Informácie

E5. Drogy viažuce DNA - Biológia

E5. Drogy viažuce DNA - Biológia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Väčšina dnes používaných liekov sa viaže na špecifické proteíny a interferuje s aktivitou proteínu. Stuart Schreiber na Harvarde je lídrom v tejto oblasti.

Ďalším spôsobom inhibície špecifickej génovej transkripcie je naviazanie malej jednovláknovej DNA na dsDNA za vzniku trojitej špirály. Jednovláknová molekula DNA sa môže viazať na exponované donory H väzby a akceptory báz, ktoré sa nezúčastňujú Watson-Crickových H-väzbových interakcií medzi komplementárnymi bázami v ds DNA.

Obrázok: Trojitá špirála

Jednovlákno sa viaže k takým darcom, ktorí sú prístupní v hlavnom háji dsDNA.

Analógy peptid-nukleová kyselina, ako je uvedené nižšie, sú sľubnými novými liekmi. Sú menej nabité ako nukleové kyseliny (takže môžu ľahšie prechádzať cez membránu) a sú odolné voči štiepeniu proteázami a nukleázami. Dalo by sa predstaviť, že sa viažu na špecifické nukleotidové sekvencie a inhibujú procesy, ako je replikácia a transkripcia DNA.

Transkripčné faktory, ktoré sú vo všeobecnosti aktivované genetickými udalosťami alebo upstream signálnymi dráhami, sú kľúčovými regulátormi bunkového stavu. V dôsledku rozsiahlych rozhraní proteín-proteín a všeobecnej absencie hydrofóbnych vreciek, ktoré by mohli inhibovať interakcie proteín:proteín potrebné na reguláciu transkripcie, bolo ťažké navrhnúť lieky, ktoré sa viažu na transkripčné faktory a modulujú ich aktivitu. Moellering a kol. uvádzajú úspešný vývoj priamo pôsobiaceho antagonistu onkogénneho transkripčného faktora, NOTCH1. Tento antagonista pozostáva z bunkovo ​​permeabilných stabilizovaných a-helikálnych peptidov, SAHM, ktoré boli "zošité" do stabilnej špirály pridaním dvoch neprirodzených alkenylových aminokyselín, ktoré uzavretím kruhu stericky obmedzili peptid v alfa helixe. Helix napodobňoval jednu oblasť rozhrania proteín:proteín v ternárnom komplexe DNA:NOTCH1:MAML1 (čo je koaktivátorový proteín). Peptidy antagonizujúce signalizáciu NOTCH a bunkovú proliferáciu v T-bunkových bunkách akútnej lymfoblastickej leukémie (T-ALL).


DNA Binding Lab Structure Collection

DNA Binding Lab Structure Collection

Zbierka štruktúr DNA Binding Lab je samostatná laboratórna aktivita so súborom „neznámych štruktúr“, ktoré študenti skúmajú, aby sa dozvedeli o štruktúre DNA a interakciách medzi DNA a inými molekulami. Toto laboratórium je vhodné pre študentov stredných aj vysokých škôl.

Mnoho základných krokov v biológii začína, keď sa proteíny viažu na DNA. Proteíny kopírujú DNA, strihajú DNA, opravujú DNA, používajú DNA ako templát na výrobu RNA, zabaľujú DNA do štruktúr, ktoré jej pomáhajú zapadnúť do jadra, a viažu sa na DNA, čím riadia všetky tieto procesy. Iné molekuly, ako sú protinádorové lieky alebo antibiotiká, môžu tiež viazať DNA. Niekedy tieto ďalšie molekuly blokujú aktivity, ako je replikácia a transkripcia DNA. Niekedy spôsobujú problémy a vedú k chorobám, ako je rakovina.

V tomto laboratóriu digitálnej biológie študenti pracujú s molekulárnymi štruktúrami, aby identifikovali hlavné a menšie drážky v DNA a videli, ako to vyzerá, keď sa proteíny alebo lieky viažu na tieto oblasti. Laboratórium Molecule World DNA Binding Lab vám umožňuje pridať molekulárne modelovanie do vašej sady nástrojov v triede.

Súbor neznámych štruktúr poskytuje nástroj na hodnotenie tým, že umožňuje každému študentovi preskúmať inú štruktúru a určiť, či sa proteín alebo liek viaže na hlavnú drážku, vedľajšiu drážku alebo oboje, a zachytí obrázok, ktorý odovzdá ako dôkaz na podporu svojho záveru. .

*** Túto aplikáciu sme nahradili kolekciou štruktúr, ktoré možno použiť v Molecule World. Choďte na Zbierka štruktúr DNA Binding Lab stiahnuť súbor štruktúr DNA a získať laboratórne pokyny.


Interakcia malých molekúl so štruktúrou G-kvadruplexu piatich guanínových traktov z ľudského promótora MYC

Všeobecne sa uznáva, že DNA môže prijať iné biologicky relevantné štruktúry okrem Watson-Crickovej dvojitej špirály. Jedným z nedávnych dôležitých príkladov je štruktúra guanín-kvadruplex (G-kvadruplex) tvorená guanínovými traktami nachádzajúcimi sa v oblasti promótora MYC (alebo c-myc), ktorá reguluje transkripciu onkogénu MYC. Stabilizácia tohto G-kvadruplexu pomocou ligandov, ako je katiónový porfyrín TMPyP4, znižuje transkripčnú hladinu MYC. Tu uvádzame prvú štruktúru fragmentu DNA obsahujúceho päť guanínových traktov z tejto oblasti. Nezvyčajný G-kvadruplex záhyb, ktorý bol odvodený z obmedzení NMR s použitím jednoznačných prístupov priraďovania rezonancie nezávislých od modelu, zahŕňa jadro troch na sebe naskladaných guanínových tetrád vytvorených štyrmi paralelnými guanínovými traktami so všetkými antiguanínmi a snapback synguanínom na 3'-konci. Určili sme štruktúru komplexu vytvoreného medzi týmto G-kvadruplexom a TMPyP4. Tieto štrukturálne informácie v kombinácii s detailmi interakcie malých molekúl poskytujú platformu pre návrh protirakovinových liekov zameraných na sekvencie multiguanínového traktu, ktoré sa nachádzajú v MYC a iných onkogénnych promótoroch, ako aj v teloméroch.

Vyhlásenie o konflikte záujmov

VYHLÁSENIE KONKURENČNÝCH ZÁUJMOV

Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne konkurenčné finančné záujmy.

Figúrky

NMR štúdium MÔJ C…

NMR štúdium MÔJ C promótorové sekvencie bohaté na guanín. ( a ) 600…

Štruktúra Pu24I quadruplex.…

Štruktúra Pu24I quadruplex. ( a ) Stereofónny pohľad na osem superponovaných…

Interakcia medzi Pu24I quadruplex…

Interakcia medzi Pu24I quadruplex a rôzne ligandy monitorované pomocou NMR. (…

NMR štúdium Pu24I…

NMR štúdium Pu24I – komplex TMPyP4. ( a ) Štruktúra…

Šesť superponovaných rafinovaných štruktúr…

Šesť superponovaných rafinovaných štruktúr Pu24I quadruplex-TMPyP4 komplex. ( a ) Strana...


Obsah

U ľudí, TP53 gén sa nachádza na krátkom ramene chromozómu 17 (17p13.1). [8] [9] [10] [11] Gén má veľkosť 20 kb, s nekódujúcim exónom 1 a veľmi dlhým prvým intrónom s veľkosťou 10 kb. Kódujúca sekvencia obsahuje päť oblastí vykazujúcich vysoký stupeň konzervácie u stavovcov, prevažne v exónoch 2, 5, 6, 7 a 8, ale sekvencie nájdené u bezstavovcov vykazujú len vzdialenú podobnosť s cicavčím TP53. [15] TP53 ortológie [16] boli identifikované u väčšiny cicavcov, pre ktoré sú k dispozícii úplné údaje o genóme.

