Informácie

Aký význam má spustenie nerozrezaného plazmidu na elektroforéznom géli?

Aký význam má spustenie nerozrezaného plazmidu na elektroforéznom géli?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aký význam má spustenie nerozrezaného plazmidu na elektroforéznom géli?

V tomto prípade hovoríme o vložení génu do plazmidu, ktorý potom prechádza PCR a následne elektroforézou.


Používa sa na určenie, či nepoužité/nadbytočné množstvo plazmidu kontaminovalo konečný roztok požadovanej rekombinantnej DNA alebo nie. Elektroforéza sa vykonáva na "prázdnom" (neprerezanom) plazmide, aby sa definovali jeho pásy. Ak výsledok elektroforézy obsahuje pásy "prázdnej" aj rekombinantnej DNA, ukazuje, že váš roztok nie je 100% čistý.


Účely nerozrezanej plazmidovej DNA - (28. júl 2007)

ahoj minulý týždeň som po extrakcii plazmidu urobil gélovú elektroforézu, jeden starší študent nám vysvetlil dôležitosť nerozrezanej plazmidovej DNA. ale stále nechápem účel týchto supercoiled, nicked a lineárneho plazmidu dna. dosť mätúce. Bol by som veľmi rád, keby mi niekto pomohol vyriešiť moje problémy. Som biotechnologický druhák, ale stále som veľmi tvrdohlavý pri diskusii o výsledkoch môjho experimentu

Som rovnako zmätený ako ty. Pre väčšinu klonovacích účelov nie je plazmidová DNA vo svojej nerozrezanej forme veľmi informatívna. Nemôžete povedať ani veľkosť plazmidu. Lineárna DNA (v rebríku) prebieha odlišne od superzvinutej DNA (v ktorej bude plazmid)

Možno váš starší vysvetľoval rôzne formy plazmidov v kontexte kontroly kvality. Ak je to tak, premýšľajte o tom takto. Iba úplne intaktný plazmid, ako je to v nadzávitnicovom plazmide, je pre vás užitočný. Poškodená a zlomená plazmidová DNA je málo použiteľná, nereplikuje sa presne, väčšinou je nepoužiteľná pre PCR a nepoužiteľná pre ďalšiu ligačnú prácu. Takže spustením surového plazmidu môžete zistiť, či bola vaša príprava DNA vykonaná úspešne.

Na druhej strane, takmer všetky moderné klonovacie kmene e coli boli skonštruované tak, že produkcia natívnych endonukleáz a rekombináz bola väčšinou eliminovaná. Preto už nie je také dôležité alebo ťažké vykonať dobrú prípravu DNA.

tat dáva zmysel, ja sa zúčastním tat hovorí abt `poškodený plazmid DNA a problémy s replikáciou` vďaka 4 odpoveď

Môj starý PI navrhoval spustenie nestrávenej DNA po klonovaní, aby som mal predstavu, či ligácia funguje alebo nie. Ale inzert musí mať viac ako 10% veľkosti pôvodného plazmidu, myslím. Týmto spôsobom môžete ušetriť niektoré enzýmy a nemusíte robiť veľa minipreparácií. Ale môže to byť časovo náročné.


Nestrihaná plazmidová DNA - (26. novembra 2006)

Ak sa nerozrezaná plazmidová DNA separuje pomocou elektroforézy na agarózovom géli, je viditeľný len 1 pás superzvinutej DNA alebo 3 pásy viditeľné v otvorenom kruhu, lineárne a superšpirálové?

Ak sa nerozrezaná plazmidová DNA separuje pomocou elektroforézy na agarózovom géli, je viditeľný len 1 pás superzvinutej DNA alebo 3 pásy viditeľné v otvorenom kruhu, lineárne a superšpirálové?

Najvyšší - vrúbkovaný alebo uvoľnený kruhový plazmid
Stredná - lineárna
Najnižšia - supercoiled

Potom môžete získať všetky tie ďalšie kombinácie dimérov a sú vyššie ako vrúbkovaný alebo uvoľnený cirkulárny plazmidový pás.

Najvyšší - vrúbkovaný alebo uvoľnený kruhový plazmid
Stredná - lineárna
Najnižšia - supercoiled

Potom môžete získať všetky tie ďalšie kombinácie dimérov a sú vyššie ako vrúbkovaný alebo uvoľnený cirkulárny plazmidový pás.

