Informácie

Otázka týkajúca sa vylúčenia účastníkov štúdie pre pole genotypovania Exome

Otázka týkajúca sa vylúčenia účastníkov štúdie pre pole genotypovania Exome


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Čítam dokument, ktorý použil celé sekvenovanie exómu na afroamerickej a európskej populácii na objavenie nových nízkofrekvenčných a zriedkavých variantov spojených s hladinami lipidov a rizikom koronárnej choroby srdca.

Použili pole genotypizácie ľudského exómu Illumina, ktoré bolo navrhnuté na základe kódovacích variantov objavených zo sekvenovania exómov 12 000 jedincov. Preto zo štúdie vybrali svojich účastníkov, ktorí neboli medzi 12 000 jednotlivcami, ktorí sa použili na navrhnutie poľa.

Moja otázka znie: Prečo by vyberali jednotlivcov, ktorí neboli medzi 12 000 použitými na návrh poľa? (Premýšľam, pretože by to mohlo spôsobiť falošné pozitívne asociácie? zaujatosť?)


Keď navrhujete polia, musíte mať na povrchu sondy komplementárne k sekvencii, ktorú chcete detegovať. V závislosti od toho, čo chcete zistiť, musíte navrhnúť tieto sondy so známou sekvenciou na známej pozícii. Ak chcete detegovať jednonukleotidové polymorfizmy (SNP), potom potrebujete knižnicu známych SNP na svojom ChIP, čo je v podstate poloha SNP a okolitá sekvencia.

SNP sa dajú zhruba rozdeliť do dvoch podskupín, bežné (ja ich nazývam takto) a zriedkavé (frekvencia v populácii nižšia ako 0,1 %). Problém s touto metódou založenou na ChIP je, že dokáže detegovať iba SNP, ktoré sú už známe (alebo sa aspoň nachádzajú blízko známych SNP, s ktorými sú vo väzbovej nerovnováhe). Takže ak chcete vo svojej populačnej vzorke odhaliť zriedkavé SNP, potrebujete veľkú skupinu ľudí, od ktorých prevezmete SNP do svojho návrhu ChIP. Ak sa pozriete na čísla, jeden vzácny variant bude prítomný len u približne 12 z 12 000 osôb použitých v dizajne.

Vaša študijná skupina je potom odlišná od skupiny ľudí, ktorá bola použitá pri tvorbe návrhu ChIP. Tu vezmete ľudí s určitým pozadím (napríklad vysoké hladiny lipidov) a potom porovnáte, či ľudia, ktorí mali koronárne srdcové problémy, majú spoločné SNP, ktoré môžu súvisieť s týmto ochorením. To môže pomôcť identifikovať mutáciu v proteíne, ktorý je rizikovým faktorom.


Zbierka dbGaP: Údaje dbGaP súvisiace so srdcovým zlyhaním NHLBI (žiadne požiadavky IRB)

Výzva na analýzu veľkých údajov Národného inštitútu srdca, pľúc a krvi (NHLBI): Vytvorenie nových paradigiem pre výskum srdcového zlyhania sa uzavrela. NHLBI bude pokračovať v sprístupňovaní tohto zberu údajov výskumnej komunite.

Minulé informácie týkajúce sa zhromažďovania údajov pre NHLBI Big Data Analysis Challenge: Vytváranie nových vzorov pre výskum srdcového zlyhania sú uvedené nižšie.

Národný inštitút srdca, pľúc a krvi (NHLBI), ktorý je súčasťou Národného inštitútu zdravia (NIH), pozýva na nové riešenia pre NHLBI Big Data Analysis Challenge: Vytváranie nových paradigiem pre výskum srdcového zlyhania. Cieľom výzvy je podporiť inovácie v oblasti výpočtovej analýzy a prístupov strojového učenia s využitím rozsiahlych súborov údajov financovaných NHLBI na identifikáciu nových paradigiem vo výskume srdcového zlyhania. Cieľom výzvy je riešiť potrebu nových modelov chorôb s otvoreným zdrojom, ktoré dokážu definovať podkategorizácie srdcového zlyhania dospelých, aby slúžili ako odrazový mostík pre nové výskumné hypotézy a vývoj nástrojov v oblastiach výskumu srdcového zlyhania od základných až po klinické nastavenia.

NHLBI má za sebou históriu značných investícií do vytvárania zdrojov hlbokých údajov vrátane: dlhodobých, hlboko fenotypovaných epidemiologických kohort, inovatívnych klinických štúdií a rozsiahlych snáh o presnú medicínu, ktoré generovali sekvenovanie celého genómu a „iné omické“ údaje. pre viac ako stotisíc jednotlivcov. S cieľom poskytnúť účastníkom výziev efektívny prístup k údajom z mnohých štúdií NHLBI obsahujúcich údaje o srdcovom zlyhaní, NHLBI vytvoril túto zbierku štúdií dbGaP. Prístup k údajom pre túto kolekciu je kontrolovaný Výborom pre prístup k údajom NHLBI. Od účastníkov výzvy sa vyžaduje, aby dodržiavali obmedzenia používania a pokyny na potvrdenie z pôvodných súborov údajov. Upozorňujeme, že údaje v tejto zbierke nie sú harmonizované naprieč štúdiami ani inak zmenené oproti pôvodnej štúdii.

NHLBI Big Data Analysis Challenge: Heart Failure Data Collection obsahuje všetky NHLBI štúdie, ktoré sú momentálne v dbGaP, ktoré obsahujú údaje, ktoré môžu byť relevantné pre výskum srdcového zlyhania. Štúdie v tejto zbierke sú schválené pre všeobecné výskumné použitie (GRU), zdravie/medicínske/biomedicínske použitie (HMB) alebo použitie špecifické pre chorobu (DS), ktoré umožňuje výskum srdcového zlyhania. Tieto štúdie zahŕňajú rôzne návrhy štúdií, kritériá zaradenia a vylúčenia, veľkosti vzoriek a poskytujú širokú šírku a hĺbku fenotypových údajov o účastníkoch štúdie. Dostupné genómové údaje v týchto štúdiách sa tiež líšia, vrátane genotypových polí, sekvenovania (cielený, exóm, celý genóm) a ďalších -omických údajov (napr. profily RNA alebo metabolitov). Ak sa chcete dozvedieť viac o spôsobe zberu údajov štúdie, pozrite si individuálnu prístupovú stránku každej štúdie.

Účastníkom výzvy pripomíname, že okrem dbGaP obsahuje koordinačné centrum informácií o biologických vzorkách a úložiskách údajov NHLBI (BioLINCC) ďalšie štúdie, ktoré zhromaždili údaje týkajúce sa zlyhania srdca a môžu chcieť využiť údaje BioLINCC pri vývoji svojho riešenia.

Pozrite si individuálnu prístupovú stránku pre každú štúdiu v tejto zbierke, kde sa dozviete viac o histórii každej štúdie.


