Informácie

Orezávanie prekurzorov tRNA

Orezávanie prekurzorov tRNA


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Z Molecular Biology of the Cell (4. vydanie) od Bruce Alberts a kol. (Chp 6, Pg 338) :

Bakteriálne aj eukaryotické tRNA sa typicky syntetizujú ako väčšie prekurzorové tRNA a tie sa potom upravia, aby sa vytvorila zrelá tRNA. Okrem toho niektoré prekurzory tRNA (z baktérií aj eukaryotov) obsahujú intróny, ktoré sa musia zostrihať.

Aký je rozdiel medzi týmito dvoma tvrdeniami (a medzi orezávaním a spájaním)?


Trimovanie = odstránenie sekvencií RNA z jedného konca.

Splicing = odstránenie intrónov a spájanie exónov späť dohromady.


Izotopové značenie biomolekúl – metódy označovania

Olivier Duss, . Frédéric H.-T. Allain, v Metódy v enzymológii, 2015

5.3 Štiepenie RNázy H špecifické pre sekvenciu

Prekurzor RNA sa potom podrobí sekvenčne špecifickému štiepeniu RNázou H za pomoci 2'- O-metyl-RNA/DNA chiméra hybridizovala s miestom štiepenia (obr. 3 a 8). Pre úspešné štiepenie musí byť chiméra navrhnutá tak, aby štyri nukleotidy DNA hybridizovali priamo 5′ k miestu štiepenia na RNA a niekoľko ďalších 2′-O-metyl-RNA nukleotidy hybridizujú ďalej upstream na RNA, ktorá sa má štiepiť (obr. 5 B). Hoci to nie je potrebné na štiepenie, 2′-ONukleotidy -metyl-RNA môžu byť tiež navrhnuté tak, aby hybridizovali s RNA po smere od miesta štiepenia (obr. 3). Zistili sme, že chiméry, ktoré sú dlhé 14 až 16 nukleotidov a hybridizujú pred aj za miestami štiepenia, zvyčajne poskytujú najkompletnejšie a najšpecifickejšie výsledky štiepenia (až do 95 % špecifického štiepenia) (Duss et al., 2010, 2012).

Obrázok 8. Príklad prekurzorovej RNA a zodpovedajúcich 2′-O-metyl-RNA/DNA chiméra potrebná na miestne špecifické štiepenie sprostredkované RNázou H. Sekvencia záujmu je červenými (svetlosivá v tlačenej verzii) písmenami, 5′-oblasť komplementárna k chimére je sivá a VS 3 ′ predstavec v čiernej farbe. Štyri ďalšie nukleotidy predlžujú VS stopku-slučku a sú nepostrádateľné. 2′-O-metyl-RNA nukleotidy sú označené „m“.

Najlepšie podmienky na štiepenie sa získajú reakciami v malom meradle (typicky 500 pmol RNA v 15 μl reakčného objemu). Najdôležitejšími optimalizačnými parametrami sú koncentrácia enzýmu RNázy H (NEB alebo interne produkované (Ponchon, Beauvais, Nonin-Lecomte, & Dardel, 2009)) a pomer medzi RNA a 2′-O-metyl-RNA/DNA chiméra (Duss et al., 2010). Hoci väčšina štiepnych reakcií RNázy H sa môže uskutočniť s použitím iba 5 % stechiometrického množstva 2'-O-metyl-RNA/DNA chiméra v porovnaní s RNA, ktorá sa má štiepiť, sú niektoré reakcie menej citlivé na nešpecifické štiepenie pri použití stechiometrických množstiev chiméry. Všeobecne sa reakcie inkubujú 1 hodinu pri 37 °C. Niektoré reakcie sa môžu uskutočňovať aj pri nižšej teplote (napr. 4 °C), aby sa minimalizovalo nešpecifické štiepenie.

Najlepšie podmienky sú škálované až po reakciu vo veľkom meradle (zvyčajne 20–200 nmol). Všimnite si, že keď sa koncentrácia enzýmu RNázy H zvýši proporcionálne ako ostatné reakčné zložky, môže to viesť k nešpecifickému štiepeniu. Preto by sa pri reakcii vo veľkom meradle mala koncentrácia RNázy H znížiť približne 10-násobne. Ukončenie reakcie by sa malo overiť denaturáciou polyakrylamidových gélov. V prípade neúplného štiepenia sa môže pridať viac RNázy H a reakcia pokračuje ďalšiu hodinu. Typická reakcia na štiepenie 200 nmol RNA sa uskutočňuje v objeme 6 ml s obsahom 33 μM RNA, 1,65 μM chiméra, 80 nM vlastná produkcia RNázy H v 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl a 10 minM MgCl2.

Reakcie sa priamo nanesú na aniónovo-výmennú HPLC, po ktorej nasleduje n-extrakcia butanolu a lyofilizácia, ako je uvedené vyššie.


Spracovanie pre-tRNA v E.coli a kvasinkách | genetika

V tomto článku budeme diskutovať o spracovaní pre-tRNA v E. coli a kvasinkách.

V prokaryotoch existuje veľa operónov (napr. 7 génov v E. coli), ktoré sú oddelené medzerníkovými sekvenciami. Zrelé molekuly tRNA sa generujú spracovaním dlhších pre-tRNA transkriptov. Prostredníctvom špecifického kroku RNázy D, E, F a P generujú tieto zrelé molekuly tRNA exo- a endonukleolytickým štiepením (obr. 10.11 A).

Keď sa primárne transkripty poskladajú a vytvoria kmeň a slučku, endonukleáza (RNáza alebo F) odreže vločkujúcu sekvenciu na 3′ konci na báze stonky a vytvorí prekurzor s deviatimi nukleotidmi navyše. Potom RNáza D odstráni sedem z týchto 3′- nukleotidov jeden po druhom.

