Informácie

Červený transkripčný reportér v Psudomonas putida

Červený transkripčný reportér v Psudomonas putida


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Potrebujem zabudovať transkripčného reportéra P. putida s vysokou vlnovou dĺžkou excitácie, aby sa znížila fototoxicita (doteraz som používal mNeonGreen a chcel by som vyskúšať niečo červené).

Moji kolegovia mi oznámili, že predchádzajúce pokusy s mCherry a mKate2 zlyhali, pretože:

  • Zdá sa, že mCherry má veľmi dlhú dobu zrenia, ktorá nie je vhodná pre moje experimenty
  • mKate2 neukázala vôbec žiadny výraz

Má niekto skúsenosti s transkripčnými reportérmi v P. putida? Nejaké nápady? (DsRed? skúste to znova s ​​mKate?)

Meriam expresiu regulovaného génu PsrI (faktor sigma na produkciu siderofórov).


Funkčná úloha lantanoidov v enzymatickej aktivite a transkripčnej regulácii PQQ-dependentných alkoholdehydrogenáz v Pseudomonas putida KT2440

Oxidácia alkoholov a aldehydov je rozhodujúca pre detoxikáciu a účinný katabolizmus rôznych prchavých organických zlúčenín (VOC). Mnohé gramnegatívne baktérie si teda vyvinuli periplazmatické oxidačné systémy založené na alkoholdehydrogenázach závislých od pyrolochinolín-chinónu (PQQ-ADH), ktoré sú často funkčne nadbytočné. Použitie purifikovaných enzýmov z modelového organizmu v pôde Pseudomonas putida KT2440, táto štúdia uvádza prvý opis a charakterizáciu PQQ-ADH (PedH) závislej od lantanoidov v nemetylotrofnej baktérii. PedH vykazuje enzýmovú aktivitu v podobnom rozsahu substrátov ako jeho Ca2+-dependentný náprotivok PedE, vrátane lineárnych a aromatických primárnych a sekundárnych alkoholov, ako aj aldehydov, avšak len v prítomnosti lantanoidových iónov vrátane La3+, Ce3+, Pr 3+, Sm 3+ alebo Nd 3+. Reportérové ​​testy odhalili, že PedH má nielen katalytickú funkciu, ale podieľa sa aj na transkripčnej regulácii pedE a pedH, ktorý s najväčšou pravdepodobnosťou pôsobí ako senzorický modul. Je pozoruhodné, že základná regulačná sieť reaguje už na 1 – 10 nM lantánu, čo je koncentrácia, o ktorej sa predpokladá, že má ekologický význam. Táto štúdia ďalej ukazuje, že oxidačný systém závislý od PQQ je rozhodujúci pre efektívny rast s rôznymi prchavými alkoholmi. Z týchto výsledkov sme dospeli k záveru, že funkčná redundancia a inverzná regulácia PedE a PedH predstavuje adaptívnu stratégiu P. putida KT2440 na optimalizáciu rastu s prchavými alkoholmi v reakcii na rôznu dostupnosť lantanoidov.

DÔLEŽITÉ Vzhľadom na ich nízku biologickú dostupnosť boli lantanoidy dlho považované za biologicky inertné. V posledných rokoch však identifikácia lantanoidov ako kofaktora v metylotrofných baktériách pritiahla obrovský záujem medzi rôznymi biologickými oblasťami. Táto štúdia odhaľuje, že jeden z dvoch PQQ-ADH produkovaných modelovým organizmom P. putida KT2440 tiež využíva lantanoidy ako kofaktor, čím rozširuje rozsah lantanoidov využívajúcich baktérie nad rámec metylotrofov. Podobne ako pri metyloptrofických baktériách je komplexná regulačná sieť zapojená do prepínača reagujúceho na lantanoidy medzi dvoma PQQ-ADH kódovanými P. putida KT2440. Ďalej ukazujeme, že funkčná produkcia aspoň jedného z enzýmov je rozhodujúca pre efektívny rast s niekoľkými prchavými alkoholmi. Celkovo naša štúdia poskytuje nové pochopenie redundancie PQQ-ADH pozorovanej v mnohých organizmoch a ďalej zdôrazňuje dôležitosť lantanoidov pre bakteriálny metabolizmus, najmä v pôdnom prostredí.


