Informácie

Knockdown dlhej nekódujúcej RNA (lncRNA) – ako sa to robí?

Knockdown dlhej nekódujúcej RNA (lncRNA) – ako sa to robí?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Nepracujem v mokrom laboratóriu a nepoznám všetky podrobnosti o technikách zrážania.
Moja otázka znie:
Ako sa vykonáva knockdown lncRNA?
Napríklad - máte lncRNA funkčné v jadre. Ako je možné urobiť knockdown pomocou iRNA, ak k interferencii dochádza iba v cytoplazme?
Ospravedlňujem sa, ak je v mojej otázke mylná predstava o biológii.


Knockdown lncRNA u cicavcov sa neuskutočňuje prostredníctvom RNAi. Namiesto toho sa prenášajú antisense DNA oligo, ktoré sa viažu na RNA. To spúšťa činnosť enzýmu RNázy H, ktorý degraduje duplexy RNA-DNA. Degraduje lncRNA.

AKTUALIZÁCIA: Pre informáciu, dozvedel som sa o tom zo seminára a nie je to veľmi dobre zdokumentované, ale po nejakom hľadaní literatúry som našiel tento článok, ktorý môžem citovať:

Hoci sme (obr. 3A) a iní (42, 49) použili siRNA na zníženie NEAT1 lncRNA a hoci knockdown striktne nukleárnych RNA bol dobre popísaný (53, 54), zostali sme znepokojení tým, že NEAT1 je väčšinou jadrový RNA (55), nemusí byť veľmi efektívne zameraná RNAi mašinériou. Jadrové RNA sú však efektívne cielené pomocou komplementárnych antisense (AS) oligodeoxynukleotidov, ktoré získavajú aktivitu jadrovej RNázy H na degradáciu RNA (56). Preto sme tiež použili komplementárne AS oligodeoxynukleotidy na zníženie NEAT1 lncRNA v HIV-1 NL4-3-infikovaných Jurkat bunkách (obr. 4C, vľavo). AS prístup znížil NEAT1 (obr. 4C, vľavo) a zvýšil HIV-1 p24 produkciu (obr. 4C, vpravo), čo poskytuje výsledky konzistentné s výsledkami z knockdownu NEAT1 sprostredkovaného siRNA (obr. 4A a B).


Dochádza k jadrovej RNAi... pozrite si tieto články:

http://www.nature.com/nrg/journal/v14/n2/execsumm/nrg3355.html

http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2011/11/07/nar.gkr891.full

Existuje tiež určitý dôkaz, že Ago2 sa viaže na lncRNA.

Môžete však použiť iné techniky na potlačenie lncRNA napr. ribozýmy.


To je kontroverzné, ale väčšina skupín v tejto oblasti dospela k záveru, že RNAi nefunguje v jadre napriek prítomnosti Ago. Keď boli lncRNA KD'd s RNAi, zvyčajne sa ukázalo, že sú prítomné v jadre aj v cytoplazme a predpokladá sa, že KD sa vyskytuje v cytoplazme, nie v jadre. Samozrejme ako vždy v biológii je možné, že jadrová RNAi sa vyskytuje v niektorých typoch buniek alebo za určitých špeciálnych podmienok. Gapmer oligonukleotidy pôsobiace prostredníctvom RNAseH sú zvyčajne vynikajúcim spôsobom, ako dosiahnuť KD jadrovú lncRNA, ale dodal by som, že by ste mali byť pripravení otestovať povedzme 6 alebo viac rôznych oligonukleotidov, pretože účinnosť je nepredvídateľná a na rozdiel od RNAi neexistujú žiadne veľké všeobecne dostupné algoritmy pre návrh antisense oligo.


Knockdown dlhej nekódujúcej RNA CCAT2 inhibuje bunkovú proliferáciu, inváziu a epiteliálny a mezenchymálny prechod v bunkách gliómu

Pridruženia: 1: Oddelenie kontroly infekcií, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan, provincia Hubei, P.R. China 2: Neurochirurgické oddelenie, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan, provincia Hubei, P.R. China 3: Oddelenie PET centra a Ústav anestéziológie a bolesti, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei Province, P.R. China

Dátum zverejnenia: 5. июля 2017 г.

Tento článok bol sprístupnený online 17. novembra 2016. ako Fast Track článok s názvom: "Knockdown dlhej nekódujúcej RNA CCAT2 inhibuje bunkovú proliferáciu, inváziu a EMT v gliómových bunkách".

Predtým: Onkologický výskum zahŕňajúci dizajn protirakovinových liekov
Oncology Research Featuring Preklinická a klinická rakovina Therapeutics publikuje výskum najvyššej kvality, ktorý prispieva k pochopeniu rakoviny v oblastiach molekulárnej biológie, bunkovej biológie, biochémie, biofyziky, genetiky, biológie, endokrinológie a imunológie, ako aj štúdie o mechanizme o pôsobení karcinogénov a terapeutických činidiel, správy zaoberajúce sa prevenciou a epidemiológiou rakoviny a klinické skúšky vymedzujúce účinné nové terapeutické režimy.

Od zväzku 23 je Onkologický výskum zahŕňajúci predklinickú a klinickú terapiu rakoviny otvoreným prístupom podľa podmienok licencie Creative Commons CC BY-NC-ND.


Knockdown dlhej nekódujúcej RNA (lncRNA) – ako sa to robí? - Biológia

Požiadali ste o strojový preklad vybraného obsahu z našich databáz. Táto funkcia je poskytovaná výhradne pre vaše pohodlie a v žiadnom prípade nie je určená na nahradenie ľudského prekladu. Ani BioOne, ani vlastníci a vydavatelia obsahu neposkytujú a výslovne odmietajú akékoľvek výslovné alebo implicitné vyhlásenia alebo záruky akéhokoľvek druhu, vrátane, bez obmedzenia, vyhlásení a záruk týkajúcich sa funkčnosti funkcie prekladu alebo presnosti alebo úplnosti preklady.

Preklady sa v našom systéme neuchovávajú. Vaše používanie tejto funkcie a prekladov podlieha všetkým obmedzeniam používania uvedeným v podmienkach používania webovej stránky BioOne.

Knockdown dlhej nekódujúcej RNA CCDC144NL-AS1 zmierňuje fenotypy migrácie a invázie v endometriálnych stromálnych bunkách z endometriózy

Chen Zhang, 1 Wei Wu, 2 Honglan Zhu, 3 Xiaoming Yu, 4 Yinli Zhang, 5 Xue Ye, 1 Hongyan Cheng, 1 Ruiqiong Ma, 1 Heng Cui, 1 Jianjun Luo />https://orcid.org/0000- 0002-5550-9889 , 2,* Jing Guan, 4,* Xiaohong Chang />https://orcid.org/0000-0002-9879-2266 1,**

11Centrum gynekologickej onkológie, Pekingská univerzitná ľudová nemocnica, Peking, Čína
2 2Kľúčové laboratórium biológie RNA, Ústav biofyziky, Čínska akadémia vied, Peking, Čína
3 3Klinika pôrodníctva a gynekológie, Pekingská univerzitná ľudová nemocnica, Peking, Čína
4 4Centrum reprodukčnej medicíny, Pekingská univerzitná ľudová nemocnica, Peking, Čína
5 5Oddelenie patológie, Pekingská univerzitná ľudová nemocnica, Peking, Čína

* JL a JG spoločne režírovali túto prácu a mali by sa považovať za spolukorešpondentov.
** Korešpondencia: Centrum gynekologickej onkológie, Pekingská univerzitná ľudová nemocnica, č. 11 Xizhimen South Str., okres Xicheng, Peking 100044, Čína. Tel: +86-10-88324473 Fax: +86-10-88324472 E-mail: [email protected]

Zahŕňa PDF a HTML, ak sú k dispozícii

Tento článok je dostupný iba pre predplatiteľov.
Nie je k dispozícii na individuálny predaj.

Endometrióza (EM) je záhadné a komplikované ochorenie, o ktorom sa zistilo, že je multifaktoriálne. Nedávne štúdie ukázali, že dlhé nekódujúce RNA (lncRNA) hrajú dôležitú úlohu v patogenéze EM. Funkčné a biologické mechanizmy lncRNA v EM však zostávajú neznáme. Tu sme vykonali mikročipové analýzy na porovnanie profilov expresie lncRNA štyroch párových ektopických endometriálnych (EC) tkanív a eutopických endometriálnych (EU) tkanív od pacientov s EM vaječníkov. Nová lncRNA, CCDC144NL-AS1, bola identifikovaná ako potenciálne funkčná. Expresia CCDC144NL-AS1 bola zvýšená v tkanivách EC v porovnaní s EÚ a normálnymi tkanivami endometria (NE). Jeho expresia bola vyššia v tkanivách EC ako v tkanivách EÚ u 86,7 % (26/30) pacientov s EM. Napriek tomu, že podľa revidovaných štádií American Fertility Society (rAFS) nedošlo k významnému zvýšeniu, približne 60 % prípadov EM štádia VI vykazovalo vyššie hladiny CCDC144NL-AS1, oveľa viac ako v prípadoch štádia II–III. Subcelulárna frakcionácia ukázala, že CCDC144NL-AS1 bol lokalizovaný v cytoplazme a jadre imortalizovanej endometriálnej stromálnej bunkovej línie hEM15A odvodenej od ľudského EM. Deplécia CCDC144NL-AS1 potlačila migráciu a inváziu buniek hEM15A, ale nevykazovala žiadne účinky na bunkovú adhéziu, proliferáciu, apoptózu alebo bunkový cyklus. Knockdown CCDC144NL-AS1 dramaticky zmenil distribúciu stresových vlákien cytoskeletálneho filamentózneho aktínu (F-aktín) v porovnaní s liečbou negatívnou kontrolnou skupinou. Analýza Western blot odhalila, že knockdown CCDC144NL-AS1 zoslabil hladiny proteínov filamentov vimentínu a MMP-9, ale nie N-kadherínu alebo β-katenín. Naše výsledky spoločne naznačujú, že CCDC144NL-AS1 by sa mohol podieľať na patogenéze EM a poskytnúť nový cieľ pre EM vaječníkov.

Zvýšené hladiny lncRNA CCDC144NL-AS1 prispievajú k reorganizácii cytoskeletu, migrácii a invázii do endometriálnych stromálnych buniek prostredníctvom regulácie vimentínu a MMP-9.

© The Author(s) 2018. Vydalo Oxford University Press v mene Society for the Study of Reproduction. Všetky práva vyhradené. Ak chcete získať povolenia, pošlite e-mail: [email protected]

Chen Zhang , Wei Wu , Honglan Zhu , Xiaoming Yu , Yinli Zhang , Xue Ye , Hongyan Cheng , Ruiqiong Ma , Heng Cui , Jianjun Luo , Jing Guan a Xiaohong Chang „Knockdown migrácie dlhých nekódujúcich RNA CCDC144 zoslabuje invaziu a phenASphenAS v endometriálnych stromálnych bunkách z endometriózy," Biology of Reproduction 100(4), 939-949, (28. novembra 2018). https://doi.org/10.1093/biolre/ioy252

Prijaté: 25. augusta 2018 Prijaté: 27. novembra 2018 Zverejnené: 28. novembra 2018


VÝSLEDKY A DISKUSIA

The Drosophila genóm kóduje početné lncRNA, ktoré vykazujú tkanivovo a pohlavne špecifickú expresiu (16, 17). Funkcie väčšiny týchto transkriptov však zostávajú neznáme. Usúdili sme, že represia transkripcie lncRNA pomocou CRISPRi by prekonala obmedzenia súčasných metód používaných na ich analýzu a rozhodli sme sa prehodnotiť účinnosť dCas9 pri potláčaní transkripcie z endogénnych lokusov lncRNA v Drosophila bunky. Systém CRISPR/Cas9 sa vo veľkej miere používa na úpravu génov v Drosophila ( 11, 13–14, 18–26). CRISPRi sa však doteraz nepoužíval Drosophila.

Na implementáciu CRISPRi v Drosophila Najprv sme skonštruovali jeden transfekčný vektor, ktorý umožňuje koexpresiu mutantného proteínu Cas9 a sgRNA, podobne ako ten, ktorý sme predtým opísali (14). Táto stratégia eliminuje variabilitu medzi experimentmi, ktorá vzniká kotransfekciou dvoch plazmidov. Transfekčný vektor pGTL-1 (obrázok 1B), odvodený z multicistrónového vektora pAc5-STABLE2-neo (12), obsahuje gén Bla R, ktorý umožňuje účinnú selekciu transfekovaných buniek a skracuje čas na vytvorenie stabilných bunkových línií (27 ). Okrem toho prítomnosť GFP umožňuje ľahké monitorovanie transformovaných buniek. Ľudský gén Cas9 s optimalizovaným kodónom, ktorému chýba nukleázová aktivita (dCas9) lemovaný sekvenciami NLS a označený epitopom FLAG na N-konci, je exprimovaný pod Actin5C promótor. Pre optimálnu expresiu vodiacich RNA bola kazeta U6: 3 – sgRNA vložená do vektora, pričom tento promótor má vyššiu aktivitu na úpravu génov sprostredkovanú CRISPR/Cas9. Drosophilav porovnaní s bežne používaným promótorom U6:2 (13).