Dve z mojich miniprep DNA. Vľavo je DOBRÝ, v ktorom máte veľkú supercoiled DNA a napravo je zlý miniprípravok so všetkými druhmi DNA spomenutými vo vyššie uvedenom citáte!

ok. môžem sa spýtať qn: prečo možno nájsť 3 formy, hoci plazmid sa považuje za „neprerezaný“"!!!

Pretože lásky nebolo dosť. takže DNA ťa nemiluje.

V zásade operátorovi trvalo príliš dlho, kým dokončil extrakciu DNA a následnú deproteináciu a/alebo s DNA zaobchádzal príliš tvrdo, čo viedlo k veľkému rozbitiu plazmidu.

Príliš veľa vortexovania a/alebo trvalo príliš veľa času na odstránenie všetkých nukleáz.


Tipy a triky na obmedzovanie:

Nasledujúce tipy vám uľahčia získanie užitočného a informatívneho diagnostického súhrnu obmedzení.

Pre váš prehľad:

  • Skúste si vybrať jedinečné enzýmy. Enzýmy, ktoré sa režú len raz, vám umožňujú jednoduchšie a presnejšie vizualizovať plnú veľkosť vašej konštrukcie.

Pre váš gél:

  • Pred naliatím do gélu pridajte etídium bromid (EtBr). EtBr sa viaže na DNA a umožňuje vám vizualizovať DNA pod ultrafialovým (UV) svetlom.

Dúfam, že tieto tipy demonštrujú, že overenie plazmidov nie je len nevyhnutné, ale aj jednoduchý proces. Navštívte zdroj Addgene na overenie plazmidov, kde nájdete ďalšie tipy a podrobné protokoly o témach, ako je nastavenie trávenia a naliatie/spustenie gélu DNA.


Aby sme vizualizovali výsledky experimentu, vykonáme na našich natrávených vzorkách agarózovú elektroforézu. Preskúmanie gélu nám môže umožniť odhaliť neúspešné štiepenie plazmidov, pretože rozdiely vo fyzickom tvare rozrezaných a nerozrezaných plazmidov spôsobujú, že migrujú rôznou rýchlosťou cez gél, aj keď majú rovnakú dĺžku. Nestrihané plazmidy môžu byť v dvoch formách: uvoľnené a supercoiled (alebo superhelikálny). Tieto dve formy možno pochopiť porovnaním s gumičkou. Normálna gumička je ako uvoľnená forma. Ak uchopíte jednu stranu prúžku medzi palec a ukazovák a zrolujete túto stranu, prúžok sa skrúti do kompaktnej formy podobnej ako superzvinutý plazmid. Ak pás prestrihnete nožnicami, už nezostane skrútený.

Pri gélovej elektroforéze DNA normálne považujeme rýchlosť migrácie kúska DNA za závislú predovšetkým od jej veľkosti (na rozdiel od proteínov, ktoré majú rýchlosť migrácie, ktorá môže byť tiež významne ovplyvnená pH gélu). To však neplatí pre nelineárne fragmenty DNA, pretože ich tvar má dôležitý vplyv na rýchlosť ich migrácie. Kvôli svojej kompaktnej veľkosti sa superšpirálové plazmidy môžu pohybovať cez gél oveľa rýchlejšie ako lineárny fragment DNA s rovnakým počtom párov báz. Podobne, nerozrezané uvoľnené plazmidy sa zvyčajne pohybujú inou rýchlosťou ako rozrezaný fragment rovnakej hmotnosti.

Obr. 5. Gélové pásy rozrezaných (vľavo) a nerozrezaných (vpravo) plazmidov. Všetky majú rovnakú hmotnosť v pároch báz, ale sú v rôznych polohách, pretože ich odlišný tvar spôsobuje, že sa pohybujú cez gél rôznymi rýchlosťami.