Červený transkripčný reportér v Psudomonas putida - Biológia

<div><p>Koonizácia baktérií podporujúcich rast rastlín je komplexný viacstupňový proces, ktorý je ovplyvnený niekoľkými faktormi. Napríklad počas priľnutia ku koreňom rastlín musia baktérie znášať reaktívne formy kyslíka (ROS) produkované rastlinami. V tejto štúdii uvádzame, že globálny transkripčný regulátor Fis sa podieľa na regulácii ROS-tolerancie <i>Pseudomonas putida</i>, a tým ovplyvňuje kolonizáciu koreňov jačmeňa. Nadmerná expresia <Fis</i> znížila tak toleranciu ROS, ako aj adherenciu ku koreňom jačmeňa a aktivovala transkripciu operónu <nuoA-N</i> kódujúceho NADH dehydrogenázu I, prvého enzýmu membránovo viazaného elektrónového transportného reťazca. Knokautovaná mutácia <i>nuoA-N</i> v pozadí nadmernej expresie <i>fis</i> zvýšila toleranciu ROS a adherenciu ku koreňom jačmeňa. Ukázali sme, že >nuoA</i> má dve miesta začiatku transkripcie umiestnené 104 a 377 nukleotidov pred kódujúcou sekvenciou, čo naznačuje prítomnosť dvoch promótorov. Analýza stopy DNázy I odhalila štyri väzbové miesta Fis: Fis-nuo1 až Fis-nuo4, ktoré sa nachádzajú medzi týmito dvoma promótormi. Miestne cielená mutagenéza v promótor-lacZ reportér a test β-galaktozidázy ďalej potvrdila priamu väzbu Fis na Fis-nuo2 a pravdepodobne na Fis-nuo4, ale nie na Fis-nuo1 a Fis-nuo3. Okrem toho výsledky naznačujú, že Fis väzba na Fis-nuo4 by mohla ovplyvniť transkripciu operónu modifikáciou upstream topológie DNA. Naše výsledky transpozónovej mutagenézy navyše naznačili, že Fis by sa mohol podieľať na regulácii niekoľkých alternatívnych detoxikačných procesov ROS využívajúcich NADH.</p></div


Úvod

Pseudomonas putida KT2440 je gramnegatívna pôdna baktéria, ktorá je klasifikovaná ako všeobecne považovaný za bezpečný (GRAS) certifikovaný kmeň (Loeschcke a Thies, 2015 Nikel a de Lorenzo, 2018). Tento kmeň pritiahol značnú pozornosť pre priemyselné aplikácie vďaka svojmu rýchlemu rastu, prirodzenej metabolickej všestrannosti a vysokej robustnosti v drsných podmienkach prostredia, čo sú obzvlášť vhodné vlastnosti pre bio-sanáciu environmentálnej kontaminácie a metabolické inžinierstvo (Nikel a kol., 2016 Nikel a de Lorenzo, 2018). Okrem toho metabolické modely na úrovni genómu P. putida KT2440 boli vyvinuté na lepšie pochopenie všestranného metabolizmu kmeňa na systémovej úrovni, ktoré boli aplikované na preprogramovanie fenotypu pre biotechnologické implementácie (Nogales a kol., 2008 Sohn a kol., 2010 Hintermayer a Weuster-Botz, 2017). V skutočnosti boli využité dobre zavedené molekulárne biologické nástroje vrátane systémov na génovú expresiu a genómové inžinierstvo. P. putida KT2440 na výrobu biopalív a liečiv metabolickým inžinierstvom (Martínez-García a de Lorenzo, 2011 Cook a kol., 2018 ).

