zdôrazňuje dôležitosť multivalencie pri definovaní väzby a špecifickosti nukleozómov. Mnohé takéto interakcie zahŕňajú motív arginínovej kotvy, ktorý sa zameriava na jedinečnú kyslú náplasť na povrchu nukleozómu. O týchto vznikajúcich paradigmách rozpoznávania chromatínu sa bude diskutovať so zameraním na niekoľko nedávnych štrukturálnych prelomov.


Biosenzory: Vlastnosti, princíp a typy (s diagramom)

Biosenzor je analytické zariadenie obsahujúce imobilizovaný biologický materiál (enzým, protilátka, nukleová kyselina, hormón, organela alebo celá bunka), ktorý môže špecificky interagovať s analytom a produkovať fyzikálne, chemické alebo elektrické signály, ktoré je možné merať. Analyt je zlúčenina (napr. glukóza, močovina, liečivo, pesticíd), ktorej koncentrácia sa musí merať.

Biosenzory v podstate zahŕňajú kvantitatívnu analýzu rôznych látok premenou ich biologických účinkov na merateľné signály. Veľká väčšina biosenzorov má imobilizované enzýmy. Výkon biosenzorov je okrem stability enzýmu väčšinou závislý od špecificity a citlivosti biologickej reakcie.

Všeobecné vlastnosti biosenzorov:

Biosenzor má dva odlišné komponenty (obr. 21.13).

1. Biologická zložka – enzým, bunka atď.

2. Fyzický komponent – ​​prevodník, zosilňovač atď.

Biologická zložka rozpoznáva a interaguje s analytom, aby vytvorila fyzikálnu zmenu (signál), ktorú môže detegovať prevodník. V praxi je biologický materiál vhodne imobilizovaný na prevodníku a takto pripravené biosenzory možno opakovane použiť niekoľkokrát (môže to byť približne 10 000-krát) počas dlhého obdobia (veľa mesiacov).

Princíp biosenzora:

Požadovaný biologický materiál (zvyčajne špecifický enzým) sa imobilizuje konvenčnými metódami (fyzikálne alebo membránové zachytenie, nekovalentná alebo kovalentná väzba). Tento imobilizovaný biologický materiál je v tesnom kontakte s prevodníkom. Analyt sa viaže na biologický materiál za vzniku naviazaného analytu, ktorý zase vytvára elektronickú odozvu, ktorú možno merať.

V niektorých prípadoch sa analyt premieňa na produkt, ktorý môže byť spojený s uvoľňovaním tepla, plynu (kyslíka), elektrónov alebo vodíkových iónov. Prevodník dokáže previesť zmeny spojené s produktom na elektrické signály, ktoré možno zosilniť a zmerať.

Typy biosenzorov:

Existuje niekoľko typov biosenzorov založených na senzorových zariadeniach a type použitých biologických materiálov. Niekoľko vybraných z nich je diskutovaných nižšie.

Elektrochemické biosenzory:

Elektrochemické biosenzory sú jednoduché zariadenia založené na meraní elektrického prúdu, zmien iónov alebo vodivosti vykonávaných bioelektródami.

Amperometrické biosenzory:

Tieto biosenzory sú založené na pohybe elektrónov (t. j. určovaní elektrického prúdu) v dôsledku enzýmovo katalyzovaných redoxných reakcií. Normálne medzi elektródami prechádza konštantné napätie, ktoré je možné určiť. V enzymatickej reakcii, ktorá prebieha, môže substrát alebo produkt preniesť elektrón s povrchom elektródy, ktorý sa má oxidovať alebo redukovať (obr. 21.14).

To má za následok zmenený tok prúdu, ktorý je možné merať. Veľkosť prúdu je úmerná koncentrácii substrátu. Clarkova kyslíková elektróda, ktorá určuje redukciu O2, je najjednoduchšia forma amperometrického biosenzora. Dobrým príkladom je stanovenie glukózy glukózooxidázou.

V prvej generácii amperometrických biosenzorov (opísaných vyššie) dochádza k priamemu prenosu elektrónov uvoľnených na elektródu, čo môže predstavovať určité praktické ťažkosti. Bola vyvinutá druhá generácia amperometrických biosenzorov, kde mediátor (napr. ferocény) zachytáva elektróny a potom ich prenáša na elektródu. Tieto biosenzory sa však ešte nestanú populárnymi.

Biosenzor krvnej glukózy:

Je to dobrý príklad amperometrických biosenzorov, ktoré sú široko používané na celom svete diabetickými pacientmi. Biosenzor glukózy v krvi vyzerá ako hodinkové pero a má jednorazovú elektródu (pozostávajúcu z Ag/AgCI referenčnej elektródy a uhlíkovej pracovnej elektródy) s glukózooxidázou a derivátom ferocénu (ako mediátor). Elektródy sú pokryté hydrofilnou sieťovinou pre rovnomerné šírenie kvapky krvi. Jednorazové testovacie prúžky zatavené v hliníkovej fólii majú životnosť približne šesť mesiacov.

Bol vyvinutý amperometrický biosenzor na hodnotenie čerstvosti rýb. Akumulácia ionozínu a hypoxantínu vo vzťahu k ostatným nukleotidom indikuje čerstvosť rýb – ako dlho uhynuté a skladované. Na tento účel bol vyvinutý biosenzor využívajúci imobilizovanú nukleozidfosforylázu a xantínoxidázu na elektróde.

Potenciometrické biosenzory:

V týchto biosenzoroch sa zmeny iónových koncentrácií určujú pomocou iónovo selektívnych elektród (obr. 21.15). pH elektróda je najbežnejšie používaná iónovo selektívna elektróda, pretože mnohé enzymatické reakcie zahŕňajú uvoľňovanie alebo absorpciu vodíkových iónov. Ďalšie dôležité elektródy sú selektívne pre amoniak a CO2 selektívne elektródy.

Môže sa merať potenciálny rozdiel získaný medzi potenciometrickou elektródou a referenčnou elektródou. Je úmerná koncentrácii substrátu. Hlavným obmedzením potenciometrických biosenzorov je citlivosť enzýmov na koncentrácie iónov, ako sú H+ a NH+ 4.

Iónovo selektívne tranzistory s efektom poľa (ISFET) sú lacné zariadenia, ktoré možno použiť na miniaturizáciu potenciometrických biosenzorov. Dobrým príkladom je biosenzor ISFET používaný na monitorovanie intra-myokardiálneho pH počas operácie na otvorenom srdci.

Vykonávajte metrické biosenzory:

V biologických systémoch dochádza k niekoľkým reakciám, ktoré spôsobujú zmeny v iónových druhoch. Tieto iónové druhy menia elektrickú vodivosť, ktorú možno merať. Dobrým príkladom biosenzora s meraním vodivosti je biosenzor močoviny využívajúci imobilizovanú ureázu. Ureáza katalyzuje nasledujúcu reakciu.

Vyššie uvedená reakcia je spojená s drastickou zmenou koncentrácie iónov, ktorá sa môže použiť na monitorovanie koncentrácie močoviny. V skutočnosti sa biosenzory močoviny veľmi úspešne používajú počas dialýzy a operácií obličiek.

Termometrické biosenzory:

S produkciou tepla je spojených niekoľko biologických reakcií, ktoré tvoria základ termometrických biosenzorov. Bežnejšie sa označujú ako tepelné biosenzory alebo kalorimetrické biosenzory. Schematické znázornenie tepelného biosenzora je znázornené na obr. 21.16. Pozostáva z tepelne izolovaného boxu vybaveného výmenníkom tepla (hliníkový valec).

Reakcia prebieha v malom reaktore s enzýmovou náplňou. Keď substrát vstupuje do lôžka, premieňa sa na produkt a vytvára sa teplo. Rozdiel v teplote medzi substrátom a produktom je meraný termistormi. Tepelné biosenzory dokážu zaznamenať aj malú zmenu teploty.

Na stanovenie sérového cholesterolu sa používajú termometrické biosenzory. Keď sa cholesterol oxiduje enzýmom cholesteroloxidázou, vzniká teplo, ktoré je možné merať. Podobne môžu byť týmito biosenzormi uskutočnené odhady glukózy (enzým-glukóza oxidáza), močoviny (enzým-ureáza), kyseliny močovej (enzým-urikáza) a penicilínu G (enzým-P laktamáza). Vo všeobecnosti je však ich užitočnosť obmedzená. Termometrické biosenzory môžu byť použité ako súčasť enzýmovej imunoanalýzy (ELISA) a nová technika sa označuje ako termometrická ELISA (TELISA).

Optické biosenzory:

Optické biosenzory sú zariadenia, ktoré využívajú princíp optických meraní (absorbancia, fluorescencia, chemiluminiscencia atď.). Využívajú vláknovú optiku a optoelektronické prevodníky. Bežne sa používa slovo optroda, predstavujúce kondenzáciu slov optická a elektróda. Optické biosenzory primárne zahŕňajú enzýmy a protilátky ako transdukčné prvky.

Optické biosenzory umožňujú bezpečné neelektrické diaľkové snímanie materiálov. Ďalšou výhodou je, že tieto biosenzory zvyčajne nevyžadujú referenčné senzory, pretože porovnávací signál môže byť generovaný použitím rovnakého zdroja svetla ako odberový senzor. Niektoré z dôležitých optických biosenzorov sú stručne opísané nižšie.

Laktátový biosenzor z optických vlákien:

Obr. 21.17 predstavuje biosenzor laktátu z optických vlákien. Jeho práca je založená na meraní zmien v molekulovom O2 koncentrácii stanovením zhášacieho účinku O2 na fluorescenčnom farbive. Nasledujúca reakcia je katalyzovaná enzýmom laktátmonooxygenáza.

Množstvo fluorescencie generovanej zafarbeným filmom závisí od O2. Je to preto, lebo O2 má zhášací (redukčný) účinok na fluorescenciu. Keď sa koncentrácia laktátu v reakčnej zmesi zvyšuje, O2 V dôsledku toho dochádza k úmernému zníženiu tlmiaceho účinku. Výsledkom je zvýšenie merateľného fluorescenčného výkonu.