Prieskum prínosu zriedkavých variantov ku genetickej architektúre ľudských chorôb prostredníctvom sekvenovania exómu 177 882 účastníkov britskej Biobanky

Biobanka Spojeného kráľovstva (UKB) predstavuje bezprecedentnú populačnú štúdiu 502 543 účastníkov s podrobnými fenotypovými údajmi a prepojením na lekárske záznamy. Zatiaľ čo uvoľnenie údajov o genotypovom poli pre túto kohortu podporilo objav genómu pre bežné varianty, príspevok zriedkavých variantov k tejto širokej zbierke fenotypov zostáva relatívne neznámy. Tu používame údaje o sekvenovaní exómu od 177 882 účastníkov UKB na vyhodnotenie asociácie medzi zriedkavými variantmi kódovania proteínov s 10 533 binárnymi a 1 419 kvantitatívnymi fenotypmi. Vykonali sme asociačnú štúdiu na úrovni celého fenoménu (PheWAS) a PheWAS založenú na analýze kolapsu na úrovni génov prispôsobenú na detekciu súhrnného príspevku vzácnych variantov. Posledne menovaný odhalil 911 štatisticky významných vzťahov medzi génom a fenotypom so stredným pomerom pravdepodobnosti 15,7 pre binárne znaky. Spomedzi asociácií binárnych znakov identifikovaných pomocou analýzy kolapsu bolo 83 % nedetegovateľných pomocou testov asociácie s jedným variantom, čo zdôrazňuje silu kolapsovej analýzy na detekciu signálu v prostredí vysokej alelickej heterogenity. Ako celok boli tieto asociácie genotyp-fenotyp významne obohatené o vlastnosti sprostredkované stratou funkcie a v súčasnosti schválené ciele liečiv. Pomocou týchto výsledkov sumarizujeme príspevok zriedkavých variantov k bežným ochoreniam v kontexte fenoménu UKB a poskytujeme príklad toho, ako môžu nové asociácie gén-fenotyp pomôcť pri uprednostňovaní terapeutických cieľov.


Výsledky

V rokoch 2006 až 2011 bolo do štúdie MeninGene zaradených 656 pacientov s bakteriálnou meningitídou 21 . Z týchto pacientov malo 469 (72 %) pneumokokovú meningitídu. Po filtroch kontroly kvality bolo 408 pacientov s pneumokokovou meningitídou a 2072 kontrol zaradených do analýzy genetických asociácií na náchylnosť k meningitíde. Demografické a klinické údaje úspešne genotypovaných pacientov možno nájsť v tabuľke 1. Po vylúčení všetkých monomorfných a pohlavných chromozómových variantov celkovo 100 464 jednonukleotidových polymorfizmov (SNP) prešlo prahmi kontroly kvality > 95 % frekvencie hovorov a Hardyho Weinbergovou rovnováhou a boli zahrnuté do analýzy asociácie.

Genomický kontrolný parameter λ bol 0,31, keď boli zahrnuté všetky variácie. Bolo to spôsobené zriedkavými variantmi a vylúčením variantov s menšou frekvenciou alel pod 0, 01%, zvýšenou λ na 0, 93 (doplnkový obrázok 1). Do našej analýzy jedného markera sme preto zahrnuli tie s menšou frekvenciou alel vyššou ako 0,01 %.

Žiadny z testovaných genetických variantov nedosiahol Bonferroniho korigovaný prah významnosti (p-hodnota < 5 × 10-7). Šesť genetických variantov spojených s pneumokokovou meningitídou dosiahlo p-hodnoty nižšie ako 1 × 10 −4 (obr. 1). Náš najsilnejší signál bol missense rs139064549 v kolagéne typu XI alfa 1 (COL11A1) gén (p = 1,51 × 10 −6 G alela OR 3,21 [95 % CI 2,05–5,02]) a druhým najsilnejším bol intrónový variant rs9309464 v zložke komplexu exocyst 6B (EXOC6B) gén (p = 6,01 × 10 −5 G alela OR 0,66 [95 % CI 0,54–0,81] Tabuľka 2). Z týchto šiestich variantov s p-hodnotou nižšou ako 1 × 10-4 boli tri varianty lokalizované vo väzbovom proteíne CABYR fibrózneho obalu (FSCB) gén, konkrétne rs3809429 (p = 6,80 × 10 −5 A-alela OR 1,65 [95 % CI 1,30–2,09]), rs3825630 (p = 6,80 × 10 −5 G alela OR 1,65 [93 % −2.] CI2. a rs1959379 (p = 8,81 x 10-5 A alela OR 1,64 [95 % CI 1,30-2,09]). Šiesty variant rs617169 (p = 7,33 × 10 −5 G alela OR 0,72 [95 % CI 0,61 – 0,85]) sa nenachádzal v géne, ale najbližším génom bola proteínkináza N2 (PKN2) nachádza sa na 2. chromozóme.

Manhattanský graf p-hodnôt.

Os y označuje –log10 (p-hodnoty) SNP v asociačnej analýze a os x označuje chromozomálnu polohu. Vodorovná modrá čiara označuje prah p = 1 × 10 −4 . Všetky markery troch génov s najvyšším asociačným signálom, tj COL11A1 (rs139064549, p-hodnota = 1,51 × 10-6, lokalizácia chromozómu 1), EXOC6B (rs9309464, p-hodnota = 6,01 × 10 −5, lokalizácia chromozómu 2) a FSCB (s rs3809429, rs3825630 rs1959379, p-hodnota = 6,80 × 10 -5, 6,80 × 10 -5, 8,81 × 10 -5 chromozóm 14), boli zafarbené na zeleno.

Do analýzy jedného markera sme nezahrnuli varianty s MAF pod 0,01 %. Na posúdenie úlohy týchto zriedkavých variantov v asociačnom testovaní citlivosti na pneumokoky sme použili test asociácie sekvenčného jadra (SKAT), ktorý nám umožňuje zahrnúť všetky bežné a zriedkavé variácie v rámci génovej oblasti. Pomocou analýzy SKAT sme našli jeden významný asociovaný gén, a to COL11A1 (p = 1,03 x 10-7). V tejto analýze sme testovali celkovo 12 968 génových sád a po korekcii na tieto viacnásobné testy COL11A1 dosahuje významnosť p = 0,001. Žiadny rozdiel v p-hodnote COL11A1 bol pozorovaný pri korekcii pomeru nerovnováhy medzi prípadom a kontrolou. Druhým najsilnejším signálom v analýze SKAT bola polymeráza (riadená DNA) lambda (ANKETA) gén (p = 8,10 × 10 −5 ), ktorý nebol významný po viacnásobnej korekcii testovania. Keď sa táto p-hodnota upravila na podiel nerovnováhy medzi prípadom a kontrolou, asociácia bola o niečo významnejšia (p = 7,05 × 10-5). Skúmali sme tiež, či časť bežných a zriedkavých variantov vedie k asociáciám s citlivosťou na pneumokokovú meningitídu, keď bol prah zriedkavých variantov definovaný ako funkcia celkovej veľkosti vzorky22. Táto analýza ukázala len pre ANKETA (p = 1,90 × 10-5), že asociácia bola založená na podiele bežných a zriedkavých variantov, hoci to nedosiahlo význam pre celý genóm po korekcii na viacnásobné testovanie.