Ako kandidátsky gén sme vybrali roX (RNA na n X chromozóm), ktorý kóduje lncRNA zapojené do kompenzácie dávky v Drosophila muži (28). Špecifické pre mužov roX RNA, roX1 a roX2tvoria komplex s proteínmi MSL (m alespecific l ethal) a uľahčujú zacielenie komplexu na chromozóm X, ktorý je potrebný na dvojnásobnú hyperaktiváciu génov spojených s X u mužov. Ukazuje to genetická analýza RoX1 RoX2 dvojité mutanty sú smrteľné pre mužov, ktorých zachráni jeden z nich roX1 alebo roX2 cDNA, čo naznačuje funkčnú redundanciu v ich aktivite (29, 30). V súčasnosti sú alely používané na analýzu straty funkcie genómové delécie lokusov alebo komplexné chromozomálne usporiadania. Okrem toho zostávajú miesta iniciácie transkripcie a identita regulačných prvkov nejasné. Navrhli sme viacero sgRNA zameraných na roX1 a roX2 lokus (obrázky 2A a 3A). Ak chcete zistiť, či je účinné umlčanie roX RNA je závislá od špecifickosti vlákna, vybrali sme sekvencie komplementárne k templátovému (rT) aj netemplátovému (rNT) vláknu a v blízkosti predpokladaných miest začiatku transkripcie. Pre test sme vytvorili stabilné bunkové línie pomocou Drosophila klon 8 buniek, ktorý exprimuje oboje roX RNA (31).

The roX1 expresia je účinne utlmená pomocou CRISPRi. (A) Schematické znázornenie Drosophila roX1 lokus a relatívnej polohy roX1- zacielenie sgRNA. Existujú dve miesta začiatku transkripcie roX1 gén (od seba 270 nt), ktoré produkujú izoformy RA a RB (FlyBase). Sú zobrazené sgRNA zacielené na RNA polymerázový templát (rT, červená) a netemplátové (rNT, fialové) vlákna. 5′ intergénová oblasť medzi roX1 RA a upstream gén jin je znázornená plnou čiernou čiarou. Šípky označujú polohu primerov použitých na detekciu roX1 RNA (čierna) a roX1 RA izoforma (modrá) na analýzu RT-qPCR. (B) RT-PCR analýza s použitím buniek klonu 8 ukazuje prítomnosť roX1 RA a RB prepisy. Priméry špecifické pre sekvencie v intergénovej oblasti, roX1 RA a roX1 RB izoformy boli použité na PCR amplifikáciu. (C, D, E) RT-qPCR meranie abundancie roX1 a roX2 transkripty v bunkových líniách koexprimujúcich ľudské (C, D) alebo Drosophila (E) proteín dCas9 a sgRNA (ako je znázornené na osi x) komplementárne k reťazcu rT alebo rNT DNA na endogénnom roX1 lokus. Sú znázornené bunkové línie exprimujúce jednu sgRNA (C) alebo dve vodiace RNA súčasne (D, E). GRNAs rNT7, rT8 a rT9 sprostredkovávajú účinný knockdown roX1 prepis, buď samostatne alebo spoločne s inými. Avšak kombinácie rT1+rT3 a rT4+rNT5, ktoré sú zamerané na roX1 RA miesto iniciácie transkripcie, sú účinné len v pároch v prítomnosti ľudského dCas9 a Drosophila dCas9, resp. Os y ukazuje obohatenie RNA relatívne k rp49 transkript a normalizovaný na bunky transfekované pGTL-1 obsahujúcim necielenú sekvenciu (Ctrl). Údaje sú uvedené z dvoch biologických replikátov, z ktorých každý sa uskutočnil trojmo. Chybové stĺpce označujú SEM. % zobrazuje zníženie v percentách v porovnaní s klávesom Ctrl.

The roX1 expresia je účinne utlmená pomocou CRISPRi. (A) Schematické znázornenie Drosophila roX1 lokus a relatívnej polohy roX1- zacielenie sgRNA. Existujú dve miesta začiatku transkripcie roX1 gén (od seba 270 nt), ktoré produkujú izoformy RA a RB (FlyBase). Sú zobrazené sgRNA zacielené na RNA polymerázový templát (rT, červená) a netemplátové (rNT, fialové) vlákna. 5′ intergénna oblasť medzi roX1 RA a upstream gén jin je znázornená plnou čiernou čiarou. Šípky označujú polohu primerov použitých na detekciu roX1 RNA (čierna) a roX1 RA izoforma (modrá) na analýzu RT-qPCR. (B) RT-PCR analýza s použitím buniek klonu 8 ukazuje prítomnosť roX1 RA a RB prepisy. Priméry špecifické pre sekvencie v intergénovej oblasti, roX1 RA a roX1 RB izoformy boli použité na PCR amplifikáciu. (C, D, E) RT-qPCR meranie abundancie roX1 a roX2 transkripty v bunkových líniách koexprimujúcich ľudské (C, D) alebo Drosophila (E) proteín dCas9 a sgRNA (ako je znázornené na osi x) komplementárne k reťazcu rT alebo rNT DNA na endogénnom roX1 lokus. Sú znázornené bunkové línie exprimujúce jednu sgRNA (C) alebo dve vodiace RNA súčasne (D, E). GRNAs rNT7, rT8 a rT9 sprostredkovávajú účinný knockdown roX1 prepis, buď samostatne alebo spoločne s inými. Avšak kombinácie rT1+rT3 a rT4+rNT5, ktoré sú zamerané na roX1 RA miesto iniciácie transkripcie, sú účinné len v pároch v prítomnosti ľudského dCas9 a Drosophila dCas9, resp. Os y ukazuje obohatenie RNA relatívne k rp49 transkript a normalizovaný na bunky transfekované pGTL-1 obsahujúcim necielenú sekvenciu (Ctrl). Údaje sú uvedené z dvoch biologických replikátov, z ktorých každý sa uskutočnil trojmo. Chybové stĺpce označujú SEM. % zobrazuje zníženie v percentách v porovnaní s klávesom Ctrl.

The roX2 transkript je účinne down-regulovaný pomocou CRISPRi. (A) Schematické znázornenie Drosophila roX2 lokus ukazujúci relatívne polohy roX2 zacielenie sgRNA. Miesto začiatku transkripcie je označené šípkou, zatiaľ čo intrón je vo vnútri roX2 gén je znázornený plnou šedou čiarou. Intergénna oblasť medzi roX2 miesto začiatku transkripcie a susedný gén (cg11695) je znázornená plnou čiernou čiarou. SgRNA zacielené na vlákna rT a rNT sú znázornené červenou a fialovou farbou. Šípky označujú polohu primerov použitých na detekciu roX2 RNA pre analýzu RT-qPCR. (B a C) RT-qPCR meranie abundancie roX1 a roX2 transkripty v bunkových líniách koexprimujúcich ľudské (B) alebo Drosophila (C) proteín dCas9 a dve sgRNA (ako je znázornené na osi x). Zatiaľ čo sgRNA rTb+rTc neovplyvňujú roX1 alebo roX2 hladiny v prítomnosti ľudského dCas9, konkrétne knockdown roX2 hladiny transkriptov v bunkách koexprimujúcich Drosophila dCas9. Os y ukazuje obohatenie RNA relatívne k rp49 transkript a normalizovaný na bunky transfekované pGTL-1 obsahujúcim necielenú sekvenciu (Ctrl). Údaje sú uvedené z dvoch biologických replikátov, z ktorých každý sa uskutočnil v troch opakovaniach. Chybové stĺpce označujú SEM. % zobrazuje zníženie v percentách v porovnaní s klávesom Ctrl.

The roX2 transkript je účinne down-regulovaný pomocou CRISPRi. (A) Schematické znázornenie Drosophila roX2 lokus ukazujúci relatívne polohy roX2 zacielenie sgRNA. Miesto začiatku transkripcie je označené šípkou, zatiaľ čo intrón je vo vnútri roX2 gén je znázornený plnou šedou čiarou. Intergénna oblasť medzi roX2 miesto začiatku transkripcie a susedný gén (cg11695) je znázornená plnou čiernou čiarou. SgRNA zacielené na vlákna rT a rNT sú zobrazené červenou a fialovou farbou. Šípky označujú polohu primerov použitých na detekciu roX2 RNA pre analýzu RT-qPCR. (B a C) RT-qPCR meranie abundancie roX1 a roX2 transkripty v bunkových líniách koexprimujúcich ľudský (B) alebo Drosophila (C) proteín dCas9 a dve sgRNA (ako je znázornené na osi x). Zatiaľ čo sgRNA rTb+rTc neovplyvňujú roX1 alebo roX2 hladiny v prítomnosti ľudského dCas9, konkrétne knockdown roX2 hladiny transkriptov v bunkách koexprimujúcich Drosophila dCas9. Os y ukazuje obohatenie RNA relatívne k rp49 transkript a normalizovaný na bunky transfekované pGTL-1 obsahujúcim necielenú sekvenciu (Ctrl). Údaje sú uvedené z dvoch biologických replikátov, z ktorých každý sa uskutočnil v troch opakovaniach. Chybové stĺpce označujú SEM. % zobrazuje zníženie v percentách v porovnaní s klávesom Ctrl.

Najprv sme sa pokúsili potlačiť transkripciu roX1 RNA koexpresiou jedinej vodiacej RNA s proteínom dCas9. Génový model FlyBase (http://flybase.org/) pre roX1 predpovedá dve odlišné miesta začiatku transkripcie, čo vedie k dlhšej roX1 RA a kratší roX1 RB izoforma. Naše údaje ukazujú, že oba transkripty sú prítomné v bunkách klonu 8 (obrázok 2B), čo potvrdzuje dve iniciačné miesta. Najmä, roX1 RB V transgénnych konštruktoch sa na záchrannú analýzu použila samotná oblasť génu (30). Naše výsledky ukazujú, že nábor dCas9 susedí s roX1 RB začiatok transkripcie viedol k účinnému umlčaniu oboch RA a RB izoformy (obrázok 2C, doplnkový obrázok S1A). Je zaujímavé, že sgRNA zameraná na netemplátový (rNT7) a templátový (rT8) reťazec vykazovala podobnú účinnosť (95 % a 85 %), čo naznačuje absenciu skreslenia templátu DNA pre umlčanie, ako bolo pozorované v ľudských bunkách (7). V súlade s tým rT9, ktorý sa zameriava na templátový reťazec a čiastočne sa prekrýva s rNT7, vykazuje podobnú represívnu aktivitu. Knockdown závisí od roX1 cieľovú sekvenciu a je špecifický ako bunky s výrazne zníženou roX1 hladiny nepreukázali súbežné zníženie roX2 hladiny RNA. Zameranie dCas9 na regióny proti prúdu od roX1 miesta začiatku transkripcie (TSS) neovplyvnili hladiny RNA. Western analýza ukázala účinnú expresiu proteínu dCas9 v týchto bunkových líniách (doplnkový obrázok S2A), čo podčiarkuje kritickú úlohu sekvencie vodiacej RNA pri represii. Variabilita v expresii proteínu dCas9 by mohla byť spôsobená vplyvom chromozomálnej polohy a/alebo zmenami počtu kópií chromozómov v tejto bunkovej línii (31). Celkovo naše výsledky odhaľujú silné sgRNA pre roX1 umlčanie a ukazujú, že zostavenie komplexu dCas9-sgRNA na ktoromkoľvek reťazci DNA môže účinne umlčať expresiu lncRNA, pravdepodobne tým, že zabráni naviazaniu a/alebo predĺženiu RNA polymerázy.

Predchádzajúca štúdia ukázala, že účinnosť CRISPRi by sa mohla zvýšiť použitím dvoch sgRNA zameraných na rovnaký gén v baktériách (9). Aby ste to otestovali Drosophila Vložili sme kazetu U6:1-sgRNA do vektora pGTL-1 bezprostredne pred kazetou U6:3, čím sme vytvorili vektor pGTL-2 (obrázok 1B), čo umožňuje expresiu druhej sgRNA pod kontrolou U6: 1 promótor, ktorý tiež vykazuje silnú aktivitu v Drosophila (13). Na expresiu sme vybrali kombinácie sgRNA, ktoré sú umiestnené >30 bp od seba, aby sa umožnila účinná väzba proteínu dCas9. Ako je znázornené na obrázku 2D, sgRNA komplementárne k sekvenciám pred (rNT6 + rNT7) a lemujúce roX1 RB izoforma (rNT7+rT8, rT8+rT9) vykazovala výrazné zníženie roX1 prepis. To sa očakáva a možno to pripísať účinnosti rNT7, rT8 a rT9 sgRNA, ako bolo pozorované skôr (obrázok 2C), hoci rNT7 a rT8 sú teraz exprimované pod kontrolou promótora U6:1. Pozoruhodné je, že pozorujeme efektívne umlčanie roX1 RNA pomocou sgRNA zacielených na roX1 RA transkripčná oblasť. Hoci sú individuálne neúčinné, kombinácie sgRNA zacielené na templátový reťazec (rT1+rT3) alebo templátový aj netemplátový reťazec (rT4+rNT5) vykazujú výraznú stratu roX1 Hladiny RNA (50 % a 90 %). Nepozorovali sme silnú koreláciu medzi hladinami dCas9 a inhibíciou transkripcie (doplnkový obrázok S2B). Súhrnne tieto výsledky naznačujú, že väzba viacerých proteínov dCas9 na miestach začiatku transkripcie môže zvýšiť účinnosť umlčania transkripcie.