Upraviť ľudský gén TP53

U ľudí bežný polymorfizmus zahŕňa substitúciu arginínu za prolín v pozícii kodónu 72. Mnohé štúdie skúmali genetickú súvislosť medzi touto variáciou a náchylnosťou na rakovinu, avšak výsledky boli kontroverzné. Napríklad metaanalýza z roku 2009 nepreukázala súvislosť s rakovinou krčka maternice. [17] Štúdia z roku 2011 zistila, že TP53 mutácia prolínu mala hlboký vplyv na riziko rakoviny pankreasu u mužov. [18] Štúdia arabských žien zistila, že homozygotnosť prolínu pri TP53 kodón 72 je spojený so zníženým rizikom rakoviny prsníka. [19] Jedna štúdia to naznačila TP53 polymorfizmy kodónu 72, MDM2 SNP309 a A2164G môžu byť kolektívne spojené s náchylnosťou na neorofaryngeálnu rakovinu a že MDM2 SNP309 v kombinácii s TP53 kodón 72 môže urýchliť vývoj neorofaryngeálnej rakoviny u žien. [20] Zistila to štúdia z roku 2011 TP53 polymorfizmus kodónu 72 bol spojený so zvýšeným rizikom rakoviny pľúc. [21]

Metaanalýzy z roku 2011 nezistili medzi nimi žiadne významné súvislosti TP53 polymorfizmy kodónu 72 a riziko rakoviny hrubého čreva [22] a rakoviny endometria. [23] Štúdia z roku 2011 na brazílskej kohorte narodení zistila súvislosť medzi nemutovaným arginínom TP53 a jedincov bez rodinnej anamnézy rakoviny. [24] Ďalšia štúdia z roku 2011 zistila, že homozygotný (Pro/Pro) genotyp p53 bol spojený s výrazne zvýšeným rizikom karcinómu obličkových buniek. [25]

  1. kyslá N-koncová doména aktivácie transkripcie (TAD), tiež známa ako aktivačná doména 1 (AD1), ktorá aktivuje transkripčné faktory. N-koniec obsahuje dve komplementárne transkripčné aktivačné domény, s hlavnou na zvyškoch 1–42 a vedľajšou na zvyškoch 55–75, ktoré sa špecificky podieľajú na regulácii niekoľkých proapoptotických génov. [26]
  2. aktivačná doména 2 (AD2) dôležitá pre apoptotickú aktivitu: zvyšky 43–63. bohatá doména dôležitá pre apoptotickú aktivitu p53 jadrovým exportom cez MAPK: zvyšky 64–92.
  3. centrálna jadrová doména viažuca DNA (DBD). Obsahuje jeden atóm zinku a niekoľko aminokyselín arginínu: zvyšky 102–292. Táto oblasť je zodpovedná za väzbu korepresora p53 LMO3. [27] (NLS) doména, zvyšky 316-325.
  4. homo-oligomerizačná doména (OD): zvyšky 307-355. Tetramerizácia je nevyhnutná pre aktivitu p53 in vivo. podieľajú sa na downregulácii väzby DNA centrálnej domény: zvyšky 356–393. [28]

Mutácie, ktoré deaktivujú p53 pri rakovine, sa zvyčajne vyskytujú v DBD. Väčšina z týchto mutácií ničí schopnosť proteínu viazať sa na svoje cieľové sekvencie DNA, a tak zabraňuje transkripčnej aktivácii týchto génov. Mutácie v DBD ako také sú recesívne mutácie so stratou funkcie. Molekuly p53 s mutáciami v OD dimerizujú s divokým typom p53 a bránia im v aktivácii transkripcie. Preto OD mutácie majú dominantný negatívny vplyv na funkciu p53.

Divoký typ p53 je labilný proteín, ktorý obsahuje zložené a neštruktúrované oblasti, ktoré fungujú synergickým spôsobom. [29]

Poškodenie a oprava DNA Upraviť

p53 hrá úlohu v regulácii alebo progresii bunkovým cyklom, apoptóze a genómovej stabilite prostredníctvom niekoľkých mechanizmov:

  • Môže aktivovať opravné proteíny DNA, keď je DNA poškodená. Môže byť teda dôležitým faktorom starnutia. [30]
  • Môže zastaviť rast tým, že pri rozpoznaní poškodenia DNA podrží bunkový cyklus v regulačnom bode G1/S – ak tu bunku udrží dostatočne dlho, opravné proteíny DNA budú mať čas opraviť poškodenie a bunka bude môcť pokračovať. bunkový cyklus.
  • Môže iniciovať apoptózu (t. j. programovanú bunkovú smrť), ak sa poškodenie DNA ukáže ako nenapraviteľné.
  • Je nevyhnutný pre reakciu starnutia na krátke teloméry.

WAF1/CIP1 kódujúci p21 a stovky ďalších downstream génov. p21 (WAF1) sa viaže na komplexy G1-S/CDK (CDK4/CDK6, CDK2 a CDK1) (molekuly dôležité pre prechod G1/S v bunkovom cykle), čím inhibuje ich aktivitu.

Keď je p21 (WAF1) v komplexe s CDK2, bunka nemôže pokračovať do ďalšej fázy bunkového delenia. Mutantný p53 už nebude viazať DNA účinným spôsobom a v dôsledku toho nebude proteín p21 dostupný, aby pôsobil ako „stop signál“ bunkového delenia. [31] Štúdie ľudských embryonálnych kmeňových buniek (hESC) bežne opisujú nefunkčnú os p53-p21 dráhy kontrolného bodu G1/S s následným významom pre reguláciu bunkového cyklu a reakciu na poškodenie DNA (DDR). Dôležité je, že p21 mRNA je jasne prítomná a upregulovaná po DDR v hESC, ale proteín p21 nie je detegovateľný. V tomto type buniek p53 aktivuje početné mikroRNA (ako miR-302a, miR-302b, miR-302c a miR-302d), ktoré priamo inhibujú expresiu p21 v hESC.

Proteín p21 sa viaže priamo na komplexy cyklín-CDK, ktoré poháňajú bunkový cyklus vpred a inhibuje ich kinázovú aktivitu, čím spôsobuje zastavenie bunkového cyklu, aby sa umožnila oprava. p21 môže tiež sprostredkovať zastavenie rastu spojené s diferenciáciou a trvalejšie zastavenie rastu spojené s bunkovým starnutím. Gén p21 obsahuje niekoľko prvkov odozvy p53, ktoré sprostredkovávajú priamu väzbu proteínu p53, čo vedie k transkripčnej aktivácii génu kódujúceho proteín p21.

Dráhy p53 a RB1 sú spojené prostredníctvom p14ARF, čo zvyšuje možnosť, že sa dráhy môžu navzájom regulovať. [32]

Expresia p53 môže byť stimulovaná UV svetlom, ktoré tiež spôsobuje poškodenie DNA. V tomto prípade môže p53 iniciovať udalosti vedúce k opaľovaniu. [33] [34]

Kmeňové bunky Upraviť

Hladiny p53 hrajú dôležitú úlohu pri udržiavaní kmeňových buniek počas vývoja a zvyšku ľudského života.