Metódy a analýzy

Tento GWAS sa riadi usmerneniami o posilnení podávania správ o štúdiách genetických asociácií. 25 Vývojový diagram postupu štúdie je podrobne znázornený na obrázku 1. Obr.

Postup pri štúdiu. Graf podrobne opisuje postup štúdie od náboru až po analýzu údajov. Žlté políčka predstavujú nové postupy, zelené políčka označujú generovanie údajov a modré políčka zberu označujú procesný krok. AITC, alyl izotiokyanát BMI, index telesnej hmotnosti CANDELA, Konzorcium pre analýzu diverzity a vývoja Latinskej Ameriky CDT, prahy detekcie chladu GWAS, celogenómová asociačná štúdia HPT, prah bolesti pri teple MPT, prah mechanickej bolesti PC, hlavné komponenty PPT , prah tlakovej bolesti QST, kvantitatívne senzorické testovanie TSL, teplotné senzorické limen VDT, prah detekcie vibrácií VAS, Visual Analogue Scale WDT, prahy detekcie tepla WUR, wind-up ratio.

Účastníci

Zdraví účastníci vo veku 18� budú náborovaní v Medelline v Kolumbii prostredníctvom verejných násteniek na miestnych univerzitách, distribúciou letákov a prostredníctvom miestnych tlačených médií. Okrem toho pozývame predchádzajúcich účastníkov z Konzorcia pre analýzu diverzity a vývoja Latinskej Ameriky (CANDELA) 26 GWAS, aby sa zúčastnili na tomto projekte.

Nábor zdravých mladých účastníkov má v štúdiách GWAS výhody. Je menej pravdepodobné, že budú mať neodhalené choroby alebo iné problémy, ktoré môžu ovplyvniť ich biologickú dráhu citlivosti na bolesť. Mladí ľudia budú mať tiež menšiu celkovú akumulovanú expozíciu alebo riziká z environmentálnych (vonkajších) faktorov, ktoré môžu ovplyvniť ich citlivosť na bolesť. Takéto faktory zvyšujú celkovú variabilitu účastníkov vnímania bolesti a znižujú schopnosť detekcie genetických príčin. Keďže väčšina vlastností je ovplyvnená kombináciou genetických a environmentálnych faktorov, mnohé štúdie vrátane CANDELA majú tendenciu používať mladých účastníkov na objavenie genetických variantov. 27

Účastníci budú vylúčení, ak budú mať chronickú bolesť alebo akýkoľvek chronický zdravotný stav (napr. diabetes, neurodegeneratívne, muskuloskeletálne alebo psychiatrické ochorenia). Účastníci, ktorí v súčasnosti užívajú analgetiká, protizápalové lieky, opioidy, antihistaminiká, antidepresíva alebo antiepileptiká, budú vylúčení. Ženy, ktoré sú tehotné alebo sú v menštruačnom období (samohodnotenie), budú zo štúdie vylúčené. Účastníkom bude odporučené, aby nefajčili ani nekonzumovali kávu do 1 hodiny od testovania a aby sa vyhli psychoaktívnym látkam alebo alkoholu do 8  hodín pred testovaním. Ďalšie vylučovacie kritériá zahŕňajú súčasné alebo minulé zranenia, ktoré si sami spôsobili, ako aj dermatomálne, traumatické alebo infekčné stavy postihujúce rameno a anamnézu závažných alergických reakcií na akýkoľvek druh liekov, materiálov, potravín alebo bodnutí hmyzom. Účastníci so stredne ťažkou až ťažkou úzkosťou (� na Hamiltonovej stupnici úzkosti 28) alebo ťažkou depresiou (㸕 na 16-položkovom rýchlom inventári samohlásených symptómov depresie (QIDS-SR16) 29 budú zo štúdie vylúčení Nábor sa začal v januári 2013 a predpokladá sa, že bude trvať približne 5𠄷 rokov.

Postup

Účastníci sa zúčastnia na jednom stretnutí v laboratóriu kvantitatívneho senzorického testovania (QST) na Universidad de Antioquia, Medellín. Po informovanom súhlase sa zaznamená vek a pohlavie a účastníci odpovedia na otázky týkajúce sa ich vlastného pôvodu (pozri online doplnkovú prílohu 1). Zmeria sa výška a hmotnosť a vypočíta sa index telesnej hmotnosti (BMI). Keďže psychologické faktory, ako je úzkosť, môžu ovplyvniť vnímanie bolesti počas experimentálneho testovania bolesti, 30 účastníkov dokončí španielsku verziu Hamiltonovej škály hodnotenia úzkosti a QIDS-SR16. QIDS-SR16 má prijateľnú vnútornú konzistenciu a strednú až silnú súbežnú platnosť v porovnaní s inými skóre depresie 31 a jeho španielska verzia vykazuje primeranú spoľahlivosť testu a vysokú vnútornú konzistenciu. 32 Hamiltonova škála hodnotenia úzkosti preukázala vysokú spoľahlivosť medzi hodnotením a opakovaným testom 33 a dobrú konštruktívnu validitu. 34

Doplňujúce údaje

Hodnotenie senzorickej funkcie v naïve stave

Zistíme senzorickú funkciu v naïve stave a po nociceptívnej senzibilizácii. Základná senzorická funkcia bude hodnotená pomocou špecifického statického a dynamického QST. Patria sem prahy detekcie chladu a prahy detekcie tepla, teplotné senzorické prahy vápna a tepelné prahy bolesti (HPT) pomocou ThermoTesteru (Q-sense, Medoc, Izrael, veľkosť termody 30휰  mm). Zaznamenávanie teplotných prahov sa bude prísne riadiť publikovanými smernicami QST. 35 Mechanické prahy bolesti (MPT)  sa vyhodnotia pomocou 20 kusov von Freyovho vlasového setu (Touch Test, Severné pobrežie, USA), ktorý pôsobí rôznymi silami (9,8, 13,7, 19,6, 39,2, 58,8, 948,1, 948,1, 5 255,0, 588,4, 980,7, 1765,2, 2942,0 mN). Von Freyove chĺpky budú aplikované rýchlosťou 2 s zapnuté, 2 s vypnuté vo vzostupnom poradí začínajúc od 9,8 mN základného stimulu, kým účastníci prvýkrát nevnímajú stimul ako ostrý (pichanie). Následne budú chĺpky aplikované v zostupnom poradí, kým nebude stimul vnímaný ako tupý. Geometrický priemer piatich sérií vzostupných a zostupných stimulov je definovaný ako MPT. Pomer nábehu sa určí pomocou číselných hodnotení bolesti na vizuálnej analógovej škále (VAS 0�) pre jeden stimul, po ktorom nasleduje priemerné hodnotenie bolesti pre rad 10 stimulov aplikovaných pri frekvencii 1  Hz v rámci rovnakej 1𠂜m 2 pomocou 255 mN von Freyho vlasu. Toto sa zopakuje päťkrát a pomer sa stanoví ako priemerné hodnotenie sledov stimulov delené priemerným hodnotením jednotlivých stimulov. Prahové hodnoty detekcie vibrácií (VDT) sa určia zaznamenaním priemeru 3 prahov zmiznutia pomocou ladičky Rydel-Seiffer. Prahové hodnoty tlakovej bolesti (PPT) sa budú zaznamenávať trojmo pomocou manuálneho algometra (Wagner Instruments, Greenwich, Connecticut, USA) a ich priemerná hodnota sa použije na analýzu.

