Informácie

T50: Hh-PYP - Biológia

T50: Hh-PYP - Biológia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

T50V

  1. Changenet-Barret, Pascale, Pascal Plaza, Monique M. Martin, Haik Chosrowjan, Seiji Taniguchi, Noboru Mataga, Yasushi Imamoto a Mikio Kataoka. "Štrukturálne účinky na ultrarýchlu fotoizomerizáciu fotoaktívneho žltého proteínu. Prechodná absorpčná spektroskopia dvojbodových mutantov†." Journal of Physical Chemistry C 113, č. 27 (2009): 11605-11613. pdf (skontrolované)
  2. Chosrowjan, Haik, Noboru MATAGA, Seiji TANIGUCHI, Masashi UNNO, Hironari KAMIKUBO, Yasushi IMAMOTO a Mikio KATAOKA. "Skúmanie časovej a frekvenčnej domény ultrarýchlej fotoreakčnej dynamiky fotoaktívneho žltého proteínu (PYP)." Prehľad laserového inžinierstva 32, č. 2 (2004): 114-120. pdf (skontrolované)
  3. Chosrowjan, Haik, Seiji Taniguchi, Noboru Mataga, Masashi Unno, Seigo Yamauchi, Norio Hamada, Masato Kumauchi a Fumio Tokunaga. "Nízkofrekvenčné vibrácie a ich úloha v dynamike ultrarýchlych fotoizomerizačných reakcií fotoaktívneho žltého proteínu." Journal of Physical Chemistry B 108, č. 8 (2004): 2686-2698. pdf (skontrolované)
  4. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan, Seiji Taniguchi, Norio Hamada, Fumio Tokunaga, Yasushi Imamoto a Mikio Kataoka. "Ultrarýchle fotoreakcie v proteínových nanopriestoroch, ako sa ukázalo pri meraní dynamiky fluorescencie fs na fotoaktívnom žltom proteíne a súvisiacich systémoch." Fyzikálna chémia Chemická fyzika 5, č. 11 (2003): 2454-2460. pdf (skontrolované)
  5. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan, Yutaka Shibata, Yasushi Imamoto a Fumio Tokunaga. "Vplyv modifikácie proteínovej nanopriestorovej štruktúry a zmeny teploty na femtosekundovú až pikosekundovú fluorescenčnú dynamiku fotoaktívneho žltého proteínu." Journal of Physical Chemistry B 104, č. 21 (2000): 5191-5199. pdf (skontrolované)
  6. Chosrowjan, Haik, Noboru Mataga, Yutaka Shibata, Yasushi Imamoto a Fumio Tokunaga. "Environmentálne účinky na femtosekundovo-pikosekundovú fluorescenčnú dynamiku fotoaktívneho žltého proteínu: chromofóry vo vodných roztokoch a v proteínových nanopriestoroch modifikovaných miestne cielenou mutagenézou." Journal of Physical Chemistry B 102, č. 40 (1998): 7695-7698. pdf (skontrolované)
  7. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan a Seiji Taniguchi. "Vyšetrovanie dynamiky a mechanizmov ultrarýchlych fotoindukovaných reakcií prebiehajúcich vo fotoresponzívnych proteínových nanopriestoroch (PNS)." Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews 5, č. 2 (2004): 155-168. pdf (skontrolované)

T50A

  1. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan, Yutaka Shibata, Yasushi Imamoto a Fumio Tokunaga. pdf (skontrolované)
  2. Mataga, Noboru, Haik Chosrowjan a Seiji Taniguchi. pdf (skontrolované)

Bezacetátová, citrátom okyslená bikarbonátová dialýza zlepšuje sklon k sérovej kalcifikácii – predbežná štúdia

Pozadie: Nový in vitro test (T50 test) hodnotí ex vivo sklon k sérovej kalcifikácii a predpovedá mortalitu u pacientov s chronickým ochorením obličiek a hemodialýzou (HD). V druhom prípade sa ukázalo, že pokles T50 závislý od času súvisí s mortalitou. Tu sme hodnotili, či 3-mesačný prechod na štandardný hydrogénuhličitan HD (CiaHD) bez acetátu, okyslený citrátom (CiaHD) trvalo zlepšuje sklon ku kalcifikácii.

Metódy: Hodnoty T50 boli hodnotené v párových sérach pred dialýzou v polovici týždňa odobratých pred a 3 mesiace po CiaHD u 78 prevládajúcich európskych HD pacientov. Celkovo 44 potom prešlo späť na acetát. Čiastočná korelácia sa použila na štúdium asociácií meniacich sa T50 a meniacich sa kovariátov. Lineárne modely so zmiešaným efektom boli zostavené na posúdenie asociácie CiaHD a kovariátov so zmenou T50.

Výsledky: Významné intraindividuálne zvýšenie odolnosti sérovej kalcifikácie sa zistilo po 3 mesiacoch na CiaHD (206 ± 56 až 242 ± 56 min P < 0,001), ale nie po prechode späť na acetát (252 ± 63 až 243 ± 64 min n = 44 P = 0,29). CiaHD, Δ sérový fosfát a Δ albumín, ale nie Δ ionizovaný vápnik a horčík boli najsilnejšími determinantmi zmeny T50. Pod T50 sa počas 3 mesiacov CiaHD významne zmenil iba sérový albumín, ale nie fosfát.

Záver: Dialýza CiaHD priaznivo ovplyvnila sklon ku kalcifikácii meraný testom T50. Je potrebné ďalej skúmať, či má táto liečba, nad rámec zavedenej liečby zameranej na fosfáty, potenciál trvalo nakloniť rovnováhu smerom k viac antikalcifikátnemu prostrediu séra.


Sklon sérovej kalcifikácie a riziko kardiovaskulárnej úmrtnosti a úmrtnosti zo všetkých príčin v bežnej populácii: Štúdia PREVEND

Cieľ: Kalcifikácia ciev prispieva k vzniku kardiovaskulárnych ochorení. Doba dozrievania kalciproteínových častíc (T50) v sére, miera sklonu ku kalcifikácii, bola spojená s nepriaznivými výsledkami u pacientov s chronickým ochorením obličiek, ale jeho úloha vo všeobecnej populácii je nejasná. Skúmali sme, či sérum T50 je spojená s kardiovaskulárnou mortalitou vo veľkej všeobecnej populačnej kohorte. Prístup a výsledky: Vzťah medzi sérovým T50 a kardiovaskulárna mortalita bola skúmaná u 6231 účastníkov kohorty PREVEND (Prevencia renálnych a vaskulárnych ochorení v konečnom štádiu). Úmrtnosť zo všetkých príčin bola sekundárnym výsledkom. Priemerný (±SD) vek bol 53±12 rokov, 50 % boli muži a priemerný sérový T50 bol 329±58 minút. Kratšie sérum T50 svedčí o vyššom sklone ku kalcifikácii. Sérum T50 bol nepriamo spojený s cirkulujúcim fosfátom, vekom, odhadovanou rýchlosťou glomerulárnej filtrácie a spotrebou alkoholu, zatiaľ čo horčík v plazme bol pozitívne spojený so sérovým T50 (PR 2 = 0,281). Počas mediánu (medzikvartilné rozmedzie) sledovania počas 8,3 (7,8-8,9) rokov zomrelo 364 pacientov (5,8 %), z ktorých 95 (26,1 %) zomrelo na kardiovaskulárne príčiny. V multivariabilných Coxových modeloch proporcionálneho rizika sa každých 60 minút znižuje T v sére50 bola nezávisle spojená s vyšším rizikom kardiovaskulárnej mortality (plne upravený pomer rizika [95 % CI], 1,22 [1,04-1,36], P=0,021). Táto asociácia bola modifikovaná stratifikovanou analýzou diabetes mellitus, ktorá ukázala výraznejšiu asociáciu u jedincov s diabetes mellitus.

Závery: Sérum T50 je nezávisle spojená so zvýšeným rizikom kardiovaskulárnej mortality vo všeobecnej populácii, a preto môže byť skorým a potenciálne modifikovateľným rizikovým markerom kardiovaskulárnej mortality.

Kľúčové slová: asociácia sklon ku kalcifikácii (T50) kalciproteínové častice kardiovaskulárne choroby diabetes mellitus úmrtnosť populácia.


Pacienti s pokročilým chronickým ochorením obličiek a vaskulárnou kalcifikáciou majú veľký hydrodynamický polomer sekundárnych kalciproteínových častíc

Pozadie: Veľkosť sekundárnych kalciproteínových častíc (CPP2) a rýchlosť transformácie (T50) z primárnych kalciproteínových častíc (CPP1) na CPP2 v sére môže byť spojená s vaskulárnou kalcifikáciou (VC) u pacientov s chronickým ochorením obličiek (CKD).

Metódy: Vyvinuli sme vysoko výkonný test na mikrodoštičkách s použitím dynamického rozptylu svetla (DLS) na meranie transformácie CPP1 na CPP2, hydrodynamického polomeru (Rh) CPP1 a CPP2, T50 a agregácie CPP2. Tento test DLS sme použili na testovanie hypotézy, že veľké Rh CPP2 a/alebo rýchly T50 sú spojené s VC u 45 účastníkov s CKD štádiami 4-5 (22 bez VC a 23 s VC) a 17 zdravých dobrovoľníkov (HV) . VC bola definovaná ako skóre Kauppila >gt6 alebo skóre Adragao ≥3.

Výsledky: Účastníci CKD s VC mali väčšie kumulanty Rh CPP2 <370 nm [interkvartilový rozsah (IQR) 272-566]>v porovnaní s účastníkmi CKD bez VC [212 nm (IQR 169-315)] a v porovnaní s HV [168 nm (IQR 145 -352), P < 0,01 pre každý]. Viac CPP2 bolo v súhrne u účastníkov CKD s VC ako u účastníkov bez VC (70 % oproti 36 %). Pravdepodobnosť, že sa VC zvýši o 9 % s každým zvýšením Rh CPP2 o 10 nm, po úprave podľa veku, cukrovky, sérového vápnika a fosfátu [pomer pravdepodobnosti 1,09, 95 % interval spoľahlivosti (CI) 1,03, 1,16, P = 0,005 ]. Plocha pod krivkou prevádzkovej charakteristiky prijímača pre VC veľkosti CPP2 bola 0,75 (95 % CI 0,60, 0,90). T50 bol podobný u účastníkov CKD s a bez VC, hoci obe skupiny mali nižší T50 ako HV.

Závery: Rh CPP2, ale nie T50, je nezávisle spojená s VC u pacientov s CKD štádiami 4-5.

Kľúčové slová: sklon ku kalcifikácii kalciproteínové častice chronické ochorenie obličiek metabolizmus minerálov vaskulárna kalcifikácia.

© Autor(i) 2018. Vydalo Oxford University Press v mene ERA-EDTA. Všetky práva vyhradené.


Výsledky a diskusia

Predikcia a experimentálna detekcia spektrálneho izotopového efektu v PYP

Výmena atómu vodíka vo vodíkovej väzbe za deutérium mierne mení silu interakcie vodíkovej väzby. Vo vode sú vodíkové väzby slabšie ako väzby deutéria o 𢏀,6 kJ/mol, čo zodpovedá 5% oslabeniu (28,29). Na rozdiel od toho experimentálne štúdie v plynnej fáze na malých molekulách a výpočtové štúdie odhalili, že iónové vodíkové väzby sa vyznačujú opačným účinkom, pričom väzba deutéria je o 𢏅% slabšia (29,30). Účinok výmeny vodík/deutérium (H/D) na silu vodíkových väzieb je založený na jemných zmenách vo vibračných režimoch intramolekulárnych donor-akceptor naprieč vodíkovou väzbou, čo vedie k opačným účinkom na výmenu H/D za neutrálne verzus iónové vodíkové väzby ( 29,30). Vplyv H/D výmeny na silu vodíkových väzieb sa prejavuje aj v zmene geometrie vodíkových väzieb, čo je Ubbelohdeho efekt (31). Nedávno ab initio výpočty odhalili takýto efekt pre pVodíkové väzby CA-bočného reťazca na aktívnom mieste na PYP (32).

Na základe empirickej závislosti λmax PYP na sile vodíkovej väzby medzi zvyškom 46 a pCA a hlásené účinky výmeny H/D na silu vodíkových väzieb, vplyv výmeny H/D bočného reťazca Glu-46 na λmax PYP možno predpovedať. Pretože Glu-46-pVodíková väzba CA je iónová, a preto sa očakáva, že bude oslabená pri výmene H/D, a pretože oslabený Glu-46-pCA vodíková väzba vedie k červenému posunu, očakávame, že λmax PYP v D2O je mierne červený posun. Hovoríme o zmenách polohy vrcholu elektronického prechodu λmax pri H/D výmene ako spektrálny izotopový efekt (SIE).

Odhad veľkosti tohto SIE pCA možno získať, ak dôjde k zmene sily vodíkovej väzby pri výmene H/D (ΔHBSH/D) a posun v λmax spôsobené zmenou pevnosti vodíkových väzieb (Δλmax, HBS) sú známe: SIE = ΔHBSH/D × Δλmax, HBS.

Odhadujeme závislosť λmax Hh PYP na sile vodíkovej väzby medzi zvyškom 46 a pCA na základe spektrálnych posunov spôsobených mutáciami E46Q a E46V (23�). Mutácia E46Q spôsobuje červený posun 14 nm (zo 446 na 460 nm). Používame aproximáciu, že mutácia E46Q znižuje silu vodíkových väzieb medzi pCA a zvyšok 46 na polovicu (odhadom � kJ/mol, t.j. polovica typickej iónovej vodíkovej väzby, pozri nižšie), čo zodpovedá červenému posunu 721਌m 𢄡 v λmax pre �਌m 𢄡 zníženie pevnosti vodíkovej väzby (pozri tabuľku 1). Tieto údaje poskytujú hodnotu pre Δλmax, HBS 𢏀,6 nm červeného posunu na 1 kJ/mol straty pevnosti vodíkovej väzby. Podobný odhad sa získa, keď sa posunie 32 nm λmax po úplnom odstránení tejto vodíkovej väzby (odhadom � kJ/mol) v E46V sa uvažuje PYP. Na základe publikovaných výsledkov (29) používame hodnotu 5 % zníženia sily iónovej vodíkovej väzby medzi zvyškom 46 a pCA pri výmene H/D. Preto 5 % zníženie (2,5 kJ/mol) sily Glu-46-pOčakáva sa, že vodíková väzba CA spôsobená výmenou H/D bude mať za následok 𢏁,5 nm červený posun v λmax PYP. Experimentálne sme testovali túto predpoveď pre vysoko študovaný PYP z Hh PYP a nedávno identifikovaný PYP z extrémne halofilnej baktérie Sr PYP, o ktorej sa zistilo, že vykazuje výrazne odlišné spektrálne a kinetické vlastnosti (12, 17).

Stôl 1

Experimentálne pozorované posuny v maximách absorbancie Sr PYP a Hh PYP a ich mutantov E46Q spôsobených výmenou H/D v porovnaní s predbežnými odhadmi sily vodíkovej väzby medzi pCA a zvyšok 46

ProteínMaximálna absorpcia Predbežný odhad pSila CA-rezidua 46 HB a
nmcm 𢄡 kJ/molcm 𢄡
Sr PYP
H2O431.823,158504,179
D2O437.122,87847.73,970
Δ H/D exch5.32802.5209
Sr E46Q PYP
H2O455.121,973252,089
D2O457.821,84323.81,989
Δ H/D exch2.71301.3100
Δ mutáciou23.31,185252,090
Hh PYP
H2O445.722,436453,761
D2O447.522,346433,594
Δ H/D exch1.8902167
Hh E46Q PYP
H2O460.521,715231,922
D2O461.521,668221,839
Δ H/D exch1.047183
Δ mutáciou14.8721221,880

Stanovili sme vplyv výmeny H/D na absorbančné spektrum PYP meraním UV/vis absorbančných spektier Hh PYP a Sr PYP v pufrovanom H2O a D2O roztoky (pH 7,0). Toto meranie odhalilo malé, ale merateľné posuny v absorbančných spektrách oboch Hh PYP a Sr PYP (obr.ਂ, tabuľka 1). Prvé deriváty absorbančných spektier sa použili na extrakciu presných polôh píkov chromoforových absorbančných pásov. Táto kvantifikácia SIE v Hh PYP a Sr PYP priniesla dve kľúčové pozorovania. Po prvé, λmax Hh PYP pri 445,7 nm vykazuje červený posun 1,8 nm v D2O (obr.ਂ), v súlade s predchádzajúcimi výsledkami (33). Po inkubácii v D2O a výsledná H/D výmena, the λmax Sr PYP pri 431,8 nm je červený posunutý o 5,3 nm (obr.ਂ). Pre oba PYP sa teda pozoruje SIE. Smer tohto SIE je v súlade s posunom očakávaným pre iónovú vodíkovú väzbu odvodenú predtým. Tento efekt označujeme ako invertovaný SIE, pretože je opakom toho, čo by sa očakávalo pri štandardnej vodíkovej väzbe. Po druhé, obrátený SIE pre Sr PYP je väčší o faktor tri v porovnaní s obráteným SIE pre Hh PYP.