V ľudských embryonálnych kmeňových bunkách (hESC) sa p53 udržiava na nízkych neaktívnych hladinách. [35] Je to preto, že aktivácia p53 vedie k rýchlej diferenciácii hESC. [36] Štúdie ukázali, že vyradenie p53 oneskoruje diferenciáciu a že pridanie p53 spôsobuje spontánnu diferenciáciu, čo ukazuje, ako p53 podporuje diferenciáciu hESC a hrá kľúčovú úlohu v bunkovom cykle ako regulátor diferenciácie. Keď sa p53 stabilizuje a aktivuje v hESC, zvyšuje p21, aby sa vytvoril dlhší G1. To zvyčajne vedie k zrušeniu vstupu do S-fázy, čo zastaví bunkový cyklus v G1, čo vedie k diferenciácii. Práca na myších embryonálnych kmeňových bunkách však nedávno ukázala, že expresia P53 nemusí nutne viesť k diferenciácii. [37] p53 tiež aktivuje miR-34a a miR-145, ktoré potom potláčajú faktory pluripotencie hESC, čo ďalej podnecuje diferenciáciu. [35]

V dospelých kmeňových bunkách je regulácia p53 dôležitá na udržanie kmeňových buniek vo výklenkoch dospelých kmeňových buniek. Mechanické signály, ako je hypoxia, ovplyvňujú hladiny p53 v týchto špecifických bunkách prostredníctvom faktorov indukovateľných hypoxiou, HIF-1a a HIF-2a. Zatiaľ čo HIF-1α stabilizuje p53, HIF-2α ho potláča. [38] Potlačenie p53 hrá dôležitú úlohu vo fenotype rakovinových kmeňových buniek, indukovaných pluripotentných kmeňových bunkách a iných úlohách a správaní kmeňových buniek, ako je tvorba blastému. Ukázalo sa, že bunky so zníženými hladinami p53 sa preprogramujú na kmeňové bunky s oveľa vyššou účinnosťou ako normálne bunky. [39] [40] Dokumenty naznačujú, že nedostatok zastavenia bunkového cyklu a apoptózy dáva viac bunkám šancu na preprogramovanie. Ukázalo sa tiež, že znížené hladiny p53 sú kľúčovým aspektom tvorby blastému v nohách mlokov. [41] Regulácia p53 je veľmi dôležitá, pretože pôsobí ako bariéra medzi kmeňovými bunkami a diferencovaným stavom kmeňových buniek, ako aj bariéra medzi funkčnými a rakovinovými kmeňovými bunkami. [42]

Iné Edit

Okrem vyššie uvedených bunkových a molekulárnych účinkov má p53 protirakovinový účinok na úrovni tkaniva, ktorý pôsobí inhibíciou angiogenézy. Ako nádory rastú, potrebujú získavať nové krvné cievy, aby ich zásobovali, a p53 to inhibuje tým, že (i) interferuje s regulátormi nádorovej hypoxie, ktoré tiež ovplyvňujú angiogenézu, ako sú HIF1 a HIF2, (ii) inhibuje produkciu faktorov podporujúcich angiogénne ochorenia, a (iii) priame zvýšenie produkcie inhibítorov angiogenézy, ako je aretén. [43] [44]

Ukázalo sa, že p53 reguláciou leukemického inhibičného faktora uľahčuje implantáciu u myší a možno aj u ľudí. [45]

p53 sa aktivuje v reakcii na nespočetné stresory, vrátane, ale nie výlučne, poškodenia DNA (indukovaného buď UV, IR alebo chemickými činidlami, ako je peroxid vodíka), oxidačného stresu, [46] osmotického šoku, deplécie ribonukleotidov a deregulovanej expresie onkogénu. Táto aktivácia je poznačená dvoma hlavnými udalosťami. Po prvé, polčas p53 sa drasticky zvýši, čo vedie k rýchlej akumulácii p53 v stresovaných bunkách. Po druhé, konformačná zmena núti p53, aby sa aktivoval ako regulátor transkripcie v týchto bunkách. Kritická udalosť vedúca k aktivácii p53 je fosforylácia jeho N-terminálnej domény. N-terminálna transkripčná aktivačná doména obsahuje veľký počet fosforylačných miest a možno ju považovať za primárny cieľ pre proteínkinázy prenášajúce stresové signály.

Proteínkinázy, o ktorých je známe, že sa zameriavajú na túto transkripčnú aktivačnú doménu p53, možno zhruba rozdeliť do dvoch skupín. Prvá skupina proteínkináz patrí do rodiny MAPK (JNK1-3, ERK1-2, p38 MAPK), o ktorej je známe, že reaguje na niekoľko typov stresu, ako je poškodenie membrány, oxidačný stres, osmotický šok, tepelný šok atď. Druhá skupina proteínkináz (ATR, ATM, CHK1 a CHK2, DNA-PK, CAK, TP53RK) sa podieľa na kontrolnom bode integrity genómu, čo je molekulárna kaskáda, ktorá deteguje a reaguje na niekoľko foriem poškodenia DNA spôsobeného genotoxickým stresom. Onkogény tiež stimulujú aktiváciu p53, sprostredkovanú proteínom p14ARF.

V nestresovaných bunkách sa hladiny p53 udržiavajú na nízkej úrovni prostredníctvom kontinuálnej degradácie p53. Proteín nazývaný Mdm2 (u ľudí nazývaný aj HDM2) sa viaže na p53, bráni jeho pôsobeniu a transportuje ho z jadra do cytosolu. Mdm2 tiež pôsobí ako ubikvitín ligáza a kovalentne viaže ubikvitín na p53, a tak označuje p53 na degradáciu proteazómom. Ubikvitylácia p53 je však reverzibilná. Pri aktivácii p53 sa aktivuje aj Mdm2, čím sa vytvorí spätná väzba. Hladiny p53 môžu vykazovať oscilácie (alebo opakované impulzy) v reakcii na určité stresy a tieto impulzy môžu byť dôležité pri určovaní, či bunky prežijú stres alebo odumrú. [47]

MI-63 sa viaže na MDM2 a reaktivuje p53 v situáciách, keď je funkcia p53 inhibovaná. [48]

Proteáza špecifická pre ubikvitín, USP7 (alebo HAUSP), môže odštiepiť ubikvitín z p53, čím ho chráni pred degradáciou závislou od proteazómu prostredníctvom dráhy ubikvitín ligázy . Toto je jeden z prostriedkov, ktorým je p53 stabilizovaný v reakcii na onkogénne poškodenia. Ukázalo sa tiež, že USP42 deubikvitinuje p53 a môže byť potrebný pre schopnosť p53 reagovať na stres. [49]

Nedávny výskum ukázal, že HAUSP je lokalizovaný hlavne v jadre, hoci jeho časť možno nájsť v cytoplazme a mitochondriách. Nadmerná expresia HAUSP vedie k stabilizácii p53. Deplécia HAUSP však nevedie k zníženiu hladín p53, ale skôr zvyšuje hladiny p53 v dôsledku skutočnosti, že HAUSP viaže a deubikvitinuje Mdm2. Ukázalo sa, že HAUSP je lepším väzbovým partnerom pre Mdm2 ako p53 v nestresovaných bunkách.