Strana, ktorá sa má testovať, bude náhodne vybraná a pacienti budú najprv oboznámení so senzorickými testami na predlaktí na kontrolnej strane pred vykonaním skutočných meraní na testovacom ramene. Všetky testy sa vykonajú nad polovinou strany predlaktia s výnimkou VDT (ulnárny styloid) a PPT (thenarové svaly).

Horčičný olej vyvolal nociceptívnu senzibilizáciu

Po základných senzorických meraniach sa použije acetátová šablóna na označenie hviezdy s ôsmimi lúčmi, z ktorých každý obsahuje osem bodov v prírastkoch 1  cm na volárnom predlaktí (obrázok 2). Teplota pokožky bude štandardizovaná umiestnením 32ଌ teplej termody nad stred hviezdy na 5  minút pred spustením. Potom použijeme paradigmu senzibilizácie s použitím horčičného oleja (AITC (Sigma), zriedeného na 30 % v olivovom oleji), ako bolo vykonané predtým. 36 AITC, aktívna zložka horčičného oleja, aktivuje iónový kanál TRPA1 a vyvoláva vzplanutie kože a nociceptívnu senzibilizáciu. 37 Malý vatový tampón namočený v horčičnom oleji sa aplikuje na oblasť 0,64  cm 2 na predlaktí a pridrží sa na mieste pomocou Tegaderm (3M) 10  minút. 36  Počas tejto doby sa skóre bolesti bude zaznamenávať každých 30  s pomocou elektronického VAS v rozsahu od 0 do 100. Po 10  minútach sa horčičný olej odstráni a oblasť kožného záblesku sa zaznamená s presnosťou na 0,5  cm na každom lúči. 7 Spojením bodov na susedných lúčoch sa vytvorí osem trojuholníkových tvarov a celková plocha sa vypočíta sčítaním všetkých trojuholníkových segmentov. Plocha aplikácie horčičného oleja sa odpočíta od celkovej plochy, aby sa určila plocha sekundárneho vzplanutia (plocha vzplanutia).

Metóda na určenie oblasti vzplanutia, bodovej hyperalgézie a alodýnie. (A) Acetátová šablóna sa používa na označenie hviezdy s ôsmimi lúčmi s ôsmimi bodmi v prírastkoch 1  cm na volárnom predlaktí. (B) Do stredu hviezdy sa nanesie malý vatový tampón namočený v 30 % horčicovom oleji a (C) sa pridrží na mieste pomocou Tegadermu 10  minút. Počas tejto doby sa skóre bolesti zaznamenáva každých 30  s. (D a E) Po odstránení horčicového oleja sa označí kožný zápal a vypočíta sa plocha. (F) Oblasť precitlivenosti vyvolanej štetcom a bodovej precitlivenosti sa určí pomocou štetca a 98,1 mN von Freyovho vlasu (na obrázku) testovaním potenciálnej precitlivenosti v každom bode na ôsmich lúčoch.

Po zmapovaní vzplanutia sa oblasť precitlivenosti vyvolanej štetcom určí štetcom (Nr 5 Senselab, Somedic, Švédsko) aplikovaním 1  cm dlhých ťahov na každý z bodov na ôsmich lúčoch, začínajúc zvonku a pohybujúce sa smerom k senzibilizovanému centru. Oblasť bodovej precitlivenosti sa určí pomocou vlákna 98,1 mN (Bailey Instruments, UK) podľa rovnakého postupu. 36 Čo sa týka vzplanutia, primárna oblasť aplikácie horčičného oleja sa odpočíta od oboch hypersenzitívnych oblastí tak, že zaznamenané oblasti predstavujú sekundárnu hyperalgéziu/hypersenzitivitu.

Po senzibilizácii horčičného oleja sa MPT a HPT zopakujú pomocou rovnakých metód, ako sú opísané vyššie. Všetky postsenzibilizačné testy sa vykonajú do 5  minút po odstránení horčičného oleja.

Spoľahlivosť protokolu naïve a senzibilizovaných senzorických funkcií

Na stanovenie spoľahlivosti intratestera sme zopakovali protokol senzorickej funkcie vykonaný tým istým výskumníkom u n=12  zdravých dobrovoľníkov pri dvoch rôznych príležitostiach v priebehu 2𠄶 týždňov. Vnútrotriedne korelačné koeficienty (3.1) odhalili dobrú až vynikajúcu zhodu pre všetky premenné senzorického testovania (tabuľka 1). 38

Stôl 1

Intratesterová spoľahlivosť protokolu senzorických funkcií

Vnútrotriedne korelačné koeficienty95%𠂜IP hodnota
CDT0.7280,277 až 0,9140.003
WDT0.7640,351 až 0,927π,0001
TSL0.6380,161 až 0,8780.005
HPT0.7520,339 až 0,9220.002
MPT0.9280,767 až 0,979π,0001
WUR0.6340,113 až 0,8800.012
VDT0.9560,860 až 0,987π,0001
PPT0.7340,305 až 0,9150.002
VAS0.8930,667 až 0,970π,0001
Oblasť vzplanutia0.6100,095 až 0,8690.015
Kefou vyvolaná alodýnia0.7560,365 až 0,9220.001
Prerušovaná hyperalgézia0.6150,094 až 0,8710.013
Postsenzibilizácia MPT0.9410,808 až 0,983π,0001
Postsenzibilizačná HPT0.7580,339 až 0,9240.002

CDT, prah detekcie chladu HPT, prah bolesti za tepla MPT, prah mechanickej bolesti PPT, prah bolesti pri tlaku TSL, teplotné senzorické limen VDT, prah detekcie vibrácií VAS, Visual Analogue Scale WDT, prah detekcie tepla WUR, wind-up ratio.

Genotypizácia

Každý účastník daruje krv alebo sliny (Oragene OG-500, Genotek, Kanada) na extrakciu DNA. Vzorky DNA budú genotypované na čipe Illumina HumanOmniExpress, ktorý obsahuje 

700� markerov. U dobrovoľníkov, ktorí sa už zúčastnili na CANDELA GWAS, je už k dispozícii 39 genotypových údajov zo vzoriek krvi genotypovaných na tom istom čipe a budú opätovne použité.