Hoci P. putida KT2440 sa široko používa ako podvozok pre metabolické inžinierstvo, syntetickú biológiu a biologickú nápravu, neexistuje žiadna spoľahlivá a štandardizovaná metóda na sekvenčne špecifickú reguláciu záujmových génov. Nedávno sa klastrované pravidelne rozmiestnené palindromické opakovania (CRISPR) a proteín spojený s CRISPR (Cas) objavili ako všestranné nástroje na úpravu genómu pre rôzne organizmy vrátane baktérií (Cho a kol., 2018), bunky cicavcov (Komor a kol., 2017) a rastliny (Ma a kol., 2016). Okrem úpravy genómu bol systém CRISPR-Cas prepracovaný na kontrolu génovej expresie metódou označovanou ako interferencia CRISPR (CRISPRi) (Qi a kol., 2013). Rovnako ako systémy CRISPR-Cas, CRISPRi tiež vyžaduje proteín Cas9 (dCas9) s deficitom nukleázy a špecificky navrhnutú jednoduchú vodiacu RNA (sgRNA) obsahujúcu 20-nukleotidovú (nt) spacerovú sekvenciu komplementárnu k cieľovej sekvencii DNA. Komplex dCas9-sgRNA sa potom viaže na vlákno cieľovej DNA, čo interferuje s iniciáciou alebo predĺžením transkripcie blokovaním väzby RNA polymerázy (Qi a kol., 2013). Systém CRISPRi bol tiež široko používaný ako výnimočne jednoduchý a účinný nástroj na sekvenčne špecifickú reguláciu cieľových génov v mnohých organizmoch, vrátane Escherichia coli (Qi a kol., 2013 ), Bacillus subtilis (Peters a kol., 2016) a bunky cicavcov (Gilbert a kol., 2013 ).

U niektorých bola tiež hlásená génová regulácia založená na CRISPRi Pseudomonas spp. Tan a kol. (2018) vyvinuli laditeľný systém CRISPRi na realizáciu dynamickej génovej represie v Pseudomonas aeruginosa s použitím homológu dCas9 typu II Streptococcus pasteurianus. Konkrétne skonštruovali dva plazmidy na expresiu dCas9 gén a sgRNA z Plac a Ptet promótora resp. Vyvinutý dvojplazmidový systém CRISPRi však vykazoval netesnú expresiu dCas9 gén v P. aeruginosačo viedlo k represii cieľového génu v neprítomnosti induktora. Okrem toho bol systém CRISPR-dCas typu I prijatý ako transkripčný represor v P. aeruginosa PA14, ktorý vyžaduje vymazanie Cas3 gén z P. aeruginosa alebo expresia anti-CRISPR proteínov z profága (Bondy-Denomy a kol., 2015). Nedávno bola vyvinutá technika CRISPRi s použitím dCas9 of Streptococcus pyogenes (SpdCas9), ktorý preukázal funkčnosť pomocou vylepšeného zeleného fluorescenčného proteínu (eGFP) v P. putida KT2440 (Ne a kol., 2018). V tejto štúdii však chýbali aplikácie CRISPRi na metabolické inžinierstvo alebo syntetickú biológiu P. putida KT2440.

Tu uvádzame l-ramnózou indukovateľný jednoplazmidový systém CRISPRi na dosiahnutie jednoduchej a účinnej regulácie cieľových génov v P. putida KT2440. Tento regulovateľný systém CRISPRi bol schopný kontrolovať expresiu exogénnych a endogénnych génov v P. putida KT2440. Ďalej uvádzame príklady jeho aplikácie na zmenu metabolického toku na zvýšenie produkcie mevalonátu (MVA), kľúčového medziproduktu metabolitu pre biosyntézu nespočetného množstva terpenoidov. Pseudomonas putida KT2440 vykazuje predĺženú fázu oneskorenia na glycerole ako jedinom zdroji uhlíka, takže stratégie na zníženie tejto fázy oneskorenia by mohli pomôcť prekonať toto obmedzenie kmeňa pri použití nákladovo efektívneho obnoviteľného zdroja na mikrobiálnu produkciu terpenoidov. Pomocou kľúčového regulátora podieľajúceho sa na metabolizme glycerolu P. putida KT2440 ako cieľový gén pre jednoplazmidový systém CRISPRi sa ukázal ako robustná platforma na moduláciu expresie endogénneho génu. Tento systém teda môže urýchliť metabolické inžinierstvo P. putida KT2440 na vývoj mikrobiálnych bunkových tovární, ktoré môžu v budúcnosti vyrábať priemyselne hodnotné produkty.