RNáza P štiepi za vzniku zrelého 5′ konca tRNA, po čom nasleduje orezanie RNázy D zvyšných 2 nukleotidov z 3′ konca. Nakoniec, tRNA prechádza reťazcom modifikácie báz, t.j. modifikáciou v 20 % báz za vzniku neobvyklých báz, ako je ribotymidín (rT), pseudouridín (Ψ), dihydrouridín (DHU) a inozín (I).

Mnoho eukaryotných molekúl pre-tRNA sa syntetizuje so 16 nukleotidovým 5′ vedúcim, 14 nukleotidovým intrónom a ďalšími 5′- a 3′- nukleotidmi. Tie sa však pri spracovaní odstránia. Primárny transkript sa premení na sekundárnu štruktúru so stonkami a slučkami.

Tie umožňujú endonukleázam rozpoznať a štiepiť 5′-líder a dva 3′-nukleotidy. Na rozdiel od prokaryotickej tRNA je 3’koncová 5′ CCA-3′ pridaná enzýmom tRNA nukleotidyltransferázou. Na každom konci sú intróny odstránené endokatalytickým štiepením, po ktorom nasleduje ligácia polovičných molekúl tRNA. (obr. 10.11B).


Výsledky a diskusia

Množstvo druhov RNA

Metodológia RNA-Seq bola použitá na získanie globálneho prehľadu o produkcii a spracovaní malých molekúl RNA v N. equitans. V závislosti od zvolenej metódy izolácie RNA, prípravy knižnice a použitej platformy sekvenovania RNA sa selektívne obohacujú rôzne druhy RNA [16]. Na získanie čo najúplnejšieho obrazu o malej diverzite RNA prítomnej v N. equitans malé RNA boli obohatené, ale neboli zbavené ribozomálnych RNA. Všetky vzorky RNA boli pred ligáciou adaptéra ošetrené T4 polynukleotidkinázou a pyrofosfatázou tabakovej kyseliny. Tieto kroky sa použili na zaistenie, že sa zachytia RNA s 5'-trifosfátovými alebo 5'-OH koncami a 2',3'-cyklickými fosfátovými koncami. Použilo sa sekvenovanie Illumina HiSeq2000, ktoré prinieslo viac ako 12 miliónov čítaní, ktoré bolo možné mapovať na N. equitans genómu (doplnkový súbor 1). Analýza množstva rôznych druhov RNA overila, že v údajoch RNA-Seq boli detegované všetky očakávané rôzne typy druhov RNA, vrátane rRNA, tRNA, polovičných molekúl tRNA, malých RNA (sRNA) a crRNA. Napriek tomu bolo detegované iba prekvapivo malé množstvo zrelých tRNA a sekvenčné čítania (zvyčajne menej ako 1 000 čítania) mapované na fragmenty génov tRNA. Toto pozorovanie sa považuje za príklad problémov, ktoré vysoko štruktúrované a silne modifikované sekvencie RNA predstavujú pre enzýmy reverznej transkriptázy. Väčšina získaných sekvenčných čítaní (približne 8,5 milióna čítaní) mapovaných na gény kódujúce 5S, 16S a 23S rRNA, po ktorých nasleduje niekoľko vysoko hojných C/D box sRNA a crRNA (obrázok 1). Analýza týchto dvoch malých druhov RNA je podrobne uvedená nižšie. Aj keď prístup na izoláciu RNA nebol nastavený na čistenie mRNA, hĺbka získaných výsledkov sekvenovania umožnila mapovanie hojného počtu fragmentovaných mRNA. Väčšina čítaní fragmentov mRNA (približne 119 000 čítaní) bola mapovaná na dva gény NEQ300 (proteín S-vrstvy) a NEQ026 (proteín s neznámou funkciou). Oba génové produkty boli tiež identifikované celobunkovou proteomikou ako medzi šiestimi najrozšírenejšími N. equitans proteíny [12]. Jediný identifikovateľný homológ NEQ026 sa nachádza v Thermofilum pendens (arCOG06945) a spojené s predpokladanou aminokyselinovou permeázou. Toto pozorovanie poskytuje východiskový bod pre analýzu vysoko hojného proteínu NEQ026, ktorý sa potenciálne podieľa na absorpcii aminokyselín z I. hospitalis.

Množstvo RNA v N. equitans. Sekvenčné čítania Illumina HiSeq2000 mapované na N. equitans referenčný genóm (GenBank: NC_005213, 490885 bp) zvýrazňujú množstvo crRNA a C/D box sRNA.

Zrenie molekúl tRNA

N. equitans bol prvým organizmom, ktorý bol identifikovaný na generovanie šiestich izoakceptorov tRNA prostredníctvom a trans- zostrihová reakcia pomocou polovičných molekúl tRNA. Skoršie štúdie charakterizovali zrelé zostrihané molekuly tRNA v bunke, ale bolo možné identifikovať iba jeden polovičný transkript tRNA [5, 17]. Hĺbka dostupných údajov RNA-Seq umožnila identifikáciu všetkých 11 polovíc tRNA v N. equitans bunka. Polovičné molekuly tRNA obsahujú sekvenciu, ktorá sa zloží do tela zrelej tRNA a úsek bohatý na GC, ktorý je komplementárny k sekvencii, ktorá sa nachádza iba v zodpovedajúcej polovici tRNA. Tieto sekvencie sú navrhnuté na uľahčenie identifikácie zodpovedajúcich polovíc, na ktorých sa skladá telo tRNA [5]. Následne sa generuje spoločné pôsobenie heterotetramérnej zostrihovej endonukleázy a RNA ligázy trans- zostrihané zrelé tRNA. Boli identifikované konce všetkých polovíc tRNA (obrázok 2). 5'-konce prekurzorov tRNA sú viac definované ako ich 3' konce a obsahujú purínový zvyšok potrebný na správnu iniciáciu transkripcie. Vo väčšine prípadov prekurzorové transkripty tRNA nepresahujú úsek bohatý na GC. Táto oblasť je predĺžená iba o dva nukleotidy (GC) pre 3' tRNA Met polovicu, o jeden nukleotid (A) pre 3' tRNA His polovicu a skrátená o jeden nukleotid (A) pre 3' tRNA Lys polovicu. V niektorých prípadoch sa získané tRNA prekurzorové sekvencie spájajú s mRNA susedného génu. Jedným príkladom je 5' tRNA His polovica, ktorá je umiestnená priamo pred génom kódujúcim valyl-tRNA syntetázu a ktorá definuje jej 5' netranslatovanú oblasť. Je lákavé špekulovať, že táto štruktúrovaná polovica tRNA by mohla hrať úlohu v stabilite mRNA alebo regulácii syntézy valyl-tRNA syntetázy. 5' tRNA Glu (UUC) polovica a 3' tRNAi Met polovičné sekvencie zasahujú do susedných génov rôznej orientácie, čo môže spôsobiť ťažkosti so správnymi terminačnými signálmi. Tieto sekvencie naznačujú, že definovaný 3' koniec nemusí byť vždy nutnosťou pre zostavenie polovíc tRNA do funkčných molekúl tRNA. Nakoniec obidve polovice 5' tRNA pre tRNAi Met a tRNA His už obsahujú dodatočnú -1 bázu, ktorá vedie k predĺženému akceptorovému kmeňu v zrelej tRNA.