Údaje o genotype celého genómu z poľa Illumina budú podrobené kontrole kvality40, aby sa vylúčili akékoľvek markery alebo vzorky, ktoré nespĺňajú prísne prahové hodnoty. Na filtrovanie slabo genotypovaných SNP sa použijú metriky kvality poskytované algoritmom volania genotypu v softvéri Illumina GenomeStudio 41, ako je skóre GenTrain, skóre separácie klastrov a nadmerné miery heterozygotnosti. Použijú sa následné prahové hodnoty kontroly kvality na úrovni SNP a na úrovni vzorky, ako napríklad chýbajúce. Skontroluje sa nesúlad pohlaví medzi záznamami a genetickými údajmi chromozómov X a Y. Na analýzu sa ponechajú iba vzorky a SNP, ktoré spĺňajú všetky kritériá. Podrobnosti o aktuálne používanom protokole kontroly kvality pre vzorky s genotypom CANDELA sú uvedené v online doplnkovej prílohe 2.

Doplňujúce údaje

Štatistická analýza

Výpočet veľkosti vzorky

Sila GWAS experimentálnych fenotypov bolesti pre rôzne veľkosti vzoriek a účinkov sa odhadla podľa vzorcov opísaných vo Visscher a kol. 42 Odhadovaná sila je uvedená pre rozsah veľkostí účinkov pre experimentálne fenotypy bolesti prevzaté z existujúcich experimentálnych štúdií bolesti. Na vykonanie výpočtov a vytvorenie čísel sa použil štatistický softvér R V.3.4.1 43 . Kódy sú zverejnené na https://github.com/kaustubhad/gwas-power.

V štúdiách GWAS založených na SNP celého genómu sa asociačná analýza zvyčajne vykonáva s multivariačným lineárnym regresným modelom, kde sú hodnoty vlastností regresované na genotyp SNP (s aditívnym kódovaním) a ďalšie kovariáty, ktoré bežne zahŕňajú vek, pohlavie, BMI a genetické hlavné komponenty (PC). Prah hodnoty p  39 42 pre významné asociácie v celom genóme je bežne 5휐 𢄨, zatiaľ čo prah pre sugestívne významné asociácie je zvyčajne 10𢄥. Vzorce na výpočet výkonu v GWAS s celogenómovými a sugestívnymi prahmi významnosti sú uvedené v online doplnkovom dodatku 3 a výkon vypočítaný pre aktuálne nastavenie GWAS je znázornený na obrázku 3.

Odhadovaná sila (v percentách) v rámci štandardných nastavení celogenómových asociačných štúdií (GWAS) pri použití údajov o genotypizácii celého genómu. (A) Odhadovaná sila (v percentách) ako teplotná mapa s nastavením prahu významnosti na 5휐 𢄨, čo je bežne používaná prahová hodnota pre významnosť celého genómu v štúdiách GWAS. (B) Odhadovaná sila s prahom významnosti nastaveným na 10 𢄥, čo je bežne používaný prah pre sugestívnu významnosť. V paneloch A-B os x označuje rozsah veľkostí vzoriek (n) v GWAS, os y predstavuje podiel rozptylu vlastnosti (q2) vysvetleného markerom. Sila detekcie markera pri špecifickej (n, q 2 ) kombinácii je reprezentovaná farebným gradientom. Sú zobrazené aj vrstevnice pre výkon v 10% intervaloch. Panely C-D ukazujú výkonové krivky pre očakávané veľkosti vzoriek pre túto štúdiu. (C) Očakávaná sila pri prahoch významnosti pre celý genóm pre veľkosť vzorky n = 1500. (D) Odhadovaný výkon pre veľkosť vzorky n=2000. V paneloch C-D os x označuje podiel rozptylu vlastnosti (q2) vysvetleného markerom a os y predstavuje odhadovanú silu (v percentách). Tieto dve krivky zodpovedajú dvom bežne používaným prahom GWAS. Na každom paneli je bod pre 80% výkon označený zeleným trojuholníkom, aby bolo možné z grafu prečítať potrebné konfigurácie parametrov. V paneloch A-B je obrys zodpovedajúci 80% výkonu označený aj zelenou farbou.

Doplňujúce údaje

Obrázok 3A ukazuje odhadovaný výkon (v percentách) ako tepelnú mapu pri štandardných nastaveniach GWAS s použitím údajov o genotypizácii celého genómu a prahu významnosti hodnoty p  5휐𢄨. Veľkosť vzorky (n) sa pohybuje od 100 do 5 000, zatiaľ čo podiel rozptylu vlastnosti vysvetlený markerom (q 2, v percentách) sa pohybuje od 0,01 % do 6 %. So zvyšujúcou sa veľkosťou vzorky sa výkon rýchlo zvyšuje, aby rozsah hodnôt rozptylu vlastností dosiahol 100 %.

Obrázok 3B ukazuje odhadovaný výkon (v percentách) pri rovnakých nastaveniach, ale sugestívny prah významnosti hodnoty p  10𢄥. Ako sa očakávalo, výkon je vyšší pri podobných veľkostiach vzorky a účinku pre tento menej prísny prah.

Zjednodušené odhady výkonu sú znázornené ako krivky výkonu na obrázku 3C,D pre očakávané veľkosti vzoriek pre túto štúdiu. Obrázok 3C ukazuje očakávanú silu na úrovni genómu a sugestívne prahy významnosti pre veľkosť vzorky n = 1500 pri rôznych veľkostiach účinku, zatiaľ čo obrázok 3D ukazuje odhadovanú silu pre veľkosť vzorky n = 2000.

Rozsah rozptylu vlastností bol prevzatý od Doehringa a kol, 44, ktorý poskytuje odhady podielu rozptylu znakov vysvetleného SNP pre niekoľko experimentálnych fenotypov bolesti a viacerých markerov. Hodnoty sa pohybovali od 0,02 % do 6 %. Niektoré črty boli rovnaké ako tu skúmané črty, zatiaľ čo niektoré iné črty boli odlišné. Napriek tomu sú distribúcie rozptylu znakov pre dve skupiny znakov veľmi podobné, ako je vidieť na obrázku 4A.

(A) Distribúcie rozptylu vlastností vysvetlené jediným markerom od Doehringa a kol 44 pre vlastnosti zahrnuté v našej štúdii a tie, ktoré nie sú zahrnuté. (B) Distribúcie frekvencie alel lokusov spojených s experimentálnou bolesťou v predtým publikovaných kohortách pre Európanov a Kolumbijčanov.