Optické biosenzory pre krvnú glukózu:

Stanovenie hladiny glukózy v krvi je veľmi dôležité pre sledovanie diabetu. Na tento účel sa používa jednoduchá technika zahŕňajúca papierové prúžky impregnované činidlami. Prúžky obsahujú glukózooxidázu, chrenovú peroxidázu a chromogén (napr. toluidín). Vyskytujú sa nasledujúce reakcie.

Intenzitu farby farbiva je možné merať pomocou prenosného merača odrazivosti. Výroba glukózových pásikov je celosvetovo veľmi veľké odvetvie.

Kolorimetrické testovacie prúžky z celulózy potiahnuté príslušnými enzýmami a činidlami sa používajú na odhad niekoľkých parametrov krvi a moču.

Luminiscenčné biosenzory na detekciu močových infekcií:

Mikroorganizmy v moči, ktoré spôsobujú infekcie močových ciest, môžu byť detekované použitím luminiscenčných biosenzorov. Na tento účel sa používa imobilizovaný (alebo dokonca voľný) enzým luciferáza. Mikroorganizmy pri lýze uvoľňujú ATP, ktorý je možné detegovať nasledujúcou reakciou. Množstvo svetelného výkonu je možné merať elektronickými zariadeniami.

Iné optické biosenzory:

Zariadenia na snímanie optických vlákien sa používajú na meranie pH, pCO2 a pO2 v kritickej starostlivosti a chirurgickom monitorovaní.

Piezoelektrické biosenzory:

Piezoelektrické biosenzory sú založené na princípe akustiky (zvukové vibrácie), preto sa nazývajú aj akustické biosenzory. Piezoelektrické kryštály tvoria základ týchto biosenzorov. Kryštály s kladným a záporným nábojom vibrujú s charakteristickými frekvenciami. Adsorpcia určitých molekúl na povrchu kryštálu mení rezonančné frekvencie, ktoré je možné merať elektronickými zariadeniami. Na tieto kryštály sa môžu naviazať aj enzýmy s plynnými substrátmi alebo inhibítormi.

Bol vyvinutý piezoelektrický biosenzor pre organofosforový insekticíd, ktorý obsahuje acetylcholínesterázu. Podobne bol vyvinutý biosenzor pre formaldehyd začlenením formaldehyddehydrogenázy. Biosenzor pre kokaín v plynnej fáze bol vytvorený pripojením kokaínových protilátok na povrch piezoelektrického kryštálu.

Obmedzenia piezoelektrických biosenzorov:

Je veľmi ťažké použiť tieto biosenzory na stanovenie látok v roztoku. Vo viskóznych kvapalinách totiž môžu kryštály úplne prestať oscilovať.

Celobunkové biosenzory:

Celobunkové biosenzory sú obzvlášť užitočné pre viackrokové reakcie alebo reakcie vyžadujúce kofaktor. Tieto biosenzory môžu využívať živé alebo mŕtve mikrobiálne bunky. Vybraný zoznam niektorých organizmov spolu s analytmi a typmi použitých biosenzorov je uvedený v tabuľke 21.8

Výhody mikrobiálnych bunkových biosenzorov:

Mikrobiálne bunky sú lacnejšie s dlhším polčasom rozpadu. Okrem toho sú menej citlivé na zmeny pH a teploty v porovnaní s izolovanými enzýmami.

Obmedzenia mikrobiálnych bunkových biosenzorov:

Celé bunky vo všeobecnosti vyžadujú dlhší čas na katalýzu. Okrem toho špecifickosť a citlivosť biosenzorov celých buniek môže byť nižšia v porovnaní so špecifickosťou a citlivosťou enzýmov.

Imuno-biosenzory:

Imuno-biosenzory alebo imunochemické bio­senzory pracujú na princípe imunologickej špecifickosti spojenej s meraním (väčšinou) na báze amperometrických alebo potenciometrických bio­senzorov. Existuje niekoľko možných konfigurácií pre imunobiosenzory a niektoré z nich sú znázornené na obr. 21.18 a stručne opísané nižšie.

1. Imobilizovaná protilátka, na ktorú sa antigén môže priamo viazať (obr. 21.18A).

2. Imobilizovaný antigén, ktorý sa viaže na protilátku, ktorá sa zase môže viazať na voľný druhý antigén (obr. 21.18B).

3. Protilátka naviazaná na imobilizovaný antigén, ktorý sa môže čiastočne uvoľniť kompetíciou s voľným antigénom (obr. 21.18C).

4. Imobilizovaná protilátka neviaže antigén a enzým značený antigén v kompetícii (obr. 21.18D).

Pre biosenzory 1-3 možno použiť piezoelektrické zariadenia. Najbežnejšie používané sú imunobiosenzory využívajúce enzýmy (4 vyššie, obr. 21.18D). Tieto biosenzory využívajú termometrické alebo amperometrické zariadenia. Aktivita enzýmov naviazaných na imunobiosenzory závisí od relatívnych koncentrácií značených a neznačených antigénov. Koncentrácia neznačeného antigénu môže byť stanovená testovaním enzýmovej aktivity.


Mechanizmy regulácie enzýmov: Molekulárne metódy regulácie enzýmov a enzýmovej aktivity

Ø Všetky živé organizmy na svete by mali mať DVE základné vlastnosti
Ø Sú to:
(1). Musí byť schopný sa replikovať
(2). Musí byť schopný katalyzovať chemické reakcie efektívne a selektívne
Ø Enzýmy sú molekuly, ktoré umožňujú každej živej bytosti vykonávať tieto dve základné činnosti
Ø Enzýmy sú známejšie ako biologické katalyzátory

Ø Takmer všetky enzýmy sú vysoko špecializované bielkoviny
Ø Ribozýmy: Molekuly RNA s katalytickými vlastnosťami
Ø Abzymes: protilátky s katalytickými vlastnosťami

Čo je regulácia enzýmov?

Ø Definícia regulácie enzýmov: „Proces, ktorým bunky môžu zapínať, vypínať alebo modulovať aktivity rôznych metabolických dráh reguláciou aktivity enzýmu“

Ø Enzýmy majú mimoriadnu katalytickú silu

Ø Môžu zvýšiť rýchlosť chemickej reakcie tisíckrát

Ø Za optimálnych podmienok sú enzýmy schopné premeniť milióny molekúl substrátu na produkty v krátkom čase

Ø Je veľmi dôležité kontrolovať aktivitu enzýmu, aby sa regulovali metabolické aktivity v bunke

Ø Enzýmová regulácia umožní meniacim sa potrebám bunky uspokojiť jej požiadavky na energiu a zdroje

Ø Ak je produktu k dispozícii nadbytok, regulácia enzýmov by mohla presmerovať zdroje na iné potrebné reakcie

Ø Ak je po produkte dopyt, mohol by aktivovať cesty na produkciu väčšieho množstva potrebnej biomolekuly

Čo sú regulačné enzýmy?

Ø Pri bunkových metabolických aktivitách mnohé enzýmy spolupracujú v sekvencii, aby uskutočnili daný metabolický proces

Ø Príklad, dráha glykolýzy zahŕňa desať postupných krokov, z ktorých každý je katalyzovaný špecifickými enzýmami

Ø Ak je v takomto enzymatickom procese zahrnutých viac ako jeden krok, reakčný produkt jednej enzymatickej reakcie pôsobí ako substrát pre ďalší enzým

Ø Definícia regulačného enzýmu: „Vo viacstupňovom enzymatickom procese bude existovať jeden enzým, ktorý bude zodpovedný za celkovú rýchlosť tohto procesu“

Ø Tento enzým obmedzujúci kritickú rýchlosť sa nazýva regulačný enzým

Ø Regulačný enzým vykazuje zvýšené alebo znížené katalytické aktivity v reakcii na iné molekuly (signály) v bunkách

Ktorý enzým je regulačným enzýmom vo viacstupňovej metabolickej dráhe?

Ø Prvý enzým multienzýmovej metabolickej sekvencie pôsobí ako regulačný enzým

Ø Prvá reakcia je vynikajúcim miestom na reguláciu alebo kontrolu metabolickej dráhy

Ø Je to preto, že katalýza aj prvých niekoľkých reakcií spotrebováva veľa metabolickej energie, ktorá môže byť presmerovaná na iné dôležitejšie procesy

Mechanizmy regulácie enzýmov:

Ø PÄŤ v bunkách sa vyskytujú rôzne typy enzymatického regulačného mechanizmu

Ø Aktivity regulačného enzýmu sú modulované rôznymi spôsobmi

Ø Rôzne typy metód regulácie enzýmov sú:

(1). Allosterické enzýmy (alosterická regulácia enzýmov)

Inhibícia spätnej väzby

(2). Reverzibilná kovalentná modifikácia enzýmov

(3). Proteolytická aktivácia enzýmu

(4). Regulácia spätnej väzby

(5). Regulácia pomocou izoenzýmov (izoenzýmov)

(1). Alosterické enzýmy

Čo je alosterická regulácia enzýmu?