Na obr. 5 pruh vľavo obsahuje plazmid, ktorý bol na jednom mieste štiepený reštrikčným enzýmom. Dráha napravo obsahuje rovnaký plazmid nestrávený. Dráha s natrávenou vzorkou má jeden pás, zatiaľ čo dráha s neštiepenou vzorkou má tri pásy. Ak by sa spodný pás pohyboval najrýchlejšie, pretože bol menším fragmentom ako ostatné, potom by sme očakávali, že by bol oveľa slabší ako ostatné, pretože vo všeobecnosti je menšími fragmentmi interkolované menej fluorescenčného farbiva. Avšak v tomto prípade je spodný pás oveľa jasnejší ako ostatné pásy, buď preto, že superšpirálový tvar drží farbivo lepšie, alebo preto, že vyšší podiel molekúl v tomto páse bol v superšpirálovej forme ako v iných formách. Slabý pás je sotva viditeľný v pravom pruhu v rovnakej výške ako pruh v pruhu s natráveným plazmidom. Pravdepodobne ide o molekuly lineárnych plazmidov, ktoré boli rozbité mechanicky (do tejto vzorky nebol pridaný žiadny enzým) - slabý pásik naznačuje, že týchto molekúl je relatívne málo. Elimináciou môžeme odvodiť, že horný pás je nerozrezaný plazmid v uvoľnenej forme. Niektoré aspekty jeho tvaru spôsobujú, že sa pohybuje pomalšie ako lineárne molekuly. Vzhľadom na to, že všetky tri pásy v pravom pruhu obsahujú kúsky DNA s rovnakým počtom párov báz, je zrejmé, že tvar molekuly má dôležitý vplyv na rýchlosť jej migrácie.


Ako interpretovať výsledky gélovej elektroforézy

  1. Ak je to možné, vložte do agarózového gélu vedľa seba nestrávené, linearizované a UV vyžarované plazmidy, potom môžete porovnať pásy medzi týmito vzorkami.
  2. Vo všeobecnosti sa monomérne superšpirálové formy CCC pohybujú rýchlejšie ako akékoľvek iné formy, pretože majú kompaktnú superzávitnicovú štruktúru DNA. Preto sa v géli objavia nižšie.
  3. Otvorené kruhové (OC) a lineárne monoméry sa pohybujú pomalšie ako nadskrutkový monomér CCC. Majú väčší problém s prechodom cez póry v gélovej matrici ako forma CCC. Preto sa OC formy objavia vyššie v géli. Poradie migrácie je zvyčajne monomérna forma CCC (najrýchlejšia), po ktorej nasleduje lineárna forma a forma OC.
  4. Úplne rozštiepená plazmidová DNA zvyčajne vykazuje iba jeden pás, lineárnu formu plazmidu, vo svojej dráhe s očakávanou veľkosťou. Neštiepený plazmid môže mať vo svojej dráhe dve formy: dimér CCC a monomér CCC. Dimérne formy sa v dôsledku ich väčšej a dvojnásobnej veľkosti v porovnaní s monomérmi zvyčajne pohybujú pomalšie ako monoméry. Preto sa v géli bude javiť vyššie ako monomér. Monomérna forma CCC prebieha rýchlejšie ako lineárna forma štiepenej plazmidovej DNA.

Príklady gélovej elektroforézy pre plazmidové formy. Dráha 1: DNA rebrík. Dráha 2: Neštiepený plazmid A. Dráha 3: Úplne naštiepený plazmid A. Dráha 4: Plazmidová DNA ožiarená UV.

Teraz, ako prax, môžete uhádnuť každú plazmidovú formu z týchto pásov z agarózového gélu nižšie?

Gélová elektroforéza. Dráha 1: DNA rebrík. Dráha 2: Neštiepený plazmid A. Dráha 3: Úplne natrávený plazmid A.

Pre Lane 2 môžete vidieť dve pásma. Slabý pás navrchu je OC a ten nižšie je vo forme CCC. Pre dráhu 3 je to úplne strávený plazmid, takže pás má lineárnu formu.

Ako identifikujete svoje pásy z vašich agarózových gélov?

Počas gélovej elektroforézy možno budete musieť vložiť do jamiek nerozrezanú plazmidovú DNA, štiepený fragment DNA, produkt PCR a pravdepodobne genómovú DNA, ktorú používate ako templát PCR. Váš natrávený fragment DNA je natrávený produkt PCR. Ďalším krokom je identifikovať tieto pásy, aby ste zistili, ktorý z nich odstrihnúť.