Identifikácia polovičných prekurzorov tRNA na zostrih tRNA trans. Pozorované N. equitans pokrytie genómu sekvencie Illumina HiSeq2000 presne určuje konce polovičných prekurzorov tRNA. Anotácia prekurzorov tRNA obsahujúcich sekvencie, ktoré sa zostavujú do konečnej tRNA (rámček) a reverzné komplementárne úseky bohaté na GC, ktoré identifikujú zodpovedajúcu polovicu (podčiarknuté), sú prevzaté z [17].

Neprítomnosť RNázy P

V intergénových oblastiach sa hľadali potenciálne nízko početné štruktúrne molekuly RNA, ale inak univerzálnu molekulu RNA RNázy P nebolo možné detegovať, čo je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami [9]. Genomické preskupenia kompenzujú stratu RNázy P a zabezpečujú, že všetky tRNA začínajú purínovým zvyškom priamo v mieste iniciácie transkripcie. Údaje RNA-Seq nám umožnili analyzovať 5' konce tRNA a overiť neprítomnosť vedúcich sekvencií. Jedným zaujímavým príkladom je tRNA Tyr, ktorá vyžaduje C1 bázu na jej rozpoznanie tyrozyl-tRNA syntetázou. Avšak bez RNázy P by takéto tRNA nemohli začínať pyrimidínovým zvyškom a bolo publikované, že nezvyčajné predĺženie G-1 rieši potrebu C1 bázy aj purínového zvyšku na začiatku transkripcie [9]. Pretože tento jedinečný akceptorový kmeň je priamym dôkazom neprítomnosti RNázy P, čítania RNA-Seq boli mapované na (i) gén tRNA obsahujúci intrón a (ii) zrelú tRNA bez intrónu. Zatiaľ čo pre zrelú tRNA bolo detegovaných výrazne menej čítaní v dôsledku problémov s reverznou transkripciou úplne modifikovanej tRNA, prevažná väčšina všetkých sekvencií, ktoré sa mapovali na tRNA Tyr lokus, obsahovala predĺženie G-1.

Spracovanie CRISPR RNA

N. equitans obsahuje dva klastre CRISPR, ktorých crRNA sú v bunke veľmi hojné. Je potrebné poznamenať, že oba klastre CRISPR sú v populárnych databázach CRISPR anotované v obrátenej orientácii [18, 19]. Tieto crRNA pozostávajú z jednotlivých spacerových sekvencií, o ktorých sa v iných organizmoch ukázalo, že zodpovedajú vírusovým alebo konjugačným plazmidovým fragmentom, ktoré boli začlenené do CRISPR počas skoršieho útoku týmto mobilným genetickým elementom a poskytujú odolnosť voči opakovaným útokom prostredníctvom komplementarity báz [15]. Vírusy, ktoré útočia N. equitans nie sú známe. Redukovaný genóm však stále umožňuje prítomnosť 41 rôznych spacerových sekvencií distribuovaných do dvoch klastrov CRISPR. Klastre CRISPR sú transkribované a štiepené v rámci identických 28 bp opakovaných sekvencií. Spracované crRNA boli detegované pre všetky spacery a obsahovali 5'-koncovú 8 nukleotidovú značku obsahujúcu 3'-koncové opakujúce sa nukleotidy ATTGAAAG, ktoré sa zvyčajne generujú štiepením Cas6 (obrázok 3). 3' konce sa postupne skracujú a naznačujú 3' terminálnu exonukleolytickú degradáciu. Množstvo crRNA sa drasticky líši, s najvyšším množstvom pre spacer 2 CRISPR klastra 1 a spacer 1 CRISPR klastra 2. Táto akumulácia crRNA na 5' konci klastra CRISPR je v súlade s predchádzajúcimi pozorovaniami, že spacery v tesnej blízkosti do oblasti promótora v rámci vedúcej oblasti klastra CRISPR predstavujú najnovšie útoky [20]. Drasticky znížené množstvo niektorých spacerov môže byť dôsledkom zníženej stability crRNA alebo neefektívneho spracovania pre-crRNA. Okrem toho nedávna práca v Sulfolobus solfataricus identifikovali koreláciu medzi abundanciou a tendenciou skladať RNA [21]. Nízke množstvo crRNA 4 CRISPR klastra 1 obsahuje spacer, ktorý je podstatne dlhší ako všetky ostatné spacery v klastri, čo by mohlo predstavovať výzvy pre mašinériu dozrievania crRNA. V susedstve oboch CRISPR klastrov bola identifikovaná vedúca oblasť, ktorej sekvencia je identická pre 130 nukleotidov proti smeru prvého opakovania. Obidva klastre CRISPR teda majú identické promótory a transkripcia začína v oboch prípadoch na adenozínovom zvyšku 33 nukleotidov pred prvým opakovaním. Oblasť boxu A archaálnych promótorov je zvyčajne umiestnená v pevnej vzdialenosti od miesta začiatku transkripcie [22] a konsenzuálna 5'-TTTAAA-3' sekvencia bola skutočne identifikovaná - 27 nukleotidov proti smeru transkripcie od začiatku transkripcie. Identické promótorové a vedúce oblasti vysvetľujú porovnateľné miery produkcie crRNA z oboch klastrov CRISPR a naznačujú nedávnu duplikáciu. Systém CRISPR/Cas N. equitans patrí k nedávno definovaným systémom typu I s Cas3 (NEQ022) ako proteínom, ktorý katalyzuje degradáciu vírusovej DNA [23, 24]. Prítomné sú všetky univerzálne proteíny Cas1 (NEQ017), Cas2 (NEQ016) a Cas4 (NEQ021), o ktorých sa predpokladá, že sa podieľajú na integrácii spacerov. Nakoniec sa navrhuje NEQ018, Cas7 (NEQ019) a Cas5 (NEQ020), aby vytvorili kaskádový komplex, ktorý dodáva crRNA do cieľa DNA. Enzým Cas6 sa nedá ľahko identifikovať, čo by mohlo naznačovať jeho sekvenčnú divergenciu od známych enzýmov Cas6.

