Informácie

Je Ellmanovo činidlo špecifické pre proteíny a tioly s nízkou molekulovou hmotnosťou?

Je Ellmanovo činidlo špecifické pre proteíny a tioly s nízkou molekulovou hmotnosťou?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Je stále možné kvantifikovať proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou bohaté na cysteín, ako je metalotioneín, v danej vzorke pomocou Ellmanovho činidla, ak je vzorka kontaminovaná niektorými proteínmi s vysokou molekulovou hmotnosťou?


Je to špecifické pre tioly vo všeobecnosti. Ak kontaminujúce proteíny obsahujú tioly prístupné rozpúšťadlu, DTNB s nimi bude reagovať.


Úvod

Tioly, tiež známe ako merkaptány, sú triedou organických zlúčenín, ktoré obsahujú sulfhydrylovú skupinu (–SH) zloženú z atómu síry a atómu vodíka naviazaného na atóm uhlíka [1]. Tiolový pool v plazme je tvorený hlavne albumínovými tiolmi, proteínovými tiolmi a mierne tvorený tiolmi s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako je cysteín (Cys), cysteinylglycín, glutatión, homocysteín a γ-glutamylcysteín [2].

Tioly (RSH) môžu prejsť oxidačnou reakciou cez oxidanty a vytvárať disulfidové (RSSR) väzby [3]. Disulfidová väzba je kovalentná väzba, ktorá sa tiež nazýva SS väzba alebo disulfidový mostík. V podmienkach oxidačného stresu môže oxidácia Cys zvyškov viesť k reverzibilnej tvorbe zmiešaných disulfidov medzi proteínovými tiolovými skupinami a tiolmi s nízkou molekulovou hmotnosťou. Vytvorené disulfidové väzby môžu byť opäť redukované na tiolové skupiny, čím sa zachová dynamická tiol-disulfidová homeostáza [4].

Stav dynamickej homeostázy tioldisulfidu má rozhodujúcu úlohu v antioxidačnej ochrane, detoxikácii, signálnej transdukcii, apoptóze, regulácii enzymatickej aktivity a transkripčných faktorov a mechanizmoch bunkovej signalizácie [5], [6]. Navyše, dynamická homeostáza tioldisulfidu sa čoraz viac podieľa na mnohých poruchách. Rastie tiež množstvo dôkazov, ktoré dokazujú, že abnormálny stav homeostázy tioldisulfidu sa podieľa na patogenéze rôznych chorôb, vrátane cukrovky [7], kardiovaskulárnych chorôb [8], rakoviny [9], reumatoidnej artritídy [10], chronické ochorenie obličiek [11], syndróm získanej imunodeficiencie (AIDS) [12], Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba, Friedreichova ataxia (FRDA), roztrúsená skleróza a amyotrofická laterálna skleróza [13], [14], [ 15] a poruchou pečene [16]. Preto stanovenie dynamickej homeostázy tioldisulfidu môže poskytnúť cenné informácie o rôznych normálnych alebo abnormálnych biochemických procesoch.

Plazmatická hladina tiolu sa najčastejšie meria pomocou klasického Ellmanovho činidla, kyseliny 5,5′-ditiobis-(2-nitrobenzoovej) (DTNB). Táto zlúčenina je stechiometricky redukovaná voľnými tiolmi vo výmennej reakcii, pričom vzniká zmesový disulfid a uvoľňuje sa jedna molekula kyseliny 5-tionitrobenzoovej, čo môže byť merané pri 412 nm [17]. Alternatívnym činidlom k DTNB je 4,4′-ditiodipyridín (4-DPS) [18]. Redukcia 4-DPS vedie k 4-tiopyridónovému tautoméru a ten sa môže merať pri 324 nm, čo je vlnová dĺžka blízka ultrafialovému žiareniu. Túto vlnovú dĺžku nemôžu používať automatické analyzátory, pretože najnižšia vlnová dĺžka je 340 nm vo všetkých automatických analyzátoroch používaných v laboratóriách klinickej chémie.

Pokiaľ je nám známe, neexistuje žiadna automatizovaná kolorimetrická metóda merania hladín dynamických disulfidov v plazme/sére [19]. V niekoľkých nedávnych štúdiách boli hladiny disulfidov a tiolov v nízkomolekulových disulfidových zlúčeninách plazmy stanovené pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) [20], [21], fluorescenčnej kapilárnej elektroforézy [22] a bioluminiscenčných systémov. [23]. V týchto sofistikovaných systémoch sú separačné procesy, ako je odstraňovanie zostávajúcich redukčných činidiel, ktorými sú NaBH4Potrebné sú aj tris(2-karboxyetyl)fosfín (TCEP) a tributylfosfín, ako aj precipitácia proteínov [19]. Tieto aplikácie predúpravy a meracie postupy sú časovo náročné, prácne a nákladné a vyžadujú zložité techniky.

V tejto štúdii je opísaný nový a automatizovaný test určujúci dynamickú tiol/disulfidovú homeostázu a nový koncept testovacieho klastra obsahujúceho –S–S–, –SH, –S–S–/–SH, –S–S–/(– Zavádza sa SH + –S–S–) a –SH/(–SH + –S–S–).


Rýchlosti tiol-disulfidových výmenných reakcií medzi mono- a ditiolmi a Ellmanovým činidlom

Zobrazenia článku predstavujú súčet počtu stiahnutí článkov v plnom znení od novembra 2008 (vo formáte PDF aj HTML) vo všetkých inštitúciách a jednotlivcoch, ktorý je v súlade s COUNTER. Tieto metriky sa pravidelne aktualizujú, aby odzrkadľovali používanie až do posledných dní.

Citácie predstavujú počet ďalších článkov citujúcich tento článok, vypočítaný Crossrefom a denne aktualizovaný. Zistite viac informácií o počte citácií Crossref.

Altmetric Attention Score je kvantitatívna miera pozornosti, ktorú výskumný článok získal online. Kliknutím na ikonu šišky sa načíta stránka altmetric.com s ďalšími podrobnosťami o skóre a prítomnosti daného článku na sociálnych sieťach. Zistite viac informácií o skóre Altmetric Attention Score a o tom, ako sa skóre počíta.

Poznámka: Namiesto abstraktu je toto prvá strana článku.