Gélová elektroforéza. Dráha 1: DNA rebrík. Dráha 2: Neštiepený plazmid A. Dráha 3: Úplne natrávený plazmid A. Dráha 4: Digesovaný produkt PCR (alebo fragment DNA). Dráha 5: Produkt PCR (so slabým pásom diméru primeru). Dráha 6: Genomická DNA. Biele šípky označujú pásy, ktoré chcete odstrániť.

Tipy na identifikáciu správneho pásu na odstránenie z gélu

  • Nerozrezaná plazmidová DNA na agarózovom géli sa dá ľahko identifikovať, pretože môže mať dve formy plazmidu (formy OC a CCC).
  • Natrávený plazmid, naštiepený fragment DNA, produkt PCR a genómová DNA môžu mať všetky jeden pás. Ak chcete identifikovať tieto pásy, budete musieť skontrolovať ich veľkosť v rebríčku DNA. Váš natrávený plazmid má lineárnu formu s veľkosťou medzi formami OC a CCC neštiepeného plazmidu. Genomická DNA má veľkú veľkosť. Takže genómová DNA sa zvyčajne zobrazuje na samom vrchu vášho gélu (veľmi blízko vašej studne).
  • Natrávený fragment DNA môže mať jeden pás takmer podobnej veľkosti ako váš produkt PCR. Toto je vaša cieľová veľkosť a pás v tomto natrávenom fragmente DNA je ten, ktorý chcete vyrezať.
  • V spodnej časti dráhy produktu PCR môžete vidieť slabý pás označujúci malé molekuly. Tieto malé molekuly sú vaše primérové ​​molekuly, ktoré sa spájajú s inými primérovými molekulami a vytvárajú primérový dimér. Veľkosť týchto malých molekúl nie je vašou cieľovou veľkosťou, takže toto pásmo nechcete odstrániť.

Ak sa chcete dozvedieť viac o tom, ako interpretovať DNA gélovú elektroforézu, pozrite si naše video nižšie:


Agarózová gélová elektroforéza plazmidovej DNA - Agarózová gélová elektroforéza plazmidovej DNA (Mar/06/2005)

Mám pBSK+ fagemid s veľkosťou 2958 bp. V tomto fagemide som klonoval gén s veľkosťou 1167 bp. Teraz podrobujem elektroforéze agarózového gélu nasledovné:
(1) Nestrihané, natívne pBSK+, bez vložky.
(2) Nestrihané, pBSK, s mojou klonovanou vložkou.
Sú to teda v podstate uzavreté kruhové DNA.
Aké by boli veľkosti pásma, oproti ktorým by som pozoroval vyššie uvedené 2 vzorky?
Prosím pomôžte. Toto je študentský projekt.
---Thivaharan([email protected])

Tieto vzorky by ste mohli porovnať s inými uzavretými kruhovými plazmidmi, aby ste porovnali veľkosti, ale pravdepodobne by bolo lepšie najskôr linearizovať plazmid. Uzavretý kruhový plazmid poskytne množstvo pásov v závislosti od stupňa supercoilingu. Čo by som urobil, by bolo rozrezať oba plazmidy reštrikčnými enzýmami, ktoré ste použili na klonovanie, aby ste mohli vidieť, že fragment, ktorý ste naklonovali, má správnu veľkosť.


Alkalická lýza:

Alkalická lýza je metóda používaná v molekulárnej biológii na izoláciu plazmidovej DNA alebo iných bunkových zložiek, ako sú proteíny, rozbitím buniek. Baktérie obsahujúce požadovaný plazmid sa najskôr pestujú a potom sa nechajú lýzovať alkalickým lyzačným pufrom pozostávajúcim z detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS) a silnej zásady hydroxidu sodného. Detergent štiepi fosfolipidovú dvojvrstvu membrány a zásada denaturuje proteíny, ktoré sa podieľajú na udržiavaní štruktúry bunkovej membrány. Prostredníctvom série krokov zahŕňajúcich miešanie, precipitáciu, centrifugáciu a odstránenie supernatantu sa odstránia bunkové zvyšky a plazmid sa izoluje a purifikuje.