Identifikácia spracovania CRISPR RNA. (a) Čítania sekvenovania crRNA boli mapované na tieto dve N. equitans Zhluky CRISPR na určenie množstva jednotlivých crRNA. Spracovanie prebieha v rámci opakujúcich sa prvkov, pričom sa generujú crRNA s 5'-koncovým ATTGAAAG 8 nukleotidovým tagom (podčiarknuté) a postupným orezávaním 3'-koncového tagu. Šípky označujú aktívne body na orezanie. (b) Sekvenčné hodnoty pred prvým opakovaním v rámci identickej vedúcej sekvencie oboch polí CRISPR označujú miesto začiatku transkripcie (+1) a prvok potenciálneho promótora TATA boxu (rámček A).

Identifikácia sRNA C/D boxu a H/ACA boxu

N. equitans udržiava veľký arzenál enzýmov modifikujúcich RNA a počas anotácie genómu bolo opísaných 14 malých nukleárnych (sno) podobných RNA, ktoré slúžia ako vodiace RNA pre metyláciu rRNA [3]. Údaje ukázali, že tieto snoRNA (C/D box sRNA v archaea) sú v bunke veľmi bohaté (obrázok 1). Ďalej bolo možné identifikovať sekvencie pre 26 C/D box sRNA (obrázok 4). Všetkých 14 C/D box sRNA predpovedaných algoritmom snoscan [25] bolo overených a päť predpovedí klasifikovaných ako „sporné“ sa čiastočne prekrývalo s identifikovanými transkriptmi. Identifikovalo sa sedem ďalších C/D box sRNA, pre ktoré zlyhali výpočtové predpovede. Zarovnanie všetkých identifikovaných C/D box sRNA zvýrazňuje ich kompaktné a konzervované usporiadanie, ako aj charakteristické sekvenčné motívy boxu C/D a boxu C'/D' (obrázok 5). 5' a 3' konce týchto RNA nie sú spárované s bázami. Predpokladané ciele metylácie 2'O-ribózy boli predpovedané pomocou algoritmu PLEXY [26] (doplnkový súbor 2). V bunke sú prítomné proteíny fibrillarín (NEQ125) a NOP56 (NEQ342), ktoré sa spájajú s týmito C/D box sRNA a riadia metyláciu. Súbor archaálnych metyltransferáz zahŕňa enzým, ktorý sa nachádza iba v Thermococcales a N. equitans a používa S-adenosylmetionín ako kofaktor na katalýzu tvorby 5-metyluridínu v tRNA a rRNA [27]. Novo identifikovaná C/D box sRNA (sRNA2) sa prekrýva s génom pre túto metyltransferázu (NEQ053), čo môže naznačovať ich funkčnú asociáciu. Tri ďalšie gény C/D box sRNA sa prekrývajú s génmi pre domnelé rRNA metyltransferázy (sRNA5, sRNA11, sRNA17) a jeden gén (sRNA25) sa prekrýva s predpokladanou rRNA pseudouridínsyntázou.

Identifikácia a zarovnanie sRNA C/D boxu. Identifikovalo sa dvadsaťšesť C/D box sRNA, z ktorých každá bola pokrytá viac ako 3 000 mapovanými sekvenčnými čítaniami (doplnkový súbor 2). Všetky sRNA obsahujú konzervované prvky boxu C/D a boxu C'/D'. Permutovaná sRNA24 je podrobne uvedená na obrázku 7.

Predikcia štruktúry pre dicistronickú tRNA-C/D box sRNA a H/ACA box sRNA. (a) Najhojnejšia C/D box sRNA, sRNA8, sa nachádza bezprostredne za tRNA Val (TAC). Sekundárna štruktúra tRNA sa získala pomocou tRNA-Scan-SE [41] a možná sekundárna štruktúra C/D boxu sRNA8 sa vypočítala s mfoldom [40]. Sú označené prvky box C/D a box C'/D' a navrhované miesto štiepenia RNázy Z. (b) Možná sekundárna štruktúra (mnásobok [40]) pre jeden identifikovaný H/ACA box sRNA. Označené sú dva motívy ACA a dve identické vydutiny k-turn s potenciálnymi pármi GA-GA.

C/D box sRNAs26 obsahuje obrátené poradie konzervovaných boxov s boxom D pred boxom C. Toto pozorovanie by mohlo byť účinkom evolúcie kruhového boxu C/D, ktorý bol rozpoznaný napr. Pyrococcus furiosus [28].