Abstraktné

Tiolové skupiny v biologických molekulách hrajú významnú úlohu v rôznych fyziologických funkciách a patologických stavoch. Tioly sa delia na dve hlavné skupiny: proteínové tioly a neproteínové tioly. Pre tiolové testy boli opísané mnohé metódy. Väčšina týchto metód bola vyvinutá pre glutatión, hlavný neproteínový tiol, napriek skutočnosti, že bunkové proteínové tioly sú zastúpené vo väčšej miere ako glutatión. Ďalej tieto metódy zvyčajne zahŕňajú proces prípravy biologickej vzorky, po ktorom nasleduje separačná metóda, a sú časovo náročné. Predtým sme uviedli sériu fluorogénnych benzofurazánových sulfidov špecifických pre tiol. Tieto nefluorescenčné benzofurazán sulfidy reagujú rýchlo a špecificky s tiolom za vzniku silného fluorescenčného tiolového aduktu. Rýchla reakcia, tiolovo špecifická a fluorogénna povaha sulfidov úspešne priniesla aplikáciu jedného zo sulfidov na relatívnu kvantifikáciu celkových tiolov v živých bunkách pomocou fluorescenčnej mikroskopie. V tejto práci sme použili rovnakú zlúčeninu na vývoj prvej vysoko výkonnej metódy na simultánne monitorovanie proteínových tiolov, neproteínových tiolov a celkových tiolov v bunkách v 96-jamkovej platni na fluorescenčnej mikroplatničkovej čítačke pri λnapr = 430 nm a Aem = 520 nm. Metóda je rýchla a citlivá a bola validovaná metódou HPLC tiolového testu. Metóda môže detegovať tioly s koncentráciou buniek len 500 buniek/jamku. Tiež sme demonštrovali, že metóda môže ľahko monitorovať zmeny v bunkových hladinách tiolu. Hoci metóda nemôže poskytnúť absolútnu kvantifikáciu tiolov, pretože intenzita fluorescencie rôznych tiolových aduktov sa mení, poskytuje presné meranie relatívnej kvantifikácie v porovnaní s kontrolou. Metóda bude cenným nástrojom v biomedicínskom/farmaceutickom výskume súvisiacom s tiolmi.


Materiály

Všetky činidlá a chemikálie boli analytickej alebo vyššej kvality. Ellmanovo činidlo (kyselina 5,5&rsquo-ditio-bis-(2-nitrobenzoová), kyselina 2-merkaptoetánsulfónová, sodná soľ (MES) a ďalšie použité chemikálie boli získané od VWR Chemicals (BDH Prolab) a Sigma Aldrich.

ODS AQ silikagél (produkt 12S50) bol zakúpený od YMC Co. Ltd. Kyoto, Japonsko. Bio-Gel P2 od Bio-Rad Laboratories Inc.

Všetky použité rozpúšťadlá boli analytickej čistoty od Sigma Aldrich alebo Merck. Rozpúšťadlá pre HPLC boli čistoty Merck LiChroSolv. Europe GMBH.

Veľké sklenené kolóny dodala Soham Scientific, Fordham, Ely, Cambs., UK

LNCaP (bunky ľudského adenokarcinómu prostaty citlivé na androgény, klon FGC-ECACC č. 89110211) a bunky PNT2 (normálna ľudská epiteliálna bunková línia prostaty imortalizovaná vírusom SV40) boli zakúpené od Public Health England Laboratories (ECACC-HPA) v Porton Down , Salisbury, Anglicko. Bunky boli pestované do konfluencie v bunkových továrňach v médiu pozostávajúcom z RPMI 1640 + 2 mM glutamínu + 1 mM pyruvátu sodného obsahujúcom 10 % FBS zóny 2. Konfluentné bunky sa pred zberom trypsinizáciou (Tryple Express) inkubovali dve hodiny v čerstvom médiu. Počítanie buniek sa uskutočňovalo na Nucleocounter NC3000 a bunky sa zbierali centrifugáciou. Výsledné bunkové pelety sa rýchlo zmrazili a skladovali pri -80 °C až do použitia.


Výsledky

V tejto správe sme použili N-acetylcysteín (NAC) a redox proteín obsahujúci tiol, ľudský tioredoxín-1 (Trx1), aby sme otestovali, či je MB tiol-reaktívny a kovalentne modifikuje proteínové tioly. Výsledky (obr. 1A) ukazujú, že koncentrácia voľného tiolu sa znížila ako funkcia koncentrácie MB s úplnou stratou, keď MB:NAC dosiahol 2:1. Kinetický test ukázal, že zjavná rýchlostná konštanta 2. rádu bola 5,03 OM-1 s-1 (údaje nie sú uvedené). Ďalej sme skúmali reaktivitu MB s proteínovým tiolom s použitím rekombinantného Trx1 ako modelu. Tento proteín obsahuje tiolové zvyšky, ktoré sú prístupné rozpúšťadlu, majú spektrum reaktivity a sú nevyhnutné pre jeho biologickú funkciu [12]. Obr. 1B ukazuje stechiometrickú stratu proteínových tiolov v dôsledku pôsobenia MB. Trx1 obsahuje 5 Cys zvyškov a biotínový signál sa stratil, keď sa inkuboval s MB:Trx1 v molárnom pomere 5:1, čo naznačuje úplnú modifikáciu tiolov (buď adukciu alebo oxidáciu, pozri nižšie). Reaktivita MB na primárne amíny bola tiež skúmaná (obr. 1C) použitím postupu, ktorý je podobný vizualizácii proteínových tiolov. Po inkubácii MB boli voľné amíny označené a vizualizované pomocou sulfo-NHS-biotín , ako je ukázané na  obr. 1B. Tieto výsledky ukazujú, že MB nereaguje s amínmi za podmienok testu, pričom prednostne modifikuje iba proteínové tioly . Kinetika reakcie sa skúmala s koncentračným pomerom 5:1 s použitím mPEG2-biotínová metóda (obr. 1D). V súlade s údajmi o reaktivite NAC výsledky z tohto experimentu ukazujú, že reakcia medzi MB a Trx1 je relatívne pomalá a približuje sa úplnej modifikácii všetkých tiolov Trx1 pri 60  min.

Maneb (MB) je tiol-reaktívna zlúčenina. (A) Pridanie MB k N-acetylcysteínu spôsobuje stratu obsahu tiolu, ako sa meria pomocou Ellmanovho činidla. Maneb pri pomere 2:1 M viedol k takmer úplnej strate tiolu. (B) Použitím tioredoxínu-1 (Trx1) ako modelového proteínu maneb stechiometricky spôsobuje stratu proteínových tiolov. Proteínové tioly označené mPEG2-biotín, biotinylovaný N-etylmaleimid, a vizualizovaný v analýze Western blot s fluorescenčne značeným streptavidínom. (C) MB nemodifikuje amíny, ako sa zistilo reakciou voľných amínov so sulfo-NHS-biotínom a následnou analýzou Western blot s fluorescenčne značeným streptavidínom. (D) Časový priebeh ukazuje, že maneb spôsobuje stratu väčšiny voľných tiolov do 15�? min.

Hodnotila sa aktivita Trx1, aby sa určili funkčné dôsledky adukcie MB. Trx1 sa inkuboval 1 h s MB (5:1, ako je uvedené vyššie) a potom sa pred testom aktivity odsolil, aby sa odstránil akýkoľvek nezreagovaný MB. Dáta ukazujú, že MB modifikácia Trx1 spomalila na Trx1 závislú oxidáciu NADPH v prítomnosti Trx reduktázy o 43 % (obr. 2 A a B). Na rozdiel od týchto výsledkov, Trx1-katalyzovaná redukcia inzulínu pomocou DTT nevykazovala žiadny vplyv na aktivitu v dôsledku modifikácie MB (údaje nie sú uvedené). Neúplná inhibícia aktivity napriek dôkazom o takmer úplnej modifikácii tiolov naznačila, že modifikácia tiolu závislá od MB je pravdepodobne reverzibilná.