Ďalej sme určili, či by optimalizácia kodónov proteínu dCas9 mohla zvýšiť kombinatorickú aktivitu CRISPRi. The Drosophila Nedávno bol použitý Cas9 s optimalizovaným kodónom in vivo editácia génu však expresia proteínu so silnými, všadeprítomnými ovládačmi Gal4 viedla k značnej letalite zo zatiaľ neznámych dôvodov (13). Generovali sme katalyticky neaktívnu Drosophila Cas9 mutáciou aminokyselín nevyhnutných pre nukleázovú aktivitu (D10A a H841A) a nahradením ľudského dCas9 vo vektore pGTL-2. Ako je znázornené na obrázku 2E, koexpresia sgRNA a Drosophila dCas9 rekapituluje tlmiacu aktivitu sgRNA v podobnom rozsahu, ako bolo pozorované u ľudského proteínu dCas9 (rNT6+rNT7, rNT7+rT8 a rT8+rT9). Western analýza ukázala účinnú transláciu Drosophila Proteín dCas9 (doplnkový obrázok S2B). Bunkové línie nevykazovali žiadny zjavný fenotyp, ktorý by tomu nasvedčoval Drosophila Expresia dCas9 nie je toxická a proteín je aktívny pri umlčaní génovej expresie. V porovnaní s ľudským dCas9 sme však pozorovali výrazné zníženie (97 % pre Drosophila dCas9 oproti 50 % pre ľudský dCas9). roX1 RA a RB RNA s sgRNA, ktoré sa zameriavajú na 5' oblasť roX1 RA TSS (rT1+rT3) (obrázok 2E, doplnkový obrázok S1B). Zvýšené účinky tejto kombinácie sprievodnej RNA, hoci jednotlivo neúčinné, by mohli byť spôsobené zacielením nadbytočných regulačných prvkov v roX1 intergénový región. Tiež sme si všimli, že bunky exprimujúce rT4 + rNT5 vykazujú ~ 40% zníženie roX2 Hladiny RNA (obrázok 2E) - je to nepravdepodobné z dôvodu mimocieľového účinku, pretože hladiny RNA Gapdh a CTPsyn nie sú ovplyvnené podobne (doplnkový obrázok S3A). Dôležité je, že sekvenovanie DNA odhalilo, že tlmiaci účinok Drosophila Komplex dCas9-sgRNA na endogénnych lokusoch nezahŕňa zmeny v sekvencii DNA (doplnkový obrázok S4).

Od r roX1 zacielenie sgRNA ukázalo kombinatorický účinok pri umlčaní génov a bolo účinné v prítomnosti Drosophila dCas9, testovali sme, či by sa podobná stratégia dala použiť na zrušenie roX2 prepis. Na analýzu sme vybrali tri cieľové sekvencie okolo roX2 RA TSS, komplementárny k netemplátovým (rNTa) aj templátovým (rTb a rTc) reťazcom (obrázok 3A). Koexpresia sgRNA s ľudským dCas9 neovplyvnila roX2 úroveň transkriptu významne (obrázok 3B). Avšak, keď boli rovnaké kombinácie sgRNA exprimované spolu s Drosophila dCas9 sme zaznamenali významné zníženie (90% knockdown). roX2 transkript v sgRNA lemujúcich miesto začiatku transkripcie (rTb+rTc, obrázok 3C). Dôležité je, že roX1 transkript nebol ovplyvnený v rovnakej bunkovej línii, čo demonštruje špecifickosť knockdownu. Hladiny Gapdh a CTPsyn RNA tiež zostávajú nezmenené (doplnkový obrázok S3B). Najmä hladiny proteínu dCas9 nezodpovedali stupňu supresie (doplnkový obrázok S2C). Tieto údaje spolu s naším predchádzajúcim pozorovaním s roX1, podporuje zvýšenú činnosť Drosophila dCas9 pri sprostredkovaní represie transkripcie prostredníctvom CRISPRi.

CRISPRi sa doteraz neaplikoval v žiadnom mnohobunkovom organizme. Stanoviť účinnosť CRISPRi pri potláčaní transkripcie roX RNA in vivo, vytvorili sme dve transgénne muchy exprimujúce Drosophila dCas9 a sgRNA pod konštitutívne aktívnymi promótormi. Na analýzu sme vybrali vodiace RNA, ktoré vykazovali silnú aktivitu pri downregulácii zodpovedajúcich roX gény v Drosophila bunková línia – rT8+rT9 do cieľa roX1 a rTb+rTc pre roX2. Pre transgenézu sme modifikovali pAct5c-Vektor Cas9 (13) na vytvorenie vektora pGTL-3 – gén Cas9 bol nahradený Drosophila dCas9 a kazety U6:1-sgRNA-U6:3-sgRNA boli vložené medzi mini-biely gén a Zákon 5c promótor (obrázok 4A). Tento vektor umožňuje stabilnú miestne špecifickú integráciu do Drosophila genómu, čím sa eliminuje efekt polohy a variabilita expresie transgénu. Skutočne, dCas9-roX1 a dCas9-roX2 muškárske šnúry efektívne vyjadrujú podobné úrovne Drosophila proteín (doplnkový obrázok S2D) a boli životaschopné, čo naznačuje, že expresia týchto transgénov nebola toxická. RT-qPCR ukázala robustné a špecifické zníženie roX1 a roX2 Hladiny RNA (obrázok 4B), čo je v súlade s našimi analýzami v bunkovej línii, a teda potvrdzuje represívnu aktivitu Drosophila dCas9 in vivo. Knokaut je pravdepodobne podcenenie Actin5c nie je exprimovaný v niektorých dospelých tkanivách (32) a je vylúčený zo zárodočnej línie. Je pozoruhodné, že v porovnaní so ženami sme pozorovali drastické zníženie životaschopnosti koexprimujúcich samcov roX1 a roX2 vodiace RNA (7,6 % dCas9-roX1/dCas9-roX2 samcov oproti 52,1 % samcov divokého typu, obrázok 4C). Samce, ktoré unikli, sú plodné a nevykazujú žiadne zjavné fenotypové defekty. To je v súlade so silnou stratou funkcie roX (33). Preto sme dospeli k záveru, že nábor Drosophila dCas9 at roX1 a roX2 lokus narúša ich expresiu potlačením transkripcie, čo má za následok mužskú letalitu.

Zraziť z roX1 a roX2 RNA in vivo. (A) Schematické znázornenie Drosophila transgenézne vektory pGTL-3. Dominantný výberový marker mini-biely je nasledovaná dvojitou vodiacou RNA exprimujúcou kazetou pod kontrolou U6:1 a U6:3 promótorov pri expresii Drosophila dCas9 je riadený konštitutívne aktívnym promótorom Actin5c. Mutované aminokyselinové zvyšky (D10 > A a H841 > A) v dCas9 sú označené červenými hviezdičkami (*). N = sekvencia NLS, F = epitop FLAG, pA = polyadenylácia. (B) RT-qPCR analýza ukazuje silné vyčerpanie roX1 a roX2 RNA u samcov línií múch vyjadrujúcich zodpovedajúce vodiace RNA (zobrazené na osi x). Os y ukazuje obohatenie RNA relatívne k rp49 transkript a normalizovaný na divoký typ (y, š) muži. Údaje sú uvedené z dvoch biologických replikátov, z ktorých každý sa uskutočnil v troch opakovaniach. Chybové stĺpce označujú SEM. % ukazuje zníženie v percentách v porovnaní s divokým typom. (C) Tabuľka znázorňujúca závažné zníženie súčasne exprimujúceho samčieho potomstva roX1 a roX2 vodiace RNA (rT8+rT9-Act:dCas9/rTb+rTc-Act:dCas9). Percento prežitia samcov sa vypočíta na základe celkového počtu potomkov rovnakého genotypu získaných v rovnakom krížení. The y, š kmeň bol použitý ako divoký typ.

Zraziť z roX1 a roX2 RNA in vivo. (A) Schematické znázornenie Drosophila transgenézne vektory pGTL-3. Dominantný výberový marker mini-biely je nasledovaná dvojitou vodiacou RNA exprimujúcou kazetou pod kontrolou U6:1 a U6:3 promótorov pri expresii Drosophila dCas9 je riadený konštitutívne aktívnym promótorom Actin5c. Mutované aminokyselinové zvyšky (D10 > A a H841 > A) v dCas9 sú označené červenými hviezdičkami (*). N = sekvencia NLS, F = epitop FLAG, pA = polyadenylácia. (B) RT-qPCR analýza ukazuje silné vyčerpanie roX1 a roX2 RNA u samcov línií múch vyjadrujúcich zodpovedajúce vodiace RNA (zobrazené na osi x). Os y ukazuje obohatenie RNA relatívne k rp49 transkript a normalizovaný na divoký typ (y, š) muži. Údaje sú uvedené z dvoch biologických replikátov, z ktorých každý sa uskutočnil v troch opakovaniach. Chybové stĺpce označujú SEM. % ukazuje zníženie v percentách v porovnaní s divokým typom. (C) Tabuľka znázorňujúca závažné zníženie súčasne exprimujúceho samčieho potomstva roX1 a roX2 vodiace RNA (rT8+rT9-Act:dCas9/rTb+rTc-Act:dCas9). Percento prežitia samcov sa vypočíta na základe celkového počtu potomkov rovnakého genotypu získaných v rovnakom krížení. The y, š kmeň bol použitý ako divoký typ.

V tejto správe popisujeme efektívny prístup straty funkcie na štúdium génov lncRNA Drosophila minimálnym systémom CRISPRi, ktorý nevyžaduje fúziu efektorových domén s dCas9. Použitím tejto priamej metódy sme dosiahli vysokú úroveň zníženia kvality roX RNA (až 50-násobne) zacielením na endogénne lokusy v Drosophila bunky. Naša stratégia prekonáva predchádzajúce obmedzenia genetických prístupov používaných na hodnotenie funkcie lncRNA – nezavádza zmeny v DNA a eliminuje ektopický nábor komplexov umlčujúcich chromatín. Naše výsledky ukazujú, že zacielenie viacerých sgRNA, ktoré lemujú miesto začiatku transkripcie génov, zlepšuje účinnosť CRISPRi. V tomto ohľade by nedávny vývoj geneticky upravených proteínov Cas9 s flexibilnými vlastnosťami rozpoznávania PAM a zvýšenou špecifickosťou mal zvýšiť výber cieľových sekvencií a zároveň minimalizovať účinky mimo cieľa (34, 35). Pretože aktivitu vodiacej RNA je stále ťažké predpovedať a charakterizácia promótorových a transkripčných regulačných prvkov lncRNA zostáva neúplná, odporúčame otestovať viacero vodiacich RNA, aby sa vybrali silné vodidlá na analýzu. Dizajn nášho transfekčného vektora a bunkového testu umožňuje rýchle vyhodnotenie účinnosti niekoľkých sgRNA pred ich použitím v in vivo štúdie, od škálovania až po umlčanie génovej expresie, ako aj experimenty s mapovaním promótora a/alebo zosilňovača. Táto stratégia v kombinácii s tradičnými knock-down prístupmi by mala umožniť funkčné a mechanické skúmanie lncRNA naprieč metazoami, čím by vrhla svetlo na tieto záhadné transkripty, ktoré tvoria „temnú hmotu“ genómu.

Ďakujeme Fillipovi Portovi a Simonovi Bullockovi za dar plazmidov, Drosophila Genomics Resource Center podporovanému grantom NIH 2P40OD010949–10A1 za bunkovú líniu, Yong Huangovi za pomoc s analýzou údajov, Stuartovi Griceovi za kritické čítanie rukopisu a členom Liu laboratórium pre užitočné diskusie. Za vytvorenie transgénnych línií mušiek ďakujeme aj oddeleniu genetických mušiek na univerzite v Cambridge.


Článok

Objav funkčných dlhých nekódujúcich RNA (lncRNA) spochybnil paradigmu, že väčšina RNA kóduje proteíny. LncRNA sú hojnou triedou RNA s dĺžkou > 200 nt, o ktorých sa predtým predpokladalo, že sú transkripčným šumom. Teraz sa všeobecne uznáva, že niektoré z týchto lncRNA majú rôzne regulačné úlohy v génovej expresii, môžu slúžiť ako štrukturálne zložky na formovanie jadrovej organizácie a môžu dokonca pôsobiť ako návnady pre iné RNA alebo proteíny 1-3. Zatiaľ čo boli katalogizované desiatky tisíc transkriptov lncRNA, biologická funkcia väčšiny lncRNA stále zostáva záhadou. Určenie individuálnej funkčnosti členov tejto nedávno objavenej triedy RNA je dôležité pre lepšie pochopenie vývojovej biológie, evolúcie a genetických chorôb.