V intergénovej oblasti medzi génmi NEQ389 (tyrozyl-tRNA syntetáza) a NEQ392 (hypotetický proteín) bola identifikovaná jediná 159 nukleotidová H/ACA boxová sRNA. H/ACA box sRNA riadi pseudouridyláciu rRNA cieľov. Identifikovaná kompaktná H/ACA boxová sRNA obsahuje dve predĺžené vlásenky, z ktorých každá obsahuje vydutie s vydutím kink-turn (k-turn) (obrázok 5). Podobné vydutiny sa našli v pseudouridínových vodiacich RNA v Pyrobakulum [29]. Správna doména H (ANANNA) nie je pozorovaná, pretože dve vlásenky sú oddelené iba sekvenciou ACA v pántovej oblasti (obrázok 5). Potenciálne pseudouridylačné ciele v rámci 16S rRNA a 23S rRNA boli určené algoritmom RNAsnoop [30] (doplnkový súbor 2). Zistilo sa, že stabilná RNA je kódovaná v 66 nukleotidovom intróne elongátorovej tRNA Met. Táto tRNA je jednou zo štyroch tRNA obsahujúcich intrón, ale ostatné tri intróny sú podstatne kratšie. RNA obsahuje prvky, ktoré naznačujú jej potenciálnu úlohu ako C/D box sRNA potenciálne usmerňujúcej metyláciu RNA (obrázok 6). Intróny tRNA sú zvyčajne dosť nestabilné produkty a predtým bolo známe, že iba druhy tRNA Trp obsahujú funkčnú C/D box sRNA v niekoľkých archaeách [31, 32]. The N. equitans tRNA Met intrón tiež obsahuje predpokladanú stabilnú vlásenku so šiestimi po sebe nasledujúcimi GC párovaním báz. Keďže rozdelené gény tRNA mohli byť výsledkom rozdelenia tRNA obsahujúcich intrón, takáto štruktúra by mohla naznačovať pôvod komplementárnych sekvencií bohatých na GC na hraniciach trans- zostrihané polovice tRNA.

Predikcia štruktúry tRNA Met intron. Predpokladaná sekundárna štruktúra stabilného a hojného intrónu tRNA Met naznačuje tvorbu boxu C/D sRNA. Sú označené konsenzuálny box D a motív boxu C s mutáciou T na G v polohe 30.

Mobilné C/D box sRNA

Zarovnanie úsekov DNA pred a za identifikovanými malými koncami RNA umožňuje analýzu potenciálnych promótorových a terminátorových prvkov. Predtým boli identifikované konzervované prvky nanoarchael tRNA a promótorov polovičného génu tRNA [9]. Promótory obsahujú jasne identifikovateľný motív boxu A (5'-TTTAAA-3') 26 nukleotidov proti smeru transkripcie od začiatku transkripcie a terminátor obsahuje úsek polypyrimidínov (T-úsek) po smere od génu tRNA. Obidva prvky sú opísané ako bežne používané v mechanizme archaálnej transkripcie RNA [22, 33] a možno ich nájsť aj pre sRNA boxu H/ACA. Transkripcia a spracovanie C/D box sRNA je rôznorodejšie. Niektoré sRNA C/D boxu (sRNA12, 13, 15, 16, 21) obsahujú svoj vlastný promótor a terminačné signály a transkripcia začína purínovým zvyškom. Väčšina C/D box sRNA však neobsahuje ľahko identifikovateľné promótory alebo začína pyrimidínovým zvyškom, čo naznačuje, že sa spracovávajú počas dozrievania. Je zaujímavé, že boli identifikované potenciálne dicistronické prekurzory tRNA-sRNA. Gén pre najhojnejší C/D box sRNA, sRNA8, leží bezprostredne za génom pre tRNA Val. Preto 3' spracovanie prekurzora sRNA8-tRNA Val pomocou RNázy Z (NEQ064) automaticky generuje 5' koniec sRNA C/D boxu (obrázok 5). Toto je podľa mojich najlepších vedomostí prvýkrát, čo bola táto spracovateľská aktivita pozorovaná u prokaryotov, pretože tRNA-snoRNA boli predtým považované za jedinečné pre rastliny [34]. Okrem toho sú dva izoakceptory tRNA Gly (tRNAGly (CCC), tRNAGly (TCC)) umiestnené vedľa C/D boxu sRNAs3 a sRNA14.

Väčšina sRNA C/D boxu sa prekrýva so sekvenciami mRNA (doplnkový súbor 2). Jednou z pozoruhodných vlastností je výskyt génov C/D box sRNA na hraniciach rozdelených génov. Nachádzajú sa v susedstve NEQ156 (RNA polymeráza podjednotka B, karboxy-terminálna časť), NEQ096/NEQ097 (hypotetický proteín, karboxy-terminálna časť), NEQ124 (archeozín tRNA-guanín transglykozyláza, amino-terminálna časť) a NEQ434 (reverzná reverzná časť amino-koncová časť) (obrázok 7a). NEQ157, gén umiestnený v polohe, kde by sa očakávala amino-koncová časť RNA polymerázovej podjednotky B pre kontinuálny gén, je ohraničený dvoma génmi C/D box sRNA. Okrem toho je amino-koncová časť reverznej gyrázy tiež ohraničená dvoma C/D box sRNA. V eukaryotoch sú snoRNA rozpoznané ako mobilné genetické prvky [35], ktoré sa často spájajú s intrónmi. V archaea a potenciálne v N. equitanssRNA C/D boxu sa môže nachádzať v intrónoch tRNA [36]. Budúci výskum bude musieť určiť základ pre mobilitu C/D boxu sRNA v Archaea. Pozorovanie, že jedna z dvoch C/D box sRNA, ktoré lemujú polovičný gén reverznej gyrázy, je permutovaná (obrázok 7a), naznačuje kruhovú medziľahlú štruktúru. Na vyhľadávanie kruhových C/D box sRNA sa použil inverzný prístup RT-PCR. C/D box sRNA23 aj permutovaný C/D box sRNA24 boli detegované ako kruhové molekuly v bunke (obrázok 7b). Iba kruhové usporiadanie permutovaného C/D boxu sRNA24 umožňuje správne, zachované poradie prvkov C a D boxu, a preto môže zaručiť funkčnosť. Tento jav je potrebné zvážiť pri automatizovaných postupoch anotácie genómu sRNA C/D boxu. Preskupenia genómu, ktoré vytvárajú permutované C/D box sRNA, môžu byť detegovateľné len pre nedávne fragmentačné udalosti, pretože neaktívne gény C/D box sRNA rýchlo akumulujú mutácie. Celkovo tieto pozorovania silne naznačujú zapojenie sekvencií C/D box sRNA do štiepenia génov kódujúcich tRNA a proteín vo fragmentovanom genóme N. equitans.

C/D box sRNA lemujú rozdelený gén reverznej gyrázy. (a) Gén pre amino-koncovú časť štiepenej reverznej gyrázy (NEQ434, čierna) je ohraničený dvoma boxovými C/D sRNA. Prvky rámčeka C a rámčeka D (v rámčeku) sú označené na zvýraznenie permutácie sRNA24. (b) Sekvenovanie inverzných RT-PCR amplifikátov s naznačenými (podčiarknutými) von smerujúcimi primérmi odhalilo kruhové C/D sRNA23 a 24. Detegované miesta cirkularizácie naznačujú, že kruhové C/D sRNA sú o niečo väčšie ako priemerná dĺžka lineárnych molekúl amplifikovaných Metodológia RNA-Seq.


Štrukturálny základ pre orezávanie RNA pomocou RNázy T v stabilnom dozrievaní 3'-konca RNA

Zrenie RNA sa spolieha na rôzne exonukleázy, ktoré postupne odstraňujú nukleotidy z 5' alebo 3' konca nukleových kyselín. O molekulárnom základe pre preferenciu substrátu a štiepenia exonukleáz je však známe len málo. Naše biochemické a štrukturálne analýzy komplexov RNázy T–DNA ukazujú, že dimér RNázy T má ideálnu architektúru na viazanie duplexu s krátkym 3′ presahom, aby sa vytvoril produkt štiepenia duplexu s 2-nukleotidom (nt) alebo 1- nt 3′ previs, v závislosti od zloženia posledného páru báz v duplexe. 'C-filter' v RNáze T skrínuje nukleové kyseliny s 3'-terminálnymi cytozínmi na hydrolýzu indukciou rušivej konformačnej zmeny na aktívnom mieste. Naše výsledky odhaľujú všeobecné princípy a pracovný mechanizmus pre posledný krok orezania uskutočnený RNázou T pri dozrievaní stabilnej RNA a pripravujú cestu pre pochopenie iných exonukleáz z rodiny DEDD.


DISKUSIA

Výsledky tejto štúdie poskytujú dôležité informácie o E. coli Katalýza a funkcia RNázy BN/RNázy Z. Ukázali sme, že (a) RNáza BN dokáže spracovať 3′ konce pre-tRNA bez CCA aj s obsahom CCA (b) na rozdiel od návrhu Takakua a Nashimota (20), RNáza BN normálne neodstraňuje sekvenciu CCA z prekurzorových alebo zrelých tRNA (c) RNáza BN môže pôsobiť buď ako exoribonukleáza alebo endoribonukleáza na prekurzoroch tRNA a (d) spôsob účinku RNázy BN závisí od prítomného kovového iónu. Táto kombinácia katalytických vlastností odlišuje RNázu BN od iných enzýmov RNázy Z a opäť vyvoláva otázku, aká by mohla byť jej funkcia E. coli. Napriek jeho schopnosti pôsobiť na prekurzory tRNA, neexistuje žiadny dôkaz, že to robí in vivo okrem prípadov, keď chýbajú všetky ostatné enzýmy spracúvajúce 3′, alebo počas infekcie bakteriofágom T4, keď je potrebná na dozrievanie tRNA T4 (22). V skutočnosti bunky bez RNázy BN nevykazujú žiadny rozlíšiteľný fenotyp (16).

Schopnosť RNázy BN spracovať tRNA bez CCA aj s obsahom CCA spája v tomto enzýme katalytické vlastnosti väčšiny enzýmov RNázy Z, ktoré sa štiepia po diskriminačnom nukleotide (11, 14), s vlastnosťami RNázy Z z Thermotoga maritima, ktorá sa štiepi hneď za sekvenciou CCA (6). To vyvoláva otázku, prečo sa naše výsledky líšia od výsledkov Takaku a Nashimota (20). Títo pracovníci to navrhli E. coli RNáza Z štiepila zrelé tRNA aj prekurzory tRNA, aby sa odstránila 3′-koncová sekvencia CCA. Okrem skutočnosti, že takáto reakcia by sa zdala byť nehospodárna a vyžadovala by pokračujúce opätovné pridávanie sekvencie CCA, predtým sme s modelovými substrátmi RNA ukázali, že pôsobenie RNázy BN je inhibované sekvenciou CCA s výnimkou menšieho orezania koncového zvyšku AMP. (21). Je tiež známe, že konečný obrat tRNA in vivo je dôsledkom pôsobenia RNázy T, nie RNázy BN (27). Jednou z možností, ktorá by mohla vysvetliť rozdiel vo výsledkoch, je, že Takaku a Nashimoto uskutočnili všetky svoje štúdie pri 50 ଌ s oveľa vyšším pomerom enzýmu k substrátu (20). Možno by pri tejto zvýšenej teplote bola štruktúra tRNA aspoň čiastočne narušená, čo by zmenilo špecifickosť RNázy BN pre jej substráty. Keď sme však testovali aktivitu RNázy BN na tRNA Phe a tRNA Cys za podmienok použitých v Ref. 20, stále sme neboli schopní pozorovať odstránenie sekvencie CCA. 3 Preto bude potrebná ďalšia práca na zosúladenie rozdielov v údajoch medzi týmito dvoma laboratóriami.

V predchádzajúcej práci s použitím modelových RNA substrátov sme ukázali, že RNáza BN mala exoribonukleázové aj endoribonukleázové aktivity (21). Tu prezentované štúdie rozširujú tieto pozorovania aj na prekurzory tRNA. Pri substrátoch bez CCA bol spôsob štiepenia takmer výlučne endonukleolytický, čo viedlo k štiepeniu po diskriminátorovom nukleotide, avšak s prekurzormi tRNA obsahujúcimi CCA bol možný ktorýkoľvek spôsob účinku a závisel primárne od prítomného kovového iónu. V prítomnosti Co2+ vykazovala RNáza BN zvýšenú aktivitu a fungovala prevažne ako exoribonukleáza na odstránenie extra 3′-zvyškov z prekurzorov tRNA. V prítomnosti Mg2+ bol jeho primárnym mechanizmom účinku endoribonukleáza, ktorá štiepi sekvenciu CCA. Úloha kovového iónu v aktivite a špecifickosti RNázy BN je veľmi zaujímavá pre budúce štrukturálne a funkčné štúdie.

Ako bolo uvedené, účinok RNázy BN sa tiež dramaticky menil so substrátom pre-tRNA. tRNA bez CCA sa teda štiepili endonukleolyticky po zvyšku diskriminátora, zatiaľ čo pri molekulách obsahujúcich CCA sa zvyšky po sekvencii CCA mohli odstrániť buď exonukleolyticky alebo endonukleolyticky. Zostáva preskúmať, ako enzým rozlišuje dva typy substrátov a aké štrukturálne vlastnosti tRNA určujú túto špecifickosť. Malo by sa tiež poznamenať, že niekoľko testovaných pre-tRNA bolo slabými substrátmi pre RNázu BN. Tieto zahŕňali tRNA Cys, ktorá bola aktívna s Co2+, ale bola v podstate neaktívna v prítomnosti Mg2+ (obr. 5 D). Pre-tRNA LeuZ a pre-tRNA AlaU boli tiež slabo ovplyvnené RNázou BN dokonca aj v prítomnosti Co2+. 3 Neschopnosť RNázy BN efektívne fungovať na všetkých pre-tRNA pravdepodobne vysvetľuje, prečo bunky rastú veľmi pomaly v neprítomnosti všetkých ostatných enzýmov na spracovanie 3′-tRNA prítomných v E. coli (12).

Tu prezentované výsledky značne dopĺňajú naše znalosti o špecificite RNázy BN a pomáhajú vysvetliť, čo je o nej v súčasnosti známe in vivo pôsobenie na prekurzory tRNA. Je však zrejmé, že o tejto zaujímavej RNáze je stále veľa čo sa dozvedieť, pokiaľ ide o jej mechanizmus a jej primárnu zložku in vivo funkciu.


Beckmann, J.S., Johnson, P.F. & Abelson, J. Veda 196, 205 (1977).

Birkenmeier, E. H., Brown, D. D. & Jordan, E. Bunka 15, 1077 (1978).

Schmidt, O., Mao, J., Silverman, S., Hovemann, B. & Söll, D. Proc. natn. Akad. Sci. USA. 75, 4819 (1978).

Yen, P.H. a kol. Bunka 11, 763 (1977).

Hovemann, B., Sharp, S., Yamada, H. & Söll, D. Bunka 19, 889 (1980).

Tener, G.M. a kol. v Transfer RNA: Biologické aspekty (eds. Söll, D., Abelson, J. & Schimmel, P.) 295 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980).

Müller, F. & Clarkson, S.G. Bunka 19, 345 (1980).

Cortese, R., Melton, D., Tranquilla, T. & Smith, J. D. Nucleic Acids Res. 5, 4593 (1978).

Garber, R.L. & Gage, L.P. Bunka 18, 817 (1979).

Hagenbüchle, O., Larson, D., Hall, G. & Sprague, K. Bunka 18, 1217 (1979).

Bernhardt, D. & Darnell, J. E. J. molec. Biol. 42, 43 (1969).

Feldmann, H. Nucleic Acids Res. 4, 2831 (1977).

De Robertis, E. M. & Olson, M. V. Príroda 278, 137 (1979).

Ogden, R.C. a kol. Bunka 17, 399 (1979).

Telford, J.L. a kol. Proc. natn. Akad. Sci. 76, 2590 (1979).

Beckmann, J.S. a kol. v Nezmyselné mutácie a supresory tRNA (eds. Celis, J. E. & Smith, J. D.) 207 (Academic, New York, 1979).

Keith, G. & Dirheimer, G. Biochem. biofýza. Res. komun. 92, 116 (1980).

Gangloff, J., Keith, G., Ebel, J. P. & Dirheimer, G. Biochim. biofýza. Acta 259, 210 (1972).

Silverman, S., Schmidt, O., Söll, D. & Hovemann, B. J. biol. Chem. 254, 10290 (1979).

Mao, J., Schmidt, O. & Söll, D. Bunka 20, 589 (1980).

Brownlee, G. G. in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (eds Work, T. S. & Work, E.) 67 (Elsevier, New York, 1972).

Melton, D. A., De Robertis, E. M. & Cortese, R. Príroda 284, 143 (1980).


The four rRNAs in eukaryotes are first transcribed as two long precursor molecules. One contains just the pre-rRNA that will be processed into the 5S rRNA the other spans the 28S, 5.8S, and 18S rRNAs. Enzymes then cleave the precursors into subunits corresponding to each rRNA. In bacteria, there are only three rRNAs and all are transcribed in one long precursor molecule that is cleaved into the individual rRNAs. Some of the bases of pre-rRNAs are methylated for added stability. Mature rRNAs make up 50-60% of each ribosome. Some of a ribosome&rsquos RNA molecules are purely structural, whereas others have catalytic or binding activities.