Sila GWAS závisí od frekvencie alel SNP prostredníctvom ich účinku na štatistiku testu. Zatiaľ čo väčšina štúdií GWAS sa vykonáva na jedincoch európskeho pôvodu, vrátane experimentálnej štúdie bolesti, ktorá sa tu používa na určenie veľkosti vzorky, 44 našou populáciou, ktorá nás zaujíma, je zmiešaná populácia Latinskej Ameriky. Preto sme chceli posúdiť distribúciu frekvencií alel u Európanov oproti Kolumbijčanom pre SNP študované alebo spojené s experimentálnou bolesťou v rôznych štúdiách. 44 45 Menšie frekvencie alel boli získané pre všetky takto hlásené SNP z databázy projektu 1000 Genomes 17 pre Západoeurópanov (z Británie (GBR), obyvateľov Utahu zo severnej a západnej Európy (CEU), Španielska (IBS) a Toskánska v Taliansku ( TSI)) a Kolumbijčania (z Medellínu v Kolumbii, (CLM), kde sa táto štúdia uskutoční). Rozdelenie frekvencie alel pre Európanov aj Kolumbijčanov je znázornené na obrázku 4B. Tieto dve distribúcie sú dosť podobné, pričom kolumbijská distribúcia je o niečo viac rozšírená. To sa trochu očakáva, keďže Kolumbijčania majú v priemere 60 % európskych (španielskych) predkov. 26 Dobre rozložená distribúcia frekvencií alel je v GWAS dôležitá, pretože nízkofrekvenčné alely majú nižšiu silu pre danú vzorku a veľkosť účinku. 46 Tu porovnanie s európskou distribúciou frekvencie alel naznačuje, že súčasná kolumbijská kohorta bude mať takmer rovnakú silu ako akákoľvek kohorta z Európy. Na rozdiel od iba európskych kohort však naša kohorta bude mať tú výhodu, že alely prítomné v iných kontinentálnych populáciách, ako sú subsaharskí Afričania alebo domorodí Američania, ktoré nie sú prítomné u Európanov, by boli tiež zistiteľné v GWAS a mohli by byť sledované v replikačných kohortách konkrétnych etník.

Projekt CANDELA zahŕňa genotpy 

2000 pacientov z Medellínu. Očakávame, že kontaktujeme a fenotypujeme 50 %� % týchto účastníkov, ako aj oslovíme ďalších 500 účastníkov, aby sa počiatočná vzorka dostala na 1500�.

Plán analýzy údajov

Vyčistené genetické údaje sa najprv zlúčia s referenčnými vzorkami na celom svete, ako je projekt 1000 genómov, 17 Simonsov projekt genómovej diverzity, 47 estónsky biocentrický panel pre rozmanitosť ľudského genómu 48 a ďalšie európske a indiánske vzorky, ktoré sú obzvlášť dôležité pre populáciu Latinskej Ameriky. . 49 Zlúčený súbor údajov sa skontroluje na genetické odľahlé hodnoty prostredníctvom genetických PC a proporcií kontinentálnych predkov (pomocou kontrolovanej prísady 50 ) a na neočakávané genetické podobnosti. Tieto kroky môžu často odhaliť akékoľvek nesprávne umiestnenie alebo kontamináciu vzorky, čo sa môže prejaviť v nesúlade pohlaví, neočakávaných genetických podobnostiach alebo zvýšenej miere heterozygotnosti. 40 51 Odhady genetického pôvodu sa porovnajú s informáciami o predkoch, ktoré si sami nahlásili (pozri online doplnkovú prílohu 1), najmä v prípade genetických odľahlých hodnôt alebo vzoriek vykazujúcich neočakávané výsledky. Účastníci, ktorí sa sami hlásia k etnickým skupinám zriedkavým u Kolumbijčanov, ako je východná Ázia alebo juhoázijský región, by boli tiež vylúčení ako odľahlé hodnoty. The authors have extensive experience in conducting association analysis in admixed populations, including several GWAS publications on a wide range of phenotypes which contain detailed protocols on how to conduct such analyses. 27 39 52 53 Further details of the currently used quality control protocol for CANDELA samples 53 are provided in online supplementary appendix 2.

The genetic data allow estimation of the narrow-sense heritability of any quantitative trait, which is the fraction of trait variance that is explained by the genetic data. Estimates of heritability, obtained using the software GCTA, 54 will provide an idea of which traits have more of a biological basis versus which are more environmentally determined, and thus which traits would be more amenable to genetic analysis for discovery of associated genetic variants. Note however that relatively precise estimate (low SDs) of heritability by this method requires several thousand samples, 52 so the currently proposed sample size might be underpowered to estimate heritability accurately.

To facilitate better identification of associated loci, the genotype data will be imputed to approximately 10 million loci using the 1000 Genomes phase 3 imputation reference panel 52 by first haplotype phasing using SHAPEIT2 55 and then imputation using Impute2. 56 Quality control of the imputed genotypes will be performed using recommended thresholds on imputation quality score, concordance metrics and proportion of high-probability calls. Details of the currently used imputation protocol for CANDELA samples 52 are provided in online supplementary appendix 2.

GWAS studies will be conducted in Plink2 57 to perform single-locus association studies for each trait individually, across the whole genome in an additive multivariate linear regression model. 42 Covariates will be used in the regression to adjust for any other sources of trait variability, such as basic variables like age, sex, and BMI, and genetic PCs will be used to control for population substructure. 52 58

The number of genetic PCs to be included in the regression depends on the sample composition, such as variation in ancestry and presence/absence of genetic outliers. It would be determined by inspecting the proportion of variance explained by each PC (displayed on a scree plot) and by checking PC scatter plots.

In addition to being used as exclusion criteria, anxiety and depression scores could be used as covariates in GWAS. The exact set of covariates to be used will be determined based on initial diagnostic analyses such as correlation analysis.

These single-locus association results, obtained as p values, will be visualised via the Manhattan plot. Commonly used p value thresholds for selecting associated loci are 5휐 𢄨 for genome-wide significance and 10 𢄥 for suggestive significance. 42

An extension of this additive multivariate linear regression model, still within the single-trait single-locus setting, called the mixed linear model analysis which better controls for any cryptic relatedness or population substructure, will also be performed in GCTA. 54

There are several extensions of the single-trait single-locus association studies that increase power for detecting associated loci: combining several related traits that may share a biological basis, using multivariate Wald tests as implemented in MultiPhen 59 or gene-based tests that combine signals across all loci in a gene to increase signal strength and reduce the burden of multiple testing, such as set-based models implemented in Plink2 57 or fastBAT implemented in GCTA. 60 The admixed nature of the sample might be used in detecting associations by the method of admixture mapping, 61 though the potential of success of this method in detecting associated variants depends on the extent of stratification of the variant’s allele frequency across continents. These analyses might help detect additional loci that are underpowered in classical GWAS due to smaller effect sizes.

Handling of missing data

It might not be possible to record some traits in some individuals, even though the completeness of the first 100 samples suggests that missingness will be low. The single-trait methods used in traditional GWAS analyses automatically exclude individuals from the analysis of a trait who have missing values for that trait. The same applies to individuals having missing genotypes for any particular SNP. However, genotyping success rate using the Illumina HumanOmniExpress chip in the CANDELA cohort is very high (㺙.8%), so the number of excluded individuals in any analysis would be very low overall.

Some multivariate analyses such as PCs when applied on the set of phenotypes require having recorded values of all phenotypes for an individual. Instead of using the subset of individuals who have the complete set of phenotypes recorded, which would incur some loss in sample size, the missing phenotype data for each individual will be imputed following standard statistical procedures as implemented in the R package ‘mice’. 62 When the proportion of missing data is small, imputation is preferable in such multivariate analyses than sample exclusion, and is routinely applied to genetic data such as while calculating genetic PCs. 58


Diskusia

This GWAS including a well-defined cohort of healthy participants will provide important insights into the genetic aspects underlying experimental pain sensitivity in the naïve and sensitised state. This may allow further exploration of potential biological mechanisms underlying pain sensitivity. Future studies will be required to extrapolate these findings to patient populations with chronic pain.