Podobne ako proteíny majú jednotlivé lncRNA špecifické subcelulárne distribúcie, ktoré sú rozhodujúce pre ich funkciu 4 . Niektoré lncRNA sú obohatené v jadre a podieľajú sa na regulácii jadrových procesov, ako je transkripcia a spracovanie RNA. Iné lncRNA sú obohatené v cytoplazme, kde môžu ovplyvniť lokalizáciu proteínu alebo modulovať stabilitu a transláciu mRNA. Niektoré lncRNA sú rovnomernejšie distribuované medzi jadrom a cytoplazmou. Umiestnenie primárneho rezervoáru lncRNA môže ovplyvniť schopnosť znížiť hladiny expresie tohto druhu.

Na knockdown alebo knockout lncRNAs sa bežne používajú tri stratégie, vrátane: degradácie RNA interferenciou RNA (RNAi), degradácie RNA pomocou RNázy H aktivujúcej antisense oligonukleotidy (ASO) alebo hrubej delécie/zmeny na úrovni DNA pomocou CRISPR/ Metódy úpravy genómu Cas9 (obrázok 1). Každý z týchto nástrojov má svoje výhody a nevýhody a úspech môže byť ovplyvnený subcelulárnou lokalizáciou lncRNA a transkripčnou krajinou, v ktorej sa nachádza.

Postava 1: Schéma troch bežných metód používaných na knockdown alebo knockout lncRNA. RNA interferencia (RNAi) využíva multiproteínový RNAi-indukovaný silencing complex (RISC) obsahujúci siRNA na špecifickú degradáciu cieľovej RNA. Antisense oligonukleotidy (ASO) sa viažu na svoju cieľovú RNA a využívajú endogénnu RNázu H1, enzým, ktorý štiepi RNA v heteroduplexe RNA/DNA. Editácia genómu CRISPR-Cas9 robí zmeny na genómovej úrovni pomocou cieľovej špecifickej crRNA hybridizovanej s tracrRNA, ktorá je v komplexe s proteínom Cas9.

RNAi je bežne používaná knockdown technika, ktorá využíva multiproteínový RNAi-indukovaný silencing complex (RISC) na potlačenie mRNA5. Ľudský RISC zavádzací komplex (RLC) sa skladá z troch proteínov (Dicer, TRBP a Ago2), ktoré sú zodpovedné za spracovanie dlhších dsRNA do zrelých siRNA a nakladanie týchto siRNA do Ago2. Už skôr bolo preukázané, že degradácia mRNA sprostredkovaná RNAi nastáva v cytoplazme6. V sérii frakcionačných a koimunoprecipitačných experimentov Stalder a kol. konkrétnejšie demonštrujú, že kanonické zaťaženie RISC, následná väzba s jeho cielenou mRNA a Ago2-sprostredkované štiepenie mRNA sa vyskytuje primárne v hrubom endoplazmatickom retikule, kde sú mRNA translatované do proteínov7. Knockdown antisense RNA sprostredkovaný RNázou H využíva endogénny enzým RNáza H1, ktorý je najviac zastúpený v jadre, kde sa predpokladá, že funguje pri replikácii a oprave DNA8-11. Alternatívne sa môžu použiť stérické blokujúce ASO na blokovanie zostrihových spojení na zníženie akumulácie zrelých lncRNA transkriptov alebo blokovanie prístupu ku kľúčovým funkčným doménam bez spustenia degradácie cieľovej RNA12,13. Stérické blokujúce ASO sú vyrobené z chemicky modifikovaných zvyškov, ktoré nepodporujú štiepenie RNázy H1, ako sú 2'-modifikované ribózové alebo morfolínové hlavné reťazce 14 . ASO aktívne s RNAi aj s RNázou H sa spoliehajú na prirodzene prítomné efektorové molekuly, aby degradovali lncRNA. Na rozdiel od toho, metódy úpravy genómu CRISPR/Cas9 sa spoliehajú na enzým bakteriálnej endonukleázy, ktorý môže byť zacielený na požadované miesta v genóme pomocou miestne špecifickej vodiacej RNA, kde generuje zlomy dvojvláknovej DNA na cieľovom mieste alebo okolo neho15,16. Mechanizmus bunkovej opravy lieči dvojvláknové zlomy, pričom v genóme zanecháva malé „jazvy“, alebo sa dokonca môže použiť na odstránenie veľkých blokov DNA, a tým eliminovať lncRNA na genómovej úrovni. Metódy CRISPR / Cas9 sa môžu tiež použiť na zavedenie nových sekvencií do cieľových lokusov, ako sú napríklad terminátory transkripcie, ktoré zabránia produkcii lncRNA s plnou dĺžkou. Pochopenie povahy záujmovej lncRNA môže lepšie pomôcť pri výbere optimálnej techniky knockdown.

S rozsiahlym pozadím skúseností s knockdownom mRNA sme očakávali, že aplikácia rovnakého repertoáru činidiel na potlačenie lncRNA by sa dala ľahko dosiahnuť. Zistili sme však, že niektoré lncRNA bolo ťažké potlačiť a nakoniec sme si všimli, čo sa zdalo byť koreláciou, že metódy založené na RNAi (malé interferujúce RNA, siRNA alebo RNA substrátu Dicer, DsiRNA) boli menej účinné proti cieľom lncRNA lokalizovaným v jadre. Predpokladali sme, že tieto jadrové lncRNA by sa ľahšie potlačili pomocou antisense knockdown sprostredkovaného RNázou-H, pretože RNáza H sa nachádza prevažne v jadre. Naopak, mysleli sme si, že RNAi, väčšinou cytoplazmatický proces, môže byť účinnejší pri zacielení na cytoplazmatické populácie lncRNA. Na testovanie tejto možnosti bola vykonaná systematická štúdia v bunkovej kultúre porovnávajúca účinnosť ASO (20mérne DNA-PS, 20mérne 2'OMe-PS gapmery alebo 16merné LNA-PS gapmery (Exiqon), kde PS = fosforotioátové väzby, LNA = uzamknuté nukleová kyselina a 2'OMe = 2'-O-metyl RNA) alebo RNAi (DsiRNA, siRNA alebo Silencer® Select siRNAs (Thermo Fisher Scientific)) proti siedmim lncRNA s variabilnými vzormi lokalizácie17. Nukleárne lncRNA (MALAT1 a NEAT1), cytoplazmatické lncRNA (DANCR a OIP5-AS1) alebo duálne lokalizované lncRNA (TUG1, CasC7 a HOTAIR) boli zamerané buď ASO (18 miest/cieľ) alebo RNAi (28 miest/cieľ). Keďže medzi lokalitami existuje široká škála účinnosti v závislosti od parametrov, ako je obsah GC a cieľová dostupnosť, lokality boli vybrané pomocou optimalizovaných návrhových algoritmov (RNAi) alebo pomocou dobre definovaných prísnych interných kritérií návrhu (ASO), aby sa maximalizovala pravdepodobnosť. porovnávania vysoko aktívnych miest medzi týmito dvoma knockdown stratégiami. Výsledky boli v súlade s našou hypotézou: jadrové lncRNA boli ľahšie zrazené pri použití ASO, zatiaľ čo cytoplazmatické ciele boli ľahšie zrazené pri použití RNAi (obrázok 2). Pri porovnaní účinnosti rôznych stratégií chemickej modifikácie ASO sa zistilo, že zatiaľ čo ASO DNA-PS a 2'OMe-PS ASO mali veľmi podobné modely knockdownu medzi rôznymi miestami, gapmery 2'OMe-PS boli trvalo účinnejšie. To sa očakávalo, pretože 2'OMe bázy zvyšujú väzbovú afinitu ASO k cieľu. 2'OMe-PS gapmer a LNA-PS gapmer ASO typicky vykazovali podobnú účinnosť pri dávke 10 nM, avšak LNA-PS gapmery boli často účinnejšie pri nižších dávkach. Medzi rôznymi testovanými činidlami RNAi nebol žiadny celkový rozdiel v aktivite. Trvanie knockdownu sa v tejto štúdii neriešilo supresia trvajúca 3-7 dní sa zvyčajne pozoruje v bunkovej kultúre (kde môže byť riedenie z bunkového delenia limitujúce znížením koncentrácie ASO alebo siRNA), zatiaľ čo knockdown na niekoľko týždňov alebo dokonca mesiac môže byť vidieť v nedeliacich sa bunkách in vivo 18,19. Zatiaľ čo táto štúdia skúmala iba knockdown lncRNA v bunkovej kultúre, očakávali by sa podobné relatívne aktivity medzi rôznymi triedami činidiel in vivo ak sa použili vhodné nástroje na doručenie. Pre in vivo pri použití, by sa predpovedala jasná výkonnostná výhoda pre krátke LNA-PS gapmery, ak by sa podali holou IV injekciou (bez akejkoľvek pomôcky na podávanie)20. Použitie aplikačného nástroja, ako je lipidová nanočastica (LNP) alebo konjugovaný ligand (ako je cholesterol alebo protilátka), môže zlepšiť dodávanie ASO a bolo by potrebné na použitie akýchkoľvek RNAi činidiel in vivo18,19,21,22.

Doteraz sme komentovali „relatívnu ľahkosť“ oboch techník knockdown na potlačenie ich cieľov na základe toho, či bola lncRNA prevažne jadrová alebo cytoplazmatická. Bližší pohľad na údaje ukazuje, že ASO sú účinné aj pri degradácii cytoplazmatických RNA (obrázok 2). ASO majú nielen vrodenú schopnosť zacieliť na jadrové RNA, ale môžu tiež degradovať vznikajúce RNA pred cytoplazmatickým exportom. Nedávna štúdia skúmajúca krok obmedzujúci rýchlosť degradácie mRNA pomocou ASO tiež zistila, že RNáza H1 bola tiež prítomná v nízkych hladinách v cytoplazme23. Zatiaľ čo degradácia mRNA sprostredkovaná ASO prebiehala rýchlejšie v jadre, prebiehala tiež pomalšie v cytoplazme. To naznačuje, že ak je lokalizácia lncRNA neznáma, výber knockdown ASO (na rozdiel od RNAi) by mal najväčšiu šancu na úspech. Je zaujímavé, že naša štúdia ukázala, že pri zacielení na duálne lokalizované lncRNA by sa dalo dosiahnuť zlepšené knockdown kombináciou ASO a siRNA. To bolo predvídateľné, berúc do úvahy, že ASO by mohol najrýchlejšie degradovať populáciu jadrovej lncRNA a siRNA by mohla najrýchlejšie degradovať populáciu cytoplazmatickej lncRNA.

Obrázok 2: Prehľad výsledkov knockdownu lncRNA porovnávajúcich účinnosť metódy so subcelulárnou lokalizáciou lncRNA (17). Antisense oligonukleotidy (LNA-PS gapmery, 2'OMe-PS gapmery alebo DNA-PS) alebo RNAi činidlá (siRNA, DsiRNA alebo Silencer® Select siRNAs) boli transfekované do HeLa buniek s Lipofectamine® 2000 počas 24 hodín v dávke 10 nM. ASO = antisense oligonukleotidy PS = fosforotioátové väzby.