Ukázalo sa však, že USP10 sa nachádza v cytoplazme v nestresovaných bunkách a deubikvitinuje cytoplazmatický p53, čím zvráti ubikvitináciu Mdm2. Po poškodení DNA sa USP10 translokuje do jadra a prispieva k stabilite p53. USP10 tiež neinteraguje s Mdm2. [50]

Fosforylácia N-terminálneho konca p53 vyššie uvedenými proteínkinázami narušuje väzbu Mdm2. Ďalšie proteíny, ako napríklad Pin1, sa potom prijímajú do p53 a indukujú konformačnú zmenu v p53, čo ešte viac zabraňuje väzbe Mdm2. Fosforylácia tiež umožňuje väzbu transkripčných koaktivátorov, ako sú p300 a PCAF, ktoré potom acetylujú karboxy-terminálny koniec p53, čím sa odkryje väzbová doména DNA p53, čo mu umožňuje aktivovať alebo potlačiť špecifické gény. Enzýmy deacetylázy, ako sú Sirt1 a Sirt7, môžu deacetylovať p53, čo vedie k inhibícii apoptózy. [51] Niektoré onkogény môžu tiež stimulovať transkripciu proteínov, ktoré sa viažu na MDM2 a inhibujú jeho aktivitu.

Ak TP53 gén je poškodený, supresia nádoru je vážne narušená. Ľudia, ktorí zdedia iba jednu funkčnú kópiu TP53 génu sa s najväčšou pravdepodobnosťou vyvinú nádory v ranej dospelosti, porucha známa ako Li-Fraumeniho syndróm.

The TP53 gén môže byť tiež modifikovaný mutagénmi (chemikálie, žiarenie alebo vírusy), čím sa zvyšuje pravdepodobnosť nekontrolovaného delenia buniek. Viac ako 50 percent ľudských nádorov obsahuje mutáciu alebo deléciu TP53 gén. [52] Strata p53 vytvára genómovú nestabilitu, ktorá najčastejšie vedie k fenotypu aneuploidie. [53]

Riešením liečby nádorov alebo prevencie ich šírenia sa môže javiť zvýšenie množstva p53. Toto však nie je použiteľná metóda liečby, pretože môže spôsobiť predčasné starnutie. [54] Obnovenie normálnej endogénnej funkcie p53 je sľubné. Výskum ukázal, že táto obnova môže viesť k regresii určitých rakovinových buniek bez poškodenia iných buniek v procese. Spôsoby, ktorými dochádza k regresii nádoru, závisia hlavne od typu nádoru. Napríklad obnovenie endogénnej funkcie p53 v lymfómoch môže indukovať apoptózu, zatiaľ čo rast buniek môže byť znížený na normálnu úroveň. Farmakologická reaktivácia p53 sa teda predstavuje ako životaschopná možnosť liečby rakoviny. [55] [56] Prvá komerčná génová terapia, Gendicine, bola schválená v Číne v roku 2003 na liečbu spinocelulárneho karcinómu hlavy a krku. Dodáva funkčnú kópiu génu p53 pomocou geneticky upraveného adenovírusu. [57]

Určité patogény môžu tiež ovplyvniť proteín p53, ktorý TP53 gén exprimuje. Jeden taký príklad, ľudský papilomavírus (HPV), kóduje proteín E6, ktorý sa viaže na proteín p53 a inaktivuje ho. Tento mechanizmus v synergii s inaktiváciou regulátora bunkového cyklu pRb HPV proteínom E7 umožňuje opakované delenie buniek prejavujúce sa klinicky ako bradavice. Niektoré typy HPV, najmä typy 16 a 18, môžu tiež viesť k progresii z benígnej bradavice na cervikálnu dyspláziu nízkeho alebo vysokého stupňa, čo sú reverzibilné formy prekanceróznych lézií. Pretrvávajúca infekcia krčka maternice v priebehu rokov môže spôsobiť nezvratné zmeny vedúce k karcinómu in situ a prípadne k invazívnemu karcinómu krčka maternice. Vyplýva to z účinkov HPV génov, najmä tých, ktoré kódujú E6 a E7, čo sú dva vírusové onkoproteíny, ktoré sú prednostne zadržané a exprimované pri rakovine krčka maternice integráciou vírusovej DNA do hostiteľského genómu. [58]

Proteín p53 je neustále produkovaný a degradovaný v bunkách zdravých ľudí, čo vedie k tlmenej oscilácii. Degradácia proteínu p53 je spojená s väzbou MDM2. V negatívnej spätnej väzbe je samotný MDM2 indukovaný proteínom p53. Mutantné proteíny p53 často nedokážu indukovať MDM2, čo spôsobuje akumuláciu p53 na veľmi vysokých úrovniach. Okrem toho samotný mutantný proteín p53 môže inhibovať normálne hladiny proteínu p53. V niektorých prípadoch sa ukázalo, že jediné missense mutácie v p53 narušujú stabilitu a funkciu p53. [59]

Ukázalo sa, že supresia p53 v ľudských bunkách rakoviny prsníka vedie k zvýšenej expresii génu chemokínového receptora CXCR5 a aktivovanej migrácii buniek v reakcii na chemokín CXCL13. [60]

Jedna štúdia zistila, že proteíny p53 a Myc boli kľúčové pre prežitie buniek chronickej myeloidnej leukémie (CML). Zacielenie na proteíny p53 a Myc liekmi poskytlo pozitívne výsledky na myšiach s CML. [61] [62]

Väčšina mutácií p53 sa deteguje sekvenovaním DNA. Je však známe, že mutácie jedinej missense môžu mať široké spektrum od skôr miernych až po veľmi závažné funkčné účinky. [59]

Veľké spektrum rakovinových fenotypov v dôsledku mutácií v TP53 Tento gén podporuje aj fakt, že rôzne izoformy proteínov p53 majú rôzne bunkové mechanizmy na prevenciu proti rakovine. Mutácie v TP53 môžu viesť k vzniku rôznych izoforiem, čo bráni ich celkovej funkčnosti v rôznych bunkových mechanizmoch, a tým rozširuje fenotyp rakoviny z mierneho na závažný. Nedávne štúdie ukazujú, že izoformy p53 sú rozdielne exprimované v rôznych ľudských tkanivách a mutácie straty funkcie alebo zisku funkcie v rámci izoforiem môžu spôsobiť tkanivovo špecifickú rakovinu alebo poskytnúť potenciál rakovinových kmeňových buniek v rôznych tkanivách. [12] [63] [64] [65] Mutácia TP53 zasahuje aj do energetického metabolizmu a zvyšuje glykolýzu v bunkách rakoviny prsníka. [ potrebná citácia ]

Dynamika proteínov p53 spolu s jeho antagonistom Mdm2 naznačuje, že hladiny p53 v jednotkách koncentrácie oscilujú ako funkcia času. Táto „tlmená“ oscilácia je klinicky zdokumentovaná [66] aj matematicky modelovaná. [67] [68] Matematické modely tiež naznačujú, že koncentrácia p53 osciluje oveľa rýchlejšie, keď sa do systému zavedú teratogény, ako sú dvojvláknové zlomy (DSB) alebo UV žiarenie. To podporuje a modeluje súčasné chápanie dynamiky p53, kde poškodenie DNA indukuje aktiváciu p53 (viac informácií nájdete v regulácii p53). Súčasné modely môžu byť tiež užitočné na modelovanie mutácií v izoformách p53 a ich účinkov na osciláciu p53, čím sa podporuje de novo objav tkanivovo špecifických farmakologických liečiv.

p53 identifikovali v roku 1979 Lionel Crawford, David P. Lane, Arnold Levine a Lloyd Old, pracujúci v Imperial Cancer Research Fund (UK), Princeton University/UMDNJ (Cancer Institute of New Jersey) a Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, resp. Predtým sa predpokladalo, že existuje ako cieľ vírusu SV40, kmeňa, ktorý vyvoláva vývoj nádorov. The TP53 gén z myši prvýkrát klonoval Peter Chumakov z Akadémie vied ZSSR v roku 1982 [69] a nezávisle v roku 1983 Moshe Oren v spolupráci s Davidom Givolom (Weizmann Institute of Science). [70] [71] Človek TP53 gén bol klonovaný v roku 1984 [8] a úplný klon v roku 1985. [72]

Pôvodne sa predpokladalo, že ide o onkogén v dôsledku použitia zmutovanej cDNA po purifikácii mRNA nádorových buniek. Jeho úlohu ako tumor supresorového génu odhalili v roku 1989 Bert Vogelstein na Johns Hopkins School of Medicine a Arnold Levine na Princetonskej univerzite. [73] [74]

Warren Maltzman z Waksman Institute of Rutgers University prvýkrát preukázal, že TP53 reagoval na poškodenie DNA vo forme ultrafialového žiarenia. [75] V sérii publikácií v rokoch 1991–92 Michael Kastan z Univerzity Johnsa Hopkinsa uviedol, že TP53 je kritickou súčasťou dráhy prenosu signálu, ktorá pomáha bunkám reagovať na poškodenie DNA. [76]

V roku 1993 sa hlasovalo o p53 molekula roka podľa časopisu Science. [77]

Rovnako ako 95% ľudských génov, TP53 kóduje viac ako jeden proteín. Niekoľko izoformy boli objavené v roku 2005, a boli identifikované doteraz 12 ľudských p53 izoformy (p53α, p53β, p53γ, Δ40p53α, Δ40p53β, Δ40p53γ, Δ133p53α, Δ133p53β, Δ133p53γ, Δ160p53α, Δ160p53β, Δ160p53γ ). Okrem toho sa izoformy p53 exprimujú spôsobom závislým od tkaniva a p53a sa nikdy neexprimuje samostatne. [12]

Proteíny izoformy p53 s plnou dĺžkou môžu byť rozdelené do rôznych proteínových domén. Počínajúc od N-konca sú najskôr amino-terminálne transaktivačné domény (TAD 1, TAD 2), ktoré sú potrebné na indukciu podskupiny cieľových génov p53. Po tejto doméne nasleduje doména bohatá na prolín (PXXP), pričom motív PXXP sa opakuje (P je prolín a X môže byť akákoľvek aminokyselina). Vyžaduje sa okrem iného pre apoptózu sprostredkovanú p53. [78] Niektorým izoformám chýba doména bohatá na prolín, ako napríklad Δ133p53β,γ a Δ160p53α,β,γ, preto niektoré izoformy p53 nesprostredkujú apoptózu, čo zdôrazňuje diverzifikačné úlohy TP53 gén. [63] Potom je tu DNA viažuca doména (DBD), ktorá umožňuje proteínom sekvenovať špecifické väzby. Karboxylová koncová doména dopĺňa proteín. Zahŕňa jadrový lokalizačný signál (NLS), jadrový exportný signál (NES) a oligomerizačnú doménu (OD). NLS a NES sú zodpovedné za subcelulárnu reguláciu p53. Prostredníctvom OD môže p53 vytvoriť tetramér a potom sa viazať na DNA. Medzi izoformami môžu niektoré domény chýbať, ale všetky zdieľajú väčšinu vysoko konzervovanej domény viažucej DNA.

Izoformy sa tvoria rôznymi mechanizmami. Beta a gama izoformy sú generované viacnásobným zostrihom intrónu 9, čo vedie k odlišnému C-koncu. Okrem toho použitie vnútorného promótora v intróne 4 spôsobuje izoformy ∆133 a ∆160, ktorým chýba doména TAD a časť DBD. Okrem toho alternatívna iniciácia translácie na kodóne 40 alebo 160 nesie izoformy ∆40p53 a ∆160p53. [12]

V dôsledku izoformnej povahy proteínov p53 existuje niekoľko zdrojov dôkazov, ktoré dokazujú, že mutácie v TP53 gény, z ktorých vznikajú mutované izoformy, sú pôvodcami rôznych fenotypov rakoviny, od miernych až po ťažké, v dôsledku jedinej mutácie v TP53 génu (podrobnejšie pozri časť Experimentálna analýza mutácií p53).


Konjugáty platina-interkalátor: od derivátov cisplatiny zacielených na DNA po komplexy viažuce adenín ako potenciálne modulátory génovej regulácie

Jadrová DNA je bunkovým cieľom pre mnohé liečby rakoviny a chemoterapie zamerané na DNA naďalej zohrávajú dôležitú úlohu pri objavovaní liekov v postgenomickej ére. Väčšina protirakovinových činidiel zacielených na DNA sa viaže prostredníctvom kovalentných interakcií, nekovalentnej interkalácie alebo žliabkovej väzby alebo hybridných väzbových režimov. Sekvencia a regiošpecifickosť týchto interakcií a výsledné štrukturálne zmeny v rámci biopolyméru zohrávajú dôležitú úlohu v mechanizme účinku týchto liečiv. Proteíny viažuce DNA a/alebo enzýmy na spracovanie DNA, ktoré tiež interagujú s DNA sekvenčne a žliabkovo špecifickým spôsobom, sú mediátormi cytotoxického účinku produkovaného týmito činidlami. Jedným z hlavných cieľov pri navrhovaní nových klinických látok tohto typu je teda produkcia nových typov aduktov na DNA, čo môže viesť k bezprecedentným mechanizmom zabíjania buniek. Konjugáty platina-interkalátor sú takou triedou hybridných činidiel, ktoré pôsobia prostredníctvom dvojitého spôsobu viazania DNA. Platinové centrum (zvyčajne jednotka cis-diamíndichlórPt(II)) dominuje profilom aduktov DNA u väčšiny týchto druhov – výsledok tendencie kovu vytvárať krížové väzby v postupných postupoch guanínových báz v hlavnej drážke DNA. Táto paradigma bola nedávno po prvýkrát prelomená dizajnom cytotoxických konjugátov platina-akridinyltiomočovina, triedy adenín-afinických činidiel zameraných na menšie drážky. Tento prehľad sumarizuje hlavné pokroky v chémii a biológii interkalátorov platiny od roku 1984 do roku 2004, pričom dôraz sa kladie na súhru medzi chemickou štruktúrou, mechanizmom väzby DNA a biologickými vlastnosťami.


Metódy

Generovanie mutantov podľa špecifického pomeru mutácií

Použili sme algoritmus genetického algoritmu (GA) ako stratégiu mutácie na generovanie potomkov. V prvej generácii sa náhodne vygenerovalo 103 génových sekvencií, pričom každá sekvencia vyprodukovala 104 potomkov s rýchlosťou mutácie 10-4. Keďže procesy štrukturálneho modelovania a dokovania sú výpočtovo veľmi nákladné, veľkosť populácie a frekvencia mutácií sa znížili na výpočtovo zvládnuteľnú úroveň. V algoritme GA bola veľkosť populácie kontrolovaná odstránením jedincov s najnižším hodnotením, čo umožnilo iba 5 % najlepších jedincov obsahujúcich mutácie. Ak vhodné sekvenčné číslo presiahlo 1000, potom sa vybralo 1000 najlepších mutantných sekvencií. Pôvodné sekvencie s najvyšším skóre sa použili na vyplnenie populácie, ak vhodné sekvenčné číslo bolo menšie ako 1000. Sekvencia DNA každého jednotlivca sa preložila do proteínovej sekvencie, ktorá sa potom podrobila modelovaniu proteínovej štruktúry a molekulovému dokovaniu. Konečné hodnotiace skóre mutanta sa vypočítalo podľa Eq. (1). Genetická evolúcia sa považovala za ukončenú, keď mutant s najvyšším hodnotením vykazoval nižšiu väzbovú afinitu k liečivu ako k ATP.

Výpočty balenia bočnej reťaze

Na modelovanie štruktúr proteínových mutantov sme použili program Scap (http://honig.c2b2.columbia.edu/scap/)40,41. Na volanie modulu Scap sa použil skript Perl s cieľom previesť mutované zvyšky na zodpovedajúcu variáciu v štruktúre proteínu. Scap is used to build side chain conformations using its coordinate rotamer libraries. As we do not want the mutation to change the protein structure significantly, we chose an AMBER force field with a heavy atom model and a mixed side chain rotamer library. The other parameters were set to the default values, which allowed a relatively stable mutant protein conformation. We used the Scap program to generate structures of thousands of residue mutations.

Protein-drug docking

We used the AutoDock Vina program (http://vina.scripps.edu/index.html, version 1.1.2) to build the drug-mutant and ATP-mutant structures and calculate the binding scores 69 . Default AutoDock Vina parameters were used. The superposition module in Schrödinger 70 was used to calculate the RMSD of ATP in the crystal structure and in the mutants.

ABL structures

During the simulation, we used different ABL crystal structures for different compounds. The structure of ABL complexed with ATP was derived from the ATP-peptide conjugate complex (PDB code: 2G1T) with the protein in an inactive conformation 71 . The structure used for imatinib was 2HYY with the complexed protein in an inactive conformation 72 . The structure used for nilotinib was 3CS9 with the complexed protein in an inactive conformation 73 . For dasatinib, we used 2GQG with the complexed protein in an active conformation 48 . Ponatinib was designed for the T315I mutant. It avoids steric hindrance with the side chain of isoleucine. 3IK3 (with a T315 mutation) complexed with ponatinib was also used. The mutant protein 3IK3 adopts an inactive conformation 62 . The wide-type protein structure in this case was obtained by mutating I315 back to T315.

EGFR structures

The structure of EGFR tyrosine kinase domain in complex with ATP was derived from the thiophosphoric acid O-[(adenosyl-phospho)phosphor]-S-acetamidyl-diester complex (PDB code: 2GS6) with the protein in an active conformation 74 . The structure used for gefitinib was 4I22 with the complexed protein in an active conformation 75 .

Compounds and substrates

Imatinib (MW493.6), nilotinib (MW529.52), dasatinib (MW488.01), and ponatinib (MW532.56) were purchased from Selleck (https://www.selleck.cn/). The substrate peptide was obtained from GL Biochem (Shanghai) Ltd. and had a sequence of Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Ile-Tyr-Ala-Ala-Pro-Phe-Ala-NH2 (Directory peptide Cat # 86721).

Expression and purification of ABL and mutants

The kinase domains of human c-ABL (residues 222–500, NM_005157.5) were subcloned into the Ndeja a XhoI restriction sites of the pET-28a vector 76 . The plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells, plated on LB agar containing kanamycin (50 μg mL −1 ), and grown overnight at 37 °C. The next day, the colonies from the plates were resuspended in expression media (LB agar containing kanamycin, 50 μg mL −1 ). Cultures were grown to an OD600 of 1.2 at 37 °C and cooled for 1 h with shaking at 16 °C prior to induction for 22 h at 16 °C with 0.1 mM IPTG. Cells were harvested by centrifugation at 7000 × g at 4 °C for 15 min and stored at −80 °C. The bacterial pellet was resuspended in Buffer A [50 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazole] for immediate purification using nickel ion affinity chromatography. Elution of the protein from the column was achieved using a Buffer B gradient [50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole (pH 8.0)], which increased from 0% to 100% over 15 min. The eluted protein was concentrated to 2 mL and subjected to gel filtration using an S200 column 77,78 . The buffer used for the gel filtration was Buffer C [50 mM Tris, 500 mM NaCl (pH 8.0)]. The protein was eluted at 55 min. The purity of the protein was verified by SDS-PAGE.

For the mutants, primers were designed based on the predicted mutations and synthesized by GENEWIZ. Mutations were made using the Fast Site-Directed Mutagenesis kit from TIANGEN, according to the manufacturer’s instructions, and verified by DNA sequencing. The mutant proteins were expressed and purified following the expression and purification of the wt protein.

In vitro kinase inhibition assay

To assess the ability of the drug to inhibit the wt and mutant kinases, we used the ADP-Glo Kinase Assay kit from Promega 79 , which measures the amount of ADP produced in the reaction. The inhibition rates of the drugs at different concentrations were calculated by comparing the amount of ADP produced with and without the drug. Data were analyzed using the Hill1 model in the OriginLab2018 software package.

In vitro enzyme activity assay

ITC experiments were carried out using an ITC200 instrument (Microcal Inc.). ITC has been demonstrated to directly measure the kinetics and thermodynamic parameters (k kat, K M, ΔH) of enzymatic reactions 80 . A one-step method was used to measure the enzymatic parameters. The BCR-ABL concentration was in the nanomolar range, with the ATP/substrate concentration at least three orders of magnitude higher than the enzyme concentration and above the K M [BCR-ABL (10 nM) and substrate (1 mM) in the cell, and ATP (1 mM) in the syringe].

The thermal change (Q) is proportional to the reaction enthalpy (ΔH) and the number of moles of product (n), whereas the moles of product equal the total volume (V) multiplied by the concentration [P]:

According to Eq. (3), the ΔH of the reaction can be obtained by integrating the curve of the Method 1 experiment


Result and Discussion

Experimental studies shows that the ligands (Table 2) used in this study are good antileishmanials ( 4-15 ), but docking of these compounds revealed a great variation in their binding energy. Initially, totally five poses were saved from which best pose with lowest energy was chosen for each compound. Although the predicted free energy of binding is a useful descriptor of ligand–receptor complementarity, the choice of the ‘best’ docking model was ultimately dictated by various parameters of ADME/T study. Our results show that several compounds were not following the given range limit of few ADME/T properties. These include PISA (1/4 component, i.e. carbon and attached hydrogens of the SASA range, 0–400 Å 2 ), QlogPC16 (predicted log of hexadecane/gas partition coefficient range, 4–18), QlogPo/w (predicted log of octanol/water partition coefficient range, −2 to 6), QlogS (Predicted log of aqueous solubility range, −6 to 0.5 m ). QPPMDCK (predicted apparent MDCK cell permeability range, poor < 25 nm/seconds and great > 500 nm/seconds), QPlogHERG (predicted IC50 value of blockage of HERG K+ channel range, <−5) were also found to be violated by 2, 5-bis-(4-amidinophenyl)thiophene (5c) and berenil, respectively (not shown in Table 4).