Maneb inhibuje aktivitu tioredoxínu-1 (Trx1). Trx1 bol ošetrený 5 OM ekvivalentmi manebu a aktivita bola meraná v zmysle zníženia inzulínu v prítomnosti NADPH a tioredoxín reduktázy-1. Znížená aktivita bola evidentná v rýchlosti oxidácie NADPH (A) a vypočítanej aktivite (B). Test s DTT ako redukčným činidlom namiesto NADPH/tioredoxín reduktázy nepreukázal inhibíciu aktivity (neukázané). Strata proteínových tiolov je spojená s tvorbou Trx1 diméru a zvrátená pridaním redukčného činidla. Ako redukčné činidlo DTT (C), tak N-acetylcysteín (D) môžu zvrátiť stratu proteínových tiolov sprostredkovanú manebom.

Aby sa preskúmala reverzibilita, MB-modifikovaný Trx1 sa inkuboval s 1 mM DTT a obsah tiolu sa skúmal pomocou mPEG2-biotinylácia a Western blot ako vyššie. Výsledky ukázali, že pás zodpovedajúci nemodifikovanej tiolovej forme Trx1 bol obnovený (obr. 2 C). Titrácia s NAC (zvýšenie pomeru NAC:MB z 0 na 13,3) ukázala, že na obnovenie všetkých tiolov bol potrebný väčší ako 5-násobný nadbytok NAC (obr. 2 D). Výsledky teda ukazujú, že modifikácia Trx1 pomocou MB je úplne reverzibilná pôsobením tiolov.

Rôntgenová kryštalografia ukázala, že oxidovaný Trx1 kryštalizuje ako dimér tvorený disulfidom medzi zvyškami C73 [14]. Skúmali sme možnosť, že ošetrenie MB spôsobilo tvorbu Trx1 diméru ošetrením Trx1 so zvyšujúcimi sa koncentráciami MB, separáciou cez SDS-PAGE za neredukujúcich podmienok a vizualizáciou s Coomassie blue (obr. 3 A). Údaje demonštrujú, že MB vedie k objaveniu sa pásu pri 25 kD, čo zodpovedá dvojnásobku molekulovej hmotnosti Trx1, len s 1 M ekvivalentom MB. Tento výsledok naznačuje, že iba jeden zvyšok Cys sa podieľa na dimerizácii.

Ošetrenie MB spôsobuje, že Trx1 tvorí dimér, ktorý je obrátený pomocou DTT (A). Hmotnostná spektrálna analýza intaktného Trx1 (B) a MB-modifikovaného Trx1 ukazuje (C) jedinú MB modifikáciu (pridanie 210 hmotnostných jednotiek zodpovedajúcich pridaniu etylénbis-ditiokarbamátu (EBDTC)). Hviezdička (*) označuje an m/z čo zodpovedá potenciálnemu aduktu Mn-Trx1 (+54,9).

Kvôli pozorovaniu MB-sprostredkovaného zosieťovania proteínov sme uskutočnili LC–MS štúdie neporušeného Trx1 ošetreného MB pomocou ESI v režime pozitívnej ionizácie a detekciu pomocou LTQ-Orbitrap-Velos (Thermo). Tieto experimenty viedli k detekcii Trx1 a jedného modifikovaného produktu (obr. 3 B a C). Vo vzorke modifikovanej MB sme pozorovali veľký pokles intenzity nemodifikovaného vrcholu Trx1 (m/z 11 602) a nový vrchol (m/z 11 810) spôsobená väzbou etylénbis-ditiokarbamátu (EBDTC) na Trx1, čo vedie k posunu hmoty o 210 hmotnostných jednotiek od nemodifikovaného vrcholu. Tento výsledok naznačuje, že MB nespôsobuje jednoduchú oxidáciu tiolov na disulfidy, ale zúčastňuje sa skôr na zložitejších reakčných procesoch.


Abstraktné

Proteínové tyrozínfosfatázy (PTP) hrajú dôležitú úlohu v regulácii prenosu signálu u cicavcov. Počas niektorých bunkových signalizačných procesov generovanie endogénneho peroxidu vodíka inaktivuje vybrané PTP prostredníctvom oxidácie enzýmovej katalytickej cysteíntiolátovej skupiny. Dôležité je, že nízkomolekulárne a proteínové tioly v bunke majú potenciál regenerovať katalyticky aktívne PTP. Tu sme skúmali obnovu katalytickej aktivity z dvoch oxidačne inaktivovaných PTP (PTP1B a SHP-2) rôznymi tiolmi s nízkou molekulovou hmotnosťou a enzýmom tioredoxín. Všetky skúmané monotioly regenerovali katalytickú aktivitu oxidovaného PTP1B so zjavnými rýchlostnými konštantami, ktoré sa menili faktorom približne 8. Vo všeobecnosti molekuly s nízkou hodnotou pKa tiolové skupiny boli obzvlášť účinné. Biologický tiol glutatión opravoval oxidovaný PTP1B so zjavnou rýchlostnou konštantou druhého rádu 0,023 ± 0,004 M –1 s –1, zatiaľ čo ditiol ditiotreitol (DTT) vykazoval zjavnú rýchlostnú konštantu druhého rádu 0,325 ± 0,007 M –1 s – 1. Enzým tioredoxín regeneroval katalytickú aktivitu oxidovaného PTP1B podstatne rýchlejšou rýchlosťou ako DTT. Tioredoxín (2 μM) konvertoval oxidovaný PTP1B na aktívnu formu s pozorovanou rýchlostnou konštantou 1,4 × 10 –3 s –1. Rýchlosti, ktorými tieto činidlá regenerovali oxidovaný PTP1B, boli v poradí Trx > DTT > GSH a porovnateľné hodnoty pozorované pri 2 uM Trx, 4 mM DTT a 60 mM GSH. Rôzne disulfidy, ktoré sú vedľajšími produktmi procesu reaktivácie, neinaktivovali natívny PTP1B v koncentráciách 1–20 mM. Bežné biochemické redukčné činidlo tris(2-karboxyetyl)fosfín regeneruje enzymatickú aktivitu z oxidovaného PTP1B o niečo rýchlejšie ako činidlá na báze tiolu, s rýchlostnou konštantou 1,5 ± 0,5 M –1 s –1. Pozorovali sme hlboké kinetické rozdiely medzi tiolovo závislou regeneráciou aktivity z oxidovaných PTP1B a SHP-2, čo poukazuje na potenciál štrukturálnych rozdielov v rôznych oxidovaných PTP, ktoré zohrávajú významnú úlohu v rýchlostiach tiolov s nízkou molekulovou hmotnosťou a obsahujúcich tiol. enzýmy, ako je tioredoxín a glutaredoxín, vracajú katalytickú aktivitu týmto enzýmom počas bunkovej signalizácie.