Niektoré lncRNA budú odolné voči knockdownu buď ASO alebo RNAi. To by mohlo nastať, ak subcelulárna lokalizácia lncRNA nie je dostupná ani pre RNázu H, ani pre RNAi mechanizmus. Môže sa tiež vyskytnúť, ak je lncRNA vysoko štruktúrovaná alebo blokovaná v dôsledku nadmernej väzby na proteín alebo hybridizácie s inými bunkovými nukleovými kyselinami. Testovali sme širokú škálu ASO a RNAi činidiel proti NRON, lncRNA, ktorá funguje ako proteínová špongia a neboli schopní dosiahnuť vysoké úrovne knockdownu (nepublikované výsledky). Za týchto okolností môže byť potrebné použiť techniku, ako je úprava genómu CRISPR / Cas9. Použitie nástroja na úpravu genómu na vyradenie lncRNA nie je triviálne, pretože vytvorenie malého indelu v cielenej lncRNA s najväčšou pravdepodobnosťou nenaruší transkripciu, neexistuje žiadny „otvorený čítací rámec“, ktorý by sa ľahko narušil udalosťami indel mimo rámca. Transkribované lncRNA obsahujúce novo zavedené indely si môžu stále zachovať funkčné domény a / alebo väzbové miesta, ktoré by zakryli fenotypovú analýzu. Niekoľko stratégií úspešne využilo úpravu genómu CRISPR / Cas9 na vyradenie lncRNA. Jedna stratégia využíva duálne vodiace RNA na súčasné rozbitie DNA na dvoch špecifických miestach, vyrezanie veľkého fragmentu genómových lokusov, ktoré kódujú lncRNA. Dôkaz koncepcie pre túto techniku ​​úspešne vyradil lncRNA-21A, UCA1 a AK023948 odstránením veľkých fragmentov v rozsahu od 475 bp (lnRNA-21A) do 5,6 kb (UCA1)24. Druhá stratégia využíva CRISPR/Cas9 na vytvorenie prvku destabilizujúceho RNA (ako je poly(A) signál, miRNA väzbové miesto, samoštiepiaci ribozým atď.) do genómovej sekvencie, čo spôsobuje zvýšený obrat/degradáciu transkriptu lncRNA. Použitím tejto stratégie spočiatku s nukleázami zinkových prstov Gutschner a kol. vyvinuli model knockoutu MALAT1 integráciou poly(A) signálu proti smeru transkripčného štartovacieho miesta, čím sa dosiahne >1000-násobné zníženie hladín MALAT125,26. Príchod technológie CRISPR/Cas9 výrazne zjednodušil tento prístup. CRISPR-inhibícia (CRISPRi) je technika, ktorá buď používa katalyticky neaktívny (mŕtvy) proteín Cas9 (dCas9) na blokovanie funkcie RNA polymerázy, alebo, ak je potrebná vyššia transkripčná represia, spája dCas9 s transkripčným represorom (ako je KRAB) . Gilbert et al sa zamerali na šesť rôznych lncRNA pomocou dCas9-KRAB, čím dosiahli > 80 % knockdown pre 5/6 lncRNA27. Efektívne použitie metód CRISPRi vyžaduje najmä, aby bola známa poloha enhancerových/promotorových prvkov a tiež či tieto regulačné prvky riadia výlučne expresiu lncRNA alebo tiež prispievajú k expresii iných (kódujúcich) transkriptov. Použitím akejkoľvek metódy CRISPR by sa mohli neúmyselne vyradiť prepisy, ktoré sa prekrývajú, prepisujú sa z opačného reťazca alebo sa ďalej spracúvajú do rôznych izoforiem, čo sťažuje interpretáciu údajov. V skutočnosti Goyal et al nedávno preukázali, že 62% z 15 929 lncRNA analyzovaných v ich štúdii bolo zlými cieľmi na úpravu genómu CRISPR / Cas9 v dôsledku obsahu obojsmerných alebo vnútorných promótorov, takže ich knockout by mohol potenciálne ovplyvniť susedné gény. Autori vybrali niekoľko príkladov z tejto analýzy a preukázali, že použitie CRISPRi na vyradenie lncRNA s lokusmi, ktoré sa prekrývajú s inými génmi, skutočne ovplyvnilo ich susedné gény. Na rozdiel od toho, knockdown RNAi alebo ASO týchto rovnakých cieľov lncRNA bol špecifický pre cielený transkript28.

Všetky techniky, ktoré potláčajú génovú expresiu, majú riziko off-target efektov (OTE), kde príbuzné gény, ktoré majú sekvenčnú homológiu so zamýšľaným cieľom, sú potlačené krížovou hybridizáciou s cieľovými nukleovými kyselinami. Špecifickosť ASO sa spolieha výlučne na Watson-Crickovu hybridizáciu nukleovej kyseliny a OTE sa dajú ľahšie predpovedať bioinformatickou analýzou ako iné metódy, tieto činidlá môžu vykazovať jednobázovú špecifickosť, najmä pri použití krátkych ASO s vysokou afinitou29. Zatiaľ čo metódy RNAi môžu vykazovať jednobázovú špecifickosť, tieto metódy majú vyššie riziko nepredpokladaných OTE v dôsledku presluchu s miRNA dráhami, kde krátka 6-7 bázová „zárodková oblasť“ definuje špecifickosť supresie, čo vedie k riziku ovplyvnenia mnohých nepríbuzné gény 30 . Veľký prvok tejto dráhy OTE však pochádza z translačnej supresie, ktorá podľa definície nemôže priamo ovplyvniť funkciu lncRNA. Metódy CRISPR majú tiež riziko OTE. Použitie metód priamej úpravy génov ribonukleoproteínu (RNP) (kde sa proteín Cas9 a samotné vodiace RNA používajú vo formáte bez DNA) vykazujú oveľa nižšie profily OTE ako metódy, ktoré využívajú nadmernú expresiu Cas9 a vodiacich RNA na báze plazmidov, čím sa trochu zmierňuje Riziko OTE 31. Ďalej boli vyvinuté mutanty Cas9, ktoré majú významne znížené riziko pôsobenia na mimocieľových miestach32. Preto použitie vylepšených „metód CRISPR novšej generácie“ môže znížiť riziko, že OTE ovplyvní výsledky. Ďalším problémom je, že metódy CRISPR, ktoré natrvalo menia DNA bunky, často vedú k vytvoreniu rôznych mutácií na každom chromozóme v bunke alebo medzi bunkami v populácii. Môže byť potrebné izolovať klonálne čisté bunkové línie na štúdium predtým, ako sa dajú urobiť definitívne závery z týchto druhov experimentov na úpravu genómu.

Objav tisícov lncRNA a ich nejednoznačných úloh v bunkových procesoch zvýšil potrebu mať spoľahlivé techniky knockdown, ktoré pomôžu určiť ich individuálne funkcie. Možnosť vybrať metódu knockdown, ktorá s najväčšou pravdepodobnosťou poskytne najlepšie výsledky, šetrí čas a peniaze a ďalej napreduje vo výskume lncRNA. Tu sme opísali repertoár techník, ktoré možno použiť v závislosti od lokalizácie lncRNA, (ne)dostupnosti transkriptu lncRNA pre enzýmy a transkripčnej krajiny, v ktorej sa nachádzajú.


Knockdown dlhej nekódujúcej RNA AFAP1-AS1 podporila životaschopnosť a potlačila smrť kardiomyocytov v reakcii na I/R in vitro a in vivo

Dlhá nekódujúca RNA (lncRNA) hrá kľúčovú úlohu pri rozvoji infarktu myokardu (MI). Cieľom tejto štúdie bolo skúmať účinky lncRNA aktínového vlákna asociovaného s proteínom 1 antisense RNA 1 (AFAP1-AS1) na bunkový cyklus, proliferáciu a apoptózu. RT-qPCR sa použila na detekciu hladín expresie AFAP1-AS1, miR-512-3p a retikulonu 3 (RTN3) v potkanom modeli I/R. Bolo skonštruované simulované prostredie MI. MTT test a prietoková cytometria sa použili na detekciu zmien životaschopnosti kardiomyocytov a bunkového cyklu/apoptózy po MI umlčaním AFAP1-AS1 alebo umlčaním RTN3. Vzťah zacielenia miR-512-3p a AFAP1-AS1 a RTN3 v kardiomyocytoch bol overený duálnym luciferázovým reportérovým testom. Hladiny expresie AFAP1-AS1 a RTN3 boli významne zvýšené v potkanom modeli ligácie LAD (alebo MI), zatiaľ čo hladina expresie miR-512-3p bola významne znížená. Nadmerne exprimované AFAP1-AS1 a RTN3 podporovali apoptózu kardiomyocytov a inhibovali proliferáciu kardiomyocytov. MiR-512-3p bol priamym cieľom AFAP1-AS1 a RTN3 bol priamym cieľom miR-512-3p. AFAP1-AS1 podporoval progresiu MI zacielením na miR-512-3p. AFAP1-AS1 podporoval progresiu MI moduláciou osi miR-512-3p/RTN3. AFAP1-AS1 môže byť potenciálnym cieľom terapie IM.

Úloha AFAP1-AS1 pri regulácii poranenia MI in vivo. (A) Účinok AFAP1-AS1 na poškodenie MI in vivo. (B) Hladina mRNA RTN3 pri poškodení MI in vivo. (C) Hladina proteínu RTN3 pri poškodení MI in vivo. (D) Účinok miR-512-3p v modelovej skupine MI. (E) TUNEL test. *P < 0,05, **P < 0,01 vs. falošná skupina #P < 0,05, ##P < 0,01 oproti skupine MI


Knockdown PU.1 AS lncRNA inhibuje adipogenézu zvýšením translácie mRNA PU.1

Korešpondencia s: Wei-Jun Pang, PhD., Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, Vysoká škola živočíšnej vedy a technológie, Northwest A&F University, 22 Xinong Road, Yangling, provincia Shaanxi 712100, Čína.

Centrum výskumu detskej výživy, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, Vysoká škola živočíšnej vedy a technológie, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Výskumné centrum výživy detí, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030

Korešpondencia s: Wei-Jun Pang, PhD., Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, Vysoká škola živočíšnej vedy a technológie, Northwest A&F University, 22 Xinong Road, Yangling, provincia Shaanxi 712100, Čína.

Výskumné centrum výživy detí, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, Vysoká škola živočíšnej vedy a technológie, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, Vysoká škola živočíšnej vedy a technológie, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, Vysoká škola živočíšnej vedy a technológie, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

Laboratórium ukladania živočíšneho tuku a rozvoja svalov, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Čína

ABSTRAKT

PU.1 je transkripčný faktor rodiny Ets zapojený do myelo-lymfoidnej diferenciácie. Už sme predtým demonštrovali, že PU.1 je tiež exprimovaný v adipocytovej línii. Hladiny expresie PU.1 mRNA a proteínu v preadipocytoch však nezodpovedajú hladinám v zrelých adipocytoch. Hladina mRNA PU.1 je vyššia v preadipocytoch, zatiaľ čo jej proteín je exprimovaný v adipocytoch, ale nie v preadipocytoch. Základný mechanizmus zostáva nepolapiteľný. Tu sme zistili, že knockdown alebo nadmerná expresia miR-155 nemá žiadny vplyv na hladiny PU.1 mRNA a proteínu v preadipocytoch alebo adipocytoch. MiR-155 reguluje adipogenézu nie cez PU.1, ale cez C/EBPβ, čo je ďalší cieľ miR-155. Tiež sme skontrolovali hladiny expresie PU.1 mRNA a antisense dlhej nekódujúcej RNA (AS lncRNA). Je zaujímavé, že v porovnaní s hladinou PU.1 mRNA je hladina PU.1 AS lncRNA oveľa vyššia v preadipocytoch, zatiaľ čo v adipocytoch je opačná. Ďalej sme zistili, že PU.1 AS lncRNA sa viaže na svoju mRNA za vzniku zlúčeniny mRNA/AS lncRNA. Knockdown PU.1 AS pomocou siRNA inhibuje adipogenézu a podporuje expresiu proteínu PU.1 v preadipocytoch aj adipocytoch. Okrem toho represia PU.1 AS znižuje expresiu a sekréciu adiponektínu. Tiež sme zistili, že účinok retrovírusovo sprostredkovaného knockdownu PU.1 AS na adipogenézu je konzistentný s účinkom knockdownu PU.1 AS prostredníctvom siRNA. Celkovo možno povedať, že naše výsledky naznačujú, že PU.1 AS lncRNA podporuje adipogenézu prostredníctvom zabránenia translácii mRNA PU.1 prostredníctvom väzby na mRNA PU.1 za vzniku duplexu mRNA/AS lncRNA v preadipocytoch. J. Cell. Biochem. 114: 2500–2512, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.

Ďalšie podporné informácie možno nájsť v online verzii tohto článku na webovej stránke vydavateľa.

Názov súboru Popis
jcb24595-sm-0001-SupFig-S1.tif14,7 MB Obr. S1. A: Predpokladané miRNA sa zameriavajú na PU.1 mRNA pomocou TargetScan Release 6.2. B: štatistické informácie o predpovedanom následnom párovaní medzi PU.1 mRNA a miRNA-155.
jcb24595-sm-0002-SupFig-S2.tif11,6 MB Obr. S2. Odpoveď: Predpokladané miRNA sa zameriavajú na C/EBPp mRNA pomocou TargetScan Release 6.2. B: štatistické informácie o predpovedanom následnom párovaní medzi C/EBPβ mRNA a miRNA-155.
jcb24595-sm-0003-SupFig-S3.tif3,1 MB Obr. S3. Časový priebeh expresie adiponektínu počas diferenciácie preadipocytov.

Upozornenie: Vydavateľ nezodpovedá za obsah ani funkčnosť akýchkoľvek podporných informácií dodaných autormi. Akékoľvek otázky (okrem chýbajúceho obsahu) by ste mali smerovať na príslušného autora článku.


Génové regulačné siete kontrolujúce vývoj neurónov

27.6.3 lncRNA – dôkaz funkcie

Dlhé nekódujúce RNA (lncRNA) sú druhom transkriptu pochádzajúceho z intergénovej DNA, dlhšej ako 200 nukleotidov, ale kratšej ako väčšina mRNA, a sú všeobecne exprimované na nízkych úrovniach. Neexistuje žiadny dôkaz, že tieto transkripty kódujú proteíny a zdá sa, že väčšina lncRNA je relatívne neobmedzená prirodzeným výberom v porovnaní s génmi kódujúcimi proteín (Perry a Ulitsky, 2016 Ramos et al., 2016). Pozorovanie, že väčšina genómu je transkribovaná, spochybňuje funkčnosť týchto transkriptov (Birney et al., 2007). Napriek tomu je približne 1 000 lncRNA u ľudí mierne až vysoko exprimovaných a vykazuje známky evolučného obmedzenia, čo silne naznačuje, že sú funkčné (Hezroni et al., 2015).Okrem toho existujú náznaky, že táto funkcia by mohla byť dôležitá pre vývoj mozgu, keďže ~ 40 % lncRNA s tkanivovo špecifickou expresiou pochádza z mozgu a tieto patria medzi najviac rozdielne exprimované lncRNA (Derrien et al., 2012). Okrem toho sa lncRNA dynamicky exprimuje spôsobom špecifickým pre oblasť mozgu počas vývoja mozgu a diferenciácie nervových progenitorov (Aprea a kol., 2013 Mercer a kol., 2008 Ramos a kol., 2013).