Spektrálne izotopové účinky v PYP. UV/VIS absorpčné spektrá PYP z S. ruber (dve horné krivky) a H. halophila (spodné dve krivky) a mutant E46Q Sr PYP (stredné dve krivky) v H2O (čierna) a D2O (červená). Posuny v pásoch absorbancie chromoforov po rozpustení proteínov v D2O sú označené. Ak chcete vidieť tento obrázok vo farbe, prejdite online.

Priradenie a analýza SIE ku Glu-46-pCA vodíková väzba

Ako prvý krok k pevnému priradeniu H/D výmennej skupiny zodpovednej za pozorovaný invertovaný SIE v PYP si všimneme, že ionizované pMolekula CA v PYP neobsahuje ziadne vymenitelne protony (pozri obr.ਁ). Preto akékoľvek posuny v λmax pri výmene H/D sú spôsobené nepriamymi účinkami prostredníctvom interakcií medzi pCA a bočný reťazec a/alebo hlavný reťazec OH/NH skupín v proteíne, ktoré podliehajú výmene H/D. Jednou z možností je, že pozorovaný SIE je kumulatívnym výsledkom viacerých veľmi malých účinkov spôsobených udalosťami výmeny H/D na mnohých miestach. Alternatívnym vysvetlením je, že pozorovaný SIE je spôsobený vymeniteľnou skupinou, ktorá priamo interaguje s pCA. Nižšie explicitne zvažujeme tieto dve možnosti.

Účinky mutácií na λmax Hh PYP sa študovalo prostredníctvom miestne cielených mutácií na 22 zvyškoch vybraných na základe kryštálovej štruktúry PYP (zhrnuté v (12)), umiestnením každého z 19 možných bočných reťazcov do polohy 46 (25, 26) a kompletného alanínu skenovanie PYP (34). Poruchy spôsobené týmito mutáciami majú vo všeobecnosti tendenciu spôsobiť malé spektrálne posuny smerom k modrej aj červenej strane spektra. Je pozoruhodné, že zďaleka najväčší posun je spôsobený substitúciami v polohe 46, čo znamená, že tento zvyšok hrá nezvyčajnú úlohu v spektrálnom ladení PYP. Na základe týchto údajov by sa dalo očakávať, že v prípade, že podstatný počet udalostí H/D výmeny ovplyvní λmax Sr PYP, tieto nezávislé malé efekty by spôsobili malé posuny λmax tak smerom k modrej, ako aj k červenej, a preto by sa do značnej miery rušili (Δλmax𢒀). Ďalšou úvahou je, že je známe, že termodynamická stabilita proteínov proti rozvinutiu je mierne ovplyvnená výmenou H/D (35). V systematických štúdiách mutácií Hh PYP sa však nezistila žiadna korelácia medzi termodynamickou stabilitou mutantu a jeho λmax (34). To znamená, že stabilita PYP proti rozvinutiu nie je mechanizmom zapojeným do spektrálneho ladenia v tomto proteíne, a preto sa neočakáva, že by malá zmena v jeho stabilite spôsobená výmenou H/D zmenila jeho λmax. Tieto úvahy argumentujú proti vysvetleniu pozorovaného SIE na základe malých posunov v λmax spôsobené udalosťami výmeny H/D na viacerých rôznych miestach.

Pri zvažovaní možného pôvodu SIE pri výmene H/D skupiny vo vrecku viažucom proteíny pCA je potrebné poznamenať, že slabé interakcie medzi chromoforom a proteínom, ako je vodíková väzba a protiióny, sú svojou povahou elektronické, zatiaľ čo výmena H/D je jadrová porucha, ktorá nemení elektronickú štruktúru. V prípade vodíkovej väzby H/D výmena spôsobí 𢏅% zmenu sily interakcie. Slabá interakcia, ktorá je ovplyvnená výmenou H/D, ktorá vedie k pozorovanej SIE, by teda musela mať podstatný vplyv λmax. Na základe kryštálovej štruktúry PYP bol postranný reťazec Arg-52 pôvodne navrhnutý ako protiión pre záporne nabitý pCA (36). Následné štúdie na mutantoch R52A a R52Q však odhalili len relatívne malé účinky na obe λmax a pKa z pCA. Na základe malých účinkov oveľa dramatickejších mutácií R52A a R52Q na absorbančné spektrum PYP sme dospeli k záveru, že účinok výmeny H/D Arg-52 by bol príliš slabý na to, aby spôsobil pozorovanú SIE.To ponecháva fenolovú OH skupinu Tyr-42 a COOH skupinu Glu-46 ako kandidátske mutácie na oboch zvyškoch, ktoré majú relatívne silné účinky na λmax Hh PYP. Okrem toho základná NH skupina Cys-69, ktorá tvorí vodíkovú väzbu medzi karbonylovým kyslíkom pCA je kandidátom na H/D výmennú skupinu, ktorá prispieva k pozorovaným meraniam NMR publikovaným SIE (37), ktoré naznačujú, že amid hlavného reťazca Cys-69 skutočne podstúpi H/D výmenu za podmienok tu použitých. Bočný reťazec Glu-46 je najpravdepodobnejšou možnosťou, pretože SIE predpovedaná na základe predtým odvodenej H/D výmeny tohto bočného reťazca sa celkom dobre zhoduje s pozorovaným účinkom.

Experimentálne otestovať možnosť, že významný SIE v Sr PYP je spôsobený vodíkovými väzbami pCA s Tyr-42 alebo Glu-46 a aby sme rozobrali príspevky týchto dvoch interakcií k SIE, pripravili sme mutanty Y42F a E46Q Sr PYP. Tieto mutanty silne zmenšujú svoju vodíkovú väzbu k pCA, a preto by tiež znížila SIE spojenú s týmito vodíkovými väzbami. Y42F Sr PYP vykazoval veľmi nízky výťažok expresie a významnú nestabilitu, čo vylučovalo jeho čistenie pre spektroskopické štúdie. V prípade mutantu E46Q Sr PYP sme zistili červený posun 2,7 nm v jeho λmax pri 455,1 nm po inkubácii v D2O (obr.ਂ). ∼t dvojnásobné zníženie SIE E46Q Sr PYP v porovnaní s divokým typom Sr PYP dokazuje, že silná interakcia vodíkových väzieb medzi Glu-46 a pCA sa priamo podieľa na tomto efekte. Mutant E46Q je obzvlášť atraktívny variant na štúdium SIE v PYP, pretože je známe, že spôsobuje iba lokálne poruchy v pVrecko na viazanie CA (20,22). Ďalší dôkaz pre toto priradenie poskytujú podobnosti v správaní SIE v Sr PYP a Hh PYP, ktoré zdieľajú iba 28% identitu aminokyselinovej sekvencie, ale zachovávajú si funkčne dôležité zvyšky aktívneho miesta: pre oba PYP i), λmax v D2O je posunuté smerom k červenej a ii), SIE je podstatne znížená SIE mutáciou E46Q (obr.ਂ a tabuľka 1).

Štrukturálne a spektroskopické štúdie poskytujú rámec pre interpretáciu týchto spektroskopických údajov a naznačujú dva faktory, ktoré sú dôležité pre pochopenie obráteného SIE PYP. Prvým faktorom je, že vodíkové väzby Tyr-42 a Glu-46 s pCA sú krátke. Röntgenové kryštalografické štúdie s rozlíšením 0,82 a 1,00 Å odhalili, že vodíkové väzby bočných reťazcov Glu-46 a Tyr-42 k pCA chromofór je 2,6 a 2,5 Å (13,20) (obr.ਁ B), a preto sú výrazne kratšie ako štandardné vodíkové väzby. Neutrónové difrakčné štúdie potvrdili prítomnosť týchto krátkych vodíkových väzieb (38,39). Nezávislé informácie o prítomnosti týchto silných krátkych vodíkových väzieb s pCA bola získaná infračervenou spektroskopiou s Fourierovou transformáciou C=O napínacieho módu bočného reťazca Glu-46 v Hh PYP (14,15) a NMR spektroskopiou protónových NMR signálov Tyr-42 a Glu. -46 (21). Druhou úvahou je, že bočné reťazce Tyr-42 a Glu-46 sú neutrálne, zatiaľ čo pCA v PYP je ionizovaná (40). Záporne nabitý fenolický kyslík v pCA interaguje s neutrálnymi bočnými reťazcami Tyr-42 a Glu-46 prostredníctvom vidlicovej iónovej vodíkovej väzby (13,20,39). Krátka dĺžka a iónový charakter Glu-46-pVodíkové väzby CA sú vo vynikajúcej zhode s priradením SIE k tejto interakcii.

Úloha vodíkovej väzby medzi hlavnou NH skupinou Cys-69 a karbonylovým kyslíkom pCA v spektrálnom ladení PYP je ťažké priamo študovať, pretože atóm hlavného reťazca zapojeného Cys-69 nemožno zmeniť miestne cielenou mutagenézou. Okamoto etਊl. (41,42) pristúpili k tomuto problému prostredníctvom použitia modelových zlúčenín, ktoré kombinujú a pCA časť so zlúčeninami buď schopnými alebo neschopnými vytvárať 7-členný kruh prostredníctvom intramolekulárnych vodíkových väzieb. Merania týchto deprotonovaných modelových zlúčenín chromofóru v aprotickom rozpúšťadle (tetrahydrofuráne) odhalili, že prerušenie tejto vodíkovej väzby posúva maximum absorbancie modelovej zlúčeniny z � nm na � nm (pozri obr. a a b v (41)). Tieto výsledky naznačujú, že vodíková väzba Cys-69-chromofóru v PYP prispieva k jeho relatívne červenému posunutému maximu absorbancie pri 446 nm v natívnom proteíne. Toto zistenie naznačuje, že zvýšenie pevnosti vodíkovej väzby medzi pCA a amidová skupina hlavného reťazca Cys-69 vedie k červenému posunu v λmax PYP. Keďže táto vodíková väzba má štandardnú dĺžku blízko 2,8 Å a pretože väčšina negatívneho náboja deprotonovaného chromofóru v PYP je sústredená v blízkosti fenolického kyslíka, pVodíková väzba CA-Cys-69 je štandardného typu. Preto jeho výmena H/D povedie k malému zvýšeniu jeho sily, čo by sa dalo očakávať, že spôsobí malý červený posun λmax PYP pri výmene H/D. Pretože tento posun je v smere, ktorý sme pozorovali experimentálne, musíme zvážiť príspevok tohto účinku k SIE v PYP.

Na základe predpokladu, že výsledky pre predchádzajúce modelové zlúčeniny sú priamo aplikovateľné na PYP, narušenie Cys-69-pVodíková väzba CA spôsobuje modrý posun 840਌m 𢄡 (od 430 do 415 nm), zatiaľ čo narušenie Glu-46-pVodíková väzba CA (v E46I PYP) spôsobuje červený posun 1501਌m 𢄡 (zo 446 na 478 nm). Táto úvaha naznačuje, že účinok Glu-46-pCA vodíková väzba na λmax PYP je podstatne silnejší ako Cys-69-pCA vodíková väzba. V prípade mutantu E46Q Hhal PYP je vodíková väzba medzi zvyškom 46 predĺžená o 11 % (z 2,58 na 2,87 Å), zatiaľ čo Cys-69-pCA sa predĺži o 3 % (z 2,72 na 2,80 Å). Táto analýza podporuje interpretáciu, že znížený SIE v E46Q PYP je do značnej miery spôsobený oslabením vodíkovej väzby medzi pCA a zvyšok 46. Dospeli sme k záveru, že možný príspevok Cys-69-pVodíková väzba CA k pozorovanej SIE v PYP neovplyvňuje naše priradenie veľkej časti tohto účinku k Glu-46-pCA vodíková väzba.

Pozorovanie, že invertovaný SIE pre Sr PYP je výrazne väčší ako pre Hh PYP, vedie k návrhu, že Glu-46-pVodíková väzba CA v Sr PYP je silnejšia ako v Hh PYP. To by bolo neočakávané, pretože v Hh PYP je táto vodíková väzba už dosť silná a krátka (13,20,21,39). Túto interpretáciu priamo podporujú dve úvahy. Po prvé, λmax Sr PYP je výrazne modrý posun v porovnaní s Hh PYP. Zvýšenie sily Glu-46-pOčakáva sa, že vodíková väzba CA spôsobí takýto modrý posun. Po druhé, mutácia E46Q spôsobuje silný červený posun 1185਌m 𢄡 v λmax Sr PYP pri 457,8 nm (obr.ਂ) v porovnaní s menším červeným posunom 721਌m 𢄡 spôsobeným rovnakou mutáciou v Hh PYP (23,24). Tieto výsledky podporujú názor, že rozsah SIE v PYP odráža silu iónovej vodíkovej väzby medzi Glu-46 a pCA. Na obr.ਃ zhrnieme spektroskopický odpočet sily iónovej vodíkovej väzby medzi zvyškom 46 a pCA na aktívnom mieste PYP prostredníctvom obráteného SIE.

Účinky výmeny H/D na silu vodíkovej väzby v aktívnom mieste a maximum absorbancie v PYP. Odhadované oslabenie vodíkovej väzby medzi zvyškom 46 a chromoforom po výmene H/D a výsledný experimentálne zistený červený posun maxima absorbancie sú znázornené pre PYP z Salinibacter ruber a jeho mutant E46Q.

Klasifikácia vodíkových väzieb s kvalitatívne odlišnými vlastnosťami

V súčasnosti sa diskutuje o najužitočnejšej klasifikácii interakcií vodíkových väzieb v proteínoch. Niektorí autori navrhli klasifikáciu založenú na sile vodíkových väzieb so silnými (60� kJ/mol), strednými (15� kJ/mol) a slabými (㰕 kJ/3 vodíkovými väzbami ). Iní zdôraznili tvar potenciálu vodíkovej väzby ako dvojitá jamka, jedna jamka a LBHB (44). Ďalšia klasifikácia, zavedená v štúdiách o úlohe vodíkových väzieb C-H⋅⋅⋅O, sa zameriava na typ atómu, ku ktorému je pripojený atóm vodíka tvoriaci vodíkovú väzbu (6). Najmä úloha, ktorú zohrávajú iónové vodíkové väzby (7, 45), v ktorých je prítomný čistý náboj na páre donor-akceptor vodíkovej väzby, v proteínoch zostáva nejasná.