The eukaryotic ribosome is composed of two subunits: a large subunit (60S) and a small subunit (40S). The 60S subunit is composed of the 28S rRNA, 5.8S rRNA, 5S rRNA, and 50 proteins. The 40S subunit is composed of the 18S rRNA and 33 proteins. The bacterial ribosome is composed of two similar subunits, with slightly different components. The bacterial large subunit is called the 50S subunit and is composed of the 23S rRNA, 5S rRNA, and 31 proteins, while the bacterial small subunit is called the 30S subunit and is composed of the 16S rRNA and 21 proteins.

The two subunits join to constitute a functioning ribosome that is capable of creating proteins.


Arc1p: an adapter between the tRNA transport and mRNA translation machinery?

Yet another tRNA-binding protein, known as Arc1p, was identified through its genetic interactions with Los1p. Arc1p is found in a complex with two aminoacyl-tRNA synthetases in S. cerevisiae, MetRS and GluRS, where it is required for the efficient aminoacylation of tRNA by these enzymes (Simos et al. 1996a, 1998). Although cells lacking Arc1p grow slowly, cells lacking both Arc1p and Los1p are inviable. Experiments in which Arc1p was localized within cells using indirect immunofluorescence have revealed that while Arc1p is cytoplasmic, the protein appears to be concentrated at the nuclear periphery (Simos et al. 1996a). This finding, together with the observed synthetic lethality with Los1p, have been incorporated into a model in which tRNA is delivered by Los1p to Arc1p which transfers it to the synthetases (Simos et al. 1996a, 1998).

How might this model be reconciled with the observation that, inXenopus oocytes, aminoacylation occurs inside the nucleus and facilitates efficient tRNA export? One possibility is that, in both yeast and higher eukaryotes, aminoacylation takes place at the nuclear pore. This scenario would be consistent with the observed concentration of Arc1p at the nuclear periphery in S. cerevisiae (Simos et al. 1996a). Alternatively, aminoacylation in the nucleoplasm may be confined to higher species. In organisms from Drosophila to humans, nine aminoacyl-tRNA synthetases associate with three other polypeptides to form a multienzyme complex (Filonenko and Deutscher 1994 Kerjan et al. 1994). One of the three nonsynthetase polypeptides, p43, was recently cloned and found to share a domain with Arc1p, suggesting that it may be the mammalian homolog (Quevillon et al. 1997). Interestingly, p43, unlike the rest of the mammalian multisynthetase complex, is largely nuclear (Popenko et al. 1994). Thus, p43/Arc1p may exist in higher eukaryotes both as a free nuclear protein as well as a component of the multisynthetase complex. It is thus possible that, at least in higher eukaryotes, the nuclear fraction of p43/Arc1p facilitates aminoacylation by nuclear tRNA synthetases.

Interestingly, although S. cerevisiae cells lackingARC1 grow slowly, these cells become inviable in the presence of mutations in either LOS1, which encodes the tRNA export receptor, or NSP1, which encodes a nuclear pore protein (Simos et al. 1996a 1998). One intriguing possibility is that, in both yeast and mammalian cells, binding by nuclear p43/Arc1p allows certain tRNAs to exit the nucleus through a protein export pathway that recognizes and transports p43/Arc1p to the cytoplasm. The existence of these sorts of redundant mechanisms for tRNA nuclear transport would explain the puzzling result that Los1p is encoded by a dispensable gene. Although Arc1p is predominantly cytoplasmic inS. cerevisiae (Simos et al. 1996a), it is possible that the protein shuttles between the nucleus and the cytoplasm to facilitate export.


Perspectives: does tRNA channeling begin at birth?

Experiments performed in permeabilized mammalian cells have led to the proposal that during repeated cycles of protein synthesis, aminoacyl tRNA molecules are directly transferred, or ‘channeled,’ from the synthetases to the elongation factor EF-1 to the ribosome, and then are transferred back to the aminoacyl synthetases without dissociating into the surrounding medium (Stapulionis and Deutscher 1995). The discovery that certain tRNA binding proteins, such as Los1p and p43/Arc1p, exhibit numerous biochemical and genetic interactions with other components of the tRNA modification, transport, aminoacylation, and protein synthesis pathways suggest that tRNAs are also channeled from one component to the next during the various steps in their complicated biogenesis. For example, Los1p physically interacts with Gcd11p, the γ subunit of initiation factor eIF-2, in a two-hybrid assay (Hellmuth et al. 1998). One interpretation of this result might be that Los1p, upon entering the cytoplasm, directly hands tRNA to eIF-2 to facilitate efficient initiation of translation. Similarly, binding of certain tRNAs by p43/Arc1p, whether it occurred in the nucleus or cytoplasm, could serve to deliver these tRNAs directly to aminoacyl synthetases (Quevillon et al. 1997 Simos et al. 1998).

If the channeling model of protein synthesis can be extended to include tRNA export from the nucleus, what about the earliest steps in tRNA biogenesis? To begin to answer this question, more information is clearly needed about these very early steps. For example, where in the nucleus are the different tRNA genes transcribed? Is binding by the La protein required for nucleolar targeting or retention of the nascent pre-tRNAs? If end maturation occurs in the nucleolus, how are the end-matured but intron-containing tRNAs transported to the nuclear periphery for splicing? It is our expectation that further biochemical, genetic, and cell biological analyses of the tRNA biogenesis pathway will continue to yield important insights, not only into the basic mechanisms of tRNA maturation and processing, but also into subcellular organization and RNA transport.



Komentáre:

  1. Malami

    Ospravedlňujem sa, ale podľa mňa sa mýliš. Napíšte mi do PM.

  2. Shaktigis

    A že by sme sa urobili bez vášho pozoruhodného nápadu

  3. Rushe

    From time immemorial, David drove his bulls with a whip…. So why am I sobsno - it's time to end the conversation on this topic, don't you think, gentlemen? :))

  4. Holcomb

    nice photo asshopped

  5. Vilabar

    I missed something?



Napíšte správu