Existujú tri všeobecné kategórie navrhnuté pre mechanizmy pôsobenia lncRNA: represia vyvolaná transkripciou, cis-, a trans-pôsobiace lncRNA (obr. 27.4B, C). Posledné časti transkribovaných oblastí genómu sú často označené H3K36me3 na represiu, pravdepodobne na zníženie ektopickej transkripcie v smere génového promótora, ktorý by interferoval s expresiou alebo funkciou génu. Týmto spôsobom môže lncRNA, ktorá prekrýva promótor, viesť k represii tohto promótora (Carrozza a kol., 2005 Fang a kol., 2010 Wagner a Carpenter, 2012). V tomto prípade je funkčne významná transkripcia lokusu a nie samotnej lncRNA. Zdá sa však, že primárny mechanizmus účinku pre lncRNA je viazaný na faktor buď v mieste jej transkripcie alebo v blízkych oblastiach DNA (Kotake a kol., 2011 Monnier a kol., 2013 Nagano a kol., 2008 Wang a kol., 2011 Yang a kol., 2014 Yap a kol., 2010). Väzba faktora ho môže buď priviesť k jeho cieľovému lokusu (Sigova et al., 2015), alebo ho izolovať (Krawczyk a Emerson, 2014). Okrem tohoto cis účinky, bolo navrhnuté, aby pôsobili lncRNA trans nábor proteínov modifikujúcich chromatín do špecifických cieľových sekvencií, podobne ako TF (Koziol a Rinn, 2010), ale molekulárny mechanizmus rozpoznávania sekvencií nie je známy a existuje diskusia o tom, či by typicky nízke množstvo lncRNA mohlo účinne pôsobiť na lokusy v trans kvôli stechiometrickým obavám (Perry a Ulitsky, 2016). Trans-pôsobiace lncRNA môžu mať dôležitejšie úlohy pri udržiavaní jadrovej štruktúry (Batista a Chang, 2013) a pri regulácii translácie v cytoplazme (Lee a Bartolomei, 2013 Memczak et al., 2013 Tichon et al., 2016).

Bez ohľadu na mechanizmus sa zdá, že určité lncRNA hrajú dôležitú úlohu vo vývoji mozgu a prispievajú k etiológii neurovývojových chorôb. Nebezpečenstvo je esenciálna lncRNA exprimovaná v nervových kmeňových bunkách a dospelom mozgu. Nebezpečenstvo KO myši vykazujú nesprávnu reguláciu génov bunkového cyklu dôležitých pre diferenciáciu nervových progenitorov a polovica týchto myší umiera 2–20 dní po narodení (Goff a kol., 2015 Sauvageau a kol., 2013). Avšak, vyjadrenie Sox2, najbližší gén Nebezpečenstvo a kritický faktor pluripotencie, nie je ovplyvnený (Sauvageau et al., 2013). Evf2 je lncRNA, ktorá sa nachádza medzi Dlx5 a Dlx6 gény, dva TF dôležité pre vývoj interneurónov v prednom mozgu a Evf2 transkript reguluje expresiu týchto TF čiastočne moduláciou metylácie TF Dlx5/6 zosilňovač (Berghoff a kol., 2013 Bond a kol., 2009). Evf2 KO myši majú znížený počet GABAergických neurónov v hipokampe krátko po narodení a pretrvávajúce deficity v synaptickej inhibícii u dospelých (Bond et al., 2009). LncND je lncRNA, ktorá u katarrhinských primátov (opíc starého sveta, ľudoopov a ľudí) získala 16 miRNA odozvových prvkov, ktoré sa viažu a kompetitívne inhibujú pôsobenie miRNA zapojenej do proliferácie a diferenciácie radiálnej glie (Rani et al., 2016). Inhibícia účinku tejto miRNA, čo vedie k rozšíreniu skupiny nervových progenitorov, je možno jedným z dôvodov zväčšenia mozgovej kôry u týchto primátov. Napokon z viacerých štúdií existujú dôkazy o zapojení lncRNA do SCZ, oneskorenia vývoja a ASD (Barry a kol., 2014 Meng a kol., 2018 Millar a kol., 2004 Talkowski a kol., 2012 Ziats a Rennert, 2014).


Výsledky

Identifikácia lncRNA973 v bavlne

Naša predchádzajúca štúdia sa týkala lncRNA súvisiacej so soľou, lncRNA973 [31], ktorá bola vybraná na ďalšie analýzy. Bola identifikovaná ako sense intergénna lncRNA medzi génmi Gh_D04G0659 a Gh_D04G0660. Zdá sa, že je prepísaný z RNA Pol II a obsahuje polyadenylovaný 3' koniec. Analyzovali sme štruktúru lncRNA973, ktorá má intróny a exóny (obr. 1a), podobne ako mRNA. Okrem toho sa lncRNA973 nachádzal na sense reťazci chromozómu 4 v genóme D a má dva transkripty (lncRNA973 X1 a lncRNA973 X2). Zodpovedajúca genómová oblasť bola

3,2 Kb, s lncRNA973 X1 a lncRNA973 X2 s dĺžkou 2134 bp a 2888 bp. Okrem toho lncRNA973 X2 mal exón dlhší ako lncRNA973 X1 teda priméry na detekciu expresie lncRNA973 X2 boli navrhnuté pre tento exón, priméry sú navrhnuté v tomto mieste exónu, aby sa odlíšili od lncRNA973 X1. Hladiny expresie lncRNA973 X1 a X2 v stonke, koreň a kotyledón sa analyzovali pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase (qRT-PCR) a hladiny expresie lncRNA973 X1 v koreňoch a kotyledónoch boli relatívne vyššie, zatiaľ čo u lncRNA973 X2 boli v týchto tkanivách relatívne nižšie (obr. 1b). Okrem toho sme tiež detegovali hladiny expresie dvoch transkriptov lncRNA973 v pravých listoch bavlny ošetrených NaCl (250 mmol / l) v rôznych časových bodoch (0, 1, 3, 6, 12 a 24 hodín). Expresia lncRNA 973 X1 dosiahla svoj vrchol po 6 a 24 hodinách, zatiaľ čo expresia lncRNA973 X2 bola nízka v rôznych časových bodoch (obr. 1c). Preto sme si vybrali lncRNA973 X1 na ďalšie štúdium. Okrem toho sa uskutočnila analýza zachovania sekvencie. Rovnako ako mnoho iných lncRNA, lncRNA973 nemá homológy v iných rastlinách. Aby sme preskúmali pôvod lncRNA973, analyzovali sme jeho evolúciu a homológiu u iných druhov a zistili sme, že ide o nový gén, ktorý v zásade pochádza z G. raimondii. Jeho sekvenčné zarovnanie v G. hirsutum neodhalili žiadne homológne oblasti na chromozóme 4 genómu A, čo je v súlade s jeho evolučným pôvodom.

Charakteristika lncRNA973. a. Schematický diagram umiestnenia lncRNA973 v chromozóme. Žlté rámčeky ukazujú exón lncRNA973. P1 a P2 indikovali priméry použité pre qRT-PCR na detekciu hladiny expresie lncRNA973 X1 a lncRNA973 X2, resp. b. Úrovne expresie transkriptov lncRNA973 v stonke bavlny, koreni a kotyledóne, stanovené pomocou qPCR. c. Hladiny expresie lncRNA973 X1 a X2 v pravých listoch bavlny ošetrených 250 mM NaCl v rôznych časových bodoch, stanovené pomocou qPCR. Hladina expresie lncRNA973 bola normalizovaná pomocou GhUBQ7 úroveň prejavu. Relatívnym hladinám expresie lncRNA973 v kmeni a NaCl-0 h bola priradená hodnota 1, resp. Chybové stĺpce označujú ± SD troch biologických replikátov, pričom každý sa meria trojmo. Vzorky označené rôznymi písmenami vykazujú významný rozdiel pri p < 0,05. d. Analýza kódovacieho potenciálu lncRNA973. Skóre potenciálu kódovania sa generovalo pomocou programu CPC. PHO2 a GhActin sú uvedené ako príklady kódovania, COLDAIR a Xist predstavujú nekódujúce príklady

Bioinformatická analýza (http://cpc.cbi.pku.edu.cn/) odhalila, že lncRNA973 nemá žiadnu kódovaciu kapacitu (obr. 1d). Online nástroj ORF Finder sa použil na predpovedanie piatich ORF na lncRNA973 X1 (Dodatočný súbor 1: Obrázok S1a), ktorý sa pohyboval od 29 do 107 aminokyselín. Okrem toho, podľa hľadania homológie veľkých proteínových rodín a databáz domén (Pfam a SMART, v tomto poradí), neboli nájdené žiadne funkčné domény zodpovedajúce žiadnemu z peptidov.

Subcelulárna lokalizácia lncRNA973

Funkcia lncRNA je spojená s ich subcelulárnou lokalizáciou [32]. Aby sa preskúmala subcelulárna lokalizácia lncRNA973, uskutočnila sa fluorescenčná in situ hybridizácia v koreňoch s použitím sondy s dvojitým koncom značenej DIG špecifickej pre lncRNA973. Na potvrdenie subcelulárnej lokalizácie lncRNA973 sa jadrá zafarbili pomocou DAPI a udržiavacej mRNA (GhUBQ7) bol použitý ako pozitívna kontrola. Pre lncRNA973 a GhUBQ7 V genóme bavlny sa uskutočnila analýza sekvenčnej špecifickosti a na hybridizáciu sa vybrali špecifické sondy. Fluorescenčný signál lncRNA973 bolo možné pozorovať hlavne v jadrách koreňových buniek, ktoré boli hybridizované so sondou značenou DIG, a bol tiež slabými signálmi v cytoplazme (obr. 2). Fluorescenčný signál pozitívnej kontroly GhUBQ7 možno vidieť v jadrách a cytoplazme. Okrem toho sme tiež izolovali a purifikovali RNA z cytoplazmy a jadier a použili sme ju na RT-PCR. TY 6 bola exprimovaná hlavne v jadrách, zatiaľ čo tRNA hlavne v cytoplazme. Separácia jadier a cytoplazmy bola teda odlišná. Výsledok RT-PCR ukázal, že lncRNA973 bola vysoko obohatená v jadrách (doplnkový súbor 1: obrázok S1b). Tieto údaje naznačujú, že transkripty lncRNA973 boli lokalizované hlavne v jadrách a majú malý signál v cytoplazme.

Subcelulárna lokalizácia lncRNA973. Fluorescenčná in situ hybridizácia s DIG-značenými antisense lncRNA973 sondami sa uskutočnila v 10-d-starých koreňoch bavlníka. upratovacia mRNA (GhUBQ7) bol použitý ako pozitívna kontrola. Bar = 20 μm

Nadmerná expresia lncRNA973 zvyšuje reakcie na stres zo soli v Arabidopsis

Na identifikáciu úlohy lncRNA973 v reakciách rastlín na soľný stres sa klonoval celý transkript lncRNA973 (doplnkový súbor 2: Obrázok S2a), vektor nadmernej expresie obsahujúci promótor ubikvitínového proteínu Ubi bol skonštruovaný (Doplnkový súbor 2: Obrázok S2b) a potom Agrobacterium tumefaciens (GV3101) sprostredkovaná transformácia divokého typu (WT) Arabidopsis (ekotyp Col-0). Získalo sa päť nezávislých transgénnych línií a na ďalšiu štúdiu sa vybrali tri nadmerná expresia (OX-) (OX-lncRNA973-2, OX-lncRNA973-3 a OX-lncRNA973-5) (doplnkový súbor 2: obrázok S2c). Transgénne línie sa fenotypovo nelíšili od kontrolných línií, keď neboli ošetrené. Real-time PCR sa uskutočnila na kontrolu expresie lncRNA973 transkriptu v transgéne Arabidopsis. Hladiny expresie lncRNA973 v transgénnych rastlinách boli významne vyššie ako vo WT (doplnkový súbor 2: obrázok S2d). Skúmať schopnosti transgénnych rastlín regulovať reakcie na soľný stres, divoký typ (WT) a transgénny Arabidopsis Semená (OX-lncRNA973) sa umiestnili na pevné 1/2 MS médium doplnené 0 mM, 100 mM a 150 mM NaCI. Potom sme určili rýchlosti klíčenia semien ošetrených rôznymi koncentráciami soli od 1 do 7 dní a fenotypy po klíčení semien. Línie OX-lncRNA973 nevykazovali žiadne abnormálne fenotypy za normálnych (0 mM) podmienok. Rýchlosť klíčenia línií OX-lncRNA973 pestovaných za normálnych (0 mM) podmienok neviedla k žiadnym abnormálnym fenotypom v porovnaní s fenotypmi WT (obr. 3a). 3 dni po ošetrení 100 mM NaCl boli rýchlosti klíčenia semien línií OX-lncRNA973 55 až 60 % a sú vyššie ako u WT. Pri ošetrení soľou po 7 dňoch bola priemerná rýchlosť klíčenia semien línií OX-lncRNA973