Na základe tu uvedených výsledkov v kombinácii s analýzou množstva biofyzikálnych údajov dostupných o PYP (pozri (8,9)) a čerpaním z veľkého množstva dostupných informácií o vodíkových väzbách (7,43,45) navrhujeme, aby je užitočné rozlíšiť tri kvalitatívne odlišné typy vodíkových väzieb zahŕňajúcich atómy N a O (obr.਄). Na základe publikovanej literatúry (7,43,45) možno tieto vodíkové väzby rozlíšiť podľa ich správania pozdĺž dvoch kľúčových reakčných súradníc. Po prvé, vzdialenosť medzi heteroatómami v páre donor-akceptor vodíkovej väzby definuje dĺžku a silu vodíkovej väzby (obr.਄ A). Po druhé, poloha protónu medzi týmito dvoma heteroatómami opisuje prenos protónov po vodíkovej väzbe (obr.਄ B). Tento prístup vedie k nasledujúcim trom typom vodíkových väzieb: i), štandardným vodíkovým väzbám, ako sú tie, ktoré držia spolu α-helixy s dĺžkou blízkou 2,8 Å a typickou silou � kJ/mol (43) ii), iónové vodíkové väzby, s dĺžkou blízkou 2,6 Å a typická pevnosť blízko 50 kJ/mol (7,45) a iii), LBHB s dĺžkou blízkou 2,4 Å a typickou silou � kJ/mol (5,7). Aj keď sú dĺžky týchto troch typov vodíkových väzieb celkom dobre definované, ich energie sa pravdepodobne budú podstatne líšiť v závislosti od chemických detailov a molekulárneho prostredia vodíkovej väzby. Z týchto troch typov vodíkových väzieb pôsobí iba LBHB ako systém jednej jamky na prenos protónov. Táto analýza naznačuje, že prítomnosť krátkej iónovej vodíkovej väzby sa líši od LBHB. Silné krátke vodíkové väzby, na ktoré sa často odkazuje v rôznych proteínových systémoch (napr. (46)), teda môžu v skutočnosti zahŕňať dva odlišné typy vodíkových väzieb.

Rozdiel medzi tromi typmi vodíkových väzieb. Vzdialenosť medzi heteroatómami v páre donor-akceptor vodíkovej väzby (A) definuje rovnovážnu dĺžku a silu vodíkových väzieb, pričom polohu protónu pozdĺž tejto vodíkovej väzby (B) určuje potenciálnu energiu na prenos protónov medzi donorom a akceptorom vodíkovej väzby. Tieto dve reakčné súradnice vedú k rozlíšeniu medzi normálnymi vodíkovými väzbami (NHB) s dĺžkou 3,00 (ଐ,20) Å, iónovou vodíkovou väzbou (IHB) s dĺžkou 2,72 (ଐ,10) & #x000c5 a vodíkové väzby s nízkou bariérou (LBHB) s dĺžkou 2,46 (ଐ.03) Å. Znázornené krivky potenciálnej energie majú odrážať kvalitatívne rozdiely medzi tromi typmi vodíkových väzieb, pričom zobrazujú fyzikálne primerané hodnoty. Kvantitatívne informácie o tvaroch týchto energetických krajín boli získané z (52�). Aj keď sú iónové vodíkové väzby a LBHB značne silnejšie ako štandardné vodíkové väzby, hodnoty ich sily sú menej dobre definované a pravdepodobne sa budú značne líšiť v závislosti od detailov chemickej povahy páru donor-akceptor a ich fyzikálneho prostredia. Rovnako presné hodnoty pre bariéry a energetické rozdiely pre prenos protónov v paneli B sú určené na ilustráciu rozdielov medzi tromi typmi vodíkových väzieb, absolútne energie správnych jamiek a úrovne vibrácií slúžia na ilustračné účely. Zobrazené hodnoty boli zvolené tak, aby odrážali vodíkové väzby zahŕňajúce O (a N) heteroatómy. Normálne vodíkové väzby sa v proteínoch vyskytujú hojne. Iónové vodíkové väzby sa nachádzajú na niektorých aktívnych miestach a často sa vyskytujú na povrchu proteínu. LBHB sú zriedkavé a často sú prítomné na aktívnom mieste proteínu.

Význam iónových vodíkových väzieb pre proteíny

Hodnotu predchádzajúcej klasifikácie vodíkových väzieb ilustruje nedávna diskusia o funkčne dôležitej a krátkej vodíkovej väzbe na aktívnom mieste PYP: rôzne výskumné skupiny uviedli, že táto vodíková väzba je (39) alebo nie je (38,47). ) a LBHB. Navrhujeme, že pravda je pravdepodobne medzi tým, konkrétne, že táto aktívna vodíková väzba je silná, iónová vodíková väzba bez toho, aby bola LBHB, t. j. druhá trieda vodíkových väzieb znázornená na obr.਄. Tento návrh uvádza do súladu krátku dĺžku vodíkovej väzby s vibračnou spektroskopiou, ktorá ukazuje, že v tmavom stave PYP je bočný reťazec Glu-46 protónovaný (14, 15), zatiaľ čo pCA je ionizovaná a je v súlade s nedávnymi výpočtovými výsledkami (47).

Iónové vodíkové väzby v proteínoch sú veľmi biologicky zaujímavé. Sú podstatne kratšie a často oveľa silnejšie ako štandardné vodíkové väzby (7,45) a predpokladá sa, že sú dôležitými znakmi na aktívnych miestach radu proteínov, vrátane zeleného fluorescenčného proteínu (48), serínovej proteázy (49) HIV proteáza (50), acetylcholínesteráza, ketosteroid izomeráza (46) a PYP (39,47). Až donedávna sa však tieto štruktúrne a spektroskopické výsledky často interpretovali bez toho, aby sa brali do úvahy nezvyčajné vlastnosti iónovej vodíkovej väzby. Relevantným príkladom je, že vodíkové väzby medzi pCA a bočné reťazce Tyr-42 a Glu-46 boli opísané ako nezvyčajne krátke (20, 38). Dĺžka týchto vodíkových väzieb je však taká, aká by sa dala očakávať pre iónovú vodíkovú väzbu, a preto je neobvyklá iba vtedy, ak sa vlastnosti týchto vodíkových väzieb zvažujú v rámci štandardných vodíkových väzieb. Jedinečné vlastnosti iónových vodíkových väzieb sú tiež zodpovedné za inverznú povahu SIE, ktorá je tu uvedená.

Tu uvádzame a priraďujeme SIE v spektre elektronickej absorbancie bakteriálneho receptora modrého svetla PYP. Predtým boli malé posuny v absorbančných vrcholoch PYP (33) a zeleného fluorescenčného proteínu (51) hlásené ako neinterpretované pozorovania. Poskytujeme koncepčný rámec na pochopenie takýchto spektrálnych izotopových účinkov, uvádzame experimentálne priradenie invertovaného SIE k iónovému Glu-46-pCA vodíková väzba a demonštrujú, ako možno účinky SIE použiť ako spektroskopické odčítanie prítomnosti a sily takýchto iónových vodíkových väzieb. Stanovenie sily vodíkových väzieb v proteínoch zostáva dôležitou výzvou v biofyzike proteínov a hodnoty uvedené v tabuľke 1 sú predbežné odhady. Tu prezentované výsledky a analýzy však umožňujú pevné priradenie a analýzu SIE v PYP a upozorňujú na dôležitosť rozlišovania medzi iónovými a LBHB interakciami. Výsledky budú pravdepodobne široko aplikovateľné na systémy, ktoré vykazujú predvídateľné spektrálne posuny v elektronickom prechode po zmenách vo vodíkových väzbách a naznačujú, že invertovaný SIE poskytuje podľa našich vedomostí nový nástroj na skúmanie iónových vodíkových väzieb. Vo všeobecnosti sa SIE očakáva pre všetky fotoreceptory, v ktorých λmax skúmaného fotoreceptora je ovplyvnená vodíkovými väzbami medzi chromoforom a skupinami v jeho väzbovom vrecku, alebo presnejšie, že 𢏅% zmena sily vodíkovej väzby v aktívnom mieste vedie k merateľnej zmene λmax. Keď je známy vzťah medzi silou vodíkovej väzby medzi chromoforom a touto H/D výmennou skupinou, SIE poskytuje priame spektroskopické odčítanie relatívnej sily vodíkovej väzby oproti zapojenej deutériovej väzbe. Pre iónové vodíkové väzby sa očakáva oslabenie sily interakcie pri H/D výmene premosťujúceho vodíka vo vodíkovej väzbe.


Obsah

Pri gramnegatívnych baktériách, ako napr Escherichia coli (E. coli), alkalická fosfatáza sa nachádza v periplazmatickom priestore, mimo vnútornej bunkovej membrány a v peptidoglykánovej časti bunkovej steny. Pretože periplazmatická medzera je náchylnejšia na zmeny prostredia ako vnútorná bunka, alkalická fosfatáza je vhodne odolná voči inaktivácii, denaturácii alebo degradácii. Táto vlastnosť enzýmu je pre mnohé iné proteíny neobvyklá. [10]

Presná štruktúra a funkcia štyroch izozýmov (Int E.coli) sú určené výhradne na dodávanie zdroja anorganického fosfátu, keď v prostredí chýba tento metabolit. Tieto štyri enzýmy sú závislé od miesta expresie tkaniva. Štyri miesta tkanivovej expresie sú intestinálny ALP, placentárna ALP, zárodočná bunková ALP a pečeň/kosť/obličky ALP. [11] Anorganické fosfáty produkované týmito izoenzýmami sa potom viažu na nosné proteíny, ktoré dodávajú anorganické fosfáty do špecifického vysokoafinitného transportného systému, známeho ako Pst systém, ktorý transportuje fosfát cez cytoplazmatickú membránu. [12]

Zatiaľ čo vonkajšia membrána z E. coli obsahuje poríny, ktoré sú priepustné pre fosforylované zlúčeniny, vnútorná membrána nie. Potom vzniká problém, ako transportovať takéto zlúčeniny cez vnútornú membránu a do cytosolu. So silným aniónovým nábojom fosfátových skupín spolu so zvyškom zlúčeniny sú určite veľmi nemiešateľné v nepolárnej oblasti dvojvrstvy. Riešenie vzniká pri odštiepení fosfátovej skupiny od zlúčeniny prostredníctvom ALP. V skutočnosti, spolu so sprievodnou zlúčeninou, na ktorú bol fosfát naviazaný, tento enzým poskytuje čistý anorganický fosfát, ktorý môže byť v konečnom dôsledku zacielený transportným systémom špecifickým pre fosfát (Pst systém) [13] na translokáciu do cytosólu. [14] Hlavným účelom defosforylácie alkalickou fosfatázou je teda zvýšiť rýchlosť difúzie molekúl do buniek a inhibovať ich difúziu von. [15]

Alkalická fosfatáza je dimérny enzým obsahujúci zinok s molekulovou hmotnosťou: 86 000 Da, pričom každá podjednotka obsahuje 429 aminokyselín so štyrmi cysteínovými zvyškami spájajúcimi dve podjednotky.[16] Alkalická fosfatáza obsahuje štyri ióny Zn a dva ióny Mg, pričom Zn zaberá aktívne miesta A a B a Mg zaberá miesto C, preto sa plne aktívna natívna alkalická fosfatáza označuje ako (ZnAZnBMgC)2 enzým. Mechanizmus účinku alkalickej fosfatázy zahŕňa geometrickú koordináciu substrátu medzi iónmi Zn v aktívnych miestach, zatiaľ čo miesto Mg sa nezdá byť dostatočne blízko na to, aby sa priamo podieľalo na mechanizme hydrolýzy, môže však prispieť k tvar elektrostatického potenciálu okolo aktívneho centra. [16] Alkalická fosfatáza má Km 8,4 x 10 −4. [17]

Alkalická fosfatáza v E. coli je menej často rozpustný a aktívny pri zvýšených teplotách, ako je 80 °C. V dôsledku kinetickej energie indukovanej touto teplotou sa slabé vodíkové väzby a hydrofóbne interakcie bežných proteínov degradujú, a preto sa spájajú a precipitujú. Avšak po dimerizácii ALP sú väzby, ktoré si zachovávajú svoje sekundárne a terciárne štruktúry, účinne pochované tak, že pri tejto teplote nie sú natoľko ovplyvnené. Navyše, dokonca aj pri vyšších teplotách, ako je 90 °C, má ALP nezvyčajnú vlastnosť reverzná denaturácia. Vďaka tomu, zatiaľ čo ALP nakoniec denaturuje pri teplote asi 90 °C, má pridanú schopnosť presne reformovať svoje väzby a vrátiť sa k svojej pôvodnej štruktúre a funkcii po opätovnom ochladení. [10]

Alkalická fosfatáza v E. coli sa nachádza v periplazmatickom priestore a môže sa tak uvoľniť pomocou techník, ktoré oslabia bunkovú stenu a uvoľnia proteín. Kvôli umiestneniu enzýmu a proteínovému usporiadaniu enzýmu je enzým v roztoku s menším množstvom proteínov, ako je v inej časti bunky. [18] Tepelnú stabilitu proteínov možno využiť aj pri izolácii tohto enzýmu (prostredníctvom tepelnej denaturácie). Okrem toho môže byť alkalická fosfatáza testovaná pomocou p-nitrofenylfosfátu. Reakcia, pri ktorej alkalická fosfatáza defosforyluje nešpecifický substrát, p-nitrofenylfosfát, aby sa vytvoril p-nitrofenol (PNP) a anorganický fosfát. Žltá farba PNP a jeho λmax na 410 umožňuje spektrofotometriu určiť dôležité informácie o enzymatickej aktivite. [19] Niektoré zložitosti bakteriálnej regulácie a metabolizmu naznačujú, že pre bunku môžu zohrávať úlohu aj iné, jemnejšie účely enzýmu. V laboratóriu však mutant Escherichia coli bez alkalickej fosfatázy prežívajú celkom dobre, rovnako ako mutanti, ktorí nie sú schopní zastaviť produkciu alkalickej fosfatázy. [20]

Optimálne pH pre aktivitu E. coli enzým je 8,0 [21], zatiaľ čo optimálne pH pre hovädzí enzým je o niečo vyššie pri 8,5. [22] Alkalická fosfatáza predstavuje 6 % všetkých bielkovín v derepresívnych bunkách. [17]

Intragénna komplementácia Edit

Keď viaceré kópie polypeptidu kódovaného génom tvoria agregát, táto proteínová štruktúra sa označuje ako multimér. Keď je multimér vytvorený z polypeptidov produkovaných dvoma rôznymi mutantnými alelami konkrétneho génu, zmiešaný multimér môže vykazovať väčšiu funkčnú aktivitu ako nezmiešané multiméry tvorené každým z mutantov samostatne. V takom prípade sa jav označuje ako intragénna komplementácia. E. coli alkalická fosfatáza, dimérny enzým, vykazuje intragénnu komplementáciu. [23] Keď boli kombinované konkrétne mutantné verzie alkalickej fosfatázy, heterodimérne enzýmy vytvorené ako výsledok vykazovali vyššiu úroveň aktivity, než by sa dalo očakávať na základe relatívnych aktivít rodičovských enzýmov. Tieto zistenia ukázali, že dimérna štruktúra E.coli alkalická fosfatáza umožňuje kooperatívne interakcie medzi jednotlivými monomérmi, ktoré môžu generovať funkčnejšiu formu holoenzýmu.

Zmenou aminokyselín divokého typu enzýmu alkalickej fosfatázy produkovaného Escherichia coli vzniká mutantná alkalická fosfatáza, ktorá má nielen 36-násobné zvýšenie aktivity enzýmu, ale zachováva si aj tepelnú stabilitu. [24] Typické použitie alkalických fosfatáz v laboratóriu zahŕňa odstránenie fosfátových monoesterov, aby sa zabránilo samoligácii, ktorá je počas klonovania plazmidovej DNA nežiaduca. [25]

Bežné alkalické fosfatázy používané vo výskume zahŕňajú:

  • Krevetová alkalická fosfatáza (SAP) z druhu arktických kreviet (Pandalus borealis). Táto fosfatáza sa ľahko inaktivuje teplom, čo je užitočná vlastnosť v niektorých aplikáciách. (CIP) (PLAP) a jeho C terminálne skrátená verzia, ktorej chýba posledných 24 aminokyselín (tvoriacich doménu, ktorá sa zameriava na ukotvenie GPI membrány) – secernovanú alkalickú fosfatázu (SEAP). Predstavuje určité vlastnosti, ako je tepelná stabilita, substrátová špecifickosť a odolnosť voči chemickej inaktivácii. [26]
  • Ľudská črevná alkalická fosfatáza. V ľudskom tele je prítomných viacero typov alkalickej fosfatázy, ktoré sú determinované minimálne tromi génovými lokusmi. Každý z týchto troch lokusov riadi iný druh izoenzýmu alkalickej fosfatázy. Avšak vývoj tohto enzýmu môže byť prísne regulovaný inými faktormi, ako je termostabilita, elektroforéza, inhibícia alebo imunológia. [27]

Ľudská intestinálna ALPáza vykazuje približne 80% homológiu s hovädzou črevnou ALPázou, čo platí pre ich spoločný evolučný pôvod. Ten istý hovädzí enzým má viac ako 70% homológiu s ľudským placentárnym enzýmom. Avšak ľudský črevný enzým a placentárny enzým zdieľajú iba 20% homológiu napriek ich štruktúrnym podobnostiam. [28]

Alkalická fosfatáza sa stala užitočným nástrojom v laboratóriách molekulárnej biológie, pretože DNA normálne obsahuje fosfátové skupiny na 5' konci. Odstránenie týchto fosfátov zabraňuje ligácii DNA (5' koniec sa pripája k 3' koncu), čím sa molekuly DNA udržiavajú lineárne až do ďalšieho kroku procesu, pre ktorý sa tiež pripravujú, odstránenie fosfátových skupín umožňuje rádioaktívne značenie (náhrada rádioaktívnymi fosfátovými skupinami), aby sa zmerala prítomnosť značenej DNA prostredníctvom ďalších krokov v procese alebo experimente. Na tieto účely je najužitočnejšia alkalická fosfatáza z kreviet, pretože je najjednoduchšie ju inaktivovať, keď už splní svoju úlohu.