Ø Allosterické enzýmy sú triedou regulačných enzýmov

Ø Definícia alosterickej regulácie: Typ enzýmovej regulácie reverzibilnou nekovalentnou väzbou regulačných molekúl na enzým

Ø Regulačné molekuly sa nazývajú alosterické modulátory alebo alosterické efektory

Ø Alosterické enzýmy majú ďalšie konformácie indukované väzbou modulátorov

Ø Konformačné zmeny vyvolané alosterickými modulátormi môžu produkovať aktívnejšie alebo menej aktívne formy enzýmu

Ø Alosterické modulátory môžu byť inhibičné (+) alebo stimulačné (-)

Ø Dva typy alosterických enzýmov na základe povahy modulátora:

1. Homotropné alosterické enzýmy

2. Heterotropné alosterické enzýmy

Ø Vo väčšine prípadov samotný substrát pôsobí ako modulátor

Ø Alosterické enzýmy, ktorých substrát a modulátory sú rovnaké, sa nazývajú homotropné alosterické enzýmy

Ø Väzba modulátora spôsobuje konformačné zmeny v enzýme

Ø Konformačné zmeny ovplyvňujú následnú enzymatickú aktivitu

Ø Ak je modulátorom akákoľvek iná molekula ako substrát, enzým sa nazýva heterotropný alosterický enzým

Ø Alosterické modulátory sa nepovažujú za kompetitívne alebo nekompetitívne inhibítory

Ø Allosterické enzýmy majú jedno alebo viac regulačných alebo alosterických miest

Ø Alosterické miesta pôsobia ako väzbové miesto modulátora

Ø Modulátor a väzbové miesto modulátora na enzýme sú veľmi špecifické, podobne ako substrát špecifický pre jeho aktívne miesto

Ø Allosterické enzýmy sú zvyčajne väčšie a komplexnejšie ako nealosterické enzýmy

Ø Alosterické enzýmy majú mnoho podjednotiek

Ø Aspartát transkarbamoyláza (alosterický enzým), ktorý katalyzuje skorú reakciu v biosyntéze pyrimidínových nukleotidov, má 12 polypeptidových reťazcov organizovaných do katalytických a regulačných podjednotiek. Enzýmy s niekoľkými modulátormi majú rôzne a špecifické väzbové miesta pre každý z nich

Ø Vo väčšine alosterických enzýmov sa strana viažuca substrát a väzbové miesta modulátora nachádzajú na rôznych podjednotkách

Ø Miesto viazania substrátu je tzv katalytická podjednotka alebo C podjednotka

Ø Podjednotka viazania modulátora sa nazýva regulačná podjednotka alebo R podjednotka

Ø Väzba pozitívneho alebo stimulačného modulátora (M) na jeho špecifické miesto na regulačnej podjednotke sa prenáša do katalytickej podjednotky prostredníctvom konformačných zmien

Ø Táto zmena spôsobí aktiváciu katalytickej podjednotky

Ø Aktivácia umožňuje naviazanie substrátu (S) s vyššou afinitou

Ø Akonáhle je modulátor disociovaný z regulačnej podjednotky, enzým sa vráti do svojej neaktívnej alebo menej aktívnej formy

Ø Alosterické enzýmy vykazujú variácie v kinetických parametroch enzýmov

Ø Allosterické enzýmy sa neriadia kinetikou Michaelis-Menten

Ø Alosterické enzýmy nevykazujú zvyčajnú hyperparabolickú krivku, keď je počiatočná rýchlosť Vo vynesená proti koncentrácii substrátu [S]

Ø Ukazujú sigmoidnú krivku, keď je rýchlosť vynesená proti koncentrácii substrátu

Ø Lineweaver-Burk graf tiež ukazuje rozdiel od bežných enzýmov

Ø Lineweaver-Burk graf alosterického enzýmu bude mať konkávny tvar smerom nahor

Ø Inhibícia spätnej väzby je typ alosterickej regulácie

Čo je inhibícia spätnej väzby?

Ø Inhibícia spätnej väzby a regulácia spätnou väzbou sú rôzne pojmy

Ø Inhibícia spätnej väzby je špecifický typ mechanizmu regulácie alosterickej enzymatickej aktivity v bunkách

Ø Definícia inhibície spätnej väzby: v niektorých multienzýmových dráhach je regulačný enzým špecificky inhibovaný konečným produktom dráhy vždy, keď koncentrácia konečného produktu prekročí požiadavky bunky

Ø Keď sa reakcia regulačných enzýmov spomalí, všetky nasledujúce enzýmy fungujú zníženou rýchlosťou, pretože ich substráty sú tiež vyčerpané

Ø Rýchlosť výroby konečného produktu pathway’s je tak uvedená do rovnováhy s potrebami bunky

Ø Tento typ regulácie konečným produktom inhibujúcim prvý enzým multienzymatickej dráhy sa nazýva inhibícia spätnou väzbou

Príklad inhibície spätnej väzby:

Ø Najcitovanejším príkladom inhibície alosterickej spätnej väzby je biosyntéza L-izoleucínu z L-treonínu v baktériách

Ø V baktériách prebieha premena L-treonínu na L-izoleucín v piatich krokoch

Ø Každý krok je katalyzovaný špecifickým enzýmom

Ø Prvým enzýmom v tomto systéme je Threonie dehydratáza

Ø Treoníndehydratáza je inhibovaná izoleucínom, produktom poslednej reakcie (koncový produkt)

Ø Toto je príklad heterotropnej alosterickej inhibície

Ø Izoleucín je ako inhibítor celkom špecifický

Ø Žiadny iný medziprodukt v tejto sekvencii nemôže inhibovať treonín dehydratázu

Ø Tiež žiadny iný enzým v sekvencii nie je inhibovaný izoleucínom

Ø Izoleucín sa neviaže na aktívne miesto enzýmu

Ø Viaže sa na iné špecifické miesto na molekule enzýmu, regulačné miesto

Ø Väzba je nekovalentná a ľahko reverzibilná

Ø Keď sa koncentrácia izoleucínu zníži, izoleucín sa naviaže na regulačné miesto treoníndehydratázy, čím sa enzým opäť stane aktívnym

Ø Aktivita treoníndehydratázy teda rýchlo a reverzibilne reaguje na kolísanie bunkovej koncentrácie izoleucínu

(2). Reverzná kovalentná modifikácia:

Ako reverzibilné kovalentné modifikácie regulujú enzymatickú aktivitu?

Ø Katalytická aktivita je modulovaná reverzibilnou kovalentnou modifikáciou enzýmu

Ø Je známych viac ako 500 rôznych molekúl, ktoré modifikujú enzýmy touto metódou

Ø Najbežnejšie modifikujúce skupiny zahŕňajú fosforyl, acetyl, adenylyl, uridylyl, metyl, amid, karboxyl, prenyl, hydroxyl, sulfát a adenozíndifosfát ribozylové skupiny

Ø Bude existovať samostatný enzým na pridávanie a odstraňovanie modifikujúcich skupín do enzýmov

Ø Bežné reverzibilné kovalentné modifikácie enzýmu:

@. Fosforylácia: najbežnejší typ, pridanie fosfátovej skupiny k Tyr, Ser, Thr a His zvyšku proteínu

@. adenylácia: pridanie adenínu k Tyr zvyšku proteínu

@. ADP-ribozylácia: pridanie ADP ribózy k Arg, Gln, Cys a diftamidu proteínu (diptamid je modifikovaný histidínový zvyšok)

@. Metylácia: pridanie metylovej skupiny ku Glu zvyšku proteínu

Ø ADP ribóza odvodená z nikotínamid adenín dinukleotidu (NAD) sa pridáva k bakteriálnemu enzýmu dinitrogenáza reduktáze, čo vedie k regulácii dôležitého procesu biologickej fixácie dusíka

Ø Difterický toxín a cholerový toxín sú enzýmy, ktoré katalyzujú ADP ribozyláciu (a inaktiváciu) kľúčových bunkových enzýmov alebo proteínov

Ø Difterický toxín inhibuje elongačný faktor 2 (EF2) biosyntézy bielkovín

Ø Toxín ​​cholery pôsobí na G proteín, ktorý je súčasťou signálnej dráhy, čo vedie k niekoľkým fyziologickým reakciám vrátane masívnej straty telesných tekutín a niekedy aj smrti

Ø Fosforylácia je najbežnejším typom regulačnej kovalentnej modifikácie

Ø Pridanie fosforylových skupín k špecifickým aminokyselinovým zvyškom proteínu sa nazýva fosforylácia

Ø Fosforylačná reakcia je katalyzovaná enzýmom proteínkináza.

Ø ATP alebo GTP zvyčajne pôsobí ako donor fosfátovej skupiny

Ø Využíva sa aj energia získaná štiepením donoru fosfátovej skupiny

Ø Jedna tretina až polovica všetkých proteínov v eukaryotických bunkách je fosforylovaná

Ø Niektoré proteíny majú iba jeden fosforylovaný zvyšok, iné majú niekoľko miest na fosforyláciu

Ø Fosforylové skupiny sa zvyčajne pridávajú k zvyškom Ser, Thr alebo Thy enzýmu

Ø Fosforylácia zavádza objemnú nabitú skupinu do oblasti, ktorá bola len mierne polárna

Ø Odstránenie fosforylovej skupiny z proteínu sa nazýva defosforylácia

Ø Defosforylačná reakcia je katalyzovaná proteínfosfatázou

(3). Proteolytická aktivácia enzýmov:

Ako pôsobí proteolytické štiepenie enzýmu ako regulačný mechanizmus?

Ø Enzýmy regulované metódou proteolytického štiepenia vznikajú najskôr ako neaktívne formy

Ø Neaktívna forma enzýmu sa nazýva zymogén alebo proenzým

Ø Neaktívna povaha zymogénov je spôsobená tým, že aktívne miesto bude maskované alebo prekryté časťou polypeptidového reťazca

Ø Zymogény sa neskôr premieňajú na aktívne enzýmy

Ø Konverzia sa uskutočňuje odstránením špecifických častí enzýmu proteolytickým štiepením

Ø Špecifické štiepenie spôsobuje konformačné zmeny, ktoré odhaľujú aktívne miesto enzýmu

Ø Tento typ aktivácie je nevratný (akonáhle je enzým aktivovaný, nemožno ho deaktivovať)

Ø Proteolytické enzýmy (proteázy) žalúdka a pankreasu sú regulované proteolytickým štiepnym mechanizmom

Pepsinogén → Pepsín (autoaktivácia, enzým sa sám aktivuje)

Ø Význam produkcie enzýmov ako zymogénu:

@. Pomáha predchádzať autokatalytickému poškodeniu bunkových komponentov

@. Pomáha pri mobilizácii enzýmu v bunke

@. V prípade potreby je možné previesť na aktívne formuláre

@. Môže byť dlho skladovaný ako zymogén

@. Polčas rozpadu zymogénov je zvyčajne dlhší ako jeho aktívnych enzýmov

(4). Regulácia spätnej väzby

Čo je regulácia spätnej väzby?

Ø Regulácia spätnou väzbou sa líši od inhibície spätnou väzbou

Ø Typ regulácie enzymatickej aktivity

Ø Tu konečný produkt enzymatickej dráhy priamo inhibuje syntézu príslušného enzýmu tým, že interferuje s génom tohto enzýmu

Ø Enzým nie je priamo inhibovaný konečným produktom

Ø Konečný produkt znižuje koncentráciu enzýmu inhibíciou syntézy nových molekúl enzýmu

Ø Najlepším príkladom je zníženie enzýmu HMG CoA reduktázy cholesterolom z potravy

(5). izoenzým (izozým)


Ako izoenzýmy regulujú enzymatickú aktivitu?