S. No Compound id G score SASA FOSA FISA PISA WPSA Vol QPpolrz QPlogPC16 QPlogPoct QPlogPw QPlogPo/w QPlogS QPlogHERG PHOA Rule of five Toxicita
1 1a −5.987491 560.887 190.08 127.05 243.8 0 945.45 32.727 9.978 17.222 11.989 2.019 −4.088 −5.436 88.721 0 NIE
2 1b −4.727568 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A NIE
3 1c −4.637121 738.471 0 98.531 639.9 0 1291.9 49.089 16.002 22.977 14.476 4.779 6.764 −8.195 100 0 NIE
4 2a −5.621212 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A NIE
5 2b −6.474291 551.198 374.14 3.851 173.2 0 1002.4 34.331 8.879 13.409 6.734 3.049 −2.499 −5.046 100 0 NIE
6 2c −5.619455 734.312 512.31 176.53 45.47 0 1196 39.575 12.012 23.791 15.36 1.983 −5.99 −5.923 67.157 1 NIE
7 2d −5.509143 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Vysoká
8 3 −10.93399 564.425 0 266.67 297.8 0 934.31 28.302 12.334 23.996 19.586 −0.02 −2.279 −5.883 40.131 1 NIE
9 4a −11.09014 767.378 426.04 121.51 149.4 70.47 1374.1 45.769 13.979 23.249 12.698 4.021 6.408 −5.821 100 0 NIE
10 4b −12.05836 573.216 0 220.97 352.2 0 972.25 32.267 12.575 22.054 15.909 1.681 −3.356 −5.995 57.842 1 NIE
11 5a −10.94681 851.379 0 125.74 624.8 100.9 1506.4 54.963 19.511 29.664 16.42 6.064 8.293 −8.614 86.713 2 NIE
12 5b −11.71767 889.017 152.68 88.545 571.1 76.73 1632.1 58.194 19.809 29.374 16.427 6.575 8.222 −8.235 96.017 2 NIE
13 5c −11.4314 429.265 218.29 210.98 0 0 692.77 21.571 6.541 35.538 6.102 1.414 −3.354 −3.44 57.975 1 NIE
14 5d −11.41968 911.9 152.18 102.79 605.6 51.37 1647.7 59.149 20.27 29.734 16.805 6.506 8.509 −8.63 93.195 2 NIE
15 5e −10.88554 603.176 0 225.4 349.5 28.32 1020.4 34.168 13.239 22.196 15.51 2.19 −4.031 −6.23 60.07 1 NIE
16 6 −9.29 537.669 484.39 53.272 0 0 966.55 31.243 8.127 14.109 6.819 2.467 −2.056 −4.93 82.28 0 NIE
  • SASA, total solvent accessible surface area (range, 300–1000 Å 2 ) FOSA, hydrophobic component of the SASA (range, 0–750 Å 2 ) FISA, hydrophilic component of the SASA (range, 7–330 Å 2 ) PISA, 1/4 component of the SASA (range, 0–400 Å 2 ) WPSA, weakly component of SASA (range, 0–150 Å 2 ) Volume, total solvent accessible area (range: 500–2000 Å 3 ) QPpolrz, Predicted polarizability (range, 13–70 Å 3 ) QPlogPC16, rredicted log of hexadecane/gas partition coefficient (range, 4–18) QPlogPoct, predicted log of octanol/gas partition coefficient (range, 8–43) QPlogPw, predicted log of water/gas partition coefficient (range, 5–48) QPlogPo/w predicted log of octanol/water partition coefficient (range, −2 to 6) QplogS, predicted log of aqueous solubility (range, −6 to 0.5 m ) QPlogHERG, predicted IC50 value for blockage of HERG K+ channels (range, concern below −5) PHOS, per cent human oral absorption GScore, Glide Score.
  • The values in bold are out of range from the category of drug.

Hydrophobic drugs with high partition coefficients are preferentially distributed to hydrophobic compartments such as lipid bilayers of cells while hydrophilic drugs (low partition coefficients) preferentially are found in hydrophilic compartments such as blood serum. As adequate solubility and permeability is a prerequisite for drug absorption from the gastrointestinal tract, it plays a significant role for the resulting bioavailability of orally administered drugs. By violating these properties, a compound may be associated with side-effects, high or poor solubility (QlogS) that can result in poor absorption and distribution in the body.

The interactions and other scores resulted from docking studies for each compound are summarized in Table 5. The results are briefly described in the following section.

Ligand Receptor Interakcia
LIG.NH (37) DT4.A.O2 (148) Hydrogen bond
LIG DA6.A Hydrofóbne
LIG DT7.A Hydrofóbne
LIG DT18.B Hydrofóbne
LIG DA19.B Hydrofóbne

Acridine and its derivatives

Acridine family includes a wide range of tricyclic molecules with various biologic properties. Considered as potential antiparasitic agents since the 1990s, numerous acridine derivatives have been synthesized and successfully assessed for their antimalarial, trypanocidal or antileishmanial properties ( 19-21 ). According to a previous study, N-[6-(acetylamino)-3-acridinyl] acetamide (compound 1c) a N-[6-(benzoylamino)-3-acridinyl] (compound 1b) benzamide demonstrated highly specific antileishmanial properties against the intracellular amastigote form of the parasite ( 12 ). But our docking score suggests that only acridine (compound 1a GScore, −5.987491) was the best with no violation of any ADME/T descriptor (Table 4). Zlúčenina 1c was found to violate few ADME/T properties when analyzed by QikProp.

Berberin and its derivatives:

Berberine, a quaternary alkaloid and a minor groove binder ( 23 ), has demonstrated experimental and clinical efficacies against both visceral ( 4, 6, 7 ) and cutaneous ( 4 ) leishmaniases. Despite the apparent potential of this compound as an antileishmanial drug, only Putzer ( 22 ) has described the antileishmanial activity of derivatives of berberine and failed to present any biologic or chemical data to substantiate his claims. Further, in support of this study, Vennerstrom a kol. ( 9 ) suggested that tetrahydroberberine (2c) was proven less toxic and more potent against Leishmania donovani than berberine (2a), N-methyl tetrahydro berberinium iodide (2b), berberine chloride (2d). In contrast to these results, we have found major variation in the data when applied in silico automated docking calculations. Our results show that N-methyl tetrahydro berberinium iodide (compound 2b) was having the best GScore (−6.474291) among all with no violence of ADME/T parameters. When studied using ToxTree software, berberine chloride (compound 2d) was analyzed as highly toxic among the all compounds (Table 4).

Berenil

Berenil (diminazene aceturate), a minor groove binder in AT-rich domain ( 24 ), has been proven a good antileishmanial previously ( 5, 8 ). náš in silico docking calculation with a GScore of −10.93398 and ADME/T study with no violence of any parameters is in agreement with previous studies (Table 4).

Pentamidine and its derivatives

Pentamidine (compound 5a) is one of the few antileishmanial drugs currently available. It belongs to the diamidine class of drugs, which has been suggested to exert antiparasitic activity by binding to DNA, interfering with polyamine metabolism and disrupting of mitochondrial membrane potential ( 25 ). Typically, these dicationic molecules bind to DNA by selectively interacting with AT-rich regions of the minor groove. The complementarity of the curvature of the dicationic molecules with that of the minor groove of DNA has been considered an important determinant in the interaction of such groove binders with DNA ( 26, 27 ). Pentamidine is already in clinical use but limited by toxicity, administration by injection, and development of resistance ( 10 ). In addition to pentamidine, many of diamidine molecules –N-[2-(methylsulfanyl)-4-<5-[3-(methylsulfanyl)-4-(pyridine-2-imidamido) phenyl] fura N-2-Yl> phenyl] pyridine-2-carboximidamide (5b), 2 5-bis-(4-amidinophenyl)thiophene (5c), N-(3-chloro-4-<5-[2-chloro-4-(pyridine-2-imidamido) phenyl] fura N-2-yl> phenyl) pyridine-2-carboximidamide (5d), 2 4-bis-(4-amidinophenyl)furan (5e) – exhibited promising activity against Leishmania. The antileishmanial activity of several such dicationic molecules was reported earlier ( 10, 11, 13, 28 ).

Docking studies of these compounds including pentamidine reveal that all these compounds were scored a good GScore, but only compounds 5c a 5e satisfied the ADME/T parameters’ range and other three compounds viz. 5a, 5b, 5d seemed to violate few filters.

Diindolyl methane

(3,3′)-Diindolylmethane (DIM, compound 6) is a natural compound, product of acid condensation of indole-3-carbinol (I3C), found in most cruciferous vegetables of the genus Brassica. DIM inhibits an unusual bisubunit topoisomerase I from L. donovani and has been found to interact both with free enzyme and with DNA. A study has been carried out to verify the interaction between DIM-DNA ( 15 ). Their data and our result of its in silico interaction with DNA (GScore, −9.29) and ADME/T study showed that the compound can be a future drug molecule.

Duocarmycine and its derivative

The duocarmycins bind to the minor groove of DNA and alkylate the nucleobase adenine at the N3 position ( 29 ). Seco-hydroxy-aza-CBI-TMI, analog of duocarmycin (4a), was shown to inhibit the growth of the protozoan parasites L. donovani, Leishmania mexicana, in culture ( 14 ). Seco-hydroxy-aza-CBI-TMI (4b) was also shown (Figures 1 and 2) to score a good binding energy (GScore, −12.058362), and the study of ADME/T parameters with no violence of any parameters is in agreement with the previous studies (Table 4).

Illustration of binding pocket of seco-hydroxy-aza-CBI-TMI in DNA: (A) and (B) Ligand is shown as stick and DNA residues as wire. Possible hydrogen bond is shown as yellow thick line with the atoms and distance (2.844 Å).

(A) Ligand is shown in active site pocket. Active site residues are shown as surface. (B) 2D view of the complex (generated by Poseview v1.0.0 BioSolveIT GmbH, Sankt Augustin, Germany). Hydrogen bond is shown as dashed line, and residues taking part in hydrophobic interaction are in green color. Hydrophobic interactions are shown as green line.


Experimental Section

Cytotoxicity Assay

HeLa cells were seeded on 96-well tissue culture plates at 1.0 × 10 4 cells/well. After incubation in a humidified atmosphere containing 5% CO2 for 24 h at 37ଌ in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% FBS, the cells were washed with Leibovitz’s L-15 medium and treated with TAT, E3-TAT, and E5-TAT in L-15. After 1 h incubation, the cells were washed with fresh L-15 medium and incubated at 37ଌ for 3 hours. The number of live cells present in each well was then determined using the Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular probes, Carlsbad, CA). Alternatively, SYTOX® Blue, a nucleic acid fluorescent stain that only penetrates cells with compromised plasma membranes, was used to measure cell-viability by fluorescence microscopy imaging.

Live Cell Assay for the Transduction of Fluorescent Imaging agents

HeLa, COS-7 and COLO 316 cells were seeded on 8-well chamber glass slide at 3.0 × 10 4 cells/well in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% FBS and incubated for 24 h at 37ଌ in a humidified atmosphere containing 5% CO2. Cells were then incubated with L-15 medium (no FBS added) and placed on an inverted epifluorescence microscope (Model IX81, Olympus, Center Valley, PA) equipped with a heating stage maintained at 37ଌ. The microscope is configured with a spinning disk unit to perform both confocal and wide-field fluorescence microscopy. Images were collected using a Rolera-MGI Plus back-illuminated EMCCD camera (Qimaging, Surrey, BC, Canada). Images were acquired using phase contrast and three standard fluorescence filter sets: CFP (Ex = 436넠 nm / Em= 480녀 nm), Texas Red (Ex = 560녀 nm / Em= 630녵 nm), and FITC (Ex = 482넵 nm / Em= 536녀 nm). Cells were co-treated with of TAT or E3/E5-TAT (2 µM) in L-15 medium containing fluorescent imaging agents at 10 µM for the fluorescent proteins EGFP, mCherry, and tdTomato (obtained as previously described) and 2.5 mg/mL for the dextrans 10 and 70 kDa anionic Dextran-fluorescein, 10 and 70 kDa neutral Dextran-tetramethylrhodamine, and 70 kDa neutral Dextran-Texas Red.[10] After incubation at 4 or 37ଌ for 15 or 60 minutes, the cells were washed with PBS 5 times and the medium was replaced with fresh L-15. The integrity of the plasma membrane of the cells was determined by addition of the cell-impermeable DNA stain SYTOX® Blue. Cells with a blue fluorescent nucleus, detected with the CFP filter set, were considered compromised or dead. The cells that were not stained by SYTOX® Blue were further confirmed to be alive by detection of active transport of intracellular endocytic vesicles. To inhibit cell surface binding of the delivery peptides, heparin sodium salt (1 mg/mL) was added during the co-incubation step. To inhibit acidification of the endolysosomal organelles, cells were pretreated with bafilomycin (200 nM) for 20 min. Cells were then co-incubated with the fluorescent macromolecules and the delivery peptides in L-15 supplemented with bafilomycin (200 nM). The fluorescence intensities within cells were measured using the SlideBook 4.2 software (Olympus, Center Valley, PA). The mean intensity within cells imaged with the FITC or Texas Red filters was measured as the total intensity of the cell divided by its area. The same protocol was used for cells with either punctate or diffuse distributions. Mean fluorescence intensities were measured over a population of 3000 cells and experiments were reproduced 3 times.

Live Cell Assay for the delivery of PAD

Cells grown on 96-well plates were treated with PAD (20 µM) and TAT (5 µM) or E5-TAT (3, 5, or 7 µM) in L-15. For the inhibition of macropinocytosis, cells were first pretreated with 50 µM of amiloride (Sigma, MO) for 30 minutes, and then with the peptides while keeping amiloride present. After 1 h incubation, the cells were washed with fresh L-15 medium again and incubated at 37ଌ for additional 3 hours. The number of live cells present in each well was then determined using the Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular probes, Carlsbad, CA). After 1 h incubation the cells were washed with L-15. SYTOX® Blue (5 µM) was added and cells were incubated for 15 min at 37ଌ. Cells were then placed on the microscope and images were acquired in the blue fluorescence channel for detection of SYTOX® Blue and red fluorescence channel for detection of TMR.


Structures in the collection

Typ Popis Download structure
An MW Collection

To view the collection, you will need to download and install the iPad version of Molecule World. Once Molecule World is installed on your iPad, return to this page and download the entire DNA Binding Lab collection at once by clicking the mwc file.

A double-stranded DNA molecule. Hydrogens are shown because this structure was solved by NMR.

A double-stranded DNA molecule. Hydrogens are not seen because this structure was solved by X-ray diffraction.


DNA Intercalation by Quinacrine and Methylene Blue: A Comparative Binding and Thermodynamic Characterization Study

There is compelling evidence that cellular DNA is the target of many anticancer agents. Consequently, elucidation of the molecular nature governing the interaction of small molecules to DNA is paramount to the progression of rational drug design strategies. In this study, we have compared the binding and thermodynamic aspects of two known DNA-binding agents, quinacrine (QNA) and methylene blue (MB), with calf thymus (CT) DNA. The study revealed noncooperative binding phenomena for both the drugs to DNA with an affinity one order higher for QNA compared to MB as observed from diverse techniques, but both bindings obeyed neighbor exclusion principle. The data of the salt dependence of QNA and MB from the plot of log K versus log [Na + ] revealed a slope of 1.06 and 0.93 consistent with the values predicted by theories for the binding of monovalent cations, and have been analyzed for contributions from polyelectrolytic and nonpolyelectrolytic forces. The binding of both drugs was further characterized by strong stabilization of DNA against thermal strand separation in both optical melting and differential scanning calorimetry studies. The binding data analyzed from the thermal denaturation and from isothermal titration calorimetry (ITC) were in close proximity to those obtained from spectral titration data. ITC results revealed the binding to be exothermic and favored by both negative enthalpy and positive entropy changes. The heat capacity changes obtained from temperature dependence of enthalpy indicated −146 and −78 cal/(mol·K), respectively, for the binding of QNA and MB to CT DNA. Circular dichroism study further characterized the structural changes on DNA upon intercalation of these molecules. Molecular aspects of interaction of these molecules to DNA are discussed.


Pozri si video: Centrálna dogma molekulárnej biológie (Jún 2022).