Ďalšie dôležité použitie alkalickej fosfatázy je ako značka pre enzýmové imunotesty.

Nediferencované pluripotentné kmeňové bunky majú zvýšené hladiny alkalickej fosfatázy na svojej bunkovej membráne, preto sa farbenie alkalickou fosfatázou používa na detekciu týchto buniek a na testovanie pluripotencie (t. j. embryonálnych kmeňových buniek alebo buniek embryonálneho karcinómu). [29]

Existuje pozitívna korelácia medzi hladinami alkalickej fosfatázy v sére (B-ALP) a tvorbou kostí u ľudí, hoci sa jej použitie ako biomarkeru v klinickej praxi neodporúča. [30]

Prebiehajúci výskum Edit

Súčasní vedci skúmajú zvýšenie tumor nekrotizujúceho faktora-α a jeho priamy účinok na expresiu alkalickej fosfatázy v bunkách hladkého svalstva ciev, ako aj to, ako alkalická fosfatáza (AP) ovplyvňuje zápalové reakcie a môže hrať priamu úlohu pri prevencii orgánov poškodenie. [31]

  • Alkalická fosfatáza (AP) ovplyvňuje zápalové reakcie u pacientov s chronickým ochorením obličiek a je priamo spojená s anémiou rezistentnou na činidlo stimulujúce erytropoézu. [32]
  • Črevná alkalická fosfatáza (IAP) a mechanizmus, ktorý používa na reguláciu pH a hydrolýzy ATP v dvanástniku potkanov. [33]
  • Testovanie účinnosti inhibítora a jeho vplyvu na IAP pri akútnom črevnom zápale, ako aj skúmanie molekulárnych mechanizmov IAP pri „zlepšení črevnej permeability“. [34]

Mliečny priemysel Edit

Alkalická fosfatáza sa bežne používa v mliekarenskom priemysle ako indikátor úspešnej pasterizácie. Je to preto, že tepelne najstabilnejšia baktéria nachádzajúca sa v mlieku, Mycobacterium paratuberculosis, je zničený teplotami nižšími, ako sú tie, ktoré sú potrebné na denaturáciu ALP. Preto je prítomnosť ALP ideálna na indikáciu neúspešnej pasterizácie. [35] [36]

Overenie pasterizácie sa zvyčajne vykonáva meraním fluorescencie roztoku, ktorý sa stáva fluorescenčným, keď je vystavený aktívnej ALP. Fluorimetrické testy požadujú výrobcovia mlieka v Spojenom kráľovstve, aby dokázali, že alkalická fosfatáza bola denaturovaná [37], keďže testy p-nitrofenylfosfátu sa nepovažujú za dostatočne presné na to, aby spĺňali zdravotné normy.

Alternatívne sa môže použiť zmena farby substrátu para-nitrofenylfosfátu v pufrovanom roztoku (Aschaffenburg Mullenov test). [38] Surové mlieko zvyčajne vytvorí žlté sfarbenie v priebehu niekoľkých minút, zatiaľ čo správne pasterizované mlieko by nemalo vykazovať žiadnu zmenu. Existujú výnimky, ako v prípade tepelne stabilných alkalických fosfatáz produkovaných niektorými baktériami, ale tieto baktérie by sa v mlieku vyskytovať nemali.

Inhibítory Edit

Všetky izoenzýmy alkalickej fosfatázy u cicavcov okrem placentárnych (PALP a SEAP) sú inhibované homoarginínom a podobným spôsobom sú všetky okrem črevných a placentárnych blokované levamizolom. [11] Fosfát je ďalší inhibítor, ktorý kompetitívne inhibuje alkalickú fosfatázu. [39]

Ďalším známym príkladom inhibítora alkalickej fosfatázy je kyselina [(4-nitrofenyl)metyl]fosfónová. [40]

V pôde kontaminovanej kovmi sú alkalické fosfatázy inhibované Cd (kadmiom). Okrem toho teplota zvyšuje inhibíciu Cd na aktivitu ALP, čo sa prejavuje narastajúcimi hodnotami Km. [41]

Fyziológia Edit

U ľudí je alkalická fosfatáza prítomná vo všetkých tkanivách v tele, ale koncentruje sa najmä v pečeni, žlčových cestách, obličkách, kostiach, črevnej sliznici a placente. V sére prevládajú dva typy izoenzýmov alkalickej fosfatázy: kostrové a pečeňové. V detstve je väčšina alkalickej fosfatázy kostného pôvodu. [42] Ľudia a väčšina ostatných cicavcov obsahujú nasledujúce izoenzýmy alkalickej fosfatázy:

    – črevné (molekulová hmotnosť 150 kDa) – tkanivovo nešpecifické (vyjadrené najmä v pečeni, kostiach a obličkách) – placentárne (Regan izoenzým)
  • ALPG – zárodočná bunka

Štyri gény kódujú štyri izoenzýmy. Gén pre tkanivovo nešpecifickú alkalickú fosfatázu sa nachádza na 1. chromozóme a gény pre ostatné tri izoformy sa nachádzajú na 2. chromozóme. [4]

Črevná alkalická fosfatáza Edit

Črevná alkalická fosfatáza (IAP) je vylučovaná enterocytmi a zdá sa, že hrá kľúčovú úlohu v črevnej homeostáze a ochrane [43] [44], ako aj pri potláčaní zápalu [45] prostredníctvom represie downstreamového Toll-like receptora (TLR). -4-dependentná a MyD88-dependentná zápalová kaskáda. [46] Defosforyluje toxické/zápalové mikrobiálne ligandy, ako sú lipopolysacharidy (LPS), [47] nemetylované cytozín-guanínové dinukleotidy, bičík a extracelulárne nukleotidy, ako je uridíndifosfát alebo ATP. Defosforylácia LPS pomocou IAP môže znížiť závažnosť Salmonella tryphimurium a Clostridioides difficile infekcia obnovujúca normálnu črevnú mikroflóru. [47] Zmenená expresia IAP sa teda podieľa na chronických zápalových ochoreniach, ako je zápalové ochorenie čriev (IBD). [47] [48] Zdá sa, že tiež reguluje absorpciu lipidov [49] a sekréciu bikarbonátov [50] v sliznici dvanástnika, čo reguluje povrchové pH.

V rakovinových bunkách Edit

Štúdie ukazujú, že proteín alkalickej fosfatázy nachádzajúci sa v rakovinových bunkách je podobný proteínu, ktorý sa nachádza v nemalígnych telesných tkanivách a že proteín pochádza z rovnakého génu v oboch. Jedna štúdia porovnávala enzýmy pečeňových metastáz obrovskobunkového pľúcneho karcinómu a nezhubných placentárnych buniek. V NH boli obaja podobní2-koncová sekvencia, peptidová mapa, podjednotková molekulová hmotnosť a izoelektronický bod. [51]

V inej štúdii, v ktorej vedci skúmali prítomnosť proteínu alkalickej fosfatázy v bunkovej línii ľudskej rakoviny hrubého čreva, tiež známej ako HT-29, výsledky ukázali, že aktivita enzýmu bola podobná aktivite nezhubného črevného typu. Táto štúdia však odhalila, že bez vplyvu butyrátu sodného je aktivita alkalickej fosfatázy v rakovinových bunkách dosť nízka. [52] Štúdia založená na účinkoch butyrátu sodného na rakovinové bunky uvádza, že má vplyv na expresiu koregulátora androgénneho receptora, transkripčnú aktivitu a tiež na acetyláciu histónov v rakovinových bunkách. [53] To vysvetľuje, prečo pridanie butyrátu sodného vykazuje zvýšenú aktivitu alkalickej fosfatázy v rakovinových bunkách ľudského hrubého čreva. [52] Okrem toho to ďalej podporuje teóriu, že aktivita enzýmu alkalickej fosfatázy je skutočne prítomná v rakovinových bunkách.

V inej štúdii sa bunky choriokarcinómu pestovali v prítomnosti 5-bróm-2'-deoxyuridínu (BrdUrd) a výsledky sprostredkovali 30- až 40-násobné zvýšenie aktivity alkalickej fosfatázy. Tento postup zvýšenia aktivity enzýmu je známy ako enzýmová indukcia. Dôkazy ukazujú, že v skutočnosti existuje aktivita alkalickej fosfatázy v nádorových bunkách, ale je minimálna a je potrebné ju zvýšiť. Výsledky z tejto štúdie ďalej ukazujú, že aktivity tohto enzýmu sa líšia medzi rôznymi bunkovými líniami choriokarcinómu a že aktivita proteínu alkalickej fosfatázy v týchto bunkách je nižšia ako v nemalígnych placentárnych bunkách. [54] [55] ale hladiny sú výrazne vyššie u detí a tehotných žien. Krvné testy by sa mali vždy interpretovať pomocou referenčného rozsahu z laboratória, ktoré test vykonalo. Vysoké hladiny ALP sa môžu vyskytnúť, ak sú žlčové cesty upchaté. [56]

ALP sa tiež zvyšuje, ak dochádza k aktívnej tvorbe kostí, pretože ALP je vedľajším produktom aktivity osteoblastov (ako je prípad Pagetovej choroby kostí).

ALP je oveľa viac zvýšená v bunkách metastatického karcinómu prostaty ako v bunkách nemetastatického karcinómu prostaty. [57] Vysoké hladiny ALP u pacientov s rakovinou prostaty sú spojené s významným znížením prežitia. [57]

Hladiny sú zvýšené aj u ľudí s neliečenou celiakiou. [58] Znížené hladiny ALP sú menej časté ako zvýšené hladiny. Zdroj zvýšených hladín ALP možno odvodiť získaním sérových hladín gama glutamyltransferázy (GGT). Súbežné zvýšenie ALP s GGT by malo vyvolať podozrenie na hepatobiliárne ochorenie. [59]

Niektoré ochorenia neovplyvňujú hladiny alkalickej fosfatázy, napríklad hepatitída C. Vysoká hladina tohto enzýmu neodráža žiadne poškodenie pečene, aj keď vysoké hladiny alkalickej fosfatázy môžu byť výsledkom blokády prietoku v žlčových cestách resp. zvýšenie tlaku pečene. [60]

Zvýšené úrovne Upraviť

Ak nie je jasné, prečo je alkalická fosfatáza zvýšená, izoenzýmové štúdie pomocou elektroforézy môžu potvrdiť zdroj ALP. Skelfosfatáza (ktorá je lokalizovaná v osteoblastoch a extracelulárnych vrstvách novosyntetizovanej matrice) sa uvoľňuje do obehu zatiaľ nejasným mechanizmom. [61] Placentárna alkalická fosfatáza je zvýšená pri seminómoch [62] a aktívnych formách rachitídy, ako aj pri nasledujúcich ochoreniach a stavoch: [63]

Znížené úrovne Upraviť

Nasledujúce stavy alebo choroby môžu viesť k zníženiu hladín alkalickej fosfatázy: [65]

    , autozomálne recesívne ochorenie žien, ktoré dostávajú estrogénovú terapiu z dôvodu starnutia
  • Muži s nedávnou operáciou srdca, podvýživou, nedostatkom horčíka alebo ťažkou anémiou
  • Deti s achondropláziou a vrodeným nedostatkom jódu
  • Deti po ťažkej epizóde enteritídy
  • Liečba steroidmi
  • Kolitída

Okrem toho sa preukázalo, že perorálne kontraceptíva znižujú alkalickú fosfatázu. [66]

Prognostické použitie Edit

Ukázalo sa, že meranie alkalickej fosfatázy (spolu so špecifickým antigénom prostaty) počas a po šiestich mesiacoch hormonálne liečeného metastatického karcinómu prostaty predpovedá prežitie pacientov. [67]

Leukocytová alkalická fosfatáza Edit

Leukocytová alkalická fosfatáza (LAP) sa nachádza v zrelých bielych krvinkách. Hladiny bielych krviniek LAP môžu pomôcť pri diagnostike určitých stavov.

  • Vyššie hladiny sú pozorované vo fyziologickej reakcii, leukemoidnej reakcii a v patológiách, ktoré zahŕňajú zrelé biele krvinky, ako je polycythemia vera (PV), esenciálna trombocytóza (ET) a pri primárnej myelofibróze (PM).
  • Nižšie hladiny sa nachádzajú v patológiách, ktoré zahŕňajú nevyvinuté leukocyty, ako je chronická myeloidná leukémia[68] (CML), paroxyzmálna nočná hemoglobinúria (PNH) a akútna myeloidná leukémia (AML).

Štruktúra a vlastnosti Upraviť

Alkalická fosfatáza je homodimérny enzým, čo znamená, že je tvorená dvoma molekulami. Tri kovové ióny, dva Zn a jeden Mg, sú obsiahnuté v katalytických miestach a oba typy sú rozhodujúce pre vznik enzymatickej aktivity. Enzýmy katalyzujú hydrolýzu monoesterov v kyseline fosforečnej, ktorá môže dodatočne katalyzovať transfosforylačné reakcie s veľkými koncentráciami fosfátových akceptorov. Zatiaľ čo hlavné znaky katalytického mechanizmu a aktivity sú zachované medzi cicavčím a bakteriálnym alkalickým fosfátom, cicavčia alkalická fosfatáza má vyššiu špecifickú aktivitu a Km majú teda nižšiu afinitu, alkalickejšie pH optimum, nižšiu tepelnú stabilitu a sú typicky membránovo viazané a sú inhibované 1-aminokyselinami a peptidmi prostredníctvom nekonkurenčného mechanizmu. Tieto vlastnosti sa výrazne líšia medzi rôznymi izozýmami alkalickej fosfatázy cicavcov, a preto vykazujú rozdiel v in vivo funkcie.

Alkalická fosfatáza má homológiu s veľkým počtom iných enzýmov a tvorí časť nadrodiny enzýmov s niekoľkými prekrývajúcimi sa katalytickými aspektmi a znakmi substrátu. To vysvetľuje, prečo sú najvýraznejšie štrukturálne znaky alkalických cicavcov také, aké sú, a odkazujú na ich substrátovú špecifickosť a homológiu s inými členmi nukleozidovej pyrofosfatázy/fosfodiesterázovej rodiny izozýmu. [4] Výskum ukázal vzťah medzi členmi rodiny alkalických fosfatáz s arylsulfatázami. Podobnosti v štruktúre naznačujú, že tieto dve rodiny enzýmov pochádzajú od spoločného predka. Ďalšia analýza spojila alkalické fosfáty a arylsulfatázy s väčšou superrodinou. Niektoré z bežných génov, ktoré sa nachádzajú v tejto superrodine, sú tie, ktoré kódujú fosfodiesterázy, ako aj autotoxín. [69]


CD33 Lokus Alzheimerovej choroby: zmenená funkcia monocytov a biológia amyloidu

V našej funkčnej disekcii lokusu CD33 náchylnosti na Alzheimerovu chorobu sme zistili, že riziková alela rs3865444(C) bola spojená s väčšou expresiou CD33 na bunkovom povrchu v monocytoch (t50 = 10,06, P (kĺb) = 1,3 × 10 (-13 )) mladých a starších jedincov. Súviselo to aj so zníženou internalizáciou amyloid-p 42 peptidu, akumuláciou neuritickej amyloidnej patológie a fibrilárneho amyloidu na in vivo zobrazovaní a zvýšeným počtom aktivovaných ľudských mikroglií.

Figúrky

Obrázok 1 CD33 riziková alela je...

Obrázok 1 CD33 riziková alela je spojená so zvýšenou expresiou CD33 a zníženým vychytávaním

Obrázok 2. Alela citlivosti rs3865444…

Obrázok 2. Alela citlivosti rs3865444 je spojená so zvýšením Pittsburghskej zlúčeniny…

= 1,0) u PiB negatívnych subjektov. Hodnoty PiB z kohort HAB (c) a ADNI (d) demonštrujú zvýšenú frekvenciu jedincov PiB+ s rizikovou alelou rs3865444 C. Hodnoty PiB+ a PiB− sú oddelené bodkovanou čiarou.

Obrázok 3. Imunohistochémia odhaľuje expresiu CD33 v…

Obrázok 3. Imunohistochémia odhaľuje expresiu CD33 v mozgu a zvýšenú frekvenciu štádia…


Liečba

Liečba srdcovej amyloidózy zahŕňa dve oblasti: (i) liečenie a prevenciu komplikácií a (ii) zastavenie alebo oddialenie ukladania amyloidu špecifickou liečbou.

Liečba komplikácií a komorbidít

Podporná starostlivosť o pacientov so srdcovou amyloidózou zahŕňa rôzne klinické aspekty vrátane liečby srdcového zlyhania, arytmií, porúch vedenia vzruchu, tromboembólie a sprievodnej prítomnosti závažnej aortálnej stenózy (Obrázok 5). 23-25

Špecifická (chorobu modifikujúca) liečba

Liečba procesu ukladania amyloidu by sa mala zamerať na produkciu amyloidného prekurzorového proteínu alebo zostavenie amyloidných fibríl.

AL amyloidóza

Špecifickú liečbu srdcovej AL amyloidózy by mali vykonávať multidisciplinárne tímy zahŕňajúce onkohematologických a kardiologických špecialistov a vždy, keď je to možné, pacienti by mali byť odoslaní do špecializovaných centier. 26

Pacienti s AL amyloidózou majú nielen hematologickú malignitu, ale aj ich multiorgánové postihnutie ich robí obzvlášť krehkými a náchylnými na toxicitu liečby. Terapeutické prístupy závisia od hodnotenia rizika, ktoré je za mnohých okolností definované stupňom postihnutia srdca (online doplnkové Obrázok S1) a srdcová odpoveď závisí aj od hematologickej odpovede (online doplnok Tabuľka S1). 23, 24 Úloha kardiológa pri špecifickej liečbe zahŕňa: (i) kardiologické vyšetrenie pre počiatočné hematologické stratégie, vrátane zváženia autológnej transplantácie kmeňových buniek (online doplnkové Tabuľka S2), (ii) vyhodnotenie transplantácie srdca a (iii) monitorovanie srdca počas chemoterapie.

ATTR amyloidóza

Existuje rastúca dostupnosť nových, účinných, cielených terapeutických možností pre ATTRwt a ATTRv. Včasná diagnostika je nevyhnutná na umožnenie včasnej liečby neurologických, srdcových a iných systémových prejavov, keďže terapia je účinnejšia v počiatočných štádiách ochorenia. 27-29 Účinné terapie znižujú produkciu mutovaných (transplantácia pečene) a celkového TTR (genetické tlmiče) alebo stabilizujú cirkulujúcu molekulu TTR (stabilizátory), čím bránia ich disociácii alebo štiepeniu na amyloidogénne fragmenty (Obrázok 6). Niekoľko nových zlúčenín sa skúma, vrátane činidiel zameraných na odstránenie amyloidných fibríl (online doplnkový materiál).

Súčasné terapeutické alternatívy rozlišujú medzi ATTRv a ATTRwt a v prípade ATTRv podľa prítomnosti kardiomyopatie, polyneuropatie alebo oboch (Obrázok 7). Podrobný popis terapií ATTR, ktoré sú dostupné alebo sa testujú v štúdiách fázy III, možno nájsť v online doplnkovom materiáli. Tafamidis by sa mal vo všeobecnosti považovať za látku voľby u ATTR kardiologických pacientov s primeraným očakávaným prežitím, zatiaľ čo patisiran by sa mal zvážiť u ATTRv pacientov so srdcovým postihnutím, u ktorých sú predpísané génové tlmiče z dôvodu symptomatického neurologického ochorenia.

  • - Manažment srdcovej amyloidózy zahŕňa liečbu a prevenciu komplikácií a zastavenie alebo oddialenie ukladania amyloidu pomocou špecifických liečebných postupov.
  • - Špecifická farmakologická liečba amyloidózy ATTR zahŕňa stabilizačné molekuly (tafamidis) a genetické tlmiče (patisiran a inotersen).
  • - Tafamidis je v súčasnosti jediným liekom, ktorý preukázal účinnosť v randomizovanej štúdii u pacientov s ATTRwt a ATTRv s kardiomyopatiou a mal by sa zvážiť u pacientov s primeraným očakávaným prežitím.

VÝSLEDKY

Radiačná ochrana bola hodnotená znížením bunkovej smrti vyvolanej žiarením, apoptózy a/alebo poškodenia DNA. Merali sme tieto tri parametre, aby sme stanovili rádioprotektívny potenciál troch tried napodobenín SOD v bunkách WT a AT paralelne, aby sme určili, či 1) nejaké rádioprotektívne účinky závisia od dráh súvisiacich s ATM a 2) zlúčenina (zlúčeniny) môže mať potenciál terapeutické výhody pre rádiosenzitívnych pacientov. Zaznamenali sme rádioprotektívne účinky v 2 z 11 testovaných zlúčenín: MnMX-2-PyP-Calbio a MnTnHex-2-PyP. Tiež sme zaznamenali možné účinky závislé od ATM pri troch testoch.

MnMX-2-PyP a MnTnHex-2-PyP zvýšená životaschopnosť po vystavení žiareniu

XTT sa použilo na hodnotenie toxicity zlúčenín aj účinku každej zlúčeniny na cytotoxicitu indukovanú IR. Všetky bunky boli vopred ošetrené uvedenou zlúčeninou dve hodiny pred ožiarením 5 Gy a 48 hodín po ožiarení boli testované na životaschopnosť. Tri z jedenástich testovaných zlúčenín znížili IR-indukovanú cytotoxicitu v bunkách WT: MnMX-2-PyP-Calbio, MnTnHex-2-PyP a MnCl2 ( Stôl 1 ). MnTnHex-2-PyP (1 μM) vykazoval najvýznamnejšie zníženie IR-indukovanej cytotoxicity v bunkách WT v porovnaní s neošetrenými ožiarenými bunkami WT: 58 % (p=0,04). MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) významne znížil IR-indukovanú cytotoxicitu o 25 % (p= 6휐 𢄤) v bunkách WT. MnCl2 (1 μM) sa použil ako kontrola a znížil IR-indukovanú bunkovú smrť o 31 % (p=2 휐𢄥) v bunkách WT. Žiadna zo zlúčenín nevykazovala žiadne štatisticky významné zníženie IR-indukovanej cytotoxicity v A-T bunkách.

Stôl 1

Rádioprotektívne účinky napodobenín SOD (% rádioprotekcie)

XTTanexín/propídium jodidGamma H2AX IRIFNeutrálna kométa
Názov zlúčeninyConq(μM)WT (%)StdevA-T (%)StdevWT (%)StdevA-T (%)StdevWT (%)StdevWT (%)StdevA-T (%)Stdev
MnMx-2-PyP-Calbio5625 * 7.29�.2316.1211 * 2.10�,509.969.965.7719.99 * 17.160.2214.05
MnTM-2-PyP1�.7410.91�.2212.109.016.262.039.8713.692.168.83 * 14.120.0015.89
MnTE-2-PyP1�.3341.6741.6714.2912.323.4414.216.752.225.5113.4510.570.0018.43
MnTnHex-2-PyP158 * 7.32�.4956.6828.6126.0439 * 3.2557 * 11.3129.7616.9215.4318.79
MnTTEG-2-PyP1�.7125.00�.8161.193.220.414.1210.6119.5312.3418.5616.280.0014.28
MnBr8TSPP15.354.96�.8112.47�,5811.55�,5616.7270.332.6512.7510.780.0011.12
EUK-82014.7945.50�.9214.13𢄦.1012.2319.5616.43𢄠.4310.4127.6614.6115.8616.50
EUR-13410�.573.33�.814.547.189.978 * 4.2352 * 4.3521.0227.290.0020.23
EUR-18920�.1261.59�.764.367.2512.0910.957.8230.317.120.0012.570.0016.14
M40404201.4912.90�.2421.4614.318.254.361.63�.783.2444.5012.5628.0444.87
M4040320�.044.49�.7811.6033.0219.965.044.86�.543.3035.6615.460.0018.75
MnCl2131 * 0.5516.0012.9411.6917.19𢄥.126.4722.7913.0021.8920.130.0035.97

MnMX-2-PyP-Calbio, MnTnHex-2-PyP a EUK-134 Redukovaná IR-indukovaná apoptóza

Na meranie postradiačnej apoptózy sa použili farbenie anexínom V a propídium jodidom. Tri z jedenástich testovaných zlúčenín vykazovali mierne zníženie percenta apoptotických buniek po ožiarení: MnMX-2-PyP, MnTnHex-2-PyP a EUK-134 (tabuľka 1). MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) znížil apoptózu indukovanú IR o 11 % (p=0,03) v bunkách WT. V AT bunkách MnTnHex-2-PyP (1 μM) znížil IR-indukovanú apoptózu o 39% (p=0,01) a EUK-134 (10 μM) poskytol 8% (p=0,03) ochranu proti IR - indukovaná apoptóza. Zvyšok zlúčenín nevykazoval žiadnu ochranu proti IR-indukovanej apoptóze. MnCl2 nevykazovali žiadnu ochranu v žiadnom type buniek.

MnTnHex-2-PyP znížená IR-indukovaná γ-H2AX imunofluorescencia

Poškodenie DNA sa meralo pomocou imunofluorescencie na detekciu markera dvojvláknového zlomu DNA (DSB) γ-H2AX. Tri z jedenástich chemikálií redukovali IR-indukované γ-H2AX imunofluorescenčné jadrové ohniská (IRIF). Neožiarené bunky ošetrené MnTnHex-2-PyP vykazovali dôkaz miernej toxicity pri všetkých dávkach, tieto bunky boli približne z 25 % pozitívne na IRIF medzi 0,05 a 1 μM. Po ožiarení (2 Gy) MnTnHex-2-PyP významne znížil IRIF spôsobom závislým od dávky (obrázok 2 A a B). Ožiarené bunky ošetrené samotným vehikulom boli zo 72 % pozitívne na IRIF. Pozorovali sme od dávky závislú redukciu so zvyšujúcimi sa koncentráciami, s maximálnym účinkom pri konečnej koncentrácii 1 μM (57% proporcionálne zníženie IRIF (p=5 휐 𢄣 )). Podobne EUK-134 (10 μM) spôsobil 52% proporcionálny pokles tvorby IRIF (p=0,06). Kontrola, MnCl2 (1 μM), nevykazovali žiadne zníženie IRIF. Tvorba IRIF nemohla byť študovaná v A-T bunkách.

Tvorba imunofluorescenčných ložísk gama-H2AX v bunkách WT. WT bunky boli inkubované v MnTnHex-2-PyP počas 18 hodín, boli ožiarené 2 Gy a fixované paraformaldehydom na krycie sklíčka. Po permeabilizácii s 0,5 % Triton-X 100 sa bunky farbili na γ-H2AX a bunky sa hodnotili na prítomnosť jadrových ložísk IRIF. (A) Výsledky IRIF pre bunky WT ošetrené MnTnHex-2-PyP. Všimnite si zníženie počtu IRIF-pozitívnych buniek so zvyšujúcimi sa koncentráciami MnTnHex-2-PyP. (B) Kvantifikácia výsledkov IRIF. Plná čiara: neožiarené bunky WT prerušovaná čiara: 15 minút po 2 Gy WT bunkách. Bodkovaná čiara označuje percento ožiarených buniek WT pozitívnych na IRIF, v neprítomnosti akejkoľvek zlúčeniny prerušovaná šípka označuje maximálne zníženie počtu IRIF-pozitívnych buniek po expozícii 1 μM MnTnHex-2-PyP. Chybové úsečky predstavujú štandardnú chybu. Všetky snímky boli zakódované jedným jednotlivcom a naslepo ich prečítal iný. Tu uvedené výsledky sú priemerné výsledky z 3 experimentov.

MnMX-2-PyP-Calbio a EUK-8 redukované dĺžky chvosta DNA kométy vo WT a AT-bunkách

Poškodenie DNA vyvolané ožiarením a kinetika opravy DSB sa merali pomocou testu neutrálnej kométy. Všetky bunky sa inkubovali s uvedenou zlúčeninou 18 hodín pred ožiarením 10 Gy. Nižšie dávky IR nedokázali spôsobiť dostatočné množstvo poškodenia DNA, ktoré by umožnilo akékoľvek merateľné účinky. 10 Gy teda nebolo zamýšľané ako klinicky relevantná porucha, ale skôr ako laboratórny model na poškodenie DNA a následnú opravu s alebo bez prítomnosti rádioprotektívnych činidiel. V bunkách WT bola oprava poškodenia (indikovaná skrátením komét na dĺžku pred ožiarením) dokončená 2,5 hodiny po ožiarení, zatiaľ čo v bunkách A-T sa to oneskorilo aspoň o jednu hodinu dlhšie (obrázok 3).

Oneskorená oprava dvojvláknového zlomu DNA v A-T bunkách hodnotená testom neutrálnej kométy. Všimnite si návrat na základnú čiaru (t. j. žiadne kométy) WT po 2,5 hodine. Niektoré kométy zostali 3,5 hodiny pre A-T bunky. (A) Reprezentatívne chvosty kométy pre každý časový bod v bunkách WT a A-T po 10 Gy IR. (B) Kvantifikácia dĺžky chvosta kométy pre WT (biely stĺpec) a A-T bunky (sivý stĺpec). Každý údajový bod sa vzťahuje na priemer pre najmenej 50 komét a chybové úsečky predstavujú štandardné chyby.

Desať z jedenástich zlúčenín znížilo dĺžku chvosta DNA komét WT buniek. Ošetrenie s EUK-8 (10 μM) a MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) výrazne znížil dĺžku chvosta kométy 20 minút po–IR (10 Gy) o 30 % (p=1,9 휐 𢄩 ) a 20 % (p=5,7 x000 𢄥), v tomto poradí, v bunkách WT. Použitím AT buniek iba tri zlúčeniny znížili dĺžku chvosta kométy 20 minút po IR: M40404 (20 μM) (28% redukcia, p=8,6휐 𢄣) MnTnHex-2-PyP (1 ; ) (15 % zníženie, p=7,3휐 𢄣) a EUK-8 (20 μM) (16 % zníženie, p=2,4휐 𢄤) (Tabuľka 1).

AT bunky vykazovali vyššie hladiny ROS ako divoký typ a MnTnHex-2-PyP a MnMX-2-PyP-Calbio Redukované IR-indukované ROS

Fluorescencia DCF sa použila na meranie rôznych ROS, ako je peroxid vodíka a hydroxylový radikál (obrázok 4). Neožiarené A-T bunky vykazovali vyššiu základnú hladinu ROS v porovnaní s neožiarenými WT bunkami (p=0,001) (obrázok 4A). Ožiarené bunky WT vykazovali mierny nárast fluorescencie DCF o 20 % (p=0,02) 5 minút po ožiarení 10 Gy (obrázok 4A). A-T bunky nevykazovali žiadne významné zvýšenie fluorescencie DCF po ožiarení. Ožiarené bunky WT ošetrené napodobeninami SOD nevykazovali žiadne významné zníženie hladín ROS (obrázok 4B). Na rozdiel od toho liečba MnTnHex-2-PyP (1 μM) a MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) významne znížil ROS v ožiarených AT bunkách o 21 % (p=6,1 휐 𢄩 ) a 8% (p=2,0휐 𢄣) Obrázok 4C).