Ø Nie je to priama metóda regulácie enzýmov

Ø Izozýmy sú enzýmy, ktoré vykonávajú podobnú katalytickú funkciu, ale majú odlišné sekvencie aminokyselín

Ø Majú rôzne kinetické parametre

Ø Km hodnoty, Vmax a Vo izozýmov sa líši

Ø Km označuje afinitu enzýmu k jeho substrátu

Ø Izozýmy umožňujú bunke katalyzovať rovnakú reakciu v rôznych podmienkach buniek

Ø Cicavčí laktátdehydrogenáza (LDH) je klasickým príkladom izoenzýmu

Ø Cicavčí LDH je tetramér dvoch typov podjednotiek (podjednotka A a podjednotka B)

Ø LDH existuje v piatich rôznych formách na základe tetramérnej asociácie podjednotiek A a B

Ø Sú to A4, A3B1, A2B2, A1B3 a B4

Ø Kinetické parametre všetkých týchto izoforiem sa líšia

Ø Rôzne tkanivá exprimujú rôzne izoenzýmy zodpovedajúce ich metabolickým potrebám

Ø Reguláciou relatívneho množstva podjednotiek A a B môžu bunky rôznych tkanív regulovať enzymatickú aktivitu v špecifických tkanivách

Ø Príklad: v pečeni prevláda typ LDH A4, kde rovnako ako v srdci prevláda typ B4. V mozgu je typ A1B3 najbežnejší

Štúdium offline (bez internetu)

Teraz môžeš Stiahnuť ▼ a PDF tohto príspevku Úplne zadarmo!

Kliknite prosím na Odkaz na stiahnutie / Tlačidlo nižšie a uložte príspevok ako jeden súbor PDF. Súbor PDF sa otvorí v novom okne v samotnom prehliadači. Kliknite pravým tlačidlom myši na súbor PDF a vyberte ‘Uložiť ako‘ možnosť uložiť súbor do počítača.

Prosím Zdieľajte súbor PDF so svojimi priateľmi, príbuznými, študentmi a kolegami…


Výsledky

V prvej polovici časti Výsledky sa zaoberáme prvou otázkou, či bunková smrť sprostredkovaná McrBC prostredníctvom štiepenia metylovaných chromozómov nastáva po vstupe / indukcii epigenetickej metyltransferázového génu a spôsobuje prerušenie vytvorenia / aktivácie tohto génu.

McrBC-sprostredkovaná inhibícia vytvorenia génu DNA metyltransferázy

Najprv sme sa pýtali na biologické dôsledky McrBC, to znamená, či sa pôsobením McrBC preruší vytvorenie preneseného génu metyltransferázy alebo nie. Ako metyltransferázu sme zvolili PvuII metyltransferázu (M.PvuII) PvuII RM systému. Rozpoznáva CAGCTG a generuje CAG m4 CTG [37, 41], cieľovú sekvenciu McrBC [33].

Niekoľko správ naznačilo, že fágy alebo plazmidy nesúce gén DNA metyltransferázy sa nemohli množiť v mcrBC + kmeň z E. coli [42]. Či je blokovanie propagácie spôsobené opakovanou metyláciou zavedenej DNA a následným štiepením [42] alebo v dôsledku metylácie a štiepenia hostiteľského genómu, ako sme predpokladali v tejto práci, nebolo riešené.

V kvantitatívnom transformačnom teste sme zaviedli plazmid nesúci gén PvuII metyltransferázy (M. PvuII, CAG m4 CTG), ale bez rozpoznávacích miest PvuII (pEF43 v tabuľke 1) (obrázok 2a). Účinnosť transformácie klesla o štyri rády v an mcrBCzávislým spôsobom (obrázok 2b). Pokles nenastal v prípade génov pre tri ďalšie cytozín metyltransferázy, M.EcoRII (Cm5 CWGG), M.SsoII (Cm5 CNGG) a M.BamHI (GGAT m4 CC), čo je v súlade so sekvenčnou špecifickosťou McrBC [33]. Zistili sme, že plazmid nesúci gén pre metyltransferázu PvuII a dve rozpoznávacie miesta PvuII bol tiež inhibovaný pri svojom vytvorení v rovnakom ráde (dátum nie je uvedený). Naše výsledky naznačujú, že metylované miesta na prenesenej DNA neboli potrebné na McrBC-dependentnú inhibíciu jej vytvorenia a propagácie. Tieto výsledky demonštrujú, že McrBC môže prerušiť vytvorenie preneseného prvku s génom pre metyltransferázu a ďalej naznačujú, že je to prostredníctvom McrBC-sprostredkovaného štiepenia metylovanej chromozomálnej DNA, na rozdiel od prenesenej DNA.

McrBC-sprostredkované blokovanie vytvorenia epigenetického metylačného systému genómu. (a) Kvantitatívna transformácia. Na transformáciu sa použili rôzne množstvá pUC19 (2 pg, 20 pg, 200 pg, 2 ng, 20 ng a 200 ng). E. coli DH5a elektroporáciou. Experimenty sa uskutočňovali trojmo. (b) Transformácia plazmidov nesúcich gén metyltransferázy PvuII. Plazmidy (100 ng) nesúce jeden z niekoľkých modifikovaných génov metyltransferázy sa použili na transformáciu E. coli ER1562 (mcrB1) a ER1563 (mcrBC +). Relatívna účinnosť transformácie sa vypočítala ako pomer účinnosti transformácie testovaného plazmidu k účinnosti prázdneho vektora. M.PvuII (ColE1) označuje pEF43, zatiaľ čo M.PvuII (pPvul) označuje pEF65 (tabuľka 1). Prázdny vektor pre druhý je pEF67, zatiaľ čo pre prvý je pEF33. Vektor pre zostávajúce plazmidy je pBR322. Sú znázornené merania z dvoch samostatných experimentov uskutočnených v duplikáte. Všetky (20/20) vzácnych transformantov z mcrBC + pomocou pEF43 sa zistilo, že stratili aktivitu McrBC.

Komplex PvuII RM génu bol nájdený na pPvu1, nízkokópiovom plazmide z Proteus vulgaris [37], ktorý sa môže replikovať aj v E. coli [43]. Proteus vulgaris a E. coli patria do čeľade Enterobacteriaceae a tiež zdieľajú ekologickú niku, črevo ľudí a príbuzných zvierat. Preto sú tieto experimenty určené na reprodukovanie udalostí, ktoré sa pravdepodobne uskutočnia v prirodzenom prostredí, hoci zahŕňali použitie plazmidov z viacerých kópií (odvodených od ColE1). Transformácia plazmidu derivátu pPvu1 nesúceho M.PvuII a gén rezistencie na liečivo ako selektívny marker a bez miest PvuII (pEF65 v tabuľke 1) bola blokovaná pomocou McrBC rovnako silne ako vyššie uvedený plazmid s viacerými kópiami (obrázok 2b). To naznačuje, že silná inhibícia je biologicky relevantná.

McrBC-sprostredkované štiepenie chromozómov po fágom sprostredkovanom prenose génu DNA metyltransferázy

Vyššie uvedená inhibícia vytvorenia génu metyltransferázy je pravdepodobne spôsobená letálnym štiepením chromozómov, ktoré sa metylujú. Ďalej sme sa pýtali, či McrBC skutočne štiepi hostiteľské chromozómy, aby sa prerušila propagácia preneseného génu metylácie epigenetického genómu. Aby sme preskúmali tento problém, zaviedli sme gén M.PvuII do E. coli fágovým vektorom A.

Najprv sme pripravili fágový kmeň LIK891 s 15 miestami PvuII (Materiály a metódy) v hostiteľovi nesúcom metyltransferázu PvuII (Materiály a metódy). Jeho modifikačný stav bol potvrdený jeho odolnosťou voči obmedzeniu PvuII in vitro a in vivo nasledovne. Keď fágová genómová DNA pripravená z purifikovaného prípravku X reagovala s PvuII, nebola pozorovaná žiadna zmena v jej vzore gélovej elektroforézy za podmienok, keď sa nemodifikovaná fágová genómová DNA úplne rozštiepila. Fágový prípravok modifikovaný PvuII nevykazoval detegovateľné zníženie účinnosti tvorby plakov u hostiteľa nesúceho PvuII RM systém. V an E. coli mcrBC +, PvuII-modifikovaný A fágový prípravok vykazoval iba 10-násobné zníženie účinnosti tvorby plakov (obrázok 3a). V súlade s predchádzajúcimi správami [36, 37] toto pozorovanie naznačuje, že McrBC nemôže účinne obmedziť metylovaný fágový genóm.

McrBC-sprostredkovaná inhibícia rastu fágov a štiepenie chromozómov. (a) Titer fágu λ na ER1563 (mcrBC + ) delené jeho titrom na ER1562 (mcrB1) je vynesená pre dva nezávislé experimenty. (I) Kmeň λ s 15 miestami PvuII (LIK891 pozri Materiály a metódy) (II) rovnaký kmeň λ, ale modifikovaný metyltransferázou PvuII (III) rovnaký kmeň λ s inzerciou génu metyltransferázy PvuII (LEF1). (b) Degradácia chromozómov v ER1562 (mcrB1) a ER1563 (mcrBC +). 5 × 108 buniek bolo infikovaných LEF1 pri multiplicite infekcie 5. V uvedených časových intervaloch (v minútach) po infekcii fága nesúceho gén PvuII metyltransferázy (LEF1) bola pripravená chromozomálna DNA a podrobená pulznému poli agarózy gélová elektroforéza. M, λ rebrík DNA.

Avšak fágový kmeň LEF1, ktorý nesie gén metyltransferázy PvuII, bol obmedzený 10 000-krát (obrázok 3a). Tento výsledok súhlasí s predchádzajúcimi správami, ktoré naznačujú, že fágy nesúce gén DNA metyltransferázy sa nemohli množiť v mcrBC + kmeň z E. coli [43]. Ako sme uviedli v predchádzajúcej časti, či je blokovanie propagácie spôsobené opakovanou metyláciou zavedenej DNA a následným štiepením sprostredkovaným McrBC [43] alebo v dôsledku metylácie hostiteľského genómu a jeho letálneho štiepenia sprostredkovaného McrBC, nebolo riešené.

Keď sme skúmali chromozómy infikovaných buniek pomocou pulznej gélovej elektroforézy, pozorovali sme akumuláciu obrovskej lineárnej DNA zodpovedajúcej zlomeným chromozómom (uvedené na obrázku 3b v dráhach 30 a 45 minút po infekcii) a menších DNA rôznej veľkosti ( náter na obrázku 3b v dráhe 45 minút po infekcii), čo pravdepodobne odráža degradáciu chromozómov. Ich vzhľad bol mcrBC + -závislý (mcrB1 pruhy na obrázku 3b). Toto pozorovanie silne naznačuje, že metylácia chromozómov sprostredkovaná M. PvuII spustila štiepenie chromozómov pomocou McrBC, po ktorom nasledovala degradácia chromozómov. To zase naznačuje, že inhibícia ich množenia (obrázok 3a) je spôsobená smrťou hostiteľa.

Parenteticky sme si všimli skupinu pochádzajúcu z oboch mcrB - a mcrBC + kmene v strede rovnakého gélu a iného druhu v najnižšej polohe od mcrBC + bunky (údaje nie sú zobrazené). Z ich mobility sme usúdili, že tieto pásy predstavujú vyrezanú kruhovú formu a štiepenú lineárnu formu e14, defektného lambdoidného fága [44, 45]. Pretože e14 má jedno miesto PvuII, očakáva sa, že jeho lineárna forma sa objaví po štiepení sprostredkovanom McrBC [46]. Pretože lambdoidné fágy majú podobnú organizáciu génov [47–49] a reguláciu [50], nebolo by veľmi prekvapujúce, keby génová expresia z prichádzajúceho λ nejako viedla k expresii excíznej funkcie e14.

Bunková smrť a degradácia chromozómov sprostredkovaná McrBC po indukcii DNA metyltransferázy

Vyššie uvedené dve sady experimentov silne naznačujú, že McrBC sprostredkuje inhibíciu propagácie génu PvuII DNA metyltransferázy prostredníctvom letálneho štiepenia metylovaných chromozómov. Ďalej sme sa pýtali, či indukcia metyltransferázy PvuII vedie k metylácii chromozómov, po ktorej nasleduje štiepenie sprostredkované McrBC a bunková smrť. Ďalej sme sa pýtali, či môžeme nájsť úzku koreláciu medzi týmito tromi procesmi: metyláciou, štiepením a smrťou.

Najprv sme naklonovali pvuIIM gén downstream od promótora BAD indukovateľného arabinózou [51]. Na tento experiment sme pripravili hostiteľské kmene na základe práce Khlebnikova a kol. [52]. Týmto autorom sa podarilo dosiahnuť homogénnu expresiu z promótora BAD a získať lineárne zvýšenie hladiny expresie v reakcii na koncentráciu arabinózy deléciou araBAD a araFGH operónov a nahrádzanie araE promótor s konštitutívnym promótorom [52]. Zaviedli sme tieto mutácie na konštrukciu izogénnych mcrBC +/- kmene (BIK18260 a BIK18261 v tabuľke 2). Pri troch koncentráciách arabinózy (0%, 0,0002% a 0,002%) sme boli schopní preukázať koreláciu medzi metyláciou genómu, rozbitím genómu a bunkovou smrťou (obrázok 4), ako je podrobne uvedené nižšie.

Expresia PvuII metyltransferázy spôsobuje metyláciu chromozómov a mcrBC-závislé zlomenie chromozómov a bunková smrť. (a) Potvrdenie metylácie chromozómov. BIK18260 (mcrB1) bunky nesúce pEF24 (pvuIIM pod promótorom pBAD, pozri tabuľku 1), boli pestované v LB bujóne pod antibiotickou selekciou do strednej exponenciálnej fázy, zriedené na OD600 = 0,1 a ďalej pestované v prítomnosti 0,002 % alebo 0,002 % arabinózy (ara), aby sa indukovala expresia M.PvuII. V uvedených časových intervaloch (v minútach) bola pripravená chromozomálna DNA, štiepená endonukleázou PvuII (TaKaRa Bio) a podrobená elektroforéze na agarózovom géli s pulzným poľom. M, λ rebrík DNA. (b) Chromozómová DNA v BIK18261 (mcrBC +) nesúci pEF24 po indukcii PvuII metyltransferázy. (c) Fluorescencia etídium-bromidu v jamke sa merala pre experimenty v (b). (d) Strata životaschopnosti buniek. Počet životaschopných buniek sa monitoroval duplicitne v dvoch nezávislých experimentoch. Každá hodnota bola vydelená hodnotou v čase nula. (e) Tvar bunky. Bunky sa získali 60 minút po pridaní vyššej (0,002 %) koncentrácie arabinózy. Boli zafarbené DAPI na vizualizáciu nukleoidov a boli pozorované pomocou mikroskopie s fázovým kontrastom (vľavo) a fluorescencie (vpravo). Stĺpec stupnice ukazuje 10 μm.

Pokrok v metylácii genómu sa meral v mcrBC-negatívny kmeň, rezistenciou voči štiepeniu PvuII in vitro (Obrázok 4a). Vzor štiepeného pásu ukazuje, že rýchlosť postupu metylácie chromozomálnej DNA po indukcii koreluje s koncentráciou arabinózy (obrázok 4a). Nižšia (0,0002 %) koncentrácia viedla k oneskoreniu metylácie približne o 30 minút v porovnaní s vyššou (0,002 %) koncentráciou.

Tiež sme sledovali metyláciu jedného miesta PvuII na plazmide s viacerými kópiami (pEF60 v tabuľke 1) obsiahnutom v bunke. Plazmidy sa extrahovali z buniek (BIK18260) nesúcich pEF60 a pEF24 (indukovateľný gén M.PvuII) a štiepili sa in vitro s PvuII a HindIII, ktoré štiepia pEF60 na jednom mieste. Kvantifikácia pásov ukázala, že miesto PvuII bolo úplne metylované 30 minút a 60 minút po indukcii s 0,002 % a 0,0002 % arabinózy, v danom poradí (údaje nie sú uvedené). Čas na dosiahnutie 50 % metylácie bol asi 13 minút pre vyššiu koncentráciu a asi 38 minút pre nižšiu koncentráciu. Líšili sa o 25 minút. Metylácia pozorovaná s plazmidom teda dobre súhlasila s metyláciou pozorovanou na chromozóme.

Pozorovali sme tiež nízku úroveň metylácie PvuII pEF60 za podmienok represie: 4,1 % a 4,3 % v jednom experimente a 5,3 % a 6,0 % v ďalších 5 % zodpovedá 89 miestam z 1 778 miest PvuII v chromozóme MG1655. To naznačuje, že PvuII metyltransferáza je exprimovaná na nízkej úrovni v dôsledku mierneho úniku z BAD promótora. To je v súlade s predchádzajúcimi správami o tomto promótore [51, 53] a ťažkostiach pri udržiavaní génov pre reštrikčné enzýmy pod týmto promótorom v potláčanom stave v E. coli [54] (M Watanabe, F Khan, Y Furuta a ja Kobayashi, nepublikované pozorovanie).

Indukcia PvuII metyltransferázy skutočne spôsobila okamžité zlomenie chromozómov, ako sa zistilo gélovou elektroforézou s pulzným poľom v mcrBC + kmeň (obrázok 4b), ale nie v mcrBC - kmeň (údaje nie sú uvedené). S vyššou koncentráciou arabinózy sa obrovské lineárne molekuly DNA (v strede medzi jamkou a 485 kb markerom) stali prominentnými 15 minút po indukcii a potom sa zdalo, že sa postupne presúvajú na menšie fragmenty. Pri nižšej koncentrácii arabinózy sa obrovské lineárne molekuly DNA objavili 30 minút po indukcii a rozpadli sa rovnakým spôsobom. Pozorované zlomenie chromozómov teda dobre korelovalo s postupom metylácie v mcrBC - kmeň. Kvantifikácia DNA v jamke, ktorá pravdepodobne predstavuje relatívne intaktné chromozómy, odhalila, že sa časom po indukcii znížili (obrázok 4c). Tieto poklesy pri rôznych koncentráciách arabinózy dobre korelovali s postupom metylácie v mcrBC - kmeň.

Zlomenie chromozómov bolo sprevádzané znížením počtu životaschopných buniek (jednotky tvoriace kolónie obrázok 4d). Postup smrti opäť súvisel s koncentráciou arabinózy. Silnejšia indukcia viedla k bunkovej smrti do 15 minút, zatiaľ čo slabšia indukcia umožnila zachovanie životaschopnosti počas 30 minút. Mnoho buniek sa javilo ako vlákna s viacerými jadrami alebo bez jadra (obrázok 4e). Inhibícia bunkového rastu meraná v OD bola tiež pozorovaná v mcrBC + bunky 1-2 hodiny po indukcii (obrázok 5a, vľavo dole), ale nie v potlačovanom stave (obrázok 5a, vľavo hore).

Účinok recA a recBC mutácie bunkového rastu a chromozómových zmien. (a) Bunkový rast. BIK18260 (mcrB1), BIK18261 (mcrBC + ), 18290 BIK (mcrB1 ΔrecA), BIK18291 (mcrBC + ΔrecA), BIK18292 (mcrB1 ΔrecBC) a BIK18293 (mcrBC + ΔrecBC), nesúci pEF24 (pSC101::pvuIIMpozri tabuľku 1), boli pestované v LB bujóne s 0,2 % glukózou a selektívnymi antibiotikami do exponenciálnej fázy, zriedené na OD600 = 0,1 a ďalej pestované s alebo bez 0,0002 % arabinózy. OD600 sa monitorovala v uvedených časových intervaloch po pridaní arabinózy. Každá hodnota bola vydelená hodnotou v čase nula. (b) Chromozómy v neindukovaných bunkách. BIK18261 (mcrBC + ), BIK18291 (mcrBC + ΔrecA) a BIK18293 (mcrBC + ΔrecBC) a ich deriváty nesúce pEF24 (pSC101::pvuIIM) boli pestované v LB bujóne s 0,2 % glukózou a selektívnymi antibiotikami do exponenciálnej fázy. Pripravila sa chromozomálna DNA a podrobila sa elektroforéze na agarózovom géli s pulzným poľom. M, λ rebrík DNA. (c) Chromozómy po indukcii. Chromozómová DNA v BIK18261 (mcrBC + ), BIK18291 (mcrBC + ΔrecA) a BIK18293 (mcrBC + ΔrecBC), nesúci pEF24 (pSC101::pvuIIM) po indukcii PvuII metyltransferázy 0,002 % alebo 0,0002 % arabinózy. V uvedených časových intervaloch po indukcii sa pripravila chromozomálna DNA a podrobila sa elektroforéze na agarózovom géli s pulzným poľom. M1, λ DNA rebrík M2, λ DNA štiepená HindIII.

Tieto výsledky demonštrujú koreláciu medzi metyláciou genómu, rozpadom chromozómov a bunkovou smrťou po indukcii PvuII metyltransferázy. Silne naznačujú, že chromozomálne miesta metylované PvuII metyltransferázou sú štiepené McrBC a že toto štiepenie vedie k bunkovej smrti.

Účinok mutácií v génoch súvisiacich s DNA

Ak sú chromozomálne miesta metylované PvuII metyltransferázou štiepené McrBC a toto štiepenie vedie k bunkovej smrti, mutácie v enzýmoch zapojených do procesov súvisiacich s DNA môžu ovplyvniť tieto procesy. Skúmali sme rast buniek a zmeny chromozómov u niekoľkých mutantov zmenených v metabolizme DNA rôznymi spôsobmi.

Enzým RecBCD sa podieľa na exonukleolytickej degradácii DNA z dvojvláknového zlomu a vytvára rekombinantný jednovláknový koniec DNA [55]. Keď sa naviaže na túto jednovláknovú DNA generovanú RecBCD alebo inými enzýmami, proteín RecA iniciuje homológne párovanie na rekombinačnú opravu. RecA naviazaný na jednovláknovú DNA tiež indukuje SOS gény prostredníctvom štiepenia ich LexA represora [56]. Ak sa RecA a RecBCD podieľajú na spracovaní a oprave zlomu chromozómov sprostredkovaného McrBC, ich odstránenie môže ovplyvniť prežitie buniek a spracovanie chromozómov.

Mutačné odstránenie hostiteľského mechanizmu exonukleázy/rekombinázy RecBCD/RecA ovplyvnilo rast nielen v indukovanom stave, ale aj v potlačenom stave (obrázok 5a). Pravdepodobným vysvetlením neindukovaného stavu je metylácia chromozómov miernou expresiou PvuII metyltansferázy (pozri vyššie). Chromozómy sme analyzovali gélovou elektroforézou s pulzným poľom v pároch kmeňov s a bez PZLÝ-pvuIIM plazmid v mcrBC + pozadie. Naše výsledky ukázané na obrázku 5b jasne ukazujú na plazmidom závislú degradáciu (šmuh) v recBC mutantné a od plazmidov závislé zvýšenie obrovských lineárnych DNA (hrubý pás v strede medzi jamkou a 485 kb markerom) v recA mutant. Tieto výsledky silne naznačujú, že čiastočná metylácia chromozómov viedla k zlomeniu chromozómov sprostredkovanému McrBC a že mechanizmus RecBCD / RecA opravuje tento zlom. Defekty v oprave chromozómového zlomu sprostredkovaného McrBC sú pravdepodobne príčinou oneskoreného rastu chromozómu. recA a recBC mutanty (obrázok 5a).

Keď je indukovaná metyltransferáza, oprava prerušenia sprostredkovaná RecBC/RecA pravdepodobne oneskorí zastavenie rastu (obrázok 5a). The recA alebo recBC mutácie mierne ovplyvnili stratu životaschopnosti buniek 30 minút po indukcii metyltransferázy (tabuľka 3). Konečná úroveň životaschopnosti pri vystavení genómu metylácii však bola podobná ako v rec + kmeň (údaje nie sú uvedené).

Chromozómy v týchto mutantoch vykazovali zmeny v súlade s vyššie uvedenými rastovými vzormi a ich známymi vlastnosťami (obrázok 5c). The recBC mutant vykazoval veľké množstvo obrovských zlomených chromozómov v neindukovanom stave, tieto zostali hojné až 60 minút po indukcii. V spodnej oblasti, ktorá zodpovedá menším zlomeným chromozómom, je viditeľných veľa diskrétnych pásov recBC mutant. To je v súlade s procesom, v ktorom boli chromozómy zlomené endonukleázou McrBC ďalej degradované exonukleázou RecBCD. The recA mutant, na rozdiel od rec + kmeň, ukázal viac z obrovských zlomených chromozómov aj v neindukovanom stave. V rec + kmeň, tento druh sa stal výrazným iba 15 minút po indukcii a zmizol. V recA mutanta, zostala hojná počas 30 minút, ale začala klesať 45 minút po indukcii. Množstvo menších zlomených chromozómov v recA napätie bolo menšie ako v rec + kmeň, pravdepodobne v dôsledku degradácie enzýmom RecBCD. Nie sú viditeľné žiadne samostatné pásy recA mutant, čo je v súlade s rýchlou a rozsiahlou degradáciou DNA enzýmom RecBCD. Diskrétne pásy sú viditeľné v rec + kmeň, ale nie je ich toľko ako v recBC mutant.

Tieto vzory elektroforézy sú v súlade s krokmi chromozomálneho zlomu sprostredkovaného McrBC, exonukleolytickej degradácie sprostredkovanej RecBCD zo zlomu a homológneho párovania sprostredkovaného RecA na opravu. Reparácia sprostredkovaná RecBCD/RecA bola zistená aj pre post-segregačné usmrtenie pomocou RM systému typu II [28]. Z výsledkov uvedených na obrázku 5 a tabuľke 3 sme usúdili, že rekombinačná oprava sprostredkovaná RecBCD / RecA môže do určitej miery pôsobiť proti smrteľnému účinku McrBC na nízkej úrovni metylácie. Zdá sa však, že ich oprava chromozómov nie je schopná prispieť k prežitiu buniek, keď sa metylácia genómu a štiepenie sprostredkované McrBC rozšíria. Je to podobné ako pri štiepení chromozómov mutantným enzýmom EcoRI [57, 58].

Funkcia RecA/RecBCD sa tiež podieľa na reakcii SOS, ako bolo uvedené. Bunková filamentácia nebola pozorovaná v a recA delečný kmeň (údaje nie sú uvedené). To naznačuje, že bunková filamentácia, ktorú sme pozorovali, predstavuje odpoveď SOS. Aby sme vyhodnotili účinky SOS odpovede na inhibíciu rastu sprostredkovanú McrBC a bunkovú smrť, skúmali sme mutanty súvisiace so SOS (obrázok 6 a tabuľka 3). Medzi týmito, lexAMutant (Ind - ) je defektný v indukcii SOS lexA(Def) mutant je konštitutívny pre indukciu SOS a mutS mutant vykazuje menej zlomov DNA v pozadí na niektorých genetických pozadích [59].

Účinok mutácií súvisiacich so SOS na rast buniek. BIK18262 (mcrB1 mutS), BIK18264 (mcrBC + mutS), BIK18271 (mcrB1 lexA(Ind - )), BIK18276 (mcrBC + lexA(Ind - )), BIK18278 (mcrB1 lexA(Def)), BIK18280 (mcrBC + lexA(Def)), nesúci pEF24 (pSC101::pvuIIM pozri tabuľku 1), boli pestované v LB bujóne s 0,2 % glukózou a selektívnymi antibiotikami do exponenciálnej fázy, zriedené na OD600 = 0,1 a ďalej pestované s alebo bez 0,0002 % arabinózy. OD600 sa monitorovala v uvedených časových intervaloch po pridaní arabinózy. Každá hodnota bola vydelená hodnotou v čase nula.

Tieto mutanty vykazovali inhibíciu rastu závislú od McrBC, keď bol indukovaný M. PvuII, ale nie v potlačenom stave (obrázok 6). Inhibícia sprostredkovaná McrBC pozorovaná v lexA(Ind - ) mutant bol silnejší ako v rec + napätie, ale nie také silné ako v recA kmeň (obrázok 5a). Jednoduchá interpretácia tohto výsledku je, že chyba v oprave v recA-negatívny mutant nemožno úplne pripísať absencii SOS odpovede. Inými slovami, RecA bude pravdepodobne hrať priamu úlohu, pravdepodobne, pri rekombinačnej oprave. The lexAKmeň (Ind-) tiež vykazoval závažnú stratu životaschopnosti buniek 30 minút po indukcii (tabuľka 3). Výsledky s lexA(Def) sa ťažko interpretujú, pretože lexA(Def) mcrB1 kmeň vykazoval pomalý rast. To je známe lexA(Def) mutácia oneskoruje rast aj v sulA-negatívne pozadie [60]. Tento účinok by mohol byť prehnaný zlomom chromozómov sprostredkovaným McrBC po metylácii genómu. The mutS mutant bol na nerozoznanie od rec + (mutS + ) napätie pri týchto meraniach. Z týchto výsledkov sme usúdili, že odpoveď SOS a rekombinácia / oprava DNA sprostredkovaná RecA / RecBCD ovplyvňujú bunkovú smrť / prežitie po pôsobení McrBC na metylovaný genóm. Opravné systémy však nemôžu blokovať bunkovú smrť po rozsiahlej metylácii a štiepení chromozómov. Tieto pozorovania sú v súlade s našou hypotézou, že metylácia chromozómov vedie k jeho smrteľnému štiepeniu sprostredkovanému McrBC.

Všeobecnosť a špecifickosť pôsobenia McrBC proti DNA metyltransferázam

Aby sme preskúmali všeobecnosť a špecifickosť bunkovej smrti sprostredkovanej McrBC s ohľadom na špecifickosť DNA metyltransferázy, exprimovali sme McrBC v bunke nesúcej jednu z niekoľkých metyltransferáz s rôznymi špecifickosťami. Najprv, mcrBC z E. coli bol umiestnený pod PZLÝ promótor (pEF46 v tabuľke 1). Ako sa očakávalo, indukcia McrBC v bunke nesúcej ďalší plazmid kódujúci M.PvuII (CAG m4 CTG) viedla k bunkovej smrti v teste tvorby kolónií (obrázok 7). Indukcia McrBC tiež viedla k bunkovej smrti s M.SinI (GGW m5 CC) a M.MspI (m5 CCGG) (obrázok 7), ale nie s M.SsoII (Cm5 CNGG) (údaje nie sú uvedené). Tieto výsledky sú v súlade s pozorovanou sekvenčnou špecifickosťou RmC McrBC in vitro [33]. Naša interpretácia je taká, že McrBC má potenciál pôsobiť ako obranný systém proti mnohým DNA metyltransferázam s vhodnou špecifickosťou.

Bunková smrť sprostredkovaná McrBC s DNA metyltransferázami. Bunky (BIK18308) obsahujúce pEF46 (PZLÝ-mcrBC pozri Materiály a metódy) a pEF43 (M.PvuII), pSI4 (M.SinI), pNW106RM2-3 (M.MspI) alebo pBAD30 (vektor) sa naniesli na LB agarovú platňu obsahujúcu 30 ug/ml chloramfenikolu a 25 ug/ ml ampicilínu a 0,2 % glukózy alebo 0,2 % arabinózy. Doštičky sa inkubovali cez noc pri 37 °C.

Molekulárne evolučné analýzy McrB a McrC odhaľujú ich častú stratu a horizontálny prenos medzi vzdialene príbuznými genómami

Vyššie uvedené experimentálne výsledky poskytujú odpoveď na otázku, ktorú sme prvýkrát sformulovali. Je veľmi pravdepodobné, že McrBC štiepi hostiteľské chromozómy a spôsobuje bunkovú smrť po metylácii genómu a že táto bunková smrť inhibuje propagáciu génu metyltransferázy (obrázok 1b). Ukázalo sa tiež, že McrBC výrazne obmedzuje bakteriofágy nesúce hydroxymetylovaný C namiesto C vo svojich genómoch [34, 35, 61, 62]. Ktoré z týchto akcií McrBC poskytujú selektívnu výhodu pre ich šírenie a udržiavanie počas evolúcie?

S cieľom vyriešiť túto otázku sme sa zamerali na podobnosť McrBC s RM systémami typu II pri zabíjaní hostiteľa štiepením chromozómov. Ako je znázornené na obrázku 1a, keď je komplex génu RM typu II nahradený konkurenčným genetickým prvkom, jeho produktový reštrikčný enzým štiepi chromozómy hostiteľa, v ktorých sa metylácia znižuje, a zabije hostiteľa (obrázok 1a) [22]. To vedie k prežitiu buniek, ktoré si zachovávajú komplex génu RM, ale nie jeho konkurenta. Systém McrBC môže tiež prispieť k vylúčeniu epigenetických metylačných systémov (obrázok 1b). Kontrast medzi nimi je v tom, že pôsobenie McrBC nasleduje po získaní metylácie, na rozdiel od straty metylácie.

Potenciál zabíjania hostiteľa RM systémami typu II naznačuje ich relatívnu nezávislosť od hostiteľa. Pôsobia ako jednotka výberu a v tomto ohľade môžu byť podobné vírusovým genómom, transpozónom a iným sebeckým mobilným prvkom. V súčasnosti skutočne existuje veľa dôkazov o mobilite systémov RM typu II [21]. Patria sem molekulárne evolučné dôkazy ich rozsiahleho horizontálneho prenosu medzi vzdialene príbuznými prokaryotmi, prenášanie mobilnými prvkami, ako sú plazmidy a spojenie s génmi súvisiacimi s mobilitou. Pravdepodobne v dôsledku tejto mobility, okrem schopnosti rezať prichádzajúce DNA a bojovať proti konkurenčným prvkom zabíjaním hostiteľa, sú RM systémy typu II rozšírené v celej Prokaryote. Často sa strácajú z genómu rôznymi mutáciami [21]. Sú dosť diverzifikované v rozpoznávaní sekvencií kvôli frekvenčne závislej selekcii pri obrane proti prichádzajúcej DNA [63] a/alebo kvôli vzájomnej konkurencii o rozpoznávaciu sekvenciu pri usmrcovaní hostiteľa [18]. Pýtali sme sa, či homológy McrBC vykazujú podobné vlastnosti. Ak tak urobia, mohli by sme to považovať za dôkaz podporujúci hypotézu, že McrBC sa vyvinuli pre svoju schopnosť zabíjať hostiteľskú bunku v konkurencii so systémami metylácie genómu a správať sa ako sebecké mobilné prvky.

Aby sme sa zaoberali týmito bodmi a vyhodnotili vyššie uvedené dve hypotézy pre McrBC, preskúmali sme jeho evolučnú históriu. Pomocou postupnosti McrB a McrC z E. coli ako dopyty na vyhľadávanie PSI-BLAST [64] sme identifikovali 199 homológnych systémov podobných McrBC, typicky obsahujúcich operóny s mcrB-podobný gén, po ktorom nasleduje a mcrC-podobný gén (pozri tiež nižšie). Tieto homológy systému McrBC sú široko distribuované v baktériách a archeách (tabuľka S1 v súbore doplnkových údajov 1), ako napríklad RM systémy typu I alebo typu II [17]. Ak mcrBC homológy vykazujú veľmi úzku distribúciu a to koreluje s distribúciou fágov s hydroxymetyl C, môže byť uprednostnená hypotéza fágovej obrany. Týmto problémom sa venujeme v diskusii.

Fylogenetické stromy vypočítané z viacnásobného zarovnania sekvencií McrB a McrC (materiály a metódy) odhaľujú veľmi podobné topológie, čo naznačuje silnú koevolúciu týchto dvoch proteínov (obrázok S1 v súbore dodatočných údajov 2).Deväť vetiev podporovaných bootstrapom odhaľuje vzťahy medzi sekvenciami z rôznych taxónov, čo naznačuje veľmi vysokú pravdepodobnosť vzdialených udalostí horizontálneho prenosu génov, čo je tiež znakom evolúcie systémov RM typu II [15, 65]. Zdá sa, že vo vyššie uvedených prípadoch McrB a McrC zažili spoločný horizontálny prenos.

The mcrBC génový komplex v E. coli Predpokladá sa, že K12 bol získaný nedávno [61], čo potvrdzuje naša fylogenetická analýza: McrB a McrC z E. coli K12 sa nenachádzajú vo vetve špecifickej pre Proteobaktérie (horná časť stromu na obrázku S1 v súbore doplnkových údajov 2), ale vo vetve, ktorá tiež zahŕňa Acidobaktériová baktéria Blin 345 (najbližší homológ E. coli McrBC), Firmicutes a Actinobacteria. Vo všeobecnosti podjednotky McrBC z taxónov, ako sú Proteobacteria, Actinobacteria alebo Firmicutes, tvoria početné zmiešané vetvy v strome, čo naznačuje viaceré horizontálne prenosy génov, po ktorých nasleduje vertikálne šírenie medzi odlišnými druhmi a kmeňmi. Jeden príklad vetvy funkčne podobných enzýmov z úplne odlišných taxónov poskytuje rodina neobvyklých RM systémov typu II súvisiacich s McrBC (vrátane LlaI [66], BsuMI [67], LlaJI [68] a ich experimentálne necharakterizovaných homológov), ktoré štiepia nemetylovanú DNA a sú sprevádzané párom metyltransferáz DNA typu IIS na ochranu pred štiepením ich vlastnej DNA (označená podrodina typu II R na obrázku S1 v súbore doplnkových údajov 2).

Ďalšou črtou, ktorú odhalili fylogenetické stromy, je prítomnosť dvoch silne odlišných podrodín systémov podobných McrBC, z ktorých jedna obsahuje známe McrBC (napr. E. coli K12) a systémy podobné McrB (napríklad vyššie uvedené enzýmy typu II) a druhý obsahuje výlučne necharakterizované homológy podobné McrBC s neznámou funkciou, pričom zložka podobná McrC je definovaná ako necharakterizovaná rodina proteínov DUF524. Je zaujímavé, že členovia týchto dvoch podčeľadí vykazujú takmer dokonale komplementárnu fylogentickú distribúciu, to znamená, že napriek ich prítomnosti v podobných taxónoch sa nevyskytujú súčasne v jednom genóme (tabuľka S2 v súbore doplnkových údajov 3 a tabuľka S1 v súbore doplnkových údajov 1), čo pravdepodobne odráža určitú mieru ich vzájomnej nekompatibility.

Niekoľko udalostí vzdialeného horizontálneho prenosu uvedených na fylogenetických stromoch zodpovedá iba tým prípadom, keď sa zistí, že homológ McrB (a/alebo McrC) z jedného taxónu je vložený do vetvy obsahujúcej iný taxón (napr. Deinococcus v rámci Gammaproteobacteria) a kde má táto vetva podporu bootstrapu >50%. Toto je veľmi konzervatívny odhad udalostí horizontálneho prenosu génov. Stromy odhaľujú mnoho ďalších prípadov vetiev so zmiešanými taxónmi, ale ich podpora bootstrap je < 50 %, čo naznačuje nedostatok štatistickej podpory pre miestnu topológiu stromov. Keď sme porovnali stromy McrB a McrC so stromami 16S rRNA vypočítanými pre rovnaký súbor druhov (obrázok S2 v súbore dodatočných údajov 4), našli sme početné nezhody v hlbokých vetvách a zhodu iba v krátkych vetvách, ktoré spájajú úzko súvisiace druhy. Táto analýza naznačuje, že systémy McrBC boli mnohokrát prenesené horizontálne, ale samozrejme boli tiež zdedené vertikálne úzko príbuznými skupinami organizmov vyžarujúcich od ich spoločného predka (napríklad kmeňmi rovnakého druhu, ako napr. Streptococcus pneumoniae, Campylobacter jejuni, alebo Yersinia pestis). Je však veľmi ťažké kvantifikovať rýchlosť vzdialeného horizontálneho prenosu analýzou stromu s vysoko variabilnou podporou bootstrapu pre rôzne uzly, preto sme sa uchýlili k nezávislej stratégii.