Diskusia

Zlepšenie dodávok IPP a DMAPP pre biotechnologickú produkciu izoprenoidov s pridanou hodnotou v mikroorganizmoch bolo cieľom mnohých štúdií. Na dosiahnutie účinnej produkcie izoprenoidov bez ovplyvnenia kondície bunky je však potrebné vziať do úvahy mnoho ďalších faktorov. Zahŕňajú (A) vyčerpanie metabolických substrátov, (B) toxicitu nahromadených medziproduktov alebo konečných produktov a (C) nasýtenie bunkovej skladovacej kapacity. Stratégií na riešenie posledných dvoch problémov je veľa, ale prvému sa venovala menšia pozornosť, a to napriek negatívnemu vplyvu na rast presmerovania zásob centrálnych metabolitov, ako je pyruvát a GAP, na syntézu IPP a DMAPP. Zatiaľ čo väčšina štúdií zameraných na zlepšenie dodávky IPP a DMAPP bola vykonaná s dobre charakterizovanými organizmami, ako napr E. coli (model pre baktérie, ktoré využívajú dráhu MEP) a S. cerevisiae (model pre kvasinky, ktoré využívajú iba dráhu MVA), ďalšie mikroorganizmy, ktoré vykazujú ďalšie výhody pre produkciu a akumuláciu vysokých izoprenoidových titrov, zostávajú sotva preskúmané. Toto je prípad s P. putida, baktéria, ktorá vykazuje veľmi vysokú toleranciu voči toxickým zlúčeninám, ako sú monoterpény [4, 5]. Ďalšou výhodou P. putida spočíva v tom, že glukóza sa metabolizuje za vzniku vyvážených množstiev substrátov MEP dráhy pyruvátu a GAP [6, 10, 23]. Tieto centrálne metabolické substráty sú produkované v neekvivalentných množstvách v iných baktériách ako napr E. coli, kde táto nevyvážená dostupnosť pyruvátu a GAP môže obmedziť aktivitu MEP dráhy [24]. Zvýšenie hladín pyruvátu aj GAP v P. putida skutočne viedlo k zvýšeniu (1,3-násobku) produkcie karotenoidov (β-karoténu) [10], čo naznačuje, že prísun metabolických substrátov obmedzuje tok dráhy MEP. Naše údaje tu uvedené ďalej podporujú záver, že zabezpečenie správneho prísunu pyruvátu a GAP je tiež dôležité na zvýšenie regulácie produkcie izoprenoidu a zároveň na zabránenie veľkým interferenciám s celkovým mikrobiálnym metabolizmom vedúcim k chybnému rastu.