95 %, čo bolo viac ako u WT (

80 %) (obr. 3b). Okrem toho sa v podmienkach ošetrenia NaCl zmenili čerstvé hmotnosti, dĺžky koreňov a ozelenenie kotyledónov línií WT a OX-lncRNA973. Vystavenie 100-150 mM NaCl tiež inhibovalo ozelenenie kotyledónu v semenákoch OX-lncRNA973, ale účinok bol menej závažný ako u WT (obr. 3c). Sadenice OX-lncRNA973 mali vyššiu hmotnosť v čerstvom stave ako kontrola (obr. 3c). Predĺženie koreňa bolo významne inhibované 100–150 mM NaCl, zatiaľ čo sadenice OX-lncRNA973 mali vyššiu úroveň tolerancie voči stresu zo soli, ako naznačuje rast koreňov (obr. 3e-f). Okrem toho sme skúmali niekoľko fyziologických indikátorov, aby sme prediskutovali toleranciu rastlín OX-lncRNA973 voči stresu zo slanosti, napríklad malondialdehyd (MDA), prolín (Pro), obsah chlorofylu a aktivitu katalázy (CAT). Za normálnych rastových podmienok boli obsahy chlorofylu, MDA a Pro a aktivita CAT v líniách WT a OX-lncRNA973 podobné. Po ošetrení 200 mM NaCl sa však celkový obsah chlorofylu znížil a obsah chlorofylu v rastlinách WT klesol viac ako v rastlinách OX-lncRNA973 (obr. 3g). Obsah MDA a prolínu bol zvýšený v rastlinách WT aj OX-lncRNA973 a rastliny WT sa zvýšili viac ako v rastlinách OX-lncRNA973 (obr. 3h-i). Aktivita CAT rastlín WT bola inhibovaná po ošetrení NaCl a aktivita CAT rastlín OX-lncRNA973 bola vyššia (obr. 3j). Preto fenotypová analýza a fyziologické indikátory rastlín WT a OX-lncRNA973 ukázali, že rastliny OX-lncRNA973 boli tolerantnejšie voči stresu zo soli ako kontrolné rastliny.

Nadmerne exprimujúce línie lncRNA973 sú tolerantnejšie voči stresu zo soli. a-b. Semená boli vyklíčené na 1/2 MS médiu obsahujúcom 0 a 100 mM NaCI. Rýchlosť klíčenia sa merala počas jedného týždňa. c-e. Zelenanie kotyledónov, čerstvé hmotnosti a predĺženie primárneho koreňa 7-d-starých sadeníc s 0–150 mM NaCl. f. Fenotyp primárneho rastu koreňov 7-d-starých sadeníc vystavených 0–150 mM NaCl. g-i. Celkový obsah chlorofylu, MDA a Pro v listoch pod vplyvom soli. j. Aktivity katalázy (CAT) po ošetrení soľou a simuláciou. Mock, s úpravou vody. NaCI: ošetrenie 200 mM NaCI. Vertikálne stĺpce predstavujú ± SD priemer s tromi replikátmi. Hviezdičky naznačujú, že priemerné hodnoty sa výrazne líšia medzi transgénnymi rastlinami a WT (p

Umlčanie lncRNA973 vedie k náchylnosti na soľný stres

Aby sme ďalej preskúmali možné úlohy lncRNA973 v odolnosti bavlny voči stresu zo soli, umlčali sme lncRNA973 v G. hirsutum „SN91–11“ pomocou vírusom indukovaného umlčania génov (VIGS), ktoré sa často používa na analýzu génových funkcií. Sekvencie VIGS lncRNA973 a CLOROPLASTOS ALTERADOS 1 (CLA1) gény boli nezávisle klonované do TRV2 vektora (obr. 4a), produkujúceho TRV2:lncRNA973 a TRV2:CLA1, resp. TRV2:CLA1 a prázdny vektor TRV2 (TRV2) sa použili ako pozitívne a negatívne kontroly. Približne 490 bp fragment lncRNA973 a 465 bp CLA1 boli použité v systéme VIGS. Približne 2 týždne po infiltrácii markerový gén TRV2:CLA1Rastliny obsahujúce albino začali vo svojich pravých listoch vykazovať albínsky fenotyp (obr. 4c). Hladiny expresie lncRNA973 v rastlinách bavlny obsahujúcich TRV2:lncRNA973-(VIGS) a TRV2 (prázdny vektor) boli hodnotené pomocou qRT-PCR. Ako je znázornené na obr. 4b, drasticky znížená expresia lncRNA973 v rastlinách VIGS preukázala, že bola úspešne potlačená. Expresia génu Gh_D04G0660 susediaceho s lncRNA973 v genóme nebola významne ovplyvnená (doplnkový súbor 3: obrázok S3). Na liečbu soľného stresu sme vybrali dve rastliny VIGS a jednu rastlinu TRV2 (empty control). Rastliny boli zavlažované 250 mM NaCl a 3 dni po ošetrení soľou vykazovali rastliny VIGS závažnejšie fenotypy vädnutia a vypadávania listov ako kontrolné rastliny a dehydratované stonky rastlín VIGS boli výrazne hnedé, zatiaľ čo stonky TRV2 rastliny boli ešte zelené (obr. 4c). Takže línie VIGS boli precitlivené na podmienky soľného stresu.

Funkčná identifikácia lncRNA973 voči soľnému stresu pomocou metódy vírusom indukovaného umlčania génov (VIGS). a. Konštrukcia TRV2:GhCLA1 a lncRNA973 VIGS vektory. NOS, používa sa ako výber odporu. b. Relatívne hladiny transkriptu lncRNA973 v listoch TRV2:lncRNA973 a kontrolných rastlinách (TRV2:00). GhUBQ7 bola použitá ako vnútorná kontrola. Každá hodnota stĺpca predstavuje priemer ± SD troch nezávislých experimentov. c. Fenotypy umlčaných rastlín lncRNA973 pri 3-d ošetrení soľou, ktoré ukazujú fenotyp vädnutia, etiolované listy. Mock: Znamená naliať rovnaké množstvo vody. Umlčanie endogénneho Cloroplastos alterados 1 (CLA1) v bavlne prostredníctvom TRV-sprostredkovaného VIGS sa použil ako pozitívna kontrola. 10-ročné sadenice bavlny (G. hirsutum L., cv. SN91–11) s dvoma kotyledónmi boli infiltrované TRV2:CLA1a rastliny začali vykazovať albínsky fenotyp vo svojich skutočných listoch približne o 2 týždne neskôr. d-f. MDA, relatívny obsah vody a Pro v listoch pod vplyvom soli. g-i. Aktivity enzýmov vychytávajúcich ROS po ošetrení soľou: g: kataláza (CAT), h: superoxiddismutáza (SOD), i: peroxidáza (POD), resp. j-l. Akumulácia sodíka (Na+) a draslíka (K+) a pomer K+/Na+ v TRV2:00 a TRV2:lncRNA973 rastlinách pod vodou a NaCl. Mock, s úpravou vody. NaCI: ošetrenie 250 mM NaCI. *, p < 0,05 a **, p t-test v porovnaní s neošetrenými (Mock) alebo soľou ošetrenými sadenicami TRV2. Údaje predstavujú priemer ± SD

Okrem toho, aby sme preskúmali toleranciu bavlny VIGS voči stresu zo slanosti, skúmali sme niektoré fyziologické ukazovatele, ako je obsah MDA, Pro, relatívny obsah vody, aktivita enzýmu zachytávajúceho ROS a obsahy Na + a K +. Za normálnych rastových podmienok neboli žiadne rozdiely vo fyziologických ukazovateľoch medzi rastlinami VIGS a TRV2. Obsah MDA, indikátor oxidačného stresu, bol významne vyšší v rastlinách VIGS ako v rastlinách TRV2 v podmienkach soľného stresu (obr. 4d). Pro a relatívny obsah vody sú dva dôležité indexy odolnosti voči stresu. Akumulácia Pro bola zvýšená v rastlinách TRV2 aj VIGS ošetrených soľou, ale akumulácia bola významnejšia v rastlinách VIGS (obr. 4e). Relatívny obsah vody v rastlinách VIGS bol významne nižší ako v rastlinách TRV2 v podmienkach stresu zo soli, čo naznačuje, že strata vody v rastlinách VIGS bola väčšia, čo bolo v súlade s fenotypom (obr. 4f).

Aktivity enzýmov zachytávajúcich ROS, ako je superoxiddismutáza (SOD), peroxidáza (POD) a kataláza (CAT), hrajú dôležitú úlohu pri stresových reakciách na nepriazeň osudu. Aktivity enzýmov vychytávajúcich ROS sa znížili v rastlinách TRV2 aj VIGS ošetrených soľou, avšak bavlna VIGS vykazovala významnejšie zníženie v porovnaní s rastlinami TRV2 (obr. 4g). Nadbytok Na + je toxický pre rastliny, zatiaľ čo K + je antagonistický k Na + v podmienkach soľného stresu [33]. V rastlinách TRV2 a VIGS za normálnych podmienok neboli žiadne rozdiely v koncentráciách Na+ a K+. Avšak, keď boli vystavené stresu zo soli, rastliny VIGS akumulovali viac Na+, naopak, koncentrácia Na+ bola nižšia v rastlinách TRV2 v porovnaní s rastlinami VIGS (obr. 4h).Boli stanovené nižšie hladiny K+ v rastlinách VIGS a vyššie hladiny v rastlinách TRV2 (obr. 4i). Nerovnováha medzi hladinami Na + a K + viedla k zníženiu pomeru K + / Na + v rastlinách VIGS (obr. 4j). Okrem toho sme tiež detegovali chlorofyl, MDA, obsah prolínu a CAT aktivitu sadeníc bavlníka WT v rovnakom období rastu bez injikovaného vektora VIGS (Doplnkový súbor 4: Obr. S4) a zistili sme, že fyziologické indikátory sa významne nelíšili v Sadenice bavlny WT a rastliny TRV2, čím sa vylúči vplyv vírusového vektora. Tieto výsledky ukázali, že umlčanie lncRNA973 v bavlne zvýšilo obsah MDA a Pro, znížilo relatívny obsah vody a aktivity enzýmu zachytávajúceho ROS. Okrem toho podporoval export K+ a vnútorný tok Na+, čo malo za následok nerovnováhu obsahu K+ a Na+ a zníženú toleranciu soli u rastlín VIGS. Knokautované rastliny lncRNA973 boli teda citlivé na stres zo soli a odhalili, že lncRNA973 môže reagovať na stres zo soli reguláciou akumulácie niektorých súvisiacich fyziologických indikátorov.

LncRNA973 reguluje expresiu génov zapojených do reakcie na stres zo soli v bavlne

Na základe predchádzajúcich údajov o transkriptóme sa pomocou RNAplex vypočítal vzťah koexpresie a väzbová voľná energia medzi lncRNA973 a kódujúcimi génmi, aby sa predpovedali koexpresívne gény, ktoré zahŕňali transkripčné faktory a gény súvisiace so stresom (doplnkový súbor 6: Tabuľka S1). Na analýzu potenciálnych funkcií lncRNA973 sme na analýzu vybrali gény kódujúce proteín s koeficientmi koexpresie nad 0,95 s lncRNA973. Aby sa ďalej potvrdila expresia známych génov kritických pre reakcie na stres zo soli rastlín, celková RNA sa extrahovala z listov sadeníc TRV2 a VIGS zo stresu zo soli a listov neošetrených sadeníc a potom sa analyzovala pomocou PCR v reálnom čase. Hladiny expresie respiračných burst oxidáz B (ROBHB) a D (ROBHD), dvoch génov NADPH oxidázy, sa znížili o viac ako 30 a 50 %, v uvedenom poradí, v rastlinách VIGS ošetrených soľou, avšak u neošetrených rastlín nedošlo k žiadnym významným zmenám v hladinách expresie. rastlín (obr. 5a, b). Indukovaný prejav Δ 1 -PYRROLÍN-5-KARBOXYLÁT SYNTETÁZA (P5CS) v podmienkach soľného stresu by mohol podporovať akumuláciu Pro [34]. Vyjadrenie P5CSsa zvýšil dvojnásobne v rastlinách VIGS ošetrených soľou v porovnaní s líniami TRV2 (obr. 5c). Tieto výsledky boli v súlade s výsledkami fyziologického indexu Pro. Ďalej sme hodnotili gény súvisiace s iónmi sodíka a draslíka v reakcii na soľný stres. Výmenník sodíka a vodíka 7 (NHX7) kóduje vakuolárny Na + / H + antiporter podieľajúci sa na odolnosti voči soli, ktorý pôsobí pri elektroneutrálnej výmene protónov za katióny, ako je Na +, cez plazmatickú membránu [35]. NHX7 bol viac exprimovaný v rastlinách VIGS ako v rastlinách TRV2 v podmienkach soľného stresu (obr. 5d). REAKCIA NA DEHYDRATÁCIU 22 (RD22) je aktivovaný signalizáciou kyseliny abscisovej (ABA) spojenou s odpoveďami na stres zo soli [36]. Jeho expresia sa tiež znížila v rastlinách VIGS ošetrených soľou (obr. 5e). Okrem toho sme analyzovali hladiny expresie génov súvisiacich s ROS, SOD, POD a CAT. Hladiny ich expresie boli významne inhibované v rastlinách VIGS vystavených stresu zo soli, ale zvýšili sa v kontrolných rastlinách (obr. 5f-h). Medzitým sme skúmali hladiny expresie homológnych génov týchto génov vo WT a OX-lncRNA973–2/5 Arabidopsis rastliny. V neošetrených podmienkach boli hladiny expresie týchto génov súvisiacich so soľným stresom v rastlinách OX-lncRNA973 podobné ako vo WT Arabidopsis (Dodatočný súbor 5: Obrázok S5), okrem toho AtPOD gén vykazoval významnú up-regulovanú expresiu. Expresia týchto génov sa však zvýšila v rastlinách WT aj OX-lncRNA973 po strese zo soli. The AtRBOHB, AtRBOHD, AtPOD, AtCAT, AtRD22, AtRD29A, a AtRD29B (Dodatočný súbor 5: Obrázok S5a, b, f-j) hladiny expresie v rastlinách OX-lncRNA973 boli významne vyššie ako hladiny WT po ošetrení soľou, najmä, AtPOD, AtRD29A, a AtRD29B. Vyjadrenie AtP5CS1 a Na NHX7 v rastlinách OX-lncRNA973 boli nižšie ako u rastlín WT (doplnkový súbor 5: obrázok S5c-d). Tieto údaje naznačujú, že lncRNA973 by mohla regulovať toleranciu rastlín voči stresu zo soli moduláciou expresie génov zapojených do reakcií na stres zo soli.