Široké kroky zahrnuté v bežnom protokole DNA gélovej elektroforézy:

1. Príprava vzoriek na spustenie

2. Pripraví sa roztok agarózového TAE gélu

TAE pufor poskytuje zdroj iónov na nastavenie elektrického poľa počas elektroforézy. Na prípravu roztoku sa použije pomer hmotnosti k objemu agarózy v pufri TAE. Napríklad, ak je potrebný 1% agarózový gél, 1 g agarózy sa pridá do 100 ml TAE. Percento použitej agarózy je určené tým, aká veľká alebo malá sa očakáva, že bude DNA. Ak sa pozrieme na oddelenie skupiny pásov DNA menšej veľkosti (< 500 bp), pripraví sa agarózový gél s vyšším percentom (> 1 %). Vyššie percento agarózy vytvára hustejšie sito na zvýšenie separácie malých rozdielov v dĺžke DNA. Roztok agarózy-TAE sa zahrieva, aby sa agaróza rozpustila.

3. Naliatie gélu

Agarózový roztok TAE je nalial do odlievacej misky že keď sa gélový roztok ochladí a stuhne, vytvorí sa gélová doska s radom jamiek navrchu.

4. Nastavenie elektroforetickej komory

Tuhý gél sa umiestni do komory naplnenej TAE pufor. Gél je umiestnený tak, aby jamky komory boli najbližšie k zápornej elektróde komory.

5. Naplnenie gélu

The gélové komorové jamky sa naložia so vzorkami DNA a zvyčajne sa načíta aj rebrík DNA ako referencia pre veľkosti.

6. Elektroforéza

Záporné a kladné vodiče sú pripojené ku komore a napájaciemu zdroju, kde je nastavené napätie. Zapnutím napájania sa nastaví elektrické pole a negatívne nabité vzorky DNA začnú migrovať cez gél a preč od negatívnej elektródy k pozitívnej.

7. Zastavenie elektroforézy a vizualizácia DNA

Akonáhle modré farbivo vo vzorkách DNA migruje cez gél dostatočne ďaleko, napájanie sa vypne a gél sa vyberie a umiestni do roztoku etídiumbromidu. Etídiumbromid interkaluje medzi DNA a je viditeľný v UV svetle. Niekedy sa etídiumbromid pridáva priamo do roztoku agarózového gélu v kroku 2. Gél zafarbený etídiumbromidom sa potom vystaví UV svetlu a urobí sa snímka. Pásy DNA sú vizualizované v každej dráhe zodpovedajúcej komorovej jamke. Rebrík DNA, ktorý bol načítaný, je tiež vizualizovaný a možno odhadnúť dĺžku pásov DNA. Príklad je uvedený na obrázku nižšie.


Ako funguje elektroforéza

Pri elektroforéze existujú dva primárne faktory, ktoré riadia, ako rýchlo sa môže častica pohybovať a akým smerom. Po prvé, záleží na poplatku za vzorku. Záporne nabité druhy sú priťahované k kladnému pólu elektrického poľa, zatiaľ čo kladne nabité druhy sú priťahované k zápornému koncu. Neutrálny druh môže byť ionizovaný, ak je pole dostatočne silné. Inak to nezvykne byť ovplyvnené.

Ďalším faktorom je veľkosť častíc. Malé ióny a molekuly sa môžu pohybovať cez gél alebo kvapalinu oveľa rýchlejšie ako väčšie.

Zatiaľ čo nabitá častica je priťahovaná opačným nábojom v elektrickom poli, existujú aj iné sily, ktoré ovplyvňujú pohyb molekuly. Trenie a elektrostatická retardačná sila spomaľujú postup častíc cez kvapalinu alebo gél. V prípade gélovej elektroforézy je možné kontrolovať koncentráciu gélu, aby sa určila veľkosť pórov gélovej matrice, ktorá ovplyvňuje pohyblivosť. Prítomný je aj tekutý pufor, ktorý kontroluje pH prostredia.

Keď sú molekuly ťahané cez kvapalinu alebo gél, médium sa zahrieva. To môže denaturovať molekuly, ako aj ovplyvniť rýchlosť pohybu. Napätie je riadené tak, aby sa minimalizoval čas potrebný na oddelenie molekúl pri zachovaní dobrej separácie a zachovaní neporušených chemických látok. Niekedy sa elektroforéza vykonáva v chladničke, aby pomohla kompenzovať teplo.


Pozri si video: Prokaryotická buňka (August 2022).