Gojobori a spolupracovníci [69] publikovali analýzu 116 kompletne sekvenovaných prokaryotických genómov, v ktorých vypočítali index potenciálneho vzdialeného horizontálneho prenosu pre všetky gény porovnaním frekvencie „slov“ dĺžky pentanukleotidov v rámci každého génu s priemernou frekvenciou slov. celého genómu. Získali sme aktualizovaný súbor údajov pre 165 genómov od Dr. Nakamuru a Dr. Gojoboriho (osobná komunikácia). Spomedzi týchto genómov 29 obsahuje homológy McrB aj McrC (D. radiodurans obsahuje jeden dodatočný homológ McrB). Analyzovali sme index horizontálneho prenosu všetkých génov kódujúcich homológy McrB a McrC a zistili sme, že 9 homológnych génov McrB (9/30 = 30 %) a 10 génov homológnych McrC (10/29 = 35 %) vykazuje frekvencie slov, ktoré naznačujú významná pravdepodobnosť vzdialeného horizontálneho prenosu génov. Vo vzorke systémov McrBC, pre ktoré sú dostupné údaje, sa teda zdá, že približne jedna tretina bola odvodená nedávnym horizontálnym prenosom génov zo vzdialene príbuznej skupiny. Pre rovnaký súbor genómov sme tiež vykonali analýzu indexu horizontálneho prenosu génov z dvoch referenčných „domácich“ proteínových rodín: RecA a RpoB. V tejto vzorke sme nenašli žiadne členy génov RecA alebo RpoB, ktoré by sa dali predpovedať ako nedávno prenesené.

Zistili sme, že génový komplex McrBC sa často stráca, pretože sa nenašiel žiadny taxón vyššieho rádu, v ktorom by všetky úplne sekvenované genómy mali tento systém. Spomedzi 567 kompletne sekvenovaných genómov, v ktorých sme hľadali homológy McrB/C, sme našli McrB iba v 112 prípadoch (19,8 %) a McrC v 108 prípadoch (19,0 %) McrB a McrC sme našli spolu v 107 prípadoch (18,9 %). Dospeli sme teda k záveru, že systémy McrBC sa často prenášajú horizontálnym prenosom génov (okrem bežného vertikálneho prenosu), ale tiež sa veľmi často strácajú. To argumentuje proti hypotéze, že sú konzervované len vďaka ich využiteľnosti na obranu proti fágom alebo iným parazitom a uprednostňuje hypotézu, že sa správajú ako sebecké (hostiteľ zabíjajúce) mobilné elementy.

Analýza genómového susedstva systémov McrBC naznačuje ich mobilitu a prepojenie so systémami metylácie genómu

Génové komplexy RM typu II sa často nachádzajú na mobilných elementoch, ako sú plazmidy, fágy, integróny a genómové ostrovy [21]. V súlade s tým sú často spojené s génmi súvisiacimi s mobilitou, ako sú homológy transpozázy a homológy integrázy. Preskúmali sme štvrte mcrBC homológov, ktorí očakávajú, že nájdu podobné gény.

Analýza genómového susedstva (tabuľka S2 v súbore dodatočných údajov 3, pozri tabuľku S1 v súbore dodatočných údajov 1 pre úplný súbor údajov) odhalila, že McrB a McrC sú navzájom úzko spojené, čo naznačuje ich štruktúru ako jeden operón. Často sú spojené s homológmi integráz a transpozáz (tabuľka S2 v súbore doplnkových údajov 3 a tabuľka S1 v súbore doplnkových údajov 1). Niekoľko homológov McrBC sa jasne vyskytuje ako inzert v génovom komplexe RM (obrázok 8). Okrem toho sa na plazmide našlo osem systémov podobných McrBC (tabuľka S1 v súbore doplnkových údajov 1). Tieto tri línie dôkazov naznačujú potenciálnu mobilitu mcrBC jednotka. The mcrBC homológy boli často spojené so systémami RM alebo len s DNA metyltransferázami (tabuľka S2 v súbore dodatočných údajov 3), ako bolo prvýkrát uvedené pre E. coli [70]. Dôsledky tohto zistenia sú uvedené nižšie.

mcrBC-podobné homológy zjavne vložené do RM génového komplexu. Názvy otvorených čítacích rámcov označujú názvy enzýmov (REBASE) alebo lokusové značky (GenBank).

Niektoré genómy, ako napr Deinococcus radiodurans R1 genóm, obsahuje dva mcrBC homológy, niekedy jeden na plazmide a druhý v chromozóme. Zarovnanie týchto párov McrB homológov nachádzajúcich sa v rovnakom genóme odhalilo, že ich aminokyselinové sekvencie sa často líšia v amino-terminálnej oblasti, ktorá sa podieľa na väzbe DNA [46], čo naznačuje evolučné posuny v špecifickosti sekvencie DNA (obrázok 9). Toto je paralelné s rozmanitosťou v rozpoznávaní sekvencií reštrikčných a modifikačných enzýmov typu II.

Bodové porovnanie intragenomických mcrB paralógy. Aminokyselinové sekvencie páru mcrB paralógy v rámci jedného genómu boli vynesené proti sebe.

Na preskúmanie vzťahu medzi diverzitou McrB amino-terminálnej oblasti a rozpoznávaním sekvencie bolo použitých niekoľko homológov McrBC, STOMcrBC (NP_377078.1) a STOMcrBC2 (NP_377080.1) z r. Sulforobus tokodaii str. 7, TKOMcrBC (YP_183208.1) a TKOMcrBC2 (YP_183422.1) z Thermococcus kodakaraensis KOD1 a DraMcrBC (NP_051672.1) z D. radiodurans R1, boli amplifikované z genómovej DNA a klonované do pBAD30 [51]. Títo mcrBC homológy nespôsobili bunkovú smrť v E. coli pri 37 °C v prítomnosti arabinózy v bunke nesúcej jeden zo štyroch génov DNA metyltransferázy, M.PvuII (CAG m4 CTG), M.SinI (GGW m5 CC), M.MspI (m5 CCGG) alebo M.MspI (m5 CCGG) alebo M. SsoII (Cm5 CWGG) (údaje nie sú uvedené). EcoKMcrBC od E. coli spôsobila metyláciu genómu snímania bunkovej smrti pomocou M.SinI (GGW m5 CC) a M.MspI (m5 CCGG) za rovnakých podmienok (obrázok 7). Preto sme neboli schopní spojiť tieto homológy s biológiou organizmov.


Vývoj nových radikálových reakcií s vinylsilylovou skupinou a ich aplikácia na syntézu nukleozidov cukrov s rozvetveným reťazcom

3.2.1 Tepelná stabilita

Tepelná stabilita duplexov tvorených týmito ODN a komplementárnou DNA-10 alebo RNA-11 bola študovaná tepelnou denaturáciou v tlmivom roztoku 0,01 M fosforečnanu sodného (pH 7,0) obsahujúcom 0,01 M alebo 0,1 M NaCl. Teploty topenia (Tms) sú uvedené v tabuľke 3 s DNA-10 ako komplementárnym reťazcom. Všetky ODN obsahujúce 44, 45 alebo 47 stabilizovali duplexy ODN/DNA. Duplexy sa stali stabilnejšími, keď sa počet 44, 45 alebo 47 zvýšil. The ∆Tm hodnoty pre ODN obsahujúce päť zvyškov 44, 45 alebo 47 boli +4,5, +5,7 alebo +4,1 °C, v danom poradí. ODN obsahujúce jeden alebo dva zvyšky po 48 destabilizovali duplexy, zatiaľ čo ODN obsahujúce tri, štyri alebo päť zvyškov po 48 duplexy stabilizovali. The ∆Tm hodnota pre ODN obsahujúce päť zvyškov 48 bola +2,4 °C. The ∆Tm hodnota pre ODN s obsahom 45 bola väčšia ako pre ODN s rovnakým počtom 44 alebo 47 s výnimkou ODN-3P a 7P. Okrem toho, ∆Tm hodnota pre ODN-15 so zmiešanou sekvenciou, ktorá má päť zvyškov po 45, bola +6,8 °C. Preto sa zdá, že analógy obsahujúce 45 účinne stabilizujú duplexy ODN/DNA.

Tabuľka 3 . Údaje o hybridizácii.

ODNODN/DNA a ODN/RNA b
0,01 M NaCl Tm(°C)Tm c (°C)0,1 M NaCl Tm(°C)Tm c (°C)
154.5-73.9-
2R54.4+0.073.9+0.0
3Y54.4+0.073.7-0.2
4R54.5+0.173.3-0.6
5R54.4+1.072.9-1.0
6Y56.8+2.473.0-0.9
7Y57.5+3.172.3-1.6
8Y58.9+4.571.7-2.2
2E55.0+0.673.7-0.2
3E54.5+0.173.8-0.1
4E55.5+1.173.5-0.4
5E55.7+1.372.1-1.8
6E56.9+2.572.3-1.6
7E58.1+3.771.5-2.4
8E60.1+5.771.2-2.7
2P54.4+0.073.3-0.6
3P54.6+0.273.4-0.5
4P55.1+0.773.1-0.8
5P55.6+1.272.5-1.4
6P56.4+2.072.5-1.4
7P58.3+3.972.0-1.9
8 STR58.5+4.171.2-2.7
2Z52.1-2.373.2-0.7
3Z52.7-1.773.5-0.4
4Z50.8-3.672.8-1.1
5Z53.9-0.572.3-1.6
6Z54.9+0.572.6-1.3
7Z55.6+1.271.8-2.1
8Z56.8+2.471.4-2.5
948.3-6.1--
1242.3-49.8
1549.1+6.849.4-0.4

Na druhej strane, ODN-9 obsahujúci päť zvyškov zo 46, ktorý má acetamidoetylovú skupinu, destabilizoval ODN/DNA duplex v porovnaní s kontrolným duplexom (∆Tm = -6,1 °C). Zvýšená tepelná stabilita duplexov obsahujúcich 45 bola teda pravdepodobne spôsobená účinkom koncového amóniového iónu.

Keď sa RNA-11 použila ako komplementárne vlákno, všetky ODN obsahujúce 44, 45, 47 alebo 48 mierne destabilizovali duplexy ODN/RNA. Duplexy sa stali menej stabilnými, keď sa počet modifikovaných nukleozidov zvýšil. Avšak aj keď sa päť zvyškov 44, 45, 47 alebo 48 začlenilo do 18-mérov, ∆Tm hodnoty pre tieto ODN boli -2,2, -2,7, -2,7 a -2,5 °C. Hodnota ∆Tm hodnota pre ODN-15 bola len -0,4 °C. Preto sú duplexy DNA/RNA tvorené ODN obsahujúcimi 44, 45, 47 alebo 48 dostatočne stabilné na použitie v antisense štúdiách.


Pozri si video: Ферменты биологические катализаторы. Значение ферментов. Видеоурок по биологии 10 класс (August 2022).