VÝSLEDOK A DISKUSIA

Pevne veríme, že iba vývoj chemických sond schopných selektívne zachytávať SO2H umožní jasné objasnenie úlohy sulfinylácie proteínov. V tejto súvislosti sme nedávno vyvinuli chemoselektívne S kyselina ulfinová N itroso L igácia (SNL). 16 Pridanie SO2H až C-nitrózozlúčeniny sú známe už viac ako storočie, avšak výsledný adukt je bázicky labilný (obrázok S1). Aby sme zachytili tento nestabilný druh, začlenili sme do neho elektrofilné centrum (obrázok 1). orto- poloha derivátu nitrózobenzénu (1). Prechodný oxyanión (2) reaguje s esterom intramolekulárnou transesterifikáciou za vzniku stabilného benzizoxazolónu (3). Na základe našej práce na tejto myšlienke sme syntetizovali triedu C-nitrózo zlúčenín, ktoré vykazujú rýchlu reaktivitu s nízkou molekulovou hmotnosťou SO2H. Tieto činidlá nereagujú s inými biologicky relevantnými nukleofilmi okrem tiolov, ktoré však netvoria stabilné adukty (obrázok S2).

Chemoselektívne značenie kyseliny sulfínovej arylnitrózozlúčeninami.

Použitie SNL na značenie proteínových sulfínových kyselín

Povzbudení týmito výsledkami sme sa zamestnali SNL vyvinúť chemické sondy na detekciu sulfinylácie proteínov. V prvom rade sme skúmali schopnosť NO-Ph (Obrázok 2), C-nitrózo derivát, ktorý vykazoval najlepšiu reaktivitu na modifikáciu SO2H v dvojitom mutante (C64,82S) tiolperoxidázy Gpx3 z kvasiniek. 17 V prítomnosti H2O2Gpx3 tvorí intramolekulárnu disulfidovú väzbu prostredníctvom sulfenylácie katalytického C36, po ktorej nasleduje kondenzácia s deliacim C82. Mutácia C82 na serín stabilizuje prechodný Cys36-SOH, čo umožňuje jeho ďalšiu kontrolovanú oxidáciu na SO2H (pozri Podporné informácie).

Nitroso sondy na selektívne značenie proteínových sulfínových kyselín.

Inkubácia NO-Ph s C64,82S Gpx3-S02H (22772 Da) poskytuje očakávaný sulfónamidový adukt (22949 Da), ako bolo potvrdené analýzou ESI-LC/MS (obrázok 3A). Naše predbežné experimenty s malými molekulami ukázali, že tioly reagujú s C-nitrózo zlúčeninami za vzniku nestabilného sulfénamidového aduktu, ktorý sa štiepi reakciou s druhým tiolom (obrázok S2). Aby sme potvrdili tieto výsledky s proteínom-SH, ošetrili sme úplne redukovaný C64,82S Gpx3 (22740 Da) s NO-Ph, po ktorej nasleduje inkubácia s DTT. ESI-LC/MS prekvapivo odhalila tvorbu stabilného aduktu s hmotnosťou 22 935 Da (obrázok 3B). Alkylácia Cys zvyšku N-etylmaleimidom (NEM) naopak zabránila tvorbe aduktu (obrázok 3C). Aj keď vezmeme do úvahy, že DTT nebol schopný štiepiť sulfénamid vytvorený pridaním NO-Ph na Cys36, zistený nárast hmoty (Δm = 195) nezodpovedá očakávanému aduktu (Δm = 177). Vo všeobecnosti pridanie tiolu k C-nitrózoarylovej zlúčenine vedie k nestabilnému semimerkaptálu, ktorý môže reagovať s druhou molekulou tiolu alebo podlieha preskupeniu za vzniku stabilnejšieho sulfínamidu (obrázok S3). 18 Spontánne preskupenie nastáva prostredníctvom disociácie hydroxylového aniónu a tvorby katiónového medziproduktu nitréniového iónu, ktorý je neskôr hydrolyzovaný vodou. Rovnakým spôsobom by pridanie NO-Ph k C64,82S Gpx3-SH vytvorilo sulfínamidový adukt s nárastom hmotnosti 195 Da, čo presne zodpovedá našim pozorovaniam. Kyslé prostredie zvyčajne uprednostňuje preskupenie semimercaptale. s NO-Phakonáhle sa však vytvorí benzizoxazolón, zdá sa, že preskupenie nastáva aj pri neutrálnom pH, pravdepodobne preto, že karboxylátová skupina je oveľa náchylnejšia na disociáciu z atómu dusíka ako hydroxylový anión (obrázok S4). Tvorba preusporiadaného sulfínamidu by tiež vysvetľovala, prečo adukt nebol redukovaný DTT. Pretože tvorba sulfínamidu nebola nikdy pozorovaná pri tioloch s nízkou molekulovou hmotnosťou, 16 nás zaujímalo, prečo došlo k preskupeniu s proteínom-SH. Uvažovali sme, že v takýchto prípadoch je útok druhej molekuly tiolu na prechodný sulfénamid vo všeobecnosti rýchlejší ako preskupenie sulfénamidu. Akonáhle sa však vytvorí sulfénamid, útok druhého Cys-SH by bol vylúčený použitím C64,82S Gpx3-SH kvôli stérickej zábrane. Na overenie tejto hypotézy sme testovali reaktivitu NO-Ph smerom k C64S Gpx3, ktorý má redoxne aktívne aj štiepiace cysteíny. Ako sa očakávalo, inkubácia C64S Gpx3 s NO-Ph výhradne podporovali tvorbu vnútorného disulfidu (obrázok 3D). Prítomnosť štiepiaceho Cys, ktorý môže ľahko interagovať so sulfénamidovým aduktom vytvoreným s katalytickým Cys, zabraňuje jeho preskupeniu. Tento výsledok naznačuje, že tvorba stabilného sulfínamidu a disulfidu odráža konkurenčné reakčné dráhy ovplyvnené kinetickými faktormi (obrázok S5). Ako ďalší dôkaz sme inkubovali 2-metyl-2-propántiol s nadbytkom NO-Ph. V tomto prípade sme špekulovali, že vzhľadom na to, že interakcia dvoch molekúl tiolov by bola viac sťažená stérickou zábranou, uľahčilo by sa preskupenie sulfénamidu. Ako sa očakávalo, LC-MS analýzy ukázali tvorbu očakávaného sulfínamidového aduktu (obrázok S6).

ESI-LC/MS spektrá (A) C64,82S Gpx3-SO2H, (B) C64,82S Gpx3-SH, (C) C64,82S Gpx3-S-NEM a (D) C64S Gpx3-SH pred a po liečbe NO-Ph. Každá forma Gpx3 sa inkubovala s NO-Ph (40 ekv.) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti v PBS pH 7,4.

Selektívny blok voľných cysteínových zvyškov

Preskupenie sulfénamidu zjavne obmedzuje použitie SNL na detekciu sulfinylácie proteínov. Ako však naznačuje experiment s NEM, ochrana voľných cysteínov sa môže použiť na zabránenie tvorby neredukovateľných aduktov so bránenými tiolmi. V skutočnosti mnohé chemické metódy na detekciu špecifických modifikácií tiolov (napr. S-nitrozylácia) zahŕňajú selektívne blokovanie redukovaných tiolov. 19 Úspech týchto testov závisí od selektivity kroku blokovania tiolu a účinnosti činidla pri úplnej ochrane voľných tiolov bez krížovej reakcie s SO2H. Hodnotili sme reaktivitu niekoľkých tiol-blokujúcich činidiel voči C64,82S Gpx3-SO2H. Keď sme použili veľký nadbytok bežných alkylačných činidiel, ako je NEM alebo jódacetamid (IAM), analýzy ESI-LC/MS detegovali malé, ale významné množstvá alkylovanej kyseliny sulfínovej (obrázky S7A a S7B). Hoci sa tento výsledok môže zdať neočakávaný, reakcia SO s nízkou molekulovou hmotnosťou2H s Michaelovými akceptormi a a-halogénkarbonylovými zlúčeninami. 20 Naopak, sulfhydrylové reaktívne zlúčeniny, ktoré podporujú tvorbu zmiešaných disulfidov, ako je 2,2′-dipyridyldisulfid (DPS) a S-metylmetántiosulfonát (MMTS), nevykazovali žiadnu krížovú reaktivitu voči SO2H (obrázky S7C a S7D). Ďalej sme skúmali, či ochrana voľných zvyškov Cys ako disulfidov bola dostatočná na zabránenie krížovej reaktivite s NO-Ph. Potom, čo sa C64S,82S Gpx3-SH predinkuboval s DPS (obrázok S8A) alebo MMTS (obrázok S8B), nadbytok tiol-blokujúcich činidiel sa odstránil a proteín sa inkuboval s NO-Ph. Analýzy ESI-LC/MS potvrdili, že DPS aj MMTS účinne blokovali tvorbu sulfínamidového aduktu s redukovaným proteínom.

Návrh a syntéza NO-Bio

Po zistení toho SNL možno efektívne využiť na značenie proteínu SO2H, navrhli sme a syntetizovali NO-Bio (Obrázok 2). Nová chemická sonda kombinuje hlavicu C-nitrózo (modrá) s biotínovou rukoväťou (fialová), ktorá umožňuje detekciu sulfinylácie proteínov v biologických vzorkách. Syntéza NO-Bio (Obrázok S9), ktorý je podrobne opísaný v Podporných informáciách, zahŕňal kopuláciu komerčne dostupného Biotín-PEG4-NHS s diaminolinkerom, N-terc-butoxykarbonyl-1,6-hexándiamínom. Chránená aminoskupina sa potom odštiepila pôsobením TFA a vytvorený primárny amín sa spojil s N-sukcímidylesterom NO-Ph, čím sa získal NO-Bio, ktorý sa čistil pomocou HPLC s reverznou fázou.

Vývoj chemického prístupu na detekciu proteínovej kyseliny sulfínovej

Ako ukazuje obrázok 4A, proteínová sulfinylácia sa mohla selektívne detegovať dvojkrokovou metódou. V prvom sa zavedie sulfhydryl-reaktívna zlúčenina (DPS alebo MMTS), aby selektívne blokovala voľné Cys zvyšky. Potom sa vzorka ošetrí biotínovou sondou, NO-Biona označenie sulfínových kyselín. Tento prístup sme testovali pomocou rekombinantného DJ-1 ako modelu. Asociovaný proteín Parkinson’s má konzervovaný zvyšok Cys, C106, ktorý je extrémne citlivý na oxidačný stres a má tendenciu vytvárať stabilný SO2H. Mnohé štúdie ukazujú, že DJ-1 chráni bunky pred apoptózou sprostredkovanou oxidačným stresom prostredníctvom tvorby C106-SO2H. 21,22 Okrem toho DJ-1 obsahuje dva ďalšie voľné Cys zvyšky, C46 a C53, ktoré nie sú redox-aktívne. Hoci C53 nie je modifikovaný ROS, je stále veľmi reaktívny voči elektrofilom. 23 DJ-1 teda predstavuje vynikajúci model na testovanie selektivity našej stratégie. Redukovaný alebo oxidovaný WT DJ-1 bol inkubovaný s DPS, po ktorom nasledovalo ošetrenie s NO-Bio. Ako je znázornené na obrázku 4B, hmotnostná analýza jasne potvrdila selektívnu modifikáciu výlučne oxidovaného DJ-1. Je zaujímavé, že DPS podporoval tvorbu vnútorného disulfidu medzi C46 a C53. Špekulovali sme, že DPS by najskôr reagoval s C53 vysoko exponovaným rozpúšťadlom, čím by sa získal zmiešaný disulfid. Neskôr by relatívne hlbšie pochovaný C46 napadol aktívny disulfid s následnou tvorbou vnútornej disulfidovej väzby (obrázok S10). Selektívna ochrana voľného Cys sa môže dosiahnuť aj použitím MMTS (obrázok S11). Naše výsledky však naznačujú, že MMTS reaguje s tiolmi relatívne pomalšie ako DPS. V skutočnosti boli malé množstvá Cys-S02H detegované aj v redukovanej vzorke, čo naznačuje, že C106 bol čiastočne oxidovaný počas blokovania tiolu. Aj keď pridanie EDTA do pufra zabránilo tejto nežiaducej oxidácii, vo všetkých nasledujúcich experimentoch sme sa rozhodli použiť účinnejší DPS. Biotínová rukoväť sondy umožňuje vizualizáciu značených proteínov pomocou streptavidínového prenosu. Preto selektivita NO-Bio značenie bolo tiež potvrdené analýzou Western blot. Redukovaný alebo oxidovaný DJ-1 bol ošetrený DPS, po čom nasledovala inkubácia s NO-Bio. Reakcie sa potom podrobili SDS-PAGE a analyzovali sa streptavidínovým prenosom. Ošetrenie oxidovaného DJ-1 s NO-Bio umožnilo selektívne značenie proteínov, zatiaľ čo DJ-1 nebol vôbec detegovaný streptavidínovým prenosom v neprítomnosti oxidantu, čo dokazuje špecifickosť nášho chemoselektívneho prístupu (obrázok S12). NO-Bio vykazovali tiež vyššiu citlivosť v porovnaní s komerčne dostupnou protilátkou proti hyperoxidovanému DJ-1 (obrázok S13), čo umožňuje detekciu sulfinylovaného DJ-1 pri relatívne nízkych koncentráciách.

Označenie kyseliny sulfínovej DJ-1 NO-Bio.

DJ-1 má vysoko konzervovaný zvyšok G18, ktorý uľahčuje ionizáciu C106, znižuje jeho pKaa pomáha stabilizovať C106-SO2H. Malé zmeny v tejto polohe môžu drasticky ovplyvniť oxidačné vlastnosti C106. 24 Napríklad mutant E18D DJ-1 má nižší sklon k tvorbe SO2H, ale štrukturálne podobný mutant E18N vykazuje zvýšený sklon k oxidácii vďaka silnej stabilizácii C106-SO2H. Hodnotili sme citlivosť NO-Bio, skúmanie rôznych sklonov k oxidácii rôznych mutantov DJ-1 vrátane C106S DJ-1, ktorý neobsahuje redox-aktívny cysteín. Každý variant DJ-1 (WT, E18N, E18D a C106S) bol vystavený H2O2, ošetrené DPS a nakoniec inkubované s NO-Bio. Analýza Western blot bola konzistentná s očakávanými výsledkami (obrázok 4c). E18N DJ-1 vykazoval vyššiu frakciu sulfinylácie, dokonca aj v neprítomnosti H2O2. Úroveň sulfinylácie mutanta E18D vystaveného oxidačnému stresu bola naopak takmer zanedbateľná. Stojí za zmienku, že C106S DJ-1 ošetrený H2O2 nebol detekovaný streptavidínovým prenosom, čo potvrdzuje, že iba C106 je schopný tvoriť SO2H za relatívne miernych oxidačných podmienok.

NO-Bio deteguje proteíny modifikované kyselinou sulfínovou v bunkovom lyzáte

Po stanovení špecifickosti a citlivosti nášho dvojstupňového prístupu v homogénnych proteínových roztokoch sme ďalej skúmali, či NO-Bio mohol detekovať proteín-SO2H v komplexnom, nefrakcionovanom bunkovom lyzáte. Na tento účel sme testovali našu optimalizovanú chémiu v celom bunečnom extrakte ľudskej rakoviny krčka maternice (HeLa), ktorý sa získal lýzou buniek v modifikovanom RIPA pufri obsahujúcom katalázu a DTT. Redukujúci lyzačný pufor zabraňuje ďalšej oxidácii SO2H a udržiava voľný Cys v redukovanej forme, čím sa vyhýba nadhodnoteniu proteínovej sulfinylácie. Obrázok 5A ukazuje HRP-streptavidínový western blot, ktorý naznačuje, že silné hladiny proteínu SO2H možno zistiť za normálnych podmienok. Aby sme demonštrovali, že DPS účinne zachytáva všetky voľné tioly, a teda že streptavidínový blot odhalil iba sulfinylované proteíny, použili sme jódacetyl-PEG2-biotín (IAM-Bio). Biotinylované činidlo je schopné alkylovať tioly, ako sú voľné Cys zvyšky. Predúprava vzorky pomocou DPS úplne zrušila signál závislý od IAM-Bio (obrázok 5A, dráha 3), čo nepriamo dokázalo, že NO-Bio reagoval iba s proteínom SO2H. Ďalej sme určili, či náš chemický prístup dokáže detekovať zvýšenie sulfinylácie proteínov v kultúre ľudských buniek. Bunky HeLa boli inkubované so zvyšujúcim sa množstvom H2O2 počas 15 minút (tento časový bod bol vybraný po predbežnom časovo závislom experimente – Obrázok S14A), lýzovaný a potom označený, ako je opísané vyššie. Analýza Western blot ukázala, že úroveň sulfinylácie proteínu bola zvýšená H2O2 spôsobom závislým od dávky (obrázok S14B). Celkovo tieto výsledky potvrdzujú, že SO2H je dostatočne stabilný na to, aby bol úspešne detegovaný v bunkových lyzátoch a nevyžaduje sa in vivo označovanie.

Reaktivita No-Bio v bunkových lyzátoch - 5 μg proteínu nanesených na dráhu - (A). Analýza proteínovej sulfinylácie v lyzátoch ľudského pľúcneho nádorového tkaniva - 1 μg proteín nanesený na dráhu - (B). Legenda: T1-001-T1 Papilárny adenokarcinóm T1-001-N1 Zodpovedajúce normálne tkanivo T1-005-T1 Adenokarcinóm T1-005-N1 Zhodné normálne tkanivo T1-013-T1 Adeno-skvamocelulárny karcinóm T1-013-N1 Zhodné normálne tkanivo.

Hladiny sulfinylácie proteínov v ľudskej rakovine pľúc

Aby sme ukázali, že našu metódu možno použiť na zložitejšie biologické otázky, vykonali sme porovnávacie profilovanie kyseliny sulfínovej v tkanive ľudského pľúcneho nádoru. Pre tieto experimenty bola proteínová sulfinylácia charakterizovaná analýzou western blot celobunkových lyzátov. Naše výsledky ukázali vysoko variabilnú prítomnosť SO2H medzi tromi vzorkami nádorového tkaniva pacientov (obrázok 5B). Všetky tri nádorové tkanivá (papilárny adenokarcinóm, adenokarcinóm a adeno-skvamocelulárny karcinóm) vykazovali významné zvýšenie rozsahu SO2H modifikácie vs. zhodné s normálnym tkanivom. Hoci počet vzoriek bol príliš malý na to, aby bolo možné vyvodiť všeobecné závery, tieto počiatočné pozorovania naznačujú, že zvýšené hladiny SO2H možno použiť ako marker rakoviny.


Redox a thioly v Archaea

This is a valuable review that brings together a range of information concerning the biochemistry of thiols and their distribution in prokaryotes, with particular emphasis on Archaea. The review is well organised and written, except for some very minor edits as suggested below

  • Be consistent with gamma-glutamylcysteine abbreviation throughout
  • p.11, l. 352 unclear sentence
  • p.12, l. 364 add UDP in Appendix A
  • p.12, l. 391 closing round bracket missing

Comments and Suggestions for Authors

This is a valuable review that brings together a range of information concerning the biochemistry of thiols and their distribution in prokaryotes, with particular emphasis on Archaea. The review is well organised and written, except for some very minor edits as suggested below

Be consistent with gamma-glutamylcysteine abbreviation throughout

Response: We now use &gammaGC consistently throughout the manuscript. We no longer alternate with &gamma-GC.

p.11, l. 352 unclear sentence

Response: We corrected the sentence with stating cysteine instead of CoA. This correction now clarifies the sentence.

p.12, l. 364 add UDP in Appendix A

Response: UDP is now defined in Appendix A.

p.12, l. 391 closing round bracket missing

Response: The closing round bracket is now added.

Manuscript antioxidants-775988 by Rawat and Maupin-Furlow

For the domains of Eukarya and Bacteria various studies of low molecular weight (LMW) thiols have been published in the past, leading to a better understanding of the role and biochemistry of LMW thiols in these organism groups. Therefore, it is known that LMW thiols play important roles such as regulating the redox homeostasis inside cells or as cofactors. However, for Archaea not much is known about the role and presence of LMW thiols until now. This manuscript gives an overview on the state of art of LMW thiols in Archaea. The authors summarize the distribution of currently known LMW thiol classes in archaea and the role and biochemistry of single molecules. The article is well structured and supported by well-designed figures.

The only issue I have in terms of content is that I missed somewhat a small paragraph on thioredoxins in Archaea. Specifically for the methanogens, some literature is available. The authors could easily integrate it into paragraph 3.2 or split this paragraph.

  1. 67 Transition between the two sentences is missing/not fluent: &lsquo&hellipare found in domestic animals or humans [25]. Variations of GSH exist&hellip&rsquo please rewrite
  2. 276-276 to me this sentence sounds like DTNB reduces the -SH groups of present LMW thiols: &lsquo&hellipusing DTNB, which would reduce all -SH groups&hellip&rsquo, the -SH groups represent the reduced form, to my knowledge DTNB itself gets reduced whereas the LMW thiols gets oxidized by forming a mixed disulfide please clarify what is meant here
  3. 311-312 not the protein is induced but the expression of ohrA
  4. 332-333 transition between the two paragraphs is missing/not fluent please rewrite
  5. 334 the Fiege and Frankenberg-Dinkel article showed that RdmS is not a histidine kinase but a tyrosine kinase
  6. 371-375 sentence difficult to follow and understand, or is there meant to be a period instead of a comma in l. 374 &lsquo&hellip[121,122], Mtr,&hellip&rsquoMtr please rewrite

Inconsistent usage of &lsquoArchaea&rsquo and &lsquoarchaea&rsquo, not clear to me why sometimes with capital letter and sometimes not, e.g. l.127 &lsquoArchaea and bacteria&rsquo. Might be used to differ between the domain Archaea and archaea as organisms in general.

  1. 30 such as
  2. 38 the canonical pathway
  3. 76 auto-oxidation
  4. 107 Either &lsquoThe InterPro database&rsquo or omit &lsquoThe&rsquo
  5. 109 Consistent naming of citations in running text, either &lsquo&&rsquo or &lsquoand&rsquo between names of authors
  6. 140 &lsquobased on&rsquo instead of &lsquobased in&rsquo
  7. 187 is there an &lsquoas&rsquo missing: &lsquocan also act as a&rsquo?
  8. 202 &lsquoinsulin&rsquo instead of &lsquoinulin&rsquo
  9. 210 InterPro
  10. 266 &lsquosequences&rsquo
  11. 275 introduction of the abbreviation &lsquoDTNB&rsquo is missing
  12. 281 introduction of the abbreviations &lsquoDHA&rsquo and &lsquoHED&rsquo are missing
  13. 322 introduction of the abbreviation &lsquoDTT&rsquo is missing
  14. 333 correct citation name
  15. 358 &lsquothan&rsquo instead of &lsquothat&rsquo
  16. 359 &lsquoeven at&rsquo instead of &lsquoat even&rsquo
  17. 387 &lsquoto involve to&rsquo?
  18. 390-391 &lsquoan archaeal&rsquo
  19. 411 better: &lsquosome archaeal species&rsquo

Fig. 2 grey boxes: shade of gray somewhat darker for better contrast

Fig. 3, legend: please add the explanation of FTR with iron-sulfur cluster

For the domains of Eukarya and Bacteria various studies of low molecular weight (LMW) thiols have been published in the past, leading to a better understanding of the role and biochemistry of LMW thiols in these organism groups. Therefore, it is known that LMW thiols play important roles such as regulating the redox homeostasis inside cells or as cofactors. However, for Archaea not much is known about the role and presence of LMW thiols until now. This manuscript gives an overview on the state of art of LMW thiols in Archaea. The authors summarize the distribution of currently known LMW thiol classes in archaea and the role and biochemistry of single molecules. The article is well structured and supported by well-designed figures.

The only issue I have in terms of content is that I missed somewhat a small paragraph on thioredoxins in Archaea. Specifically for the methanogens, some literature is available. The authors could easily integrate it into paragraph 3.2 or split this paragraph.

Response: Thanks, we have altered this section of the manuscript to enhance organization and highlight the insight provided on thioredoxins in Archaea including reference to methanogens.

67 Transition between the two sentences is missing/not fluent: &lsquo&hellipare found in domestic animals or humans [25]. Variations of GSH exist&hellip&rsquo please rewrite

Response: Thanks, we have rewritten these sentences to emphasis the theme of this section is focused on GSH synthesis.

276-276 to me this sentence sounds like DTNB reduces the -SH groups of present LMW thiols: &lsquo&hellipusing DTNB, which would reduce all -SH groups&hellip&rsquo, the -SH groups represent the reduced form, to my knowledge DTNB itself gets reduced whereas the LMW thiols gets oxidized by forming a mixed disulfide please clarify what is meant here

Response: we now state that DTNB would presumably oxidize all of the &ndashSH groups.

311-312 not the protein is induced but the expression of ohrA

Response: we now state that it [leads to the induction of expression of the gene encoding OhrA]

332-333 transition between the two paragraphs is missing/not fluent please rewrite

Response: transition now added.

334 the Fiege and Frankenberg-Dinkel article showed that RdmS is not a histidine kinase but a tyrosine kinase

Response: this point is now corrected.

371-375 sentence difficult to follow and understand, or is there meant to be a period instead of a comma in l. 374 &lsquo&hellip[121,122], Mtr,&hellip&rsquoMtr please rewrite

Response: we have reorganized this paragraph to more clearly explain this section of the manuscript.

Inconsistent usage of &lsquoArchaea&rsquo and &lsquoarchaea&rsquo, not clear to me why sometimes with capital letter and sometimes not, e.g. l.127 &lsquoArchaea and bacteria&rsquo. Might be used to differ between the domain Archaea and archaea as organisms in general.

Response: we now consistently use archaea in a general manner - since we do not specifically state Archaea domain in the text.

Response: corrected to autoxidation.

107 Either &lsquoThe InterPro database&rsquo or omit &lsquoThe&rsquo

109 Consistent naming of citations in running text, either &lsquo&&rsquo or &lsquoand&rsquo between names of authors

Response: corrected to all &lsquoand&rsquo.

140 &lsquobased on&rsquo instead of &lsquobased in&rsquo

187 is there an &lsquoas&rsquo missing: &lsquocan also act as a&rsquo?

Response: corrected all Interpro to InterPro.

275 introduction of the abbreviation &lsquoDTNB&rsquo is missing

Response: Ellman's reagent [(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) or DTNB)] is now defined.

281 introduction of the abbreviations &lsquoDHA&rsquo and &lsquoHED&rsquo are missing

Response: Docosahexaenoic acid (DHA) and bis(2‐hydroxyethyl) disulfide (HED) are now defined.

322 introduction of the abbreviation &lsquoDTT&rsquo is missing

Response: dithiothreitol (DTT) is now defined.

333 correct citation name

Response: We were unclear what is meant by this point but have added that the information is related to the binding of MsvR to its own promoter to clarify which promoter is under discussion if this is what the reviewer meant.

line 333 is related to the following: Incubation of oxidized MsvR with the M. acetivorans thioredoxin system, consisting of NADPH, thioredoxin reductase and one of the 7 thioredoxins, leads to reduction of the cysteines and binding to its own promoter [105].

The citation references the work by the following which appears appropriate for the information presented:

Sheehan, R. McCarver, A.C. Isom, C.E. Karr, E.A. Lessner, D.J. The Methanosarcina acetivorans thioredoxin system activates DNA binding of the redox-sensitive transcriptional regulator MsvR. J Ind Microbiol Biotechnol 2015, 42, 965-969, doi:10.1007/s10295-015-1592-y.