Patient and public involvement

No patient involvement is performed during this study.

Ethics and dissemination

Findings will be disseminated to commissioners, clinicians and service users via papers and presentations at international conferences such as the biennial World Congress of International Association for the Study of Pain. We will also post our findings to the publicly available painnetworks.org database.


Gargis AS, Kalman L, Berry MW, Bick DP, Dimmock DP, Hambuch T, Lu F, Lyon E, Voelkerding KV, Zehnbauer BA, Agarwala R. Assuring the quality of next-generation sequencing in clinical laboratory practice. Nat Biotechnol. 201230(11):1033.

Linderman MD, Brandt T, Edelmann L, Jabado O, Kasai Y, Kornreich R, Mahajan M, Shah H, Kasarskis A, Schadt EE. Analytical validation of whole exome and whole genome sequencing for clinical applications. BMC Med Genet. 20147(1):20.

Steemers FJ, Gunderson KL. Whole genome genotyping technologies on the BeadArray™ platform. Biotechnol J. 20072(1):41–9.

Beck TF, Mullikin JC, Biesecker LG, Comparative Sequencing Program NISC. Systematic evaluation of sanger validation of next-generation sequencing variants. Clin Chem. 201662(4):647–54.

Broad Institute. GATK Tools (version 3.8). Available from: http://github.com/broadinstitute/gatk/. Accessed 5 Mar 2018.

Rehm HL, Bale SJ, Bayrak-Toydemir P, Berg JS, Brown KK, Deignan JL, Friez MJ, Funke BH, Hegde MR, Lyon E. ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing. Genet Med. 201315(9):733.

Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S, Madden TL. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinform. 201213(1):134.

Wang Z, Liu X, Yang BZ, Gelernter J. The role and challenges of exome sequencing in studies of human diseases. Predná Genet. 20134:160.

Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatika. 201430(15):2114–20.

Li H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv preprint arXiv:1303.3997 2013.

Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatika. 200925(16):2078–9.

Li H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatika. 201127(21):2987–93.


Afiliácie

Department of Health Sciences, University of Leicester, Leicester, UK

Iain R. Timmins & Frank Dudbridge

Diabetes Research Centre, University of Leicester, Leicester, UK

Francesco Zaccardi & Thomas Yates

Department of Cardiovascular Sciences, University of Leicester, Leicester, UK

NIHR Leicester Biomedical Research Centre, University Hospitals of Leicester NHS Trust & University of Leicester, Leicester, UK

Christopher P. Nelson & Thomas Yates

Department of Clinical Sciences, Lund University, Lund, Sweden

Tohto autora môžete vyhľadať aj v službe PubMed Google Scholar

Tohto autora môžete vyhľadať aj v službe PubMed Google Scholar

Tohto autora môžete vyhľadať aj v službe PubMed Google Scholar

Tohto autora môžete vyhľadať aj v službe PubMed Google Scholar

Tohto autora môžete vyhľadať aj v službe PubMed Google Scholar

Tohto autora môžete vyhľadať aj v službe PubMed Google Scholar

Príspevky

I.R.T. developed methods, performed analyses, interpreted results and wrote the manuscript. F.Z. conceived the study, interpreted results and edited the manuscript. C.P.N. interpreted results and edited the manuscript. P.W.F. interpreted results and edited the manuscript. T.Y. conceived the study, interpreted results and edited the manuscript. F.D. conceived the study, interpreted results and edited the manuscript.

Zodpovedajúci Autor


Introduction

Epithelial ovarian cancer (EOC) has a strong heritable component, with an estimated three-fold increased risk among women with a first-degree relative having the disease ( 1). The excess familial risk that is not attributed to high penetrance mutations in genes such as BRCA1 a BRCA2 may be due to a combination of common and rare alleles that confer low- to moderate penetrance ( 2, 3). Genome-wide association studies (GWAS) of EOC that have been conducted using most of the samples included in the current investigation have identified common variants at approximately 22 loci that collectively account for 4% of the estimated heritability ( 4–13). Few data exist regarding the contribution of rare (minor allele frequency (MAF) <0.5%) and low frequency (MAF 0.5–5%) protein-coding variants to EOC risk. This reflects the fact that protein- coding variants have not been targeted by conventional GWAS ( 14) despite prediction that their effects could be substantial ( 15) and imputation is known to be challenging for rare variants ( 16).

Following GWAS arrays of the mid-2000s, exome-based arrays were developed in 2012. The Affymetrix Axiom ® Exome Genotyping Array and the Illumina HumanExome Beadchip each contain >245,000 putative functional coding variants and other categories of variants selected from 16 exome sequencing initiatives that included approximately 12,000 individuals of diverse ethnic backgrounds and a range of diseases ( 17) ( Supplementary Material, Table 1 ). Variants were included as ‘fixed’ content on the arrays if they occurred at least three times and were seen in two or more of the 16 studies ( 17). Here, we report the first large-scale genetic association study of uncommon exome-wide variants and EOC risk among nearly 20,000 women ( Supplementary Material, Table 2 ).


Diskusia

In this EWAS of sporadic DCM we confirmed associations with variants in ZBTB17-HSPB7 a BAG3 and identified six novel loci. Statistical analyses, cardiac tissue expression, and physiology suggest that the most likely causal genes are HSPB7, BAG3, TTN, SLC39A8, MLIP, FLNC, ALPK3 a FHOD3.

Our data provide evidence that non-coding variants close to or within HSPB7 are more likely to account for the observed association at the ZBTB17 lokus. The genetic mechanism linking the risk haplotype to HSPB7 functional modulation in absence of detectable eQTL is unknown. HSPB7 (commonly referred as cardiovascular Heat Shock Protein cvHSP) is a member of the small HSPB family of molecular chaperones. It is a potent polyglutamin aggregation suppressor that assists the loading of misfolded proteins or small protein aggregates into autophagosomes [15]. In addition, our in vitro experiments demonstrate a physical interaction of BAG3 with HSPB7 (Fig 4) suggesting functional relationships between the 2 proteins that may be relevant for their genetic implication in DCM pathophysiology. The strongest association with sporadic DCM in our EWAS involved rs2234962 which encodes a p.Cys151Arg substitution in BAG3. The interaction signal of BAG3 Arg151 and Cys151 isoforms with HSPB7 was similar (data not shown), suggesting no direct effect of the polymorphism on HSPB7 binding The p.Cys151Arg variant is located between two conserved Ile–Pro–Val (IPV) motifs involved in BAG3 complex formation with HSPB6 and HSPB8. Interestingly, a p.Pro209Leu mutation responsible for myofibrillar myopathy associated with cardiomyopathy is located in one of the two IPV motifs [16]. Whether p.Cys151Arg modifies the interaction of BAG3 with HSPBs partners and affects the functional potential of the complex is currently unknown.