Hladiny ROS v bunkách WT a A-T pomocou fluorescencie dichlórfluoresceínu (DCF). Bunky boli inkubované v 100 μM DCF počas 1 hodiny v PBS pri 37 °C. Spriemerované výsledky pre 4 samostatné experimenty chybové úsečky predstavujú štandardnú chybu. (A) Fluorescencia DCF 5 minút po ožiarení (10 Gy) buniek WT a A-T. Výsledky boli normalizované na výsledky neožiarených buniek WT. Všimnite si zvýšenú základnú líniu ROS A-T buniek. (B) Účinok zlúčenín na fluorescenciu DCF ožiarených (10 Gy) buniek WT. Výsledky boli normalizované na výsledky ožiarených buniek WT. (C) Účinok zlúčenín na fluorescenciu DCF ožiarených (10 Gy) A-T buniek. Výsledky boli normalizované na výsledky ožiarených buniek WT. Všimnite si antioxidačné účinky MnTnHex-2-PyP a MnMX-2-PyP-Calbio.

Tvorba superoxidových radikálov sa merala pomocou fluorescencie DHE (obrázok 5). A-T bunky vykazovali zvýšenú konštitutívnu fluorescenciu DHE v porovnaní s bunkami WT (p=1휐𢄣) (obrázok 5A). Zaznamenali sme mierny nárast fluorescencie DHE po ožiarení v bunkách WT (p=5 휐 𢄢). Liečba pomocou MnTnHex-2-PyP (1 μM) a MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) znížil fluorescenciu DHE po vystavení žiareniu (10 Gy) pre oba typy buniek (obrázok 5B a 5C). V ožiarených bunkách WT MnTnHex-2-PyP (1 μM) a MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) znížil fluorescenciu DHE 5 minút po ožiarení o 14 % (p=1,6 휐 𢄣 ) a 69% (p=1,4 휐 � ), v tomto poradí . Pre ožiarené A-T bunky, MnTnHex-2-PyP (1 μM) a MnMX-2-PyP-Calbio (56 μM) znížil fluorescenciu DHE o 24 % (p=1,5 휐𢄧) a 47% (p=2,2� �), v tomto poradí. Pretože tieto zlúčeniny sú napodobeniny SOD, očakávali sme, že po ošetrení zlúčeninou uvidíme zníženie tvorby superoxidu, čo sa pozorovalo u oboch typov buniek. To bolo v kontraste s absenciou antioxidačných účinkov týchto zlúčenín na bunky WT pri hodnotení pomocou DCF, čo je všeobecná sonda pre viaceré formy ROS.

Tvorba superoxidových radikálov sa detegovala pomocou fluorescencie dihydroetídia (DHE). Zobrazené výsledky sú priemery pre 4 experimenty chybové stĺpce predstavujú štandardné chyby. (A) Fluorescencia DHE 5 minút po 10 Gy v bunkách WT a A-T. Výsledky boli normalizované na výsledky neožiarených buniek WT. (B) Účinok zlúčenín na fluorescenciu DHE v ožiarených (10 Gy) bunkách WT. Výsledky boli normalizované na výsledky neožiarených buniek WT. (C) Účinok pôsobenia zlúčenín na fluorescenciu DHE v ožiarených (10 Gy) A-T bunkách. Výsledky boli normalizované na výsledky neožiarených A-T buniek. Všimnite si antioxidačné účinky MnTnHex-2-PyP a MnMX-2-PyP-Calbio zapnuté oboje WT a A-T bunky.

MnMXLiečba -2-PyP-Calbio Zlepšená rýchlosť mitochondriálneho dýchania A-T buniek

A-T bunky typicky vykazujú nižšiu rýchlosť dýchania ako WT bunky, čo bolo zaznamenané v našich experimentoch (p=3,2휐 𢄢) [46]. Keď boli A-T bunky ošetrené 56 μM MnMX-2-PyP-Calbio, mitochondriálne dýchanie sa zlepšilo (obrázok 6). V skutočnosti MnMX-2-PyP-Calbio-ošetrené A-T bunky vykazovali zvýšený metabolizmus resazurínu o 21,46 %, čo spôsobilo, že resazurínový profil ošetrených A-T buniek’ bol takmer identický s profilom WT buniek (p=9,7휐 𢄢). MnTnHex-2-PyP a EUK-8 boli tiež testované na účinky na mitochondriálne dýchanie, nezaznamenali sme žiadny účinok.

Mitochondriálne dýchanie merané fluorescenciou resazurínu. A-T bunky vystavené MnMX-2-Pyp-Calbio vykazuje známky zlepšenej mitochondriálnej funkcie v porovnaní s neošetrenými A-T bunkami. Zatiaľ čo A-T bunky ošetrené MnTnHex-2-PyP alebo EUK-8 nevykazovali žiadny účinok. Každý experiment sa uskutočnil trojmo. Tieto výsledky sú reprezentatívne pre 2 samostatné experimenty a chybové úsečky predstavujú štandardné odchýlky. Všimnite si zlepšenie mitochondriálneho dýchania v A-T bunkách 3 hodiny po pridaní resazurínového farbiva.

MnMX-2-PyP-Calbio ani MnTnHex-2-PyP preukázali akúkoľvek ochranu pred mitotickou bunkovou smrťou vyvolanou žiarením

Bunky boli predkondicionované porfyrínovým antioxidantom, aby boli čiastočne chránené pred primárnym radiačným poškodením. Dve z najviac chrániacich zlúčenín v iných testoch, MnMX-2-PyP-Calbio a MnTnHex-2-PyP sa použili v teste prežitia kolónií (CSA) na posúdenie, či by sa mohli alebo nedali použiť na zníženie mitotickej bunkovej smrti vyvolanej žiarením. Tento test rieši tak životaschopnosť bunky, ako aj jej schopnosť zostať funkčne aktívny a vytvárať kolónie alebo klony. Žiadna zlúčenina však neposkytla žiadnu štatisticky významnú ochranu pre bunky WT aj A-T (doplnkové údaje). Pre bunky WT ošetrené MnM nie sú uvedené žiadne údajeX-2-PyP-Calbio, pretože táto skupina buniek opakovane nedokázala vyrásť dostatočné množstvo kolónií na počítanie. Nedostatok ochrany pozorovaný CSA nie je prekvapujúci vzhľadom na to, že ostatné výsledky pozorované v iných testoch boli zaznamenané v priebehu niekoľkých minút až hodín po vystavení žiareniu, zatiaľ čo CSA deteguje dlhodobý účinok. Tiež pre naše nastavenie CSA boli bunky vystavené iba uvedeným zlúčeninám od 12 do 18 hodín a potom boli umiestnené do čerstvého média na 2 týždne. Zlúčeniny mali iba tento 12-18 hodinový časový rámec na absorpciu zlúčeniny, aby sa vytvoril účinok na dlhodobú tvorbu kolónií. Je možné, že keby sa zlúčeniny kontinuálne dopĺňali počas 2-týždňového obdobia tvorby kolónií, mohol by sa pozorovať štatisticky významný rozdiel. Na druhej strane sme zaznamenali úplne opačný MnTnHex-2-PyP bol mierne cytotoxický pre W-T bunky, ale žiadna zlúčenina nebola cytotoxická pre A-T bunky (pozri doplnkový obrázok 5).

Stručne zhrnuté, identifikovali sme dve napodobeniny SOD, ktoré vykazovali rádioprotektívne účinky v šiestich z našich testov: MnMX-2-PyP-Calbio a MnTnHex-2-PyP. MnTnHex-2-PyP bol približne 50-krát účinnejší ako MnMX-2-PyP-Calbio celkovo. Všetky zlúčeniny vykazovali niektoré priaznivé účinky pri všeobecnej oprave DNA pozorovanej pri neutrálnom kométovom teste, vrátane MnCl2, čo naznačuje, že všetky tieto napodobeniny SOD majú schopnosť inhibovať nepriame poškodenie DNA. Aj keď naše údaje XTT ukázali, že 2 napodobeniny sú ochranné výlučne v bunkách WT, je možné, že tento test, ktorý vyžaduje mitochondriálne štiepenie tetrazóliovej soli, nemusí byť vhodný pre bunky AT, u ktorých sa predtým ukázalo, že vykazujú pomalšiu rýchlosť dýchania. [46].Táto myšlienka je podporená skutočnosťou, že MnTnHex-2-PyP vykazoval ochranu prostredníctvom XTT vo WT, ale nie v AT, napriek tomu vykazoval ochranné účinky v AT, ale nie WT bunkách v teste Annexin V/PI, a rovnaká zlúčenina bola ochranná v oba typy buniek testom neutrálnej kométy. Ďalšie štúdie budú potrebné na objasnenie presnej úlohy (úloh) ATM pri dosahovaní rádioprotekcie meranej našimi testami.


VÝSLEDKY

Profil expresie bazonuklinu počas oogenézy a predimplantačného vývoja

Imunofarbenie ukázalo, že basonuklin nebol detegovaný v osembunkových embryách (Q. J. Tian a H.T., nepublikované). V súlade s týmto zistením nedávna mikročipová štúdia naznačila, že bazonuklinová mRNA bola prítomná v oocytoch a jednobunkových embryách, ale jej hladina sa počas predimplantačného vývoja v osembunkovom štádiu rýchlo znížila viac ako 30-násobne, bola na úrovni pozadia ( Zeng a kol., 2004). Najprv sme potvrdili tento profil expresie mRNA bazonuklinu pomocou RT-PCR (obr. 1, prerušovaná čiara) a potom sme pomocou imunoblotu a imunocytochémie stanovili profil expresie basonuklinového proteínu v oocytoch a preimplantačných embryách. Imunoblotting odhalil zjavný pokles hladiny bazonuklinu od nezrelého oocytu (štádium GV) do štádia zrelej metafázy II (MII) (obr. 1). Podobné množstvá bazonuklinu boli prítomné vo vajíčkach MII a jednobunkových embryách, ale žiadny bazonuklin sa nezistil v dvojbunkových a morulae/blastocystách, čo je v súlade s vymiznutím jeho mRNA počas predimplantačného vývoja. Imunocytochemická analýza tiež odhalila podobný a progresívny pokles imunoreaktívneho materiálu z oocytov na preimplantačné embryá (obr. 1). Materský bazonuklin teda nie je nahradený zygotickým bazonuklinom počas predimplantačného vývoja, a preto by mohol mať materský účinok.

Profil expresie basonuklinu počas oogenézy a predimplantačného vývoja. Relatívna hojnosť bazonuklinovej mRNA bola vynesená do grafu pomocou logaritmickej stupnice a údajov z predchádzajúcej mikročipovej analýzy (Zeng et al., 2004) (neprerušovaná čiara) a PCR v reálnom čase (prerušovaná čiara). Imunocytochemické farbenie oocytov a predimplantačných embryí je znázornené vo vložkách v grafe. Šípky označujú polohy zárodočného vezikula, pronuklea a jadra príslušných vývojových štádií. Imunoblot bazonuklinu v zodpovedajúcich vývojových štádiách je znázornený pod grafom (75 oocytov/embryí na dráhu). Vývojové štádiá: GV, germinálny vezikul-intaktný oocyt Vajíčko, metafáza II-zastavené vajíčko 1C, jednobunkové embryo 2C, dvojbunkové embryo M/B, morulae a blastocysta.

Profil expresie basonuklinu počas oogenézy a predimplantačného vývoja. Relatívna hojnosť bazonuklinovej mRNA bola vynesená do grafu pomocou logaritmickej stupnice a údajov z predchádzajúcej mikročipovej analýzy (Zeng et al., 2004) (neprerušovaná čiara) a PCR v reálnom čase (prerušovaná čiara). Imunocytochemické farbenie oocytov a predimplantačných embryí je znázornené vo vložkách v grafe. Šípky označujú polohy zárodočného vezikula, pronuklea a jadra príslušných vývojových štádií. Imunoblot bazonuklinu v zodpovedajúcich vývojových štádiách je znázornený pod grafom (75 oocytov/embryí na dráhu). Vývojové štádiá: GV, germinálny vezikul-intaktný oocyt Vajíčko, metafáza II-zastavené vajíčko 1C, jednobunkové embryo 2C, dvojbunkové embryo M/B, morulae a blastocysta.

Generovanie basonuklinových-RNAi transgénnych myší

Prítomnosť bazonuklínu v oocytoch a skorých embryách naznačuje, že plní: (1) rovnakú funkciu pre oocyty aj embryá (2) nesúvisiace funkcie pri dozrievaní oocytov a/alebo v skorých embryách alebo (3) funkciu oocytov, ktorú vyžaduje embryá (materský efekt). Na vyriešenie týchto možností sme použili nedávno vyvinutý prístup transgénnej RNAi na inhibíciu basonuklinovej funkcie v oocytoch (Svoboda et al., 2001). Skonštruovali sme dva typy RNAi transgénnych plazmidov, pB1rnai-zp3-1 a pB1rani-zp3-2 (obr. 2A). Podrobnosti o generovaní transgénnych myší sú opísané v časti Materiály a metódy. Získalo sa 24 základných myší (13 samíc a 11 samcov), z ktorých 14 bolo generovaných pB1rnai-zp3-1 a 10 pomocou pB1rnai-zp3-2.

Transgénne samice basonuklinu-RNAi sú subfertilné

Analyzovali sme plodnosť zakladajúcich transgénnych samíc a samičie potomstvo transgénnych zakladateľských samcov (obr. 2B). Aby sa znížil vplyv mužskej plodnosti na výsledok, traja normálni samci sa spárili v náhodnom poradí s každou testovanou samicou. Osem z deviatich transgénnych zakladajúcich samíc vykazovalo široký rozsah subfertility - od strednej po ťažkú ​​(neplodnú) - v porovnaní s priemerom siedmich netransgénnych súrodencov v kontrolnej skupine (obr. 2B). Je nepravdepodobné, že by subfertilita bola spôsobená kostrou vektora a/alebo miestami integrácie transgénu, pretože zakladajúce samice boli odvodené z viacerých injekcií dvoch transgénových konštruktov. Southernova analýza tiež nedokázala stanoviť žiadnu koreláciu medzi integračnými miestami a počtom kópií transgénu s pozorovanou zníženou fertilitou (údaje nie sú uvedené).

Plodnosť transgénnych samičích potomkov zakladateľov samcov odrážala plodnosť zakladateľov transgénnych samičiek (obr. 2C). Okrem samičej subfertility sa transgénne samce a samice myší javili normálne. Pretože transgénne samice boli subfertilné, použili sme transgénnych samcov na prenos transgénu a následné štúdie sme zamerali na samičie potomstvo dvoch transgénnych línií, T50 a T8, ktoré mali ~10% a 50% normálnu plodnosť. Fenotyp subfertility samíc týchto línií bol doteraz stabilný po dvoch generáciách šľachtenia.

Transgénne oocyty obsahujú znížené množstvo bazonuklinovej mRNA a proteínu

Skúmali sme plne pestované transgénne oocyty na bazonuklinovú mRNA a proteín, aby sme určili kumulatívny účinok RNAi počas rastovej fázy. PCR v reálnom čase ukázala, že množstvo bazonuklinovej mRNA v transgénnych oocytoch z oboch línií sa dramaticky znížilo. V prípade oocytov T8 a T50 bolo potrebných ďalších 4 a 6 cyklov na dosiahnutie prahu v porovnaní s netransgénnymi náprotivkami (obr. 2D). Toto zvýšenie počtu cyklov sa premieta do 94 % a 98 % redukcie bazonuklinovej mRNA. Imunocytochemické (obr. 2F) a western blot (obr. 2G) vyšetrenia skutočne potvrdili dramatický pokles obsahu basonuklinového proteínu v týchto transgénnych oocytoch. Tieto testy však nedokázali rozlíšiť malý rozdiel v silne znížených hladinách basonuklinového proteínu dvoch transgénnych línií. Je možné, že exponenciálna povaha metódy RT-PCR je citlivejšia pri detekcii malých variácií medzi veľmi nízkymi hladinami bazonuklinu, ktoré boli pod úrovňou detekcie imunocytochémie a Western blotu. Zdá sa, že malý rozdiel v hladinách mRNA má vplyv na plodnosť v líniách T8 a T50, ktoré boli 50 % a 90 % (obr. 2E) a korelujú s 94 % a 98 % znížením obsahu bazonuklinovej mRNA. .

Basonuklin-RNAi transgén a jeho vplyv na ženskú fertilitu, hladiny bazonuklinovej mRNA a proteínu v oocytoch. (A) Štruktúry dvoch transgénových konštruktov s rôznymi hlavnými vektormi, zostrihovými sekvenciami a bazonuklinovými cDNA sekvenciami. Nukleotidové súradnice myšacej bazonuklinovej cDNA sú zobrazené nad jednou kópiou invertovaných opakovaní (čierne šípky).(B,C) Plodnosť transgénnych RNAi samíc bola odvodená z priemernej veľkosti vrhu. Transgénne samice (zakladateľ, B alebo krížené potomstvo zakladajúcich samcov, C) sa spárili s tromi normálnymi samcami v náhodnom poradí. (B) Údaje sú založené na troch páreniach pre každého transgénneho zakladateľa a kontrola (nie TG) je priemerná veľkosť vrhu siedmich netransgénnych samíc. (C) Číslo párenia/tehotenstva (n) je zobrazené nad každým stĺpcom. * P<0,001. Basonuklinová mRNA bola znížená v oocytoch v transgénnom štádiu GV, ako sa ukázalo pomocou PCR v reálnom čase (D), imunocytochémie (F) a imunoblotu (G). (D) mRNA pre upstream-väzbový faktor (UBF), všadeprítomný Pol I transkripčný faktor, sa použila ako kontrola. (E) Údaje PCR v reálnom čase boli prevedené na percento hladiny mRNA bazonuklinu divokého typu a vynesené do grafu oproti údajom o plodnosti z C. (F) Oocyty boli zafarbené anti-basonuklínovou protilátkou (červená) a DAPI (modrá) a dva obrázky sú prekryté, aby indikovali polohu zárodočného vezikula v transgénnych oocytoch. Mierka: 10μm. (G) Pre každú transgénnu líniu boli analyzované dve duplicitné vzorky. Každá dráha obsahuje proteín extrahovaný z 50 oocytov. Po sondovaní na bazonuklin sa membrána stripovala a znovu sondovala protilátkou proti β-tubulínu. TG, transgénne oocyty neTG, netransgénne oocyty.

Basonuklin-RNAi transgén a jeho vplyv na ženskú fertilitu, hladiny bazonuklinovej mRNA a proteínu v oocytoch. (A) Štruktúry dvoch transgénových konštruktov s rôznymi vektorovými kostrami, zostrihovými sekvenciami a bazonuklinovými cDNA sekvenciami. Nukleotidové súradnice myšacej bazonuklinovej cDNA sú zobrazené nad jednou kópiou invertovaných opakovaní (čierne šípky).(B,C) Plodnosť transgénnych RNAi samíc bola odvodená z priemernej veľkosti vrhu. Transgénne samice (zakladateľ, B alebo krížené potomstvo zakladajúcich samcov, C) sa spárili s tromi normálnymi samcami v náhodnom poradí. (B) Údaje sú založené na troch páreniach pre každého transgénneho zakladateľa a kontrola (nie TG) je priemerná veľkosť vrhu siedmich netransgénnych samíc. (C) Číslo párenia/tehotenstva (n) je zobrazené nad každým stĺpcom. * P<0,001. Basonuklinová mRNA bola znížená v oocytoch v transgénnom štádiu GV, ako sa ukázalo pomocou PCR v reálnom čase (D), imunocytochémie (F) a imunoblotu (G). (D) mRNA pre upstream-väzbový faktor (UBF), všadeprítomný Pol I transkripčný faktor, sa použila ako kontrola. (E) Údaje PCR v reálnom čase boli prevedené na percento hladiny mRNA bazonuklinu divokého typu a vynesené do grafu oproti údajom o plodnosti z C. (F) Oocyty boli zafarbené anti-basonuklínovou protilátkou (červená) a DAPI (modrá) a dva obrázky sú prekryté, aby indikovali polohu zárodočného vezikula v transgénnych oocytoch. Mierka: 10μm. (G) Pre každú transgénnu líniu boli analyzované dve duplicitné vzorky. Každá dráha obsahuje proteín extrahovaný z 50 oocytov. Po sondovaní na bazonuklin sa membrána stripovala a znovu sondovala protilátkou proti β-tubulínu. TG, transgénne oocyty neTG, netransgénne oocyty.

Naša analýza tiež ukázala vysokú špecifickosť zacielenia transgénneho RNAi prístupu v oocytoch, v súlade s predchádzajúcimi správami (Stein a kol., 2003 Fedoriw a kol., 2004 Yu a kol., 2004). V transgénnych oocytoch nebola pozorovaná žiadna detegovateľná zmena v množstve mRNA pre UBF, všadeprítomný Pol I špecifický transkripčný faktor (obr. 2D). Okrem toho sme nepozorovali žiadny rozdiel v množstve mRNA bazonuklinu 2, čo je blízko príbuzný homológ a zdieľa viac ako 57 % nukleotidovej sekvencie s bazonuklinom (Romano et al., 2004 Vanhoutteghem a Djian, 2004). Táto vysoká špecifickosť zacielenia je v súlade s predchádzajúcou správou, že transgénna RNAi cieli na oocyt Msy2 mRNA nemá žiadny vplyv na množstvo blízko príbuzných Msy4 transkript (Yu a kol., 2004). Tieto výsledky demonštrujú účinnosť a špecifickosť transgénneho RNAi prístupu. Teda, ako sa predpokladalo, narušenie funkcie bazonuklinu v oocytoch znižuje plodnosť (Tian et al., 2001).

Zvýšené zlyhanie vývoja oocytov v oocytoch s deficitom bazonuklinu

Aby sme charakterizovali príčinu fenotypu subfertility, najprv sme skúmali histológiu transgénnych vaječníkov. V porovnaní s kontrolou (obr. 3A, B) histologické rezy odhalili jasné zmeny vo folikulárnych štruktúrach v dospelých transgénnych vaječníkoch (obr. 3C, D), ktoré sa javili ako normálne vo veľkosti a hmotnosti. Aj keď sa počet folikulov javil ako neovplyvnený, niektoré folikuly vykazovali abnormálne morfológie, ktoré možno klasifikovať do dvoch samostatných kategórií. V prvej kategórii boli folikuly vždy veľké a oocyty obsahovali cytoplazmatické vezikuly alebo dutiny (obr. 3C, D, šípky), čo nebolo pozorované v netransgénnych vaječníkoch (obr. 3A, B). V druhej kategórii boli folikuly malé a nepravidelného tvaru a oocyty boli zjavne degradované a absorbované (obr. 3C, D šípky). Kumulus bunky v kontakte s degenerujúcim oocytom mali navyše zväčšené jadierka, ktoré boli intenzívne zafarbené hematoxylínom (obr. 3C, D). Transgénne vaječníky obsahovali corpora lutea, čo naznačuje, že došlo k ovulácii. Avšak v porovnaní s netransgénnymi vaječníkmi (obr. 3A,B), transgénne corpora lutea obsahovali viac buniek, vďaka čomu vyzerali tmavšie kvôli farbeniu jadier hematoxylínom (obr. 3C,D). Morfológia vaječníkov naznačovala heterogenitu v populácii transgénnych oocytov, niektoré oocyty zlyhali, zatiaľ čo iným sa podarilo dosiahnuť zrelosť.

Basonuklin-RNAi transgén ovplyvnil morfológiu vaječníkov a oocytov. Histológia netransgénnych (A,B) a T50 transgénne (C,D) vaječníky sú zobrazené v dvoch zväčšeniach: celý vaječník (A,C) a zväčšená oblasť (B,D). Šípky označujú folikuly, ktoré obsahujú abnormálne oocyty, šípky označujú zvyšky degenerujúcich folikulov. Folikuly a oocyty sú v transgénnom vaječníku zjavne normálne (*). cl, corpus luteum. Oocyty v štádiu GV boli izolované a pozorované vo fázovom kontraste (E,F) a diferenciálny interferenčný kontrast (DIC) (G,H) mikroskopia. Netransgénne oocyty sú zobrazené v E, G a transgénne v F, H. Šípky označujú príklady tmavých granúl v transgénnej cytoplazme (F) a hrbolčeky na povrchu transgénnych buniek (H). Transgénna populácia je heterogénna: sú prítomné morfologicky normálne aj abnormálne oocyty. Mierka: 50 μm v E 10 μm v H.

Basonuklin-RNAi transgén ovplyvnil morfológiu vaječníkov a oocytov. Histológia netransgénnych (A,B) a T50 transgénne (C,D) vaječníky sú zobrazené v dvoch zväčšeniach: celý vaječník (A,C) a zväčšená oblasť (B,D). Šípky označujú folikuly, ktoré obsahujú abnormálne oocyty, šípky označujú zvyšky degenerujúcich folikulov. Folikuly a oocyty sú v transgénnom vaječníku zjavne normálne (*). cl, corpus luteum. Oocyty v štádiu GV boli izolované a pozorované vo fázovom kontraste (E,F) a diferenciálny interferenčný kontrast (DIC) (G,H) mikroskopia. Netransgénne oocyty sú zobrazené v E, G a transgénne v F, H. Šípky označujú príklady tmavých granúl v transgénnej cytoplazme (F) a hrbolčeky na povrchu transgénnych buniek (H). Transgénna populácia je heterogénna: sú prítomné morfologicky normálne aj abnormálne oocyty. Mierka: 50 μm v E 10 μm v H.

Zrenie oocytov s deficitom bazonuklinu

Na charakterizáciu defektu oocytov s deficitom bazonuklinu sa izolovali GV-intaktné oocyty a pozorovali sa v kultúre. Izolované oocyty s najväčšou pravdepodobnosťou patrili do subpopulácie, ktorá prežila deficit bazonuklinu počas fázy rastu. Pozoruhodný rozdiel medzi netransgénnymi a transgénnymi GV-intaktnými oocytmi bol v tom, že asi 60 % z nich malo tmavú, granulárnu a dokonca nepriehľadnú cytoplazmu (obr. 3F, šípka ukazuje príklad). Táto cytoplazmatická zmena bola sprevádzaná zdrsnením povrchu oocytov, ako sa ukázalo pri diferenciálnej interferenčnej kontrastnej (DIC) mikroskopii (obr. 3G, H, šípka). Aby sa zistilo, či sa oocyty so zmenenou morfológiou líšia svojou schopnosťou dozrieť, izolovali sa GV-intaktné transgénne oocyty a rozdelili sa do dvoch skupín podľa ich transparentnosti cytoplazmy (priehľadné a svetlo nepriehľadné a tmavé) a kultivovali sa in vitro. Prekvapivo obidva transgénne GV-intaktné oocyty so svetlou alebo tmavou cytoplazmou dosiahli MII, čo dokazuje emisia prvého polárneho telieska, s výskytom podobným netransgénnym kontrolám (tabuľka 1). Tieto pozorovania silne naznačujú, že zmeny cytoplazmatického a bunkového povrchu neinterferovali s dozrievaním tejto subpopulácie. Tento záver bol potvrdený, keď sa zistilo, že počet vajíčok MII izolovaných z transgénnych myší aktivovaných PMSG/hCG je rovnaký v porovnaní s kontrolami (tabuľka 1).

Vlastnosti bazonuklinových-RNAi transgénnych oocytov a embryí

. Netransgénne. Transgénne (T50) . P hodnotu .
ovulácia (n=3) * 27.5±3.3 26.1±2.4 0.70
Jadrové dozrievanie (%) (n=3) †
GVBD 88.5±6.7 93.0±1.2 0.58
MII 57.9±10.3 61.5±6.3 0.79
Syntézy bielkovín(n=3) ‡ 5012±155 4846±224 0.53
Maximálny priemer samčích pronukleov (ľubovoľné jednotky pri 12 hpc) § 3.63±0.06 (n=37) 2.95±0.12 (n=34) <0,001
Penetrovaná polyspermia pri 12 hpc (%) ¶ 2.8±2.8 (n=37) 41.1±12.5 (n=36) 0.04
. Netransgénne. Transgénne (T50). P hodnota .
ovulácia (n=3) * 27.5±3.3 26.1±2.4 0.70
Jadrové dozrievanie (%) (n=3) †
GVBD 88.5±6.7 93.0±1.2 0.58
MII 57.9±10.3 61.5±6.3 0.79
Syntézy bielkovín(n=3) ‡ 5012±155 4846±224 0.53
Maximálny priemer samčích pronukleov (ľubovoľné jednotky pri 12 hpc) § 3.63±0.06 (n=37) 2.95±0.12 (n=34) <0,001
Penetrovaná polyspermia pri 12 hpc (%) ¶ 2.8±2.8 (n=37) 41.1±12.5 (n=36) 0.04

Priemerný počet zrelých oocytov izolovaných z vajcovodov troch myší po superovulácii

Percento kultivovaných oocytov v konkrétnom štádiu dozrievania

Inkorporácia metionínu [35S] vyzrážateľná kyselinou (cpm/oocyt) GV intaktných oocytov izolovaných zo 6-týždňových myší

Priemer troch sád embryí s 12 hpc: dve pozorované s epifluorescenciou a jedna s konfokálnou. Pronukley zafarbené DAPI sa merali pri ich maximálnom priemere. n je celkový počet analyzovaných embryí

Poly-pronukley sa použili ako indikátor na hodnotenie polyspermie. Sú uvedené priemery troch sád embryí. n je celkový počet analyzovaných embryí

Transkripcia sprostredkovaná Pol I je narušená v oocytoch s deficitom bazonuklinu

Kvôli predpokladanej úlohe bazonuklinu v transkripcii rRNA sme použili run-on test s BrUTP na vyhodnotenie transkripcie Pol I v rastúcich oocytoch s deficitom bazonuklinu, ktoré boli transkripčne aktívne (obr. 4), ako ukazuje inkorporácia BrdU do oboch nukleoplazmov. a jadierka (obr. 4A,B). V prítomnosti vysokej koncentrácie a-amanitínu sa inkorporácia BrU do nukleoplazmy zrušila, čo naznačuje, že transkripcia Pol II bola inhibovaná (obr. 4C, D). Za týchto podmienok sa intenzita fluorescencie v oocytoch s deficitom bazonuklinu znížila o -38 % (obr. 4E). Znížil sa aj počet transkripčných ložísk, kde je fluorescencia jasnejšia ako iné oblasti v jadierku, čo naznačuje intenzívnu inkorporáciu BrUTP, t.j. miesta transkripcie Pol I. Pretože rDNA je gén s viacerými kópiami, tieto ohniská pravdepodobne predstavujú kópie rDNA, ktoré sa aktívne transkribujú počas nábehového značenia. Hodnotenie počtu transkripčných lokusov optickým rozrezaním jadierka (obr. 4F,G) ukázalo, že počet ložísk bol znížený o ~25 % v T50 transgénnych oocytoch v porovnaní s kontrolami (P< 0,001) (obr. 4H). Napriek tomu sme nezistili ani významnú zmenu v hladine zrelej 28S a 18S rRNA testom ochrany RNázy (údaje nie sú uvedené), ani zjavnú zmenu v rýchlosti syntézy proteínov v rastúcich aj plne pestovaných transgénnych oocytoch (tabuľka 1).