Aby sme preskúmali rôzne spôsoby stimulácie metabolického toku prostredníctvom endogénnej dráhy MEP k izoprenoidovým prekurzorom, vytvorili sme P. putida kmeň (KTLYC) s exogénnym 3-génovým operónom na produkciu lykopénu ako výsledok. Transformáciou tohto kmeňa s plazmidmi, aby buď nadmerne exprimovali gény endogénnej dráhy MEP alebo začlenili alternatívne dráhy skratu, by sme mohli znásobiť produkciu lykopénu (tj dodávku IPP a DMAPP) 3 (s nDXS Obr. 8), 7 (s dráhou MVA Obr. 3 ), 25 (s DXS Obr. 4) a 50 (s DXS a DXR Obr. 10). Je však najpravdepodobnejšie, že ďalšia optimalizácia aspoň niektorých z týchto stratégií alebo kombinácia viacerých by mohla viesť k ešte vyšším nárastom. Aditívne a synergické efekty by sa mohli dosiahnuť aj zlepšením dodávky substrátov dráhy MEP. Nedávnym príkladom je prepájanie káblov P. putida jadrový metabolizmus na asimiláciu glukózy z natívneho Entner-Doudoroffa na lineárnu Embden-Meyerhof-Parnasovu glykolýzu, ktorá zlepšila produkciu pyruvátu aj GAP [10]. Metabolická plasticita znázornená P. putida, ktorý je schopný metabolizovať širokú škálu zdrojov uhlíka vrátane mastných kyselín, glycerolu a aromatických zlúčenín [25], poskytuje ďalšiu príležitosť na prepracovanie zásob substrátov potrebných na syntézu IPP a DMAPP. Kŕmenie baktérií rôznymi zdrojmi uhlíka môže pomôcť akumulovať vyššie zásoby pyruvátu, GAP (tj glukózy) alebo acetyl-CoA (tj mastných kyselín) a kombinácia rôznych zdrojov uhlíka by mohla pomôcť uvoľniť konkurenciu produktívnych (exogénnych) dráh s housekeeping (endogénny) metabolizmus. Hierarchické využitie rôznych zdrojov uhlíka [26] môže obmedzovať našu schopnosť kombinovať plne aktívne metabolické dráhy, aby súčasne kŕmili produktívne a udržiavacie dráhy v bunke. Naše znalosti o mechanizmoch riadiacich túto hierarchiu sa však neustále zlepšujú [27, 28] a poskytujú nové inžinierske príležitosti.

Spomedzi tu testovaných nových stratégií bolo použitie nDXS na produkciu DXP z Ru5P najúspešnejšie, pretože zlepšilo akumuláciu lykopénu až trojnásobne bez negatívneho ovplyvnenia rastu buniek (obr. 8). Aj keď toto zvýšenie je stále ďaleko od nárastu dosiahnutého s kanonickým enzýmom DXS (obr. 4), je dôležité mať na pamäti, že nDXS bol identifikovaný ako mutantný enzým, ktorý získal schopnosť produkovať DXP v dôsledku bodovej mutácie a nie je optimalizovaný pre syntézu DXP. Náš odhad je, že iba asi 10% substrátu Ru5P sa transformuje na DXP pomocou nDXS. Zvýšenie aktivity DXS mutantného enzýmu by malo byť uskutočniteľné a dokonca rýchle, ak sa použijú nové automatizované platformy dostupné pre adaptívne laboratórne evolučné prístupy [29, 30]. Optimalizovaný nDXS by umožnil komplementárnu stratégiu využívajúcu kanonickú DXS na posunutie dráhy MEP pomocou pyruvátu a GAP až na limity, ktoré nevykazujú žiadny vplyv na rast s dodatočným vstupom DXP získaným z transformácie Ru5P pomocou nDXS. Dostupnosť kryštálovej štruktúry ribB proteínu divokého typu [31] by mala umožniť odvodiť, ako by novovybrané mutácie mohli ovplyvniť DXS aktivitu nDXS, čo je informácia, ktorá by mohla byť veľmi cenná na vytvorenie syntetických enzýmov schopných produkovať DXP z Ru5P alebo zo substrátov, ktoré neinterferujú s endogénnou dráhou MEP alebo inými základnými metabolickými procesmi v baktériách. Ako doplnková stratégia môže byť dodávka Ru5P zvýšená prepojením pentózofosfátovej dráhy. Ru5P je substrát C5, a preto sa konvertuje na DXP pomocou nDXS bez straty uhlíka (pokiaľ nie je reakcia katalyzovaná DXS, ktorá začína dvoma prekurzormi C3 a zahŕňa dekarboxyláciu). Spoločne môže použitie optimalizovaných verzií nDXS buď samostatne alebo v kombinácii s inými stratégiami zvýšiť produkciu IPP a DMAPP na novú vysokú úroveň.

Ďalšou novou stratégiou, ktorú sme testovali, bola jemná regulácia expresie DXS pomocou endogénneho promótora, ktorý reagoval na stres rastu buniek (obr. 6). Pomocou PkatA Promótorom sme dosiahli iba štvornásobