Informácie

Odkiaľ pochádzajú lyzíny počas ubikvitinácie?

Odkiaľ pochádzajú lyzíny počas ubikvitinácie?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Viem, že Ub tvorí izopeptidovú väzbu s lyzínom, ale odkiaľ ten lyzín pochádza?

Sú jednoducho vždy k dispozícii pre Ub, aby ich našiel počas procesu ubikvitinácie? Je k dispozícii voľný lyzín na každom z ďalších Ub pridaných do reťazca? Po pridaní prvého Ub na cieľový proteín, musí sa E2/E3 komplex viazať vždy, keď sa Ub pridá do reťazca?


Článok na Wikipédii o Ubiquitine poskytuje celkom dobrú odpoveď na vaše otázky. Ak chcete získať podrobnejšie odpovede, pozrite si uvedené články.

Sú jednoducho vždy k dispozícii pre Ub, aby ich našiel počas procesu ubikvitinácie?

Áno, tento [ubikvitinačný] proces najčastejšie viaže poslednú aminokyselinu ubikvitínu (glycín 76) na lyzínový zvyšok na substráte.

Je k dispozícii voľný lyzín na každom z ďalších Ub pridaných do reťazca?

Ubikvitín má sedem lyzínov a každý z nich sa môže viazať na N-koncový glycín ďalšieho ubikvitínu.

Musí sa po pridaní prvého Ub na cieľový proteín stále viazať komplex E2/E3 vždy, keď sa do reťazca pridá Ub?

Áno, ale toto je zložitejšie ako všeobecný mechanizmus. Poly-ubikvitínový reťazec môže byť pripojený rovnako ako jeden ubikvitín alebo jeden ďalší ubikvitín môže byť konjugovaný s existujúcim komplexom ubikvitín-proteín. Pozri napríklad Brown a kol. a David a kol.


Mechanizmy mono- a poly-ubikvitinácie: Špecifickosť ubikvitinácie závisí od kompatibility medzi katalytickým jadrom E2 a aminokyselinovými zvyškami proximálne k lyzínu

Ubikvitinácia zahŕňa pripojenie ubikvitínu k lyzínovým zvyškom na substrátových proteínoch alebo samotných, čo môže viesť k proteínovej monoubikvitinácii alebo polyubikvitinácii. Pripojenie ubikvitínu k rôznym lyzínovým zvyškom môže generovať rôzne štruktúry substrát-ubikvitín, ktoré cielia proteíny na rôzne osudy. Mechanizmy selekcie lyzínu nie sú dobre známe. Ubikvitinácia najväčšou skupinou E3 ligáz, RING-rodina E3, je katalyzovaná spoluprácou medzi nekatalytickou ubikvitín-ligázou (E3) a enzýmom konjugujúcim ubikvitín (E2), kde RING E3 viaže substrát. a E2 katalyzuje prenos ubikvitínu. Predchádzajúce štúdie naznačujú, že miesta ubikvitinácie sa vyberajú polohovaním lyzínu sprostredkovaným E3 smerom k aktívnemu miestu E2. Nakoniec na katalytickej úrovni nastáva ubikvitinácia lyzínových zvyškov v substráte alebo ubikvitíne nukleofilným útokom lyzínového zvyšku na tioesterovú väzbu spájajúcu E2 katalytický cysteín s ubikvitínom. Jedným z najlepšie študovaných komplexov RING E3/E2 je proteínový komplex Skp1/Cul1/F box, SCF Cdc4 a jeho príbuzný E2, Cdc34, ktoré sa zameriavajú na CDK inhibítor Sic1 pre polyubikvitináciu spojenú s K48, čo vedie k jeho proteazomálnej degradácii. Naše nedávne štúdie tohto modelového systému ukázali, že zvyšky obklopujúce Sic1 lyzíny alebo lyzín 48 v ubikvitíne sú pre ubikvitináciu rozhodujúce. Táto sekvenčná závislosť je spojená s evolučne konzervovanými kľúčovými zvyškami v katalytickej oblasti Cdc34 a môže určiť, či je Sic1 mono- alebo poly-ubikvitinovaný. Naše štúdie naznačujú, že aminokyselinové determinanty v katalytickej oblasti Cdc34 a ich kompatibilita s okolitými akceptorovými lyzínovými zvyškami hrajú dôležitú úlohu pri selekcii lyzínu. To môže predstavovať všeobecný mechanizmus pri riadení spôsobu ubikvitinácie v E2 s.


Kľúčové zložky APC reakcie

Ubikvitinácia proteínu pomocou APC vyžaduje spoluprácu štyroch proteínových zložiek: jadro APC, aktivátorová podjednotka, E2 a substrát (obrázok 3). Aktivátory, E2 a substráty sa všetky viažu reverzibilne k jadru APC s rôznymi afinitami a tiež navzájom interagujú. Aby sme pochopili príspevok každej z týchto zložiek k ubikvitinačnej reakcii, je užitočné najprv zhrnúť ich základné vlastnosti.

Štyri hlavné proteínové zložky v APC reakcii. Katalýza závisí od kooperatívnych interakcií medzi jadrom APC, aktivátorom, substrátom a E2.

Jadro APC

APC je približne 1 MDa, pevne spojený komplex 11 až 13 podjednotiek, ktoré sú vo všeobecnosti dobre konzervované v eukaryotoch (obrázok 4, tabuľka 1). APC je ubikvitín-proteínová ligáza typu cullin-RING [7], v ktorej podjednotky Apc2 a Apc11 obsahujú domény cullin a RING. Rovnako ako v iných ligázach cullin-RING, doména RING Apc11 interaguje priamo s E2 a doména cullin z Apc2 viaže Apc11 a pravdepodobne poskytuje rozšírenú kostru, ktorá spája tieto dve podjednotky so zvyškom enzýmu.

Jadro APC obsahuje viacero subkomplexov. Pučiace kvasinkové APC jadro je približne 1 MDa komplex s 13 podjednotkami (tabuľka 1), vrátane deviatich kľúčových podjednotiek uvedených tu. Jeden subkomplex (tmavozelený) obsahuje cullinovú podjednotku Apc2 a proteín RING domény Apc11, ktorý prijíma E2. Ďalší subkomplex (svetlozelený) obsahuje tri podjednotky obsahujúce TPR, Cdc27, Cdc23 a Cdc16, ako aj dve podjednotky, Apc4 a Apc5, ktoré ich pomáhajú spojiť so zvyškom APC cez Apc1. Podjednotky obsahujúce TPR poskytujú väzbové miesta pre aktivátor (Cdh1 alebo Cdc20), ktorý obsahuje aspoň dva motívy interakcie APC, motív Ile-Arg (IR) a C-box, ako aj veľkú opakujúcu sa sekvenciu WD40, ktorá je pravdepodobné, že vytvorí väzbové miesto podobné vrtuli pre substrát.

Analýza APC purifikovaných z kmeňov kvasiniek, ktorým chýbajú jednotlivé podjednotky, viedla k identifikácii subkomplexov APC (obrázok 4) [8]. Jedna obsahuje Apc2 a Apc11, ako aj tretiu podjednotku, Doc1. Doc1 obsahuje β-barelovú štruktúru známu ako doména Doc, ktorá sa v iných proteínoch podieľa na väzbe na malé ligandy a táto podjednotka môže prispievať k väzbe substrátu, ako bude uvedené neskôr. Ďalší subkomplex APC obsahuje tri veľké podjednotky (Cdc27, Cdc16 a Cdc23 v kvasinkách), ktoré nesú desať alebo viac kópií 34-zvyškového sekvenčného motívu nazývaného tetratrikopeptidová repetícia (TPR). Zdá sa, že tieto podjednotky sa spájajú postupne s APC, takže asociácia Cdc27 závisí od Cdc16 a asociácia Cdc16 závisí od Cdc23 [8]. Výpočty stechiometrie naznačujú, že podjednotky TPR sú na APC prítomné v dvoch kópiách [9, 10]. TPR vo všeobecnosti tvoria drážky viažuce proteín, a preto je pravdepodobné, že viaceré podjednotky TPR poskytnú veľké množstvo interakčných povrchov na jadre APC.

Dva subkomplexy APC drží pohromade najväčšia podjednotka APC, Apc1 (obrázok 4). Apc4 a Apc5 pomáhajú spojiť Apc1 so základňou subkomplexu TPR, Cdc23. Neesenciálne podjednotky Cdc26 a Swm1 (na obrázku nie sú zobrazené) pomáhajú stabilizovať asociáciu TPR podjednotiek so zvyškom APC [11, 12]. Cdc26 podporuje integritu APC vytvorením komplexu s TPR drážkami Cdc16 [13]. Funkcie ostatných podjednotiek APC zostávajú nejasné.

Niekoľko analýz elektrónového mikroskopu (EM) poskytlo pohľad na veľkosť a tvar APC [9, 10, 14–16]. Zdá sa, že pri rozlíšení okolo 30 Á kvasinkové APC tvoria trojuholníkovú časticu a lokalizácia jednotlivých podjednotiek značením protilátok je zhruba v súlade s architektúrou určenou zo subkomplexových štúdií [10, 16]. V štruktúre EM s najvyšším rozlíšením sú podjednotky TPR lokalizované v štruktúre „oblúkovej lampy“ a Apc2 sa nachádza v priľahlej oblasti „platformy“, kde sa E2 pravdepodobne viažu [16].

Aktivátor

Napriek svojej veľkej veľkosti má jadro APC malú aktivitu v neprítomnosti jedného z jeho aktivačných proteínov, Cdc20 alebo Cdh1 (tretí aktivátor, Amal, je exprimovaný výlučne v meióze a tu nebude diskutovaný [17]). Cdc20 sa spája s APC v skorej mitóze, čo vedie k deštrukcii cieľov, ktoré riadia nástup anafázy. Väzba Cdc20 na APC je podporovaná fosforyláciou viacerých podjednotiek APC [18–23]. Neskôr v mitóze je Cdc20 nahradený Cdh1, ktorý si zachováva aktivitu prostredníctvom nasledujúceho G1. Asociácia Cdh1 s APC závisí od defosforylácie Cdh1 [20, 24, 25].

Aktivátorové proteíny sa podieľajú na rozpoznávaní substrátu APC. Karboxy-terminálne oblasti Cdc20 a Cdh1 obsahujú doménu WD40, o ktorej sa predpokladá, že tvorí väzbovú platformu podobnú vrtuli, ktorá viaže substráty APC [26–29]. Je pravdepodobné, že sekvenčné variácie v doménach WD40 Cdc20 a Cdh1 vedú k rôznym substrátovým špecificitám. Tieto rozdiely v špecifickosti poskytujú mechanizmus na načasovanie deštrukcie rôznych APC cieľov v mitóze: Cdc20 sa zameriava na malý počet kľúčových substrátov na deštrukciu v metafáze, zatiaľ čo Cdh1 má širšiu špecifickosť, zameriavajúc sa na tieto proteíny a mnohé ďalšie v neskorej mitóze a G1 [ 30, 31].

Aktivátory tiež obsahujú aspoň dva sekvenčné motívy, Ile-Arg (IR) motív a C-box, ktoré sú potrebné na väzbu aktivátora k jadru APC. IR motív pozostáva z dvoch zvyškov na karboxylovom konci aktivátora a C-box je osemzvyškový motív blízko amino-konca [29, 32, 33]. Väzba aktivátora na APC je aspoň čiastočne sprostredkovaná podjednotkami TPR (obrázok 4): Cdh1 sa viaže priamo na Cdc27 in vitro [26, 32] a špecifické zvyšky v drážkach pre interakciu s proteínmi vytvorenými TPR v Cdc27 a Cdc23 sú potrebné na väzbu Cdh1 aj Cdc20 [34]. IR motív aktivátora sa viaže na TPR Cdc27 a zdá sa, že ďalšia neidentifikovaná aktivátorová oblasť viaže TPR na Cdc23 [34]. Väzbové miesto C-boxu zostáva neznáme, ale jednou z možností je podjednotka Apc2, pretože odstránenie Apc2 z APC znižuje väzbu aktivátora [8]. Tieto viacnásobné interakcie spolu vytvárajú veľmi vysokoafinitnú väzbu aktivátora na jadro APC a je pravdepodobné, že aktivátor zostáva viazaný počas viacerých udalostí viazania substrátu [34]. Nedávne EM analýzy naznačujú, že aktivátor sa nachádza medzi TPR oblúkovou lampou a Apc2, v ideálnej polohe na prezentovanie substrátov na napadnutie prichádzajúcich E2-ubikvitínových konjugátov [16].

Substrát

Zatiaľ čo E2 aj cieľový proteín sú počas ubikvitinácie chemicky zmenené, pre jasnosť používame termín „substrát“ na označenie ubikvitinovaného cieľa a nie E2. Dva základné substráty APC sú sekurín a mitotické cyklíny (obrázok 1) [35]. Degradácia sekurínu spúšťa separáciu sesterských chromatidov a na dokončenie mitózy je potrebná degradácia mitotických cyklínov. APC, najmä keď je naviazaný na Cdh1, tiež ubikvitinuje množstvo ďalších proteínov zapojených do rôznych aspektov mitotického výstupu [5].

Substráty sa špecificky viažu na komplex APC-aktivátor prostredníctvom degradačných sekvencií, z ktorých najlepšie sú D-box (RXXLXXXN) a KEN-box (KEN) [36, 37]. Hoci sekvencie D- a KEN-boxu sú potrebné na ubikvitináciu mnohých substrátov pomocou APC, často nie sú dostatočné, čo naznačuje, že substráty obsahujú ďalšie neidentifikované degradačné sekvencie [36, 37]. Mnohé substráty APC obsahujú nekanonické degradačné sekvencie, ktorým chýbajú jasné sekvenčné podobnosti [38–45]. Je pravdepodobné, že väčšina, ak nie všetky, APC substráty obsahujú viaceré degradačné sekvencie a môžu byť preto schopné multivalentných interakcií s komplexom APC-aktivátor.

Degradačné sekvencie a ubikvitinované lyzíny sa často nachádzajú v oblastiach substrátu, ktoré sú pravdepodobne neusporiadané. Napríklad globulárnej Cdk-väzbovej doméne cyklínov vo všeobecnosti predchádza neusporiadaná amino-koncová oblasť, ktorá obsahuje kritické sekvencie D- a KEN-boxu spolu s mnohými lyzínmi. Sekurín má tiež pravdepodobne neusporiadanú amino-koncovú APC-rozpoznávaciu oblasť susediacu s karboxy-koncovou funkčnou doménou. Separácia degradačných a funkčných domén môže zabrániť tomu, aby degradačný signál interferoval s normálnou funkciou proteínu, a tak by mohol uľahčiť vývoj regulačnej degradácie. Keďže na ich efektívne rozbalenie a translokáciu do proteazómového póru na degradáciu sú potrebné neposkladané sekvencie na amino alebo karboxylových koncoch proteínov [46, 47], tieto neposkladané oblasti môžu byť charakteristickým znakom všetkých cieľov degradácie.

E2 zdieľajú konzervatívnu jadrovú doménu s približne 150 aminokyselinami, vrátane centrálneho cysteínového zvyšku, ku ktorému je pripojený ubikvitín, niektoré E2 tiež obsahujú amino- alebo karboxy-koncové rozšírenia, ktoré prepožičiavajú ich funkciám špecifickosť. E2 sú nabité ubikvitínom pomocou enzýmu E1 aktivujúceho ubikvitín (obrázok 2a). Keďže E2 používajú rovnaké väzbové rozhranie na interakciu s E1 aj E3, E2 sa musia oddeliť od E3, aby boli nabité ubikvitínom [48]. Rýchlosť obratu E2 je veľmi rýchla: počas in vitro pri ubikvitinačných experimentoch môže APC pridať do substrátu až desať ubikvitínov v priebehu niekoľkých sekúnd (MR-B a MEM, nepublikované výsledky).

Ubikvitín-proteínové ligázy, ako je APC, katalyzujú dve odlišné reakcie: ligáciu ubikvitínov na rôzne substrátové lyzíny (nazývané viacnásobná monoubikvitinácia) a prenos ubikvitínov na špecifické lyzíny na predtým pripojených ubikvitínoch, čo vedie k vytvoreniu ubikvitínových reťazcov (nazývaných polyubikvitinácia) . Lyzínová špecificita je primárne určená E2. V kvasinkách napríklad Ubc4 podporuje pridanie ubikvitínov k substrátovým lyzínom, zatiaľ čo Ubc1 katalyzuje ubikvitináciu lyzínu 48 (K48) predtým pripojeného ubikvitínu, čo vedie k reťazcom spojeným s K48, ktoré sú rozpoznávané proteazómom [49]. Rôzne preferencie týchto E2 im umožňujú spolupracovať in vivo, takže Ubc4 pripája počiatočné ubikvitíny k substrátovým lyzínom a Ubc1 rozširuje tieto ubikvitíny na reťazce spojené s K48. U stavovcov má UbcH5, podobne ako jeho kvasinkový ortológ Ubc4, tendenciu vytvárať nešpecifické väzby na substrátové lyzíny [50, 51], zatiaľ čo E2-25K, podobne ako kvasinky Ubc1, generuje reťazce spojené s K48 [49, 52]. UbcH10 umožňuje APC vytvárať reťazce spojené s K11 [51].


Raschke, T. M., Kho, J. & Marqusee, S. Potvrdenie hierarchického skladania RNázy H: štúdia proteínového inžinierstva. Nat. Struct. Biol. 6, 825–830 (1999).

Kenniston, J. A., Burton, R. E., Siddiqui, S. M., Baker, T. A. & Sauer, R. T. Účinky stability lokálneho proteínu a geometrická poloha značky degradácie substrátu na účinnosť denaturácie a degradácie ClpXP. J. Struct. Biol. 146, 130–140 (2004).

Liu, T., Whitten, S. T. & Hilser, V. J. Ensemble založené podpisy šírenia energie v proteínoch: nový pohľad na starý fenomén. Štruktúra bielkovín. Funkcia. Genet 62, 728–738 (2006).

Martin, A., Baker, T. A. & Sauer, R. T. Rozvíjanie proteínu pomocou AAA + proteázy závisí od rýchlosti hydrolýzy ATP a energetických oblastí substrátu. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 139–145 (2008).

Xin, F. & Radivojac, P. Posttranslačné modifikácie vyvolávajú významné, ale nie extrémne zmeny v štruktúre proteínu. Bioinformatika 28, 2905–2913 (2012).

Swatek, K. N. & Komander, D. Modifikácie ubiquitinu. Cell Res. 26, 399–422 (2016).

Prakash, S., Tian, ​​L., Ratliff, K. S., Lehotzky, R. E. & Matouschek, A. Na účinnú proteazómom sprostredkovanú degradáciu je potrebné neštruktúrované iniciačné miesto. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 830–837 (2004).

Yu, H. & Matouschek, A. Rozpoznávanie klientskych proteínov proteazómom. Annu. Biophys. 46, 149–173 (2017).

Hagai, T., Azia, A., Tóth-Petróczy, Á. & Levy, Y. Vnútorná porucha v substrátoch ubikvitinácie. J. Mol. Biol. 412, 319–324 (2011).

Godderz, D. a kol. Proteazomálna degradácia nezávislá od Cdc48 sa zhoduje so zníženou potrebou ubikvitylácie. Sci. Rep. 5, 1–8 (2015).

Tsuchiya, H. a kol. In vivo analýza typu ubikvitínovej väzby odhaľuje, že os Cdc48-Rad23/Dsk2 prispieva k špecifickosti proteazómu spojeného s K48. Mol. Bunka 66, 488–502.e7 (2017).

Olszewski, M. M., Williams, C., Dong, K. C. & Martin, A. Cdc48 unfoldáza pripravuje dobre poskladané proteínové substráty na degradáciu proteazómom 26S. komun. Biol 2, 29 (2019).

Hagai, T. & Levy, Y. Ubiquitin neslúži len ako značka, ale tiež napomáha degradácii tým, že indukuje rozvinutie proteínu. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 2001–2006 (2010).

Gavrilov, Y., Hagai, T. & Levy, Y. Nešpecifické, ale rozhodujúce: ubikvitinácia môže ovplyvniť dynamiku natívneho stavu modifikovaného proteínu. Protein Sci. 24, 1580–1592 (2015).

Faggiano, S. & Pastore, A. Výzva produkcie ubikvitinovaných proteínov pre štrukturálne štúdie. Bunky 3, 639–656 (2014).

Morimoto, D., Walinda, E., Fukada, H., Sugase, K. & Shirakawa, M. Ubiquitylation priamo indukuje násobnú destabilizáciu proteínov. Sci. Rep. 6, 39453 (2016).

Cundiff, M. D. a kol. Receptory ubikvitínu sú potrebné na aktiváciu schopnosti rozvinutia proteazómu sprostredkovanú substrátom. Sci. Rep. 9, 14506 (2019).

Saeki, Y., Isono, E. & Toh-E, A. Príprava ubikvitinovaných substrátov metódou vkladania motívu PY na monitorovanie aktivity proteazómu 26S. Metódy Enzymol. 399, 215–227 (2005).

Kim, H. C., Steffen, A. M., Oldham, M. L., Chen, J. & Huibregtse, J. M. Štruktúra a funkcia HECT domény ubikvitín viažuceho miesta. EMBO Rep. 12, 334–341 (2011).

Kamadurai, H. B. a kol. Mechanizmus ligácie ubikvitínu a uprednostňovanie lyzínu pomocou HECT E3. eLife 2013, 1–26 (2013).

Khurana, Ritu, Hate, AnitaT., Nath, Utpal & Udgaonkar, J. B. pH závislosť stability barstar na chemickú a tepelnú denaturáciu. Protein Sci. 4, 1133–1144 (1995).

Myers, J. K., Pace, C. N. & Scholtz, J. M. Hodnoty denaturačného m a zmeny tepelnej kapacity: vzťah k zmenám v prístupných povrchových oblastiach odvíjania proteínov. Protein Sci. 4, 2138–2148 (1995).

Nolting, B. a kol. Dráha skladania proteínu vo vysokom rozlíšení od mikrosekúnd po sekundy. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 826–830 (1997).

Zaidi, F. N., Nath, U. & Udgaonkar, J. B. Viacnásobné medziprodukty a prechodové stavy počas rozkladu proteínov. Nat. Struct. Biol. 4, 1016–1024 (1997).

Park, C. & Marqusee, S. Sondovanie vysokoenergetických stavov v proteínoch proteolýzou. J. Mol. Biol. 343, 1467–1476 (2004).

Park, C. Sondovanie prechodného čiastočného rozvinutia v proteínoch proteolýzou v natívnom stave.Bio. Des.3, 117–128.

Bard, J.A.M., Bashore, C., Dong, K.C. & Martin, A. Proteazóm 26S využíva kinetickú bránu na uprednostňovanie degradácie substrátu. Bunka 177, 286–298.e15 (2019).

Bashore, C. a kol. Deubikvitináza Ubp6 riadi konformačnú dynamiku a degradáciu substrátu proteazómu 26S. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 1–10 (2015).

Chojnacki, M. a kol. Polyubikvitínovo-fotoaktivovateľné sieťovacie činidlá na mapovanie ubikvitínového interaktómu identifikujú Rpn1 ako proteazómovú podjednotku asociujúcu s ubikvitínom. Cell Chem. Biol. 24, 443–457.e6 (2017).

Lee, C., Schwartz, M. P., Prakash, S., Iwakura, M. & Matouschek, A. ATP-dependentné proteázy degradujú svoje substráty procesným uvoľňovaním z degradačného signálu. Mol. Bunka 7, 627–637 (2001).

Twomey, E. C. a kol. Spracovanie substrátu komplexom Cdc48 ATPázy sa iniciuje rozvinutím ubikvitínu. Veda 365, eaax1033 (2019).

De la Peña, A. H., Goodall, E. A., Gates, S. N., Lander, G. C. & Martin, A. Štruktúry proteazómu 26S zapojené do substrátu odhaľujú mechanizmy pre translokáciu riadenú hydrolýzou ATP. Veda 362, eaav0725 (2018).

Worden, E. J., Dong, K. C. & Martin, A. AAA motorom poháňaný mechanický spínač v Rpn11 riadi deubikvitináciu na 26S proteazóme. Mol. Bunka 67, 799-811.e8 (2017).

Greene, E. R. a kol. Špecifické kontakty základne veka v proteazóme 26S riadia konformačné prepínanie potrebné na zapojenie substrátu a degradáciu. eLife 8, https://doi.org/10.1101/687921 (2019).

Reichard, E. L. a kol. Ubikvitinácia substrátu riadi schopnosť rozvinutia proteazómu. J. Biol. Chem. 291, JBC.M116.720151 (2016).

Guo, Q. a kol. In situ štruktúra neuronálnych C9orf72 poly-GA agregátov odhaľuje nábor proteazómu. Bunka 172, 696–705.e12 (2018).

Komander, D. & Rape, M. Kód ubikvitínu. Annu. Biochem. 81, 203–229 (2012).

Sakamoto, K. M. a kol. Protacs: chimérické molekuly, ktoré cielia proteíny na komplex Skp1-Cullin-F box na ubikvitináciu a degradáciu. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 8554–8559 (2001).

Nowak, R. P. a kol. Plasticita vo väzbe prepožičiava selektivitu článku s degradáciou proteínov indukovanou ligandom. Nat. Chem. Biol. 14, 706–714 (2018).

Smith, B. E. a kol. Diferenciálna substrátová špecificita PROTAC diktovaná orientáciou získanej E3 ligázy. Nat. komun. 10, 1–13 (2019).

Huang, H. T. a kol. Chemoproteomický prístup na vyhľadávanie degradovateľného kinómu pomocou multikinázového degradátora. Cell Chem. Biol. 25, 88–99.e6 (2018).

Bondeson, D. P. a kol. Lekcie v dizajne PROTAC zo selektívnej degradácie s promiskuitnou hlavicou. Cell Chem. Biol. 25, 78–87.e5 (2018).

Batey, S., Nickson, A. A. & Clarke, J. Studying the folding of multidomain proteins. HFSP J. 2, 365–377 (2008).

Carrion-Vazquez, M. a kol. Mechanická stabilita ubikvitínu závisí od väzby. Nat. Struct. Biol. 10, 738–743 (2003).

Morimoto, D. a kol. Neočakávaná úloha polyubikvitínových reťazcov pri tvorbe fibrilárnych agregátov. Nat. komun. 6, 6116 (2015).

Sousa, R. & Lafer, E. M. Fyzika entropického ťahania: nový model pre motorový mechanizmus Hsp70. Int. J. Mol. Sci. 20, 2334 (2019).

Freudenthal, B. D., Gakhar, L., Ramaswamy, S. & Washington, M. T. Štruktúra monoubikvitinovanej PCNA a implikácie pre syntézu translézie a výmenu DNA polymerázy. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 479–484 (2010).

Varadan, R., Walker, O., Pickart, C. & Fushman, D. Štrukturálne vlastnosti polyubikvitínových reťazcov v roztoku. J. Mol. Biol. 324, 637–647 (2002).

Eddins, M. J., Varadan, R., Fushman, D., Pickart, C. M. & Wolberger, C. Štúdie kryštalickej štruktúry a roztoku NMR tetraubikvitínu spojeného s Lys48 pri neutrálnom pH. J. Mol. Biol. 367, 204–211 (2007).

Debelouchina, G. T., Gerecht, K. & Muir, T. W. Ubiquitin využíva kyslú povrchovú náplasť na zmenu štruktúry chromatínu. Nat. Chem. Biol. 13, 105–110 (2017).

Beckwith, R., Estrin, E., Worden, E. J. & Martin, A. Rekonštitúcia proteazómu 26S odhaľuje funkčné asymetrie v jeho AAA+ rozvinutí. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 1164–1172 (2013).

Matyskiela, M. E., Lander, G. C. & Martin, A. Konformačné prepínanie proteazómu 26S umožňuje degradáciu substrátu. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 781–788 (2013).

Pollard, T. D. MBOC technický pohľad: sprievodca jednoduchými a informatívnymi väzbovými testami. Mol. Biol. Bunka 21, 4061–4067 (2010).


Kerscher, O., Felberbaum, R. & Hochstrasser, M. Modifikácia proteínov ubikvitínom a proteínmi podobnými ubikvitínu. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 159–180 (2006).

Ulrich, H.D. & Walden, H. Ubiquitínová signalizácia pri replikácii a oprave DNA. Nat. Mol. Cell Biol. 11, 479–489 (2010).

Komander, D. & Rape, M. Kód ubikvitínu. Annu. Biochem. 81, 203–229 (2012).

Pickart, C.M. & Eddins, M. J. Ubiquitin: štruktúry, funkcie, mechanizmy. Biochim. Biophys. Acta 1695, 55–72 (2004).

Tokunaga, F. a kol. Zapojenie lineárnej polyubikvitylácie NEMO do aktivácie NF-κB. Nat. Cell Biol. 11, 123–132 (2009).

Scaglione, K.M. a kol. Enzým konjugujúci ubikvitín (E2) Ube2w ubikvitinuje N-koniec substrátov. J. Biol. Chem. 288, 18784–18788 (2013).

Tatham, M.H., Plechanovová, A., Jaffray, E.G., Salmen, H. & Hay, R.T. Ube2W konjuguje ubikvitín s a-aminoskupinami proteínového N-konca. Biochem. J. 453, 137–145 (2013).

Deshaies, R.J. & Joazeiro, C.A. RING doména E3 ubikvitín ligázy. Annu. Biochem. 78, 399–434 (2009).

Li, W. a kol. Genómová a funkčná anotácia ľudských E3 ubikvitín ligáz identifikuje MULAN, mitochondriálny E3, ktorý reguluje dynamiku a signalizáciu organel. PLoS ONE 3e1487 (2008).

Metzger, M.B., Hristova, V.A. & Weissman, A.M. Stručný pohľad na rodiny E3 ubikvitínových ligáz HECT a RING finger. J. Cell Sci. 125, 531–537 (2012).

Budhidarmo, R., Nakatani, Y. & Day, C.L. Prstene sú kľúčom k prenosu ubikvitínu. Trends Biochem. Sci. 37, 58–65 (2012).

Huibregtse, J.M., Scheffner, M., Beaudenon, S. & Howley, P.M. Rodina proteínov štrukturálne a funkčne príbuzných E6-AP ubikvitín-proteín ligáze. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 92, 2563–2567 (1995).

Wenzel, D.M. & Klevit, R.E. Po Ariadninom vlákne: nový pohľad na RBR ubikvitín ligázy. BMC Biol. 10, 24 (2012).

van Wijk, S.J. & Timmers, H.T. Rodina enzýmov konjugujúcich ubikvitín (E2s): rozhodovanie medzi životom a smrťou proteínov. FASEB J. 24, 981–993 (2010).

Wenzel, D.M., Stoll, K.E. & Klevit, R.E. E2s: štrukturálne ekonomické a funkčne plné. Biochem. J. 433, 31–42 (2011).

Wu, P.Y. a kol. Konzervovaný katalytický zvyšok v rodine enzýmov konjugujúcich ubikvitín. EMBO J. 22, 5241–5250 (2003).

Berndsen, C.E., Wiener, R., Yu, I.W., Ringel, A. E. & Wolberger, C. Konzervovaný asparagín má štrukturálnu úlohu v enzýmoch konjugujúcich ubikvitín. Nat. Chem. Biol. 9, 154–156 (2013).

Yunus, A.A. & Lima, C.D. Aktivácia lyzínu a funkčná analýza E2-sprostredkovanej konjugácie v dráhe SUMO. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 491–499 (2006).

Plechanovová, A., Jaffray, E.G., Tatham, M.H., Naismith, J.H. & Hay, R.T. Štruktúra RING E3 ligázy a E2 nabitého ubikvitínom pripravených na katalýzu. Príroda 489, 115–120 (2012).

Jin, L., Williamson, A., Banerjee, S., Philipp, I. & Rape, M. Mechanizmus tvorby ubikvitínového reťazca pomocou komplexu podporujúceho ľudskú anafázu. Bunka 133, 653–665 (2008).

Wickliffe, K.E., Lorenz, S., Wemmer, D.E., Kuriyan, J. & Rape, M. Mechanizmus predlžovania ubikvitínového reťazca s jednou podjednotkou E2. Bunka 144, 769–781 (2011).

Sakata, E. a kol. Kryštalická štruktúra medziproduktu UbcH5b ~ ubikvitín: pohľad na tvorbu konjugátov E2 ~ Ub, ktoré sa sami zostavia. Štruktúra 18, 138–147 (2010).

Eddins, M.J., Carlile, C.M., Gomez, K.M., Pickart, C.M. & Wolberger, C. Mms2–Ubc13 kovalentne viazaný na ubikvitín odhaľuje štrukturálny základ tvorby polyubikvitínového reťazca špecifického pre väzbu. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 915–920 (2006).

McKenna, S. a kol. Model konjugačného komplexu ľudského ubikvitínu viazaného na ubikvitín Mms2.Ubc13 založený na NMR: štrukturálny základ pre katalýzu lyzínového 63 reťazca. J. Biol. Chem. 278, 13151–13158 (2003).

Pruneda, J.N., Stoll, K.E., Bolton, L.J., Brzovic, P.S. & Klevit, R.E. Ubikvitín v pohybe: štrukturálne štúdie enzýmu konjugujúceho ubikvitín približne konjugátu ubikvitínu. Biochémia 50, 1624–1633 (2011).

Lorick, K.L. a kol. Prstencové prsty sprostredkovávajú ubikvitináciu závislú od enzýmu konjugujúceho ubikvitín (E2). Proc. Natl. Akad. Sci. USA 96, 11364–11369 (1999).

Bentley, M.L. a kol. Rozpoznanie UbcH5c a nukleozómu komplexom Bmi1/Ring1b ubikvitín ligázy. EMBO J. 30, 3285–3297 (2011).

Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K. & Huang, D. T. Štruktúra konjugátu ubikvitínu BIRC7 – E2 odhaľuje mechanizmus prenosu ubikvitínu pomocou RING diméru. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 876–883 (2012).

Yin, Q. a kol. E2 interakcia a dimerizácia v kryštálovej štruktúre TRAF6. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 658–666 (2009).

Zheng, N., Wang, P., Jeffrey, P.D. & Pavletich, N.P. Štruktúra komplexu c-Cbl-UbcH7: funkcia RING domény v ubikvitín-proteínových ligázach. Bunka 102, 533–539 (2000).

Liew, C.W., Sun, H., Hunter, T. & Day, C.L. Dimerizácia RING domény je nevyhnutná pre funkciu RNF4. Biochem. J. 431, 23–29 (2010).

Brzovic, P.S., Rajagopal, P., Hoyt, D.W., King, M.C. & Klevit, R.E. Štruktúra heterodimérneho komplexu RING-RING BRCA1–BARD1. Nat. Struct. Biol. 8, 833–837 (2001).

Buchwald, G. a kol. Štruktúra a E3-ligázová aktivita komplexu Ring-Ring polycomb proteínov Bmi1 a Ring1b. EMBO J. 25, 2465–2474 (2006).

Campbell, S.J. a kol. Molekulárne pohľady na funkciu proteínov hRNF8 a hRNF168 obsahujúcich RING finger (RNF) v ubikvitylácii závislej od Ubc13 / Mms2. J. Biol. Chem. 287, 23900–23910 (2012).

Ohi, M.D., Vander Kooi, C.W., Rosenberg, J.A., Chazin, W.J. & Gould, K.L. Štrukturálne pohľady na U-box, doménu spojenú s multi-ubikvitináciou. Nat. Struct. Biol. 10, 250–255 (2003).

Eletr, Z.M., Huang, D.T., Duda, D.M., Schulman, B.A. & Kuhlman, B. Enzýmy konjugujúce E2 sa musia odpojiť od svojich enzýmov El pred E3-dependentným ubikvitínom a prenosom podobným ubikvitínu. Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 933–934 (2005).

Lydeard, J.R., Schulman, B.A. & Harper, J.W. Budovanie a prestavba ubikvitínových ligáz Cullin-RING E3. EMBO Rep. 14, 1050–1061 (2013).

Skaar, J.R., Pagan, J.K. & Pagano, M. Mechanizmy a funkcia náboru substrátu proteínmi F-boxu. Nat. Mol. Cell Biol. 14, 369–381 (2013).

Hibbert, R.G., Huang, A., Boelens, R. & Sixma, T.K. E3 ligáza Rad18 podporuje skôr monoubikvitináciu než tvorbu ubikvitínového reťazca prostredníctvom E2 enzýmu Rad6. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 108, 5590–5595 (2011).

Mace, P.D. a kol. Štruktúry cIAP2 RING domény odhaľujú konformačné zmeny spojené s náborom enzýmu konjugujúceho ubikvitín (E2). J. Biol. Chem. 283, 31633–31640 (2008).

Ozkan, E., Yu, H. & Deisenhofer, J. Mechanistický pohľad na alosterickú aktiváciu enzýmu konjugujúceho ubikvitín ubikvitín ligázami typu RING. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 102, 18890–18895 (2005).

Plechanovová, A. a kol. Mechanizmus ubikvitylácie dimérnou RING ligázou RNF4. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 1052–1059 (2011).

Spratt, D.E., Wu, K., Kovačev, J., Pan, Z.Q. & Shaw, G.S. Selektívny nábor E2~ ubikvitínového komplexu pomocou E3 ubikvitín ligázy. J. Biol. Chem. 287, 17374–17385 (2012).

Dou, H. a kol. Štrukturálny základ pre autoinhibíciu a aktiváciu c-Cbl závislú od fosforylácie. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 184–192 (2012).

Reverter, D. & Lima, C.D. Pohľady na aktivitu E3 ligázy odhalené komplexom SUMO–RanGAP1–Ubc9–Nup358. Príroda 435, 687–692 (2005).

Pruneda, J.N. a kol. Štruktúra komplexu E3:E2~Ub odhaľuje alosterický mechanizmus zdieľaný medzi ligázami RING/U-box. Mol. Bunka 47, 933–942 (2012).

Bruice, T.C. & Pandit, U.K. Intramolekulárne modely zobrazujúce kinetickú dôležitosť „fitu“ v enzymatickej katalýze. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 46, 402–404 (1960).

Jencks, W.P. Katalýza v chémii a enzymológii (Dover, New York, 1987).

Saha, A., Lewis, S., Kleiger, G., Kuhlman, B. & Deshaies, R.J. Základná úloha interakcie enzýmu konjugujúceho ubikvitín-ubikvitín pri výboji ubikvitínu z cdc34 do substrátu. Mol. Bunka 42, 75–83 (2011).

Das, R. a kol. Allosterická aktivácia E2-RING prstom sprostredkovanej ubikvitylácie štruktúrne definovanou špecifickou E2-väzbovou oblasťou gp78. Mol. Bunka 34, 674–685 (2009).

Brzovic, P.S., Lissounov, A., Christensen, D.E., Hoyt, D.W. & Klevit, R.E.A. Nekovalentný komplex UbcH5 / ubikvitín je potrebný na procesnú ubikvitináciu riadenú BRCA1. Mol. Bunka 21, 873–880 (2006).

Das, R. a kol. Alosterická regulácia interakcií E2:E3 podporuje procesný ubikvitinačný stroj. EMBO J. 32, 2504–2516 (2013).

Notenboom, V. a kol. Funkčná charakterizácia domén Rad18 pre Rad6, ubikvitín, väzbu DNA a modifikáciu PCNA. Nucleic Acids Res. 35, 5819–5830 (2007).

Metzger, M.B. a kol. Štrukturálne jedinečná doména viažuca E2 aktivuje ubikvitináciu prostredníctvom ERAD E2, Ubc7p, prostredníctvom viacerých mechanizmov. Mol. Bunka 50, 516–527 (2013).

Huang, L. a kol. Štruktúra komplexu E6AP-UbcH7: pohľad na ubikvitináciu pomocou kaskády enzýmov E2–E3. Veda 286, 1321–1326 (1999).

Verdecia, M. A. a kol. Konformačná flexibilita je základom ligácie ubikvitínu sprostredkovanej WWP1 HECT doménou E3 ligázy. Mol. Bunka 11, 249–259 (2003).

Kamadurai, H.B. a kol. Pohľad na kaskády prenosu ubikvitínu zo štruktúry komplexu UbcH5B ∼ ubikvitín-HECT (NEDD4L). Mol. Bunka 36, 1095–1102 (2009).

Kamadurai, H.B. a kol. Mechanizmus ligácie ubikvitínu a uprednostňovanie lyzínu pomocou HECT E3. Elife 2e00828 (2013).

Maspero, E. a kol. Štruktúra ubikvitínom nabitej HECT ligázy odhaľuje molekulárny základ pre katalytické primovanie. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 696–701 (2013).

Ronchi, V. P., Klein, J. M. & Haas, A. L. E6AP/UBE3A ubikvitín ligáza obsahuje dve väzbové miesta E2~ ubikvitín. J. Biol. Chem. 288, 10349–10360 (2013).

Kim, H.C. & Huibregtse, J. M. Polyubikvitinácia pomocou HECT E3 a determinanty špecifickosti typu reťazca. Mol. Bunka. Biol. 29, 3307–3318 (2009).

Aguilera, M., Oliveros, M., Martinez-Padron, M., Barbas, J.A. & Ferrus, A. Ariadne-1: životne dôležité Drosophila Tento gén je potrebný pri vývoji a definuje novú konzervovanú rodinu proteínov prstencových prstov. genetika 155, 1231–1244 (2000).

Dawson, T.M. & Dawson, V.L. Úloha parkínu pri familiárnej a sporadickej Parkinsonovej chorobe. Mov. Porucha. 25, S32 – S39 (2010).

Wenzel, D.M., Lissounov, A., Brzovic, P.S. & Klevit, R.E. Profil reaktivity UBCH7 odhaľuje, že parkin a HHARI sú hybridy RING/HECT. Príroda 474, 105–108 (2011).

Duda, D.M. a kol. Štruktúra HHARI, RING-IBR-RING ubikvitín ligázy: autoinhibícia E3 rodiny Ariadne a pohľad na mechanizmus ligácie. Štruktúra 21, 1030–1041 (2013).

Riley, B.E. a kol. Štruktúra a funkcia ubikvitín ligázy Parkin E3 odhaľuje aspekty RING a HECT ligáz. Nat. komun. 4, 1982 (2013).

Trempe, J. F. a kol. Štruktúra parkínu odhaľuje mechanizmy aktivácie ubikvitín ligázy. Veda 340, 1451–1455 (2013).

Wauer, T. & Komander, D. Štruktúra domény ľudskej parkínovej ligázy v autoinhibovanom stave. EMBO J. 32, 2099–2112 (2013).

Stieglitz, B. a kol. Štrukturálny základ pre ligázovo špecifickú konjugáciu lineárnych ubikvitínových reťazcov pomocou HOIP. Príroda 503, 422–426 (2013).

Kirisako, T. a kol. Komplex ubikvitín ligázy zostavuje lineárne polyubikvitínové reťazce. EMBO J. 25, 4877–4887 (2006).

Chaugule, V.K. a kol. Autoregulácia Parkinovej aktivity prostredníctvom svojej domény podobnej ubikvitínu. EMBO J. 30, 2853–2867 (2011).

Burchell, L., Chaugule, V.K. & Walden, H. Malé, N-koncové značky aktivujú aktivitu ubikvitín ligázy Parkin E3 narušením jej autoinhibovanej konformácie. PLoS ONE 7e34748 (2012).

Cookson, M. R. Parkinsonizmus v dôsledku mutácií v PINK1, parkin a DJ-1 a oxidačný stres a mitochondriálne dráhy. Cold Spring Harb. Perspektíva. Med. 2, a009415 (2012).

Hofmann, K. & Bucher, P. Doména UBA: sekvenčný motív prítomný vo viacerých triedach enzýmov ubikvitinačnej dráhy. Trends Biochem. Sci. 21, 172–173 (1996).

Walden, H. & Martinez-Torres, R.J. Regulácia aktivity ubikvitín ligázy Parkin E3. Bunka. Mol. Life Sci. 69, 3053–3067 (2012).

Komander, D., Clague, M. J. & Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinase. Nat. Mol. Cell Biol. 10, 550–563 (2009).

Smit, J.J. a kol. E3 ligáza HOIP špecifikuje zostavenie lineárneho ubikvitínového reťazca prostredníctvom svojej domény RING-IBR-RING a jedinečného predĺženia LDD. EMBO J. 31, 3833–3844 (2012).

Stieglitz, B., Morris-Davies, A.C., Koliopoulos, M.G., Christodoulou, E. & Rittinger, K. LUBAC syntetizuje lineárne ubikvitínové reťazce cez tioesterový medziprodukt. EMBO Rep. 13, 840–846 (2012).

Smit, J.J. a kol. Cieľová špecifickosť E3 ligázy LUBAC pre ubikvitín a NEMO závisí od rôznych minimálnych požiadaviek. J. Biol. Chem. 288, 31728–31737 (2013).

Vijay-Kumar, S., Bugg, C.E. & Cook, W. J. Štruktúra ubikvitínu rafinovaná pri rozlíšení 1,8 Á. J. Mol. Biol. 194, 531–544 (1987).

Komander, D. a kol. Molekulárna diskriminácia štruktúrne ekvivalentných Lys63-viazaných a lineárnych polyubikvitínových reťazcov. EMBO Rep. 10, 466–473 (2009).

Datta, A.B., Hura, G.L. & Wolberger, C. The structure and conformation of Lys63-linked tetraubiquitin. J. Mol. Biol. 392, 1117–1124 (2009).

Cook, W.J., Jeffrey, L.C., Carson, M., Chen, Z. & Pickart, C.M. Structure of a diubiquitin conjugate and a model for interaction with ubiquitin conjugating enzyme (E2). J. Biol. Chem. 267, 16467–16471 (1992).

Wu, G. et al. Structure of a β-TrCP1-Skp1-β-catenin complex. Mol. Bunka 11, 1445–1456 (2003).

Zheng, N. et al. Structure of the Cul1–Rbx1–Skp1–F box Skp2 SCF ubiquitin ligase complex. Príroda 416, 703–709 (2002).

Duda, D.M. a kol. Structural insights into NEDD8 activation of cullin-RING ligases: conformational control of conjugation. Bunka 134, 995–1006 (2008).


Diskusia

Previously, we have shown that KLHL12 interacts with the polymorphic repeats of the D4R and enhances its ubiquitination [8] but this has no influence on receptor degradation [31]. In the present study we investigated which specific residues of the D4R are ubiquitinated by the KLHL12-Cullin3 E3 ligase complex. In the whole sequence of D4R there are only four lysine residues and all of them can potentially serve as ubiquitin binding sites as they are localized in the intracellular domains of the receptor. Using a site-directed mutagenesis approach each lysine was separately mutated to arginine. Next, sequential double IP experiments demonstrated that all four mutants are ubiquitinated and overexpression of KLHL12 increases their ubiquitination level ( Fig 2 ). This suggests that ubiquitination occurs on multiple lysines or that the ubiquitination system is flexible and when the most preferred ubiquitin binding site is unavailable it can ubiquitinate another available lysine. Next, we created the quadruple mutant HA D4.2 4KRR in which all four lysines were mutated to arginines. This mutant should be unable to undergo lysine-mediated ubiquitination. Surprisingly, we could still detect basal ubiquitination of this mutated receptor and upon co-expression of KLHL12 an increase in its ubiquitination was visualized ( Fig 3 ). This finding encouraged us to search for other possible ubiquitination sites in the D4R. Ubiquitination on non-lysine residues is still a poorly studied phenomenon and until now ubiquitination on the N-terminus [11�, 40], cysteine [14�], serine and threonine [17�] residues was described, but it has only been suggested once for a GPCR unfortunately without characterizing the precise amino acid residue [32]. In our study we investigated the possibility of ubiquitin binding to cysteine, serine and threonine residues within the intracellular domains of the D4R. One of the most common approaches to verify ubiquitination on a non-lysine residue is a chemical cleavage of ubiquitin [38]. Ubiquitin attached to a lysine residue forms an isopeptide bond which is very stable, whereas a thioester bond connecting ubiquitin with cysteine can be destroyed during treatment with a highly reducing agent e.g. a high concentration of DTT [15, 16, 36]. Our results clearly indicate that upon treatment with a very high concentration of DTT the ubiquitination signal detected after the second IP is significantly reduced for both WT D4.2R and D4.2 4KRR, suggesting ubiquitination on cysteine residues ( Fig 4 ).

Next, we examined the possibility of ubiquitination on serine and/or threonine residues. When ubiquitin is attached to a serine or threonine residue an oxyester bond is formed which is susceptible for cleavage in a strong alkaline environment [36, 37]. We have performed a ubiquitination assay in which, after the first IP, the samples were treated with NaOH and after the second IP a strong decrease in ubiquitination signal was observed ( Fig 5A ). These results thus suggest that D4R ubiquitination on cysteine, serine and/or threonine residues can be promoted by KLHL12. It is, however, not possible to say which residues are the most preferred for KLHL12-induced ubiquitination as quantification of the results from multiple independent experiments indicates a comparable decrease in ubiquitination levels for both types of treatments ( Fig 5B� ). The decrease is more explicit when Etag KLHL12 is co-expressed which suggests that during KLHL12-promoted ubiquitination more non-lysine residues in the D4R are ubiquitinated compared to the basally ubiquitinated receptor. This decrease is even more striking in case of the D4.2 4KRR mutant in which no lysine residues are available. This indicates that in the WT receptor KLHL12 promotes ubiquitination on lysine and non-lysine residues and in the D4.2 4KRR mutant, in which lysines are not available, only non-lysine residues are ubiquitinated. The fact that in all experiments we detect an overall lower ubiquitination signal from D4.2 4KRR ( Fig 5F ) compared to WT D4.2R further supports the hypothesis about the involvement of lysine residues in KLHL12-mediated ubiquitination of D4R. To exclude the possibility that the alkaline treatment affects amide bonds which are normally formed between ubiquitin and lysine residues we have also checked the influence of NaOH on ubiquitination of other GPCRs for which lysines were described as ubiquitin binding sites. We have used the CXCR4 receptor for which three lysines in the C-terminal tail were shown to be critical for receptor ubiquitination [26]. As a second receptor we used the β2AR for which lysines in the third intracellular loop and in the C-terminal tail were presented to be important for ubiquitination and subsequent lysosomal degradation [28]. In this control experiment (S3 Fig), we have seen again a very strong effect of NaOH treatment on basal and KLHL12-induced ubiquitination of D4.2R and no effect on CXCR4 and β2AR ubiquitination. This result allows us to conclude that the conditions used for alkaline treatment are not affecting amide bonds which are formed during the typical lysine-linked ubiquitination process. Most papers that study ubiquitination on non-lysine residues identified several different residues as possible ubiquitination sites. Some of them are most preferred by the ubiquitination machinery but when those are not available ubiquitin can bind to other amino acids. Such situation was described for example for NS-1 nonsecreted immunoglobulin light chain (NS-1 LC) which is predominantly ubiquitinated on serine/threonine residues but when these amino acids were mutated then lysine residues could serve as ubiquitin-binding sites. Mutation of all three types of amino acids (serines, threonines and lysines) was required to efficiently reduce ubiquitination and stabilize the NS-1 LC [37]. Another example represents the T-cell antigen receptor α-chain (TCRα) for which mutation of two conserved serine residues to alanines in the cytosolic tail inhibited significantly receptor ubiquitination. However, when serine residues were replaced with lysine, cysteine or threonine residues the protein was still ubiquitinated [17]. Our findings seem to be in agreement with this previously described phenomenon showing that the ubiquitination machinery is a very flexible system and can easily change from one to another ubiquitination site if necessary.

To obtain a direct proof of ubiquitination on a non-lysine residue we decided to perform mass spectrometry (MS) analysis. Detection of ubiquitination by MS is possible due to the di-glycine remnant that remains attached to the ubiquitinated residue after tryptic digestion [41]. We have performed MS/MS analysis using a Fourier transform mass spectrometer but no ubiquitination was detected. Unfortunately, during tryptic digestion D4R is cut to single amino acid or very large fragments making it very hard to analyze. The computational prediction of cleavage of D4R with other enzymes, commonly used to prepare samples for MS analysis, did not suggest any good alternative to trypsine that could resolve this problem. According to our knowledge non-conventional ubiquitination was never proved with MS analysis probably due to the labile nature of thio-/oxy-ester bonds which are formed between ubiquitin and non-lysine residues. So far, only one study described the use of a novel peptide-based SILAC method to identify non-conventional ubiquitination of T-cell receptor α [42]. The authors could identify modified peptide which did not contain lysine in its sequence, however, they were unable to pinpoint the specific residue that undergoes ubiquitination.

Therefore, it is not very surprising that the detection of ubiquitination of D4R with MS/MS was not successful.

However, and most importantly, all the obtained data allow us to conclude that KLHL12 can promote ubiquitination of D4R on non-lysine residues and that ubiquitination on cysteine, serine and/or threonine is possible. The functional role of this non-lysine ubiquitination is hard to study because it would require the creation of a receptor with all possible ubiquitination sites mutated. Mutation of all intracellular cysteines, serines and threonines increases the chances of disrupted protein folding and it can also interfere with other posttranslational modifications. GPCRs are tightly regulated by phosphorylation which mainly occurs on serine and threonine residues and also by palmitoylation on cysteine residues (conserved cysteines located on the C-terminus of many GPCR) and also D4R shows these posttranslational modifications. Additionally, this can also inhibit binding of some interacting proteins, e.g. β-arrestins for which often phosphorylation of the receptor is required and which also play a critical role in the regulation of GPCR signaling. Therefore, mutation of all of these residues increases the possibility of creating of a mutant with completely different signaling properties compared to the wild type receptor. In most of the examples of non-lysine ubiquitination, which were described up to now, this modification seems to serve as a signal for protein degradation [14, 17�, 21]. Only in the case of Pex5p receptor (cytosolic receptor for peroxisome matrix proteins) ubiquitination of conserved cysteine 11 was shown to be involved in regulation of the recycling of the receptor form the peroxisomes to cytosol [15]. To the best of our knowledge, ubiquitination of the non-lysine residue was suggested only once for a GPCR. The group of Shenoy has shown that β2AR is probably ubiquitinated on a non-lysine residue in response to the treatment with an antagonist, carvedilol, as they could still detect ubiquitination of the β2AR in which lysines were mutated. Interestingly, the same mutant was not ubiquitinated upon agonist, isoproterenol, treatment. Carvedilol-promoted ubiquitination is mediated by a completely different E3 ubiquitin ligase which is not involved in the, already well defined, lysine-mediated ubiquitination of β2AR. However, both types of ubiquitination lead to endocytosis and lysosomal sorting of the receptor [32].

In the second part of our study we investigated the ubiquitination status of the three most common D4R polymorphic variants. First, the interaction of KLHL12 with these variants was examined. After IP of HA-tagged receptors co-precipitation of Etag KLHL12 with D4.2R, D4.4R and D4.7R was detected ( Fig 6 ). As a negative control we used D4.0R which is an artificial receptor variant lacking the polymorphic repeats. Next, a double sequential IP was performed to investigate the ubiquitination status of the different polymorphic variants. Ubiquitination of D4.2R and D4.4R was clearly increased when Etag KLHL12 was co-expressed, but surprisingly we hardly observed increased D4.7R ubiquitination ( Fig 7A and 7B ), although this receptor variant is still able to form a complex with KLHL12 and Cullin3 ( Fig 8 ). The differential ubiquitination pattern of the D4.7R, compared to the other D4R variants, is highly interesting as until now there is hardly evidence for pharmacological differences between this variant and the other receptor variants [43�], although behavioral research showed that the D4.7R is linked with a predisposition to develop ADHD [6], and also its association with increased sexual behavior, alcohol and cigarette craving was suggested. The functional role of differential KLHL12-mediated ubiquitination of the D4R is still under investigation. This finding opens a lot of new questions for future research on the possible role of ubiquitination in receptor signaling and suggests that ubiquitination can regulate GPCRs in a much more complicated way than previously expected.


Abstraktné

Ubiquitin (Ub)-conjugating enzymes (E2s) and ubiquitin ligases (E3s) catalyze the attachment of Ub to lysine residues in substrates and Ub during monoubiquitination and polyubiquitination. Lysine selection is important for the generation of diverse substrate-Ub structures, which provides versatility to this pathway in the targeting of proteins to different fates. The mechanisms of lysine selection remain poorly understood, with previous studies suggesting that the ubiquitination site(s) is selected by the E2/E3-mediated positioning of a lysine(s) toward the E2/E3 active site. By studying the polyubiquitination of Sic1 by the E2 protein Cdc34 and the RING E3 Skp1/Cul1/F-box (SCF) protein, we now demonstrate that in addition to E2/E3-mediated positioning, proximal amino acids surrounding the lysine residues in Sic1 and Ub are critical for ubiquitination. This mechanism is linked to key residues composing the catalytic core of Cdc34 and independent of SCF. Changes to these core residues altered the lysine preference of Cdc34 and specified whether this enzyme monoubiquitinated or polyubiquitinated Sic1. These new findings indicate that compatibility between amino acids surrounding acceptor lysine residues and key amino acids in the catalytic core of ubiquitin-conjugating enzymes is an important mechanism for lysine selection during ubiquitination.

Protein ubiquitination plays a fundamental role in most cellular processes and involves three classes of enzymes (22). First, the 8-kDa protein ubiquitin (Ub) forms a thioester bond with the E1 Ub-activating enzyme. Ub is then transferred from E1 to the active-site cysteine of E2. Finally, E2s in conjunction with an E3 transfer Ub to a substrate lysine to form an isopeptide bond. E3 ligases are important for substrate recognition, and two major families exist. The RING (really interesting new gene) finger E3s, which lack catalytic activity, recruit the substrate and E2 into one complex to facilitate ubiquitination (19). Catalytic HECT (homologous to E6-AP carboxyl terminus) E3s accept Ub from E2 via a catalytic cysteine and then transfer Ub to a substrate lysine (22). The versatility of Ub in regulating different processes derives from its ability to be conjugated as a monomer (monoubiquitination) or polymer (polyubiquitination) to substrate lysines. Since Ub contains seven lysines, polyubiquitination can generate chains with different topologies (18). Monoubiquitination can regulate DNA repair, viral budding, trafficking, and gene expression (17). Polyubiquitination through Ub K11, K29, or K48 results in proteasomal degradation, while K63-linked Ub chains function in kinase activation, DNA damage tolerance, signal transduction, and endocytosis (17). In RING E3s the mode of ubiquitination (mono- or polymeric) and Ub linkage specificity are determined by E2, while HECT E3s specify the mode of ubiquitination with this family (11, 12).

The mechanisms that control mono- or polyubiquitination, chain topology, and lysine selection are poorly understood. Insights into this area have come from studies of the RING E3 ligase Skp1-Cdc53/cullin F-box (SCF) protein and its cognate E2, Cdc34, (19). One critical substrate of the budding yeast SCF Cdc4 /Cdc34 complex (superscript indicates the F-box protein) is Sic1. Sic1 is an inhibitor of the cyclin-dependent kinase (CDK) Cdc28 (29), containing a CDK-inhibitory domain within its C-terminal 70 amino acids (9). In Saccharomyces cerevisiae, G1-S-phase cell cycle progression depends on the SCF Cdc4 /Cdc34-mediated polyubiquitination of Sic1 on at least one of the six N-terminal lysine residues (K32, K36, K50, K53, K84, and K88) via K48-linked Ub chains, leading to its proteasomal degradation (9, 20). A Sic1 mutant missing these six lysines is still ubiquitinated on the remaining 14 lysines in vitro but is not degraded and is stable in vivo, leading to cell cycle arrest (20).

While a Ub chain on any one of six Sic1 N-terminal lysines sustains proteolysis, the turnover rates vary by 5-fold between the K36 and K84 sites, indicating that the context of the Ub chain is important (20). How SCF Cdc4 /Cdc34 ubiquitinates different Sic1 lysines and whether a lysine preference exists are poorly understood, but a “positioning model” has been proposed, where E3 positions substrate lysines favorably for the attack of the E2∼Ub thioester bond (19, 37). Previous studies suggested that the number of substrate ubiquitination sites correlates with the number of its F-box protein binding sites (8, 33, 37). For example, the ubiquitination of β-catenin and I㮫α is directed by a single high-affinity F-box protein binding site, and changes to the distance between the binding site and the lysine affect catalysis by 𢏂-fold (37). The phosphorylation of Sic1 on multiple CDK sites at the N terminus generates several low-affinity Cdc4 binding sites that dynamically bind Sic1 to the single site of Cdc4 in various geometries, leading to ubiquitination on numerous lysines. The directed binding of Sic1 to Cdc4 through a single artificial high-affinity binding site at the extreme N terminus confines efficient ubiquitination to lysines K84 and K88 (33). Sic1 lysine selection flexibility may also be achieved by the dimerization of the RING E3/E2 complex (8, 33). In addition, the neddylation of the cullin subunit induces conformational variation to the E2, enhances the recruitment of E2 to SCF, and brings substrate lysines toward the Cdc34∼Ub thioester to accommodate the ubiquitination of different lysines (6, 25). Lysine selection flexibility may also be achieved by the release of the ubiquitin-charged Cdc34∼Ub from SCF to transfer Ub to different substrate lysines, as proposed by the “hit-and-run” hypothesis (5). Apart from higher-order structures contributing to lysine selection flexibility, studies with the human anaphase-promoting complex (APC/C) RING E3 and its E2, UbcH10, have identified a sequence motif adjacent to acceptor lysines, termed the TEK box, which is important for lysine selection (11).

Similar to the E3-mediated positioning of substrate lysines, structural aspects of E2s position Ub lysines to generate Ub chains of different topologies by RING E3/E2 complexes (11, 12). Structural studies of Mms2/Ubc13-Ub demonstrate that this complex assembles so that K63 of Ub is positioned proximal to the Ubc13-Ub thioester bond during Ub chain formation (35). Similarly, Cdc34 dimerization, a noncovalent Ub binding domain (UBD), and structural constraints such as an acidic loop region were suggested previously to position K48 of Ub for the attack of the Cdc34∼Ub thioester bond (21, 36). However, E2s such as human UbcH5 utilize all Ub lysines but display a preference for K11, K48, and K63, indicating less structural constraint and that other mechanisms contribute to Ub lysine preference (12).

To further elucidate the mechanisms of lysine specificity, we assessed the SCF Cdc4 /Cdc34-mediated ubiquitination of Sic1's N-terminal lysines and K48 in Ub. SCF Cdc4 /Cdc34 displayed a strong preference for Sic1 K53. Changes to proximal amino acids regulated the rate of ubiquitination in Sic1 and K48 of Ub. This was linked to key residues composing the catalytic core of Cdc34. The mutation of these core sites differentially affected Cdc34 preference toward lysines on Sic1 or Ub K48. Our studies demonstrate that in addition to the importance of the SCF/Cdc34-mediated positioning of lysines, efficient catalysis is dependent on residues surrounding ubiquitinated lysines and their compatibility with the Cdc34 catalytic core residues. We propose that this compatibility is an important mechanism for lysine selectivity during ubiquitination.


Ubiquitin Specific Peptidase 16

Normal Function and Disease Involvement

Histone ubiquitination occurs primarily on histone H2A and H2B with ubiquitination levels between 5–15% and 0.1–1% for histone H2A and H2B respectively [29,30] . Histone H2A is ubiquitinated by Polycomb Repressive Complex 1 catalytic subunit Ring1b [31–33] . H2A ubiquitination is strongly associated with gene repression. Usp16 opposes the activity of Ring1b by removing ubiquitin from H2A lysine 119 [10] . Histone H2A deubiquitination has been shown to play pivotal roles in cell cycle progression, gene expression and DNA damage response [5,10,11] .

Early work demonstrated a requirement for Usp16 deubiquitinase activity during mitosis. A catalytically inactive Usp16 mutant was found to coat mitotic chromosomes and block cell cycle progression [5] . Subsequently, it was discovered that Usp16 H2A deubiquitination is required for the Aurora B catalyzed Ser-10 phosphorylation of H3 [10] . The phosphorylation status of Usp16 changes sequentially during cell cycle progression, possibly through the activity of cdc-2/cyclin B [5] . Although changes in phosphorylation state have not been associated with altered deubiquitinase activity in vitro, the phosphorylation state of Usp16 may control its cellular localization, oligomerization state, or may serve as a docking site for associating proteins.

Characterizations of the H2A ubiquitin ligase Ring1b established the importance of H2A ubiquitination for Hox gene repression and X chromosome inactivation [31–33] . Usp16 mediated H2A deubiquitination is required for Hox gene expression [10] . Developmental studies in X. laevis demonstrate that Usp16 catalyzed H2A deubiquitination of Hox genes is required for proper Hox gene expression and posterior body patterning [10] .

Recapitulating its role in gene expression, Usp16 also reverses the ubiquitin H2A stimulated transcriptional repression that occurs during DNA damage response [11] . Following DNA damage, H2A is rapidly ubiquitinated for several hundred kilobases from the site of damage. The ubiquitination of H2A following DNA damage is associated with transcriptional silencing and is required for the recruitment of DNA damage repair proteins [34,35] . Usp16 participates in the restoration of normal gene expression following damage repair by deubiquitinating H2A [11] .

Recent characterization of the genome and epigenome of human breast tumors and leukemias has revealed that Usp16 is consistently downregulated in cancer cells. In addition to the genetic changes which initiate cancer, general epigenetic misregulation is common in tumors, including epigenetic silencing of tumor suppressors and activation of oncogenes. It is theorized that Usp16 downregulation could be associated with stable gene silencing following DNA damage [11] . Alternatively, Usp16 downregulation may influence global gene expression levels. Additionally, genetic inversions involving Usp16 and RUNX1 (a key regulator of hematopoiesis) have been observed in chronic myelomonocytic leukemias. The inversion results in the partial deletion of Usp16 and Runx1 and the creation of a new Usp16-Runx1 fusion protein [36] . The pathogenic potential of Usp16 downregulation and deletions has not been thoroughly explored.


Abstraktné

Endocytosis and targeting of growth factor receptors for lysosomal degradation have been associated with ubiquitination of the intracellular part of the receptors. To elucidate the role of receptor ubiquitination in internalization and sorting of fibroblast growth factor receptor (FGFR), we constructed several mutants of FGFR1 in which lysines, potential ubiquitination sites, were substituted for arginines. Substitution of all lysine residues in the intracellular part of FGFR1 resulted in inactivation of the tyrosine kinase domain of the receptor. However, several multilysine FGFR1 mutants, where up to 26 of 29 lysines in the intracellular part of the receptor were mutated, retained tyrosine kinase activity. The active multilysine mutants were poorly ubiquitinated, but internalized normally, indicating that ubiquitination of the receptor is not required for endocytosis. In contrast, degradation of the multilysine mutants was dramatically reduced as the mutants were inefficiently transported to lysosomes but rather sorted to recycling endosomes. The altered sorting resulted in sustained signaling. The duration of FGFR1 signaling seems to be tightly regulated by receptor ubiquitination and subsequent sorting to the lysosomes for degradation.


Additional Information

Prístupové kódy: Coordinates and structure factors have been deposited in the RCSB protein data bank (PDB) under accession codes: 5KTY (hMiro1-BC_Ca 2+ ), 5KU1 (hMiro1-BC_GDP), 5KSZ (hMiro1-BC_GMPPCP), 5KSP (hMiro1-C C2221), 5KSY (hMiro1-C P41212), 5KSO (hMiro1-C P3121), 5KUT (hMiro2-C).

How to cite this article: Klosowiak, J. L. a kol. Structural insights into Parkin substrate lysine targeting from minimal Miro substrates. Sci. Rep. 6, 33019 doi: 10.1038/srep33019 (2016).



Komentáre:

  1. Rasheed

    Súhlaste, sú to pozoruhodné informácie

  2. Morvan

    For the life of me, I don't know.

  3. Chilton

    Hanba a hanba!

  4. Gomuro

    OOOOOOOOOOOOOOO!! Toto som už dlho chcel vidieť!!!!

  5. Jawhar

    Súhlasím, skôr zábavný názor



Napíšte správu