Narušená transkripcia Pol II v oocytoch s deficitom bazonuklinu

Kvôli potenciálu bazonuklinu ako regulátora transkripcie Pol II sme skúmali účinok nedostatku bazonuklinu na transkripciu Pol II analýzou globálneho vzoru génovej expresie v plne pestovaných, GV-intaktných oocytoch pomocou mikročipovej analýzy. Po aktívnej perióde transkripcie počas prvých dvoch tretín rastu oocytov sa transkripcia zníži tak, že úplne vyrastený oocyt je v podstate transkripčne nehybný, čo zostane počas dozrievania oocytov, kým sa v neskorom jednobunkovom embryu nezačne expresia zygotického génu (Hamatani et al., 2004 Zeng a Schultz, 2005). Preto zloženie mRNA v štádiu GV intaktného odráža nielen kumulatívny účinok transkripcie Pol II počas rastu oocytov, ale je tiež zdrojom mRNA na začiatku dozrievania oocytov, a preto môže mať dôležitý vplyv na skorý embryonálny vývoj.

RNA oocytov štyroch netransgénnych a šiestich transgénnych myší sa analyzovali individuálne na génových čipoch Affymetrix MOE 430 2.0, ktoré obsahujú viac ako 34 000 transkriptov. Výsledné mikročipové dáta mali silnú tendenciu zhlukovať sa v kontrolných a transgénnych skupinách (obr. 5A), v porovnaní s nezaujatým zoznamom génov. Existovalo 772 a 253 génov, ktorých hladiny mRNA boli up- alebo downregulované viac ako dvojnásobne. Ako sa očakávalo, hladina mRNA bazonuklínu sa znížila 210-násobne, čo je najväčšia zmena medzi up- a downregulovanými génmi, hladina mRNA príbuzného bazonuklinu 2 nebola ovplyvnená. Analýza EASE (Hosack et al., 2003) (obr. 5B) ukázala, že gény, ktorých expresia bola upregulovaná viac ako dvojnásobne, patrili do štyroch procesov: transkripcia a väzba DNA (39,1 %), vývoj (17,5 %), medzibunkové spojenie/ extracelulárny priestor (11,3 %) a väzba kovových iónov (6,5 %), zatiaľ čo gény s downreguláciou viac ako dvojnásobne väčšinou súviseli s bunkovou pohyblivosťou/adhéziou (37,8 %), intracelulárnym transportom (30,0 %) a väzbou na proteíny (17,8 %). Aj keď je potrebné vidieť, ako tieto poruchy v génovej expresii prispeli k fenotypu, je jasné, že: (1) náš prístup RNAi bol účinný a vysoko špecifický (2) transkripty Pol II boli evidentne ovplyvnené nedostatkom bazonuklinu a (3) časť zvýšenej regulácie transkriptu bola pravdepodobne sekundárnou odpoveďou na nedostatok bazonuklinu (pozri tiež diskusiu). Okrem toho tieto výsledky podporujú návrh, že basonuklin reguluje transkripciu Pol II, okrem jeho funkcie ako regulátora transkripcie Pol I.

Transkripcia Pol I je znížená v bazonuklinových-RNAi transgénnych oocytoch. Nábehové testy sa uskutočnili na rastúcich oocytoch (14 dní) z kontroly (A,C,F) a línie T50 (B,D,G) v neprítomnosti (A,B) a prítomnosť (C,D) 100 ug/ml a-amanitínu. Inkorporovaný BrdU sa vizualizoval farbením nukleoplazmy anti-BrdU protilátkou značenou AlexFluor-488, ktoré je označené šípkami a jadierka šípkami. Intenzita fluorescencie jadierka v nábehu s a-amanitínom sa merala z mikrofotografie s ImageJ (non-T, n= 14 T50, n=10) a zobrazí sa priemer v ľubovoľných jednotkách (E). Jadierka 20 oocytov z každej skupiny boli opticky rozrezané (F, non-T ovládanie G, T50) a boli hodnotené transkripčné ohniská (jasne označené škvrny). Je zobrazený priemerný počet ložísk na oocyt (H). * P<0,05 ** P<0,001.

Transkripcia Pol I je znížená v bazonuklinových-RNAi transgénnych oocytoch. Nábehové testy sa uskutočnili na rastúcich oocytoch (14 dní) z kontroly (A,C,F) a línie T50 (B,D,G) v neprítomnosti (A,B) a prítomnosť (C,D) 100 ug/ml a-amanitínu. Inkorporovaný BrdU sa vizualizoval farbením nukleoplazmy anti-BrdU protilátkou značenou AlexFluor-488, ktoré je označené šípkami a jadierka šípkami. Intenzita fluorescencie jadierka v nábehu s a-amanitínom sa merala z mikrofotografie s ImageJ (non-T, n= 14 T50, n=10) a zobrazí sa priemer v ľubovoľných jednotkách (E). Jadierka 20 oocytov z každej skupiny boli opticky rozrezané (F, non-T ovládanie G, T50) a boli hodnotené transkripčné ohniská (jasne označené škvrny). Je zobrazený priemerný počet ložísk na oocyt (H). * P<0,05 ** P<0,001.

Mikročipová analýza oocytov s deficitom bazonuklinu. Oocytové RNA zo štyroch netransgénnych a šiestich transgénnych myší sa analyzovali pomocou Affymetrix Mouse Genome GeneChip MOE 430 v2. Nespracované údaje z mikročipov boli spracované programom GC-RMA alebo MAS 5 a analyzované softvérom SAM, GeneSpring a EASE. (A) Analýza zhlukovania vzoriek ukázala vysoký stupeň asociácie v rámci kontrolnej a transgénnej skupiny. (B) Analýza dráhy zoskupila upregulované gény do štyroch procesov a downregulované do troch procesov. Percentuálny podiel každej skupiny v kategórii so zvýšenou alebo zníženou reguláciou je označený dĺžkou stĺpca (čierna pre reguláciu smerom nahor a biela pre reguláciu so zníženou reguláciou).

Mikročipová analýza oocytov s deficitom bazonuklinu. Oocytové RNA zo štyroch netransgénnych a šiestich transgénnych myší sa analyzovali pomocou Affymetrix Mouse Genome GeneChip MOE 430 v2. Nespracované údaje z mikročipov boli spracované programom GC-RMA alebo MAS 5 a analyzované softvérom SAM, GeneSpring a EASE. (A) Analýza zhlukovania vzoriek ukázala vysoký stupeň asociácie v rámci kontrolnej a transgénnej skupiny. (B) Analýza dráhy zoskupila upregulované gény do štyroch procesov a downregulované do troch procesov. Percentuálny podiel každej skupiny v kategórii so zvýšenou alebo zníženou reguláciou je označený dĺžkou stĺpca (čierna pre reguláciu smerom nahor a biela pre reguláciu so zníženou reguláciou).

Oocyty s deficitom bazonuklinu vedú k skorému zlyhaniu embrya

Naša analýza izolovaných oocytov naznačila, že subfertilita nastala po dozrievaní oocytov a ovulácii. V súlade s tým sme skúmali schopnosť transgénnych oocytov byť oplodnené a podporovať predimplantačný vývoj. Oplodnené transgénne a kontrolné vajíčka sa odobrali pri -10 hpc, kultivovali sa a hodnotili sa vývojové štádiá pri 36, 60 a 84 hpc. Vývojová progresia transgénnych embryí bola jasne oneskorená alebo zastavená (obr. 6A). Pri 36 hpc dosiahli prakticky všetky netransgénne embryá dvojbunkové štádium, zatiaľ čo len 75 % a 40 % embryí T8 a T50 to dosiahli (obr. 6B). V tomto bode bolo 60 % embryí T50 v jednobunkovom štádiu a počas nasledujúcich 48 hodín sa niekoľko z nich odštiepilo a postúpilo za dvojbunkové štádium. Celkovo sa len veľmi málo embryí T50 mohlo vyvinúť po dvojbunkovom štádiu (obr. 6A, B). Hoci vývoj embryí T8 bol lepší, ~ 60 % z nich dosiahlo štádium blastocysty, rýchlosť vývoja bola napriek tomu pomalšia ako u kontrol. Akonáhle T8 transgénne embryá dosiahli osembunkové štádium, keď sa aktivuje čoraz väčší počet zygotických génov (Hamatani a kol., 2004 Wang a kol., 2004 Zeng a kol., 2004), ľahko sa vyvinuli do štádia blastocysty bez ďalšia strata (obr. 6B). Zaznamenali sme, že celkovo na konci tohto kultivačného obdobia (84 hpc alebo 3,5 dňa) sa 63 ± 11 % a 10 ± 3 % embryí T8 a T50 vyvinulo za štvor- až osembunkové štádiá, čo by mohlo zodpovedať za plodnosť týchto dvoch transgénnych línií (53 % a 10 %). Včasné embryonálne zlyhanie teda spôsobilo subfertilitu transgénnych samíc.

Pretože väčšina straty embryí nastala počas jedno- a dvojbunkového štádia, zamerali sme sa na vývoj počas tohto obdobia. Najprv sme hodnotili, či sa aktivácia genómu, ktorá je potrebná na vývoj po dvojbunkovom štádiu, vyskytla v dvojbunkových embryách s deficitom bazonuklinu (Schultz, 2002). Aktivácia genómu, ako sa testuje expresiou komplexu vyžadujúceho transkripciu (TRC), súboru štruktúrne príbuzných proteínov, ktoré sú akceptovanými markermi aktivácie genómu (Conover et al., 1991), sa vyskytla v transgénnych embryách v rovnakom rozsahu ako v kontroly (obr. 7M). Je teda nepravdepodobné, že zlyhanie aktivácie embryonálneho genómu bolo základom zlyhania vývoja, a preto sme sa pozreli na skoršie časy. V jednobunkových transgénnych embryách sme zaznamenali rôzne abnormality. Po prvé, a pripomínajúce transgénne oocyty (obr. 4G), sa transgénne jednobunkové embryá javili ako „drsné“ pod optikou Normaski (obr. 7A-D). Nukleárna morfológia transgénnych embryí bola tiež najvýraznejšie zmenená, samčie pronukleá mali o 18,7 % menší priemer ako kontrolné jadrá (obr. 7E-H, tabuľka 1), čo naznačuje zlyhanie dekondenzácie chromatínu. Distribúcia chromatínu/DNA obklopujúceho jadierko v transgénnych pronukleách sa tiež zreteľne líšila od distribúcie kontrol (obr. 7 Farrow). Najvýraznejším defektom však bola fragmentácia chromatínu, videná ako ďalšie kúsky DAPI-pozitívnych materiálov spolu s drobnými pronuklemi (obr. 7G, H, J). Polyspermia by mohla byť zdrojom ďalšieho chromatínu, pretože frekvencia polypronukleov pozorovaná v transgénnych jednobunkových embryách (12 hpc) sa zvýšila viac ako desaťnásobne (tabuľka 1). Ďalšou príčinou fragmentácie DNA bol pravdepodobne stres na segregujúci chromatín počas mitotického delenia, čo viedlo k nerovnomernej distribúcii DNA medzi dcérskymi bunkami (obr. 7K, L). Fragmentácia cytoplazmy bola rovnako častá ako fragmentácia jadra (obr. 7L). V transgénnych embryách sa však nepozoroval jediný spoločný defekt. Napriek týmto zlyhaniam nebola apoptotická dráha aktivovaná pri testovaní pomocou TUNEL (nezobrazené). Je veľmi pravdepodobné, že tento rozsah abnormalít je základom zníženej vývojovej kompetencie embryí pochádzajúcich z oocytov s deficitom bazonuklinu a najmä regulácie bunkového cyklu. V súlade s tým, v transgénnych jednobunkových embryách, náš výsledok naznačoval zníženie alebo blokovanie replikácie DNA (obr. 7M), čo bolo u netransgénnych embryí pozorované medzi 8 a 16 hodinami po oplodnení, ako už bolo uvedené (Moore a kol., 1996).

Preimplantačný vývoj transgénnych embryí bazonuklinu-RNAi.Vajíčka oplodnené in vivo boli odobraté a kultivované in vitro počas 84 hodín (3,5 dňa). (A) Vývoj transgénnych (T50) embryí bol zastavený v dvojbunkovom štádiu. (B) 36, 60 a 84 hodín po súloži sa hodnotili vývojové štádiá embryí a vyjadrili sa ako percento (± s.d.) populácie. Údaje sú priemerom troch experimentov, v ktorých bolo celkovo hodnotených 40-60 embryí pre každú transgénnu líniu. Mŕtva kategória zahŕňa zrútené, degenerované alebo fragmentované embryá 1C, jednobunkové, 2C, dvojbunkové (atď.) M/B, morula/blastocysta.

Preimplantačný vývoj transgénnych embryí bazonuklinu-RNAi.Vajíčka oplodnené in vivo boli odobraté a kultivované in vitro počas 84 hodín (3,5 dňa). (A) Vývoj transgénnych (T50) embryí bol zastavený v dvojbunkovom štádiu. (B) 36, 60 a 84 hodín po súloži sa hodnotili vývojové štádiá embryí a vyjadrili sa ako percento (± s.d.) populácie. Údaje sú priemerom troch experimentov, v ktorých bolo celkovo hodnotených 40-60 embryí pre každú transgénnu líniu. Mŕtva kategória zahŕňa zrútené, degenerované alebo fragmentované embryá 1C, jednobunkové, 2C, dvojbunkové (atď.) M/B, morula/blastocysta.


Všestranné úlohy proteínov MEIS pri chorobách

Gény MEIS majú tiež dôležité funkcie pri vrodených chorobách (rámček 2), leukémiách a solídnych rakovinách. Naozaj, Meis1, zakladajúci člen rodiny, bol objavený, keď bol jeho génový lokus prvýkrát identifikovaný ako miesto neoplastickej vírusovej integrácie v myšom modeli akútnej myeloidnej leukémie (AML) a MEIS1 dysregulácia bola následne uznaná ako kľúčová hnacia sila progresie ochorenia u niekoľkých typov ľudskej leukémie (Imamura a kol., 2002 Kawagoe a kol., 1999 Moskow a kol., 1995 Nakamura a kol., 1996 Rozovskaia a kol., 2001). Najmä pri leukémii s preskupeniami génov MLL [chromozomálne aberácie vrátane histónmetyltransferázy KMT2A („leukémia zmiešanej línie“), ktorá predstavuje agresívne formy ochorenia], množstvo publikovaných dôkazov podporuje úlohu proteínov rodiny MEIS pri podpore nádorov. bol podrobne preskúmaný (Argiropoulos a kol., 2007 Collins a Hess, 2016a,b Eklund, 2011). Správy o príspevku génov MEIS k solídnym nádorom sú naopak väčšinou náhodné. Pri zhoršení tejto situácie môže byť expresia rovnakého génu MEIS zvýšená u niektorých typov rakoviny, ale znížená u iných. Dokonca aj v rámci jednej nádorovej entity sa predpokladané onkogénne a nádorové supresívne úlohy pripisujú rovnakému transkripčnému faktoru MEIS (tabuľka 2).

MEIS1 mutácia je dôležitým rizikovým faktorom pre syndróm nepokojných nôh (RLS), neurologický stav charakterizovaný nočnými bolestivými pocitmi a s neurovývojovou zložkou (Hammerschlag a kol., 2017 Lane a kol., 2017 Schormair a kol., 2017 Spieler a kol. al., 2014 Winkelmann et al., 2007). Dodatočné MEIS1 mutácie boli spojené s fibriláciou predsiení, zatiaľ čo mutácie v MEIS2 gén zahŕňa srdcové defekty, dysmorfizmus tváre a intelektuálne postihnutie (Crowley a kol., 2010 Douglas a kol., 2018 Erdogan a kol., 2007 Fujita a kol., 2016 Giliberti a kol., 2019 Johansson a kol., 2014 Louw a kol. ., 2015 Pfeufer a kol., 2010). Ľudské vrodené chyby spojené s mutáciami MEIS teda odrážajú vývojovú expresiu MEIS rodinných príslušníkov v srdci, mozgu a neurálnej lište (Frank a Schulte, 2014 Maeda et al., 2001 Stankunas et al., 2008 Toresson et al., 2000).

Prehľad literatúry o génoch MEIS pri solídnej rakovine u človeka


Pozri si video: изнутри: как нас видят работодатели и что с этим делать (Smieť 2022).


Komentáre:

  1. Kajigore

    Ospravedlňujem sa, ale podľa mňa sa mýliš. Napíšte mi do PM, porozprávame sa.

  2. Mira

    Bravo, fráza výborná a je aktuálna

  3. Laefertun

    Don't you like it?



Napíšte správu