359 &lsquoeven at&rsquo instead of &lsquoat even&rsquo

411 better: &lsquosome archaeal species&rsquo

Fig. 2 grey boxes: shade of gray somewhat darker for better contrast

Response: the shade of gray is now darker for better contrast.

Fig. 3, legend: please add the explanation of FTR with iron-sulfur cluster

Response: FTR/FDR added to legend with explanation and citation.

The review &ldquoRedox and thiol in Archaea&rdquo by Mamta Rawat and Julie A. Maupin- Furlow provides a clear and extensive panorama on a topic regarding Low molecular weigh (LMW) thiols of which up to now there has not been an updated overview. The detailed analysis of the different LMWs in the different kingdoms of life is well written and deepens biochemical pathways of the different LMWs. In the Archaea the role of LMW is still little known but this review has analyzed the different distribution of LMW thiols in this kingdom and has highlighted their possible function. Therefore, this manuscript could be worthy of publication. However, I have some points that, if addressed, would go a long way towards reducing my reservations and making this publication even better.

Plesae change &hellip&hellipdifferent LMW thiol, bacillithiol&hellip. in &hellip&hellip different LMW thiols, such as bacillithiol

I would like that the authors describe and comment the role of PDO not only in relationship to Sur but also as part of redox system involved in the regeneration of prx in S. sofataricus . PDO activity should be commented

The authors should include the following papers among references :

- Limauro D, D'Ambrosio K, Langella E, De Simone G, Galdi I, Pedone C, Pedone E, Bartolucci S. Exploring the catalytic mechanism of the first dimeric Bcp: Functional, structural and docking analyses of Bcp4 from Sulfolobus solfataricus. Biochimie. 2010 92(10):1435-44. doi: 10.1016/j.biochi.2010.07.006

- D'Ambrosio K, Limauro D, Pedone E, Galdi I, Pedone C, Bartolucci S, De Simone G.Insights into the catalytic mechanism of the Bcp family: functional and structural analysis of Bcp1 from Sulfolobus solfataricus. Proteins. 2009 76(4):995-1006. doi: 10.1002/prot.22408.

In these papers a new disulfide redox system that reduces peroxiredoxins in Saccharolobus solfataricus is described. The canonical system NADPH / Tr / Trx, generally used to reduce Prxs, in S. solfataricus is replaced by the NADPH / Tr / PDO to regenerate the bacterioferritin (Bcps) comigratory proteins.

Line 147 change glutaredoxin and thioredoxin to Grx and Trx respectively

Line 149 changes glutaredoxin to Grx

In Fig. 3 NTR could also be connected to Prx by Protein Disulfide Oxidoreductase (PDO) as reported in the previous comment. Also the legend must be completed inserting PDO of S. solfataricus

Line 163 Please change Halobacterium salinarum do H. salinarum

Line 167 Please change Pyrococcus furiosus do P. furiosus

Line 195: Sulfolobus solfataricus must be changed to Saccharolobus solfataricus, based on the update of the taxonomy within the Sulfolobaceae rodina

Lane 205: Please change Pyrococcus horikoshii v P. horikoshii

Lane 288 Edit S. solataricus v S. solfataricus

Lane 298 Edit S. sulfotaricus v S. solfataricus

Lane 320 Insert the follow reference: Lipscomb, G.L. , Schut, G.J. Scott RA, Adams, M.W.W. SurR is a master regulator of the primary electron flow pathways in the order Thermococcales. Mol Microbiol 2017, 104, 869-881, doi: 10.1111/mmi.13668

Lane 347 Please Change Pyrococcus furiosus v P. furiosus a Sulfolobus solfataricus v S. solfataricus

Comments and Suggestions for Authors

The review &ldquoRedox and thiol in Archaea&rdquo by Mamta Rawat and Julie A. Maupin- Furlow provides a clear and extensive panorama on a topic regarding Low molecular weigh (LMW) thiols of which up to now there has not been an updated overview. The detailed analysis of the different LMWs in the different kingdoms of life is well written and deepens biochemical pathways of the different LMWs. In the Archaea the role of LMW is still little known but this review has analyzed the different distribution of LMW thiols in this kingdom and has highlighted their possible function. Therefore, this manuscript could be worthy of publication. However, I have some points that, if addressed, would go a long way towards reducing my reservations and making this publication even better.

Plesae change &hellip&hellipdifferent LMW thiol, bacillithiol&hellip. in &hellip&hellip different LMW thiols, such as bacillithiol

Response: we replaced the , with : to avoid confusion and clarify that bacillithiol is one example of a LMW thiol that differs from GSH.

I would like that the authors describe and comment the role of PDO not only in relationship to Sur but also as part of redox system involved in the regeneration of prx in S. sofataricus . PDO activity should be commented

The authors should include the following papers among references :

- Limauro D, D'Ambrosio K, Langella E, De Simone G, Galdi I, Pedone C, Pedone E, Bartolucci S. Exploring the catalytic mechanism of the first dimeric Bcp: Functional, structural and docking analyses of Bcp4 from Sulfolobus solfataricus. Biochimie. 2010 92(10):1435-44. doi: 10.1016/j.biochi.2010.07.006

- D'Ambrosio K, Limauro D, Pedone E, Galdi I, Pedone C, Bartolucci S, De Simone G.Insights into the catalytic mechanism of the Bcp family: functional and structural analysis of Bcp1 from Sulfolobus solfataricus. Proteins. 2009 76(4):995-1006. doi: 10.1002/prot.22408.

In these papers a new disulfide redox system that reduces peroxiredoxins in Saccharolobus solfataricus is described. The canonical system NADPH / Tr / Trx, generally used to reduce Prxs, in S. solfataricus is replaced by the NADPH / Tr / PDO to regenerate the bacterioferritin (Bcps) comigratory proteins.

In Fig. 3 NTR could also be connected to Prx by Protein Disulfide Oxidoreductase (PDO) as reported in the previous comment. Also the legend must be completed inserting PDO of S. solfataricus

Response: Thanks, we now include all of this information in the manuscript text in the section which discusses Prxs and the work performed in archaea. The references listed above and citations are now in the main body of the text.

Line 147 change glutaredoxin and thioredoxin to Grx and Trx respectively

Line 149 changes glutaredoxin to Grx

Response: We now use GRX and TRX throughout the manuscript.

Line 163 Please change Halobacterium salinarum do H. salinarum

Line 167 Please change Pyrococcus furiosus do P. furiosus

Line 195: Sulfolobus solfataricus must be changed to Saccharolobus solfataricus, based on the update of the taxonomy within the Sulfolobaceae rodina

Lane 205: Please change Pyrococcus horikoshii v P. horikoshii

Lane 288 Edit S. solataricus v S. solfataricus

Lane 298 Edit S. sulfotaricus v S. solfataricus

Lane 347 Please Change Pyrococcus furiosus v P. furiosus a Sulfolobus solfataricus v S. solfataricus

Response: We have made all of these taxonomic changes and now use appropriate abbreviations.



Komentáre:

  1. Ungus

    Tu je výstredník, som ohromený.



Napíšte správu