Common haplotype-tagging variants of the titin gene were associated with small differences in DCM risk in this EWAS. This extends the spectrum of TTN genetic variants that affect DCM risk, from highly penetrant mutations responsible for familial DCM [12] to common haplotypes with low penetrance associated with sporadic DCM. A potential consequence of common DCM-associated TTN variants, in line with the pathogenic mechanisms suggested by the candidate genes identified in this EWAS, is the proteotoxic effect of accumulating truncated or aggregate prone mutant TTN in cardiomyocytes.

The rs13107325 SNV in SLC39A8 has been shown in GWAS to be associated with several traits affecting cardiovascular risk, including blood pressure. It is therefore conceivable that it has systemic consequences that raise the risk of DCM but were not considered in our disease exclusion criteria. Pretože SLC39A8 encodes a zinc transporter [17], its association with DCM may also be related to the cardioprotective role of zinc [18].

In the nuclear envelope, MLIP (also known as CIP) directly interacts with the N-terminal region of lamin (LMNA) [19]. Dominant mutations in LMNA cause DCM and other hereditary multisystemic diseases and several pathogenic mutations of LMNA are located in its MLIP interacting domain [20]. In mice, Mlip interacts with Isl1, a transcription factor required for cardiomyocyte differentiation, and represses its transcriptional activity [21]. Notably, the DCM-associated SNV (rs4712056, p.Val159Ile) is located within the Isl1-interacting region of MLIP. MLIP has recently been shown to be a key regulator of cardiomyopathy that has potential as a therapeutic target to attenuate heart failure progression [22].

Filamin C is involved in the organization of actin filaments, it serves as a scaffold for signaling proteins and interacts with several Z-disk proteins. FLNC mutations in humans and mice cause hypertrophic cardiomyopathy [23] and myofibrillar myopathy, a form of muscular dystrophy with concurrent cardiomyopathy [24]. These pathologies are characterized by myofibrillar disorganization, accumulation of myofibrillar degradation products and ectopic expression of multiple proteins [25]. FLNC mutations induce massive protein aggregates within skeletal muscle fibers and altered expression of chaperone proteins and components of proteasomal and autophagic degradation pathways. Interestingly, functional interaction between FLNC and HSPB7 or BAG3, two genes confirmed by this study, have been previously reported [26,27]. In addition to the fact that BAG3 mutations also causes myofibrillar myopathy it suggests the hypothesis that dysregulation of proteostasis could be a common mechanism underlying myofibrillar myopathy and DCM.

Cardiac FHOD3 plays a crucial role in the sarcomere organization of cardiomyocytes, is essential for heart myofibrillogenesis [28] and is required for the maintenance of the contractile structures in heart muscle. A cardiac isoform of FHOD3 is targeted to thin actin filaments via phosphorylation of tyrosine residue preventing autophagy dependent degradation [29]. Most DCM-associated SNVs in our EWAS are clustered in a region in 3' of FHOD3 that encodes the Formin FH2 domain of the protein, which is implicated in actin polymerization [30]. A FHOD3 variant, Y1249N, has been reported in a Japanese patient with a dominant form of DCM. In vivo functional analysis showed that this variant may impair actin filament assembly, thus providing some support for the implication of FHOD3 in the pathogenesis of DCM [31].

Alpha-kinase 3 (ALPK3/MIDORI) was initially described as a myocyte-specific gene that promotes differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes [32]. The pattern of expression of ALPK3 in differentiating cardiomyocytes nucleus is similar to that of transcription factors specific of the cardiogenic lineage [33] but its function is still largely unknown. Recently recessive mutations in ALPK3 have been reported to cause pediatric DCM [34].

Okrem tohoto TTN a BAG3, MYBPC3 was present in the cardiomyopathy gene-set [2] and harbored variants associated with sporadic DCM in our EWAS. MYBPC3 is an actin, myosin and titin interacting protein of the M-band of the sarcomere. Mutations in this gene are a major cause of hypertrophic cardiomyopathy and have also been reported in familial forms of DCM [35]. Coding variants in MYBPC3 may affect actin-myosin interaction [36] and concurrently interfere with the ubiquitin proteasome system and autophagy in humans and animal models [37]. Both mechanisms could account for the association of common SNVs in MYBPC3 with sporadic DCM.

Considered as a whole, both rare and common variants with elevated CADD scores in the cardiomyopathy gene-set were associated with sporadic DCM (S3 Table) indicating that other loci than those found in this EWAS are involved in sporadic DCM, however identifying the responsible genes will require larger studies.

Proteostasis might be important for DCM

Three of the DCM-associated genes, FLNC, TTN (through its kinase activity) and cardiac specific FHOD3 encode maintenance partners of sarcomere and sarcomere-related structures, including Z-disk or F-actin myofibrils [29,38,39], which are disorganized or degraded in experimental models of cardiomyopathy [40]. Moreover the cellular level of FLNC, FHOD3 and TTN kinase targets such as MuRF2, appears regulated by proteostasis mechanisms [26,29,39]. One of these mechanisms, BAG3-associated chaperone-assisted selective autophagy (CASA) is described as a central adaptation mechanism that responds to acute physical exercise and to repeated mechanical stimulation [41]. BAG3 inactivation also leads to Z-disk disruption in mice and fruit fly [26]. Based on the functional similarities (also pertaining to HSPB7 a MYBPC3) characterizing several of the DCM-associated genes identified in this study, we hypothesize that abnormal cardiomyocyte sarcomere maintenance and regulation of autophagy is a potential mechanism involved in DCM pathophysiology is. Further experimental exploration of this hypothesis may yield novel therapeutic targets for DCM.

Limitations of this study

This study has some limitations. The recruitment was focused on a priori homogeneous sets of patients and controls of European ancestry and outliers were excluded based on genomic data. We also conducted a meta-analysis which did not reveal any significant heterogeneity across populations. Despite these precautions, we cannot fully exclude undetected population stratification. In addition, given the rather low prevalence of DCM, we conducted exome-wide genotyping in all available patients and controls instead of using a two-step discovery/replication design. As a consequence, even if we provide a series of arguments supporting the identified genes as plausible candidates, independent studies would certainly further refine and extend our results. It is likely that a genome-wide tagging array not limited to exon regions would identify other DCM-associated variants and loci than those reported here. Finally, as our power analyses show, our EWAS had limited power to detect the collective effect of rare variants present in our data set at the gene level.

Záver

We identified 6 novel loci associated with sporadic DCM and confirmed two previously reported associations with variants located within the ZBTB17-HSPB7 a BAG3 génov. Fine mapping revealed that at the ZBTB17 lokus HSPB7 is likely the implicated gene. The lead-SNVs at all associated loci are common variants and conditioning on them reduced considerably the associations of other variants in the regions of interest with DCM. We provide evidence that 7 of the DCM-associated genes are very plausible candidates from a pathogenic perspective.


Pozri si video: Как горох Менделя помог нам понять генетику (Jún 2022).