Relatívne hladiny expresie vybraných génov v semenákoch bavlny ošetrených soľou. RNA sa extrahovala z listov bavlníkových sadeníc VIGS a TRV2 a hladiny génovej expresie sa merali pomocou RT-qPCR normalizovaného proti GhUBQ7 gén. Sú uvedené relatívne hladiny expresie a. RBOHB, b. RBOHD, c. P5CS, d. NHX7, e. RD22, f. SOD, g. CAT, h. POD, i. MYB5, j. WRKY46, k. NAC29, l. ERF62. Falošný, bez úpravy soľou, NaCI: úprava 250 mM NaCI. *, p < 0,05 a **, p t-test v porovnaní s neošetrenými (Mock) alebo soľou ošetrenými sadenicami TRV2. Údaje predstavujú priemer ± SD

Okrem toho sa na regulácii lncRNA973 môžu podieľať transkripčné faktory. Tieto transkripčné faktory zahŕňajú transkripčné faktory MYB5, WRKY46, NAC29 a 62 (ERF62) reagujúce na etylén. Koeficienty koexpresie medzi transkripčnými faktormi a lncRNA973 boli vo všeobecnosti vyššie ako 0, 99, čo naznačuje možné regulačné vzťahy medzi nimi. RT-qPCR sa použila na detekciu expresie týchto transkripčných faktorov v rastlinách ošetrených soľou a neošetrených rastlinách. Hladiny expresie MYB5 a WRKY46 boli nižšie v rastlinách VIGS ako v kontrolných rastlinách v podmienkach soľného stresu (obr. 5i-j). NAC29 a ERF62 boli vysoko exprimované v rastlinách ošetrených soľou v porovnaní s neošetrenými rastlinami (obr. 5k-1). Podobne sme tiež skúmali hladiny expresie homológnych génov týchto transkripčných faktorov v rastlinách OX-lncRNA973 a WT a zistili sme, že transkripčné faktory AtERF a AtMYB5 sa pred a po liečbe významne nezmenili (doplnkový súbor 5: Obrázok S5k-l) . Expresia AtWRKY46 sa zvýšila v normálne rastúcich rastlinách OX-lncRNA973 a bola zjavne up-regulovaná v rastlinách OX-lncRNA973 po ošetrení soľou (doplnkový súbor 5: Obrázok S5 m). Expresia AtNAC3 bola v normálne rastúcich rastlinách nezmenená. V porovnaní s WT bola expresia NAC3 v rastlinách OX-lncRNA973 významne indukovaná po ošetrení soľou a expresia bola významne vyššia ako expresia WT (doplnkový súbor 5: obrázok S5n). Zdá sa teda, že lncRNA973 reaguje na soľný stres reguláciou viacerých génov a viacerých komplexných mechanizmov.

LncRNA973 ovplyvňuje miR399 a jeho cieľovú expresiu PHO2

Predtým sme predpovedali, že lncRNA973 môže mať regulačný účinok s miR399 [31]. Interakčná oblasť lncRNA973 a miR399 sa nachádza v druhom exóne (obr. 6a). Aby sa ďalej určil regulačný účinok lncRNA973 na miR399, expresia miR399 a jeho cieľového génu PHO2 bola detegovaná v OX-lncRNA973 Arabidopsis a rastliny bavlníka TRV2:lncRNA973. Detegovali sme expresiu ghr-miR399 v koreňoch sadeníc bavlny knockout lncRNA973. Keď bola účinnosť knockdown lncRNA973 60% alebo viac, úroveň expresie ghr-miR399 sa výrazne zvýšila, zatiaľ čo jej cieľ GhPHO2 expresia bola významne inhibovaná. A keď bola účinnosť knockdownu nižšia ako 60 %, ghr-miR399 a GhPHO2 hladiny expresie neboli významne ovplyvnené (obr. 6b). Nadmerná expresia lncRNA973 však významne neinhibovala expresiu ath-miR399, ani expresiu AtPHO2 významne zmenila OX-lncRNA973 Arabidopsis rastliny (obr. 6c). lncRNA973 teda reguluje expresiu ghr-miR399 a jeho cieľového génu GhPHO2 v bavlne, pričom sa medzi nimi nenašiel žiadny vzťah Arabidopsis.

Relatívne hladiny expresie miRNA399 a lncRNA973 vo VIGS a semenákoch s nadmernou expresiou. a. Schematický diagram miesta interakcie medzi transkriptom ghr-miR399 a lncRNA973. b. Hladiny expresie lncRNA973, ghr-miR399 a GhPHO2 v koreňoch sadeníc bavlníka TRV2:00 a TRV2:lncRNA973. c. Hladiny expresie lncRNA973, ath-miR399 a AtPHO2 v rastlinách WT a OX-lncRNA973. *, p < 0,05 a **, p t-test v porovnaní s rastlinami TRV2. Údaje predstavujú priemer ± SD


Úvod

Celosvetový výskyt melanómu, najagresívnejšej formy rakoviny kože, sa v posledných desaťročiach rapídne zvýšil. Očakáva sa, že počet nových prípadov melanómu v Spojených štátoch dosiahne do konca roka 2016 76 380 s 10 130 úmrtiami [1]. Primárny melanóm (PM) je liečiteľný chirurgicky. Ak sa však včas neodhalí a chirurgicky neodstráni, je veľmi pravdepodobné, že melanóm bude metastázovať. Preto je naliehavo potrebná identifikácia mechanizmov poháňajúcich tumorigenézu aj metastázy a vývoj nových a účinných stratégií liečby melanómu.

Dlhé nekódujúce RNA (lncRNA), ktorých dĺžka presahuje 200 nukleotidov, sú transkripty podobné messenger RNA (mRNA), ktoré nekódujú proteíny [2, 3]. Na rozdiel od menších mikroRNA, ktoré hrajú rozhodujúcu úlohu v ľudskej karcinogenéze, naše chápanie biologických funkcií lncRNA je v plienkach. Prvá funkčná lncRNA, XIST, bola objavená začiatkom 90. rokov 20. storočia. XIST inaktivuje génovú expresiu z X-chromozómu vyrovnávaním dávky [4, 5]. Viaceré správy ukázali, že lncRNA regulujú komplexné a rôznorodé funkcie, vrátane pluripotencie embryonálnych kmeňových buniek [6], epigenetickej génovej regulácie [7], reakcie na poškodenie DNA [8] a remodelácie chromatínu [9]. Okrem toho sa lncRNA podieľajú na rozsiahlych bunkových procesoch vrátane bunkového cyklu, proliferácie, apoptózy a invázie [10].

So vznikom sekvenovania ďalšej generácie veľké projekty identifikovali viaceré lncRNA, ktoré sa podieľajú na karcinogenéze a rozvoji rakoviny [11, 12], vrátane glioblastómu [13], rakoviny vaječníkov [14], hepatocelulárneho karcinómu [15], rakoviny žalúdka [ 16] a kolorektálneho karcinómu (CRC) [17] tieto poznatky naznačujú zaujímavé možnosti pre diagnostické a terapeutické aplikácie lncRNA. O funkciách lncRNA pri tumorigenéze a metastázovaní melanómu je však známe len málo. Viaceré štúdie identifikovali niekoľko funkcií pre lncRNA v melanóme. Upregulácia SPRY4-IT1 môže hrať dôležitú úlohu pri melanóme a byť užitočným skorým biomarkerom u ľudí [18, 19]. Tang a kol. [20] preukázali nadmernú expresiu HOTAIR v metastázach lymfatických uzlín v porovnaní s PM a preukázali aktívnu úlohu v bunkovej motilite a invázii, čo zdôrazňuje HOTAIR ako potenciálny cieľ liečby malígneho melanómu. Dlhá intergénna nekódujúca RNA, CASC15, koreluje s progresiou melanómu a podieľa sa na regulácii zmeny fenotypu [21]. Ďalšia lncRNA, SLNCR1, podporuje inváziu melanómu väzbou na androgénny receptor a mozgovo-špecifický homeobox proteín 3a [22]. Nízke špecificity a citlivosti lncRNA však naznačujú, že jeden cieľ pravdepodobne nebude plne ilustrovať mechanizmy lncRNA v melanóme. Potenciálne úlohy lncRNA počas tumorigenézy a metastáz melanómu ešte neboli úplne preskúmané.

Našu štúdiu sme začali analýzou predtým publikovaných profilov génovej expresie melanómu z databázy Gene Expression Omnibus (GEO) a vykonali sme profilovanie lncRNA na identifikáciu významných lncRNA. Identifikované profily lncRNA sa potom overili pomocou iného nezávislého validačného súboru. Potom sa uskutočnila analýza génovej ontológie (GO), analýza dráhy Kyoto Encyklopédia génov a genómov (KEGG) a analýza koexpresnej siete lncRNA-mRNA. Vykonali sme analýzu prežitia na základe databázy TCGA. Naše zistenia by mohli odhaliť možné profily expresie lncRNA a mRNA spojené s progresiou a metastázami melanómu a poskytnúť nový pohľad na molekulárnu patogenézu melanómu.


Úloha dlhej nekódujúcej RNA PCA3 pri tumorigenéze a progresii epiteliálneho karcinómu vaječníkov

Ciele: Karcinóm ovária je jedným z najvyšších výskytov nádorov u žien a vznik, vývoj a prognóza epitelového ovariálneho karcinómu (EOC) zostáva otvorenou oblasťou štúdia. Úloha dlhých nekódujúcich RNA (lncRNA) v epiteliálnom karcinóme vaječníkov je novou oblasťou výskumu.

Materiály a metódy: Expresia LncRNA PCA3 bola stanovená v EOC a normálnych ovariálnych tkanivách pomocou RT-PCR. Fenotypy indikujúce progresiu a agresivitu nádoru, vrátane bunkovej proliferácie, migrácie, invázie a expresie príbuzných molekúl, boli analyzované v EOC bunke po knockdown lncRNA PCA3 transfekciou s malou interferujúcou RNA (siRNA).

Výsledky: Expresia lncRNA PCA3 v tkanivách epiteliálneho karcinómu vaječníkov bola vyššia ako v normálnom tkanive vaječníkov. Zistili sme, že knockdown lncRNA PCA3 v bunkách EOC transfekciou siRNA významne potlačil bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu. Bioinformatické predpovede a duálne luciferázové reportérové ​​testy naznačujú, že 3'UTR PCA3 má potenciálne väzbové miesta pre miR-106b-5p. Knockdown lncRNA PCA3 pomocou siRNA viedol k up-regulovanej expresii miR-106b. Okrem toho knockdown PCA3 tiež znížil proteínovú expresiu člena rodiny homológnych génov Ras C (RhoC), Bcl/xl, P70 ribozomálnej S6 kinázy (P70S6K) a matricovej metalopeptidázy 2 (MMP2), ktoré sú regulované miR-106b.

Závery: Výsledky výskumu ukazujú, že lncRNA PCA3 môže koordinovať EOC tumorigenézu prostredníctvom narušenia miR-106b regulovanej génovej expresie. PCA3 môže byť novým a dôležitým diagnostickým biomarkerom a cenným markerom na predikciu v klinickej starostlivosti o epiteliálny karcinóm vaječníkov.

Kľúčové slová: Epiteliálny karcinóm vaječníkov LncRNA PCA3 Progresia Tumorigenéza.


Pozri si video: Big picture sur les ARN non-codants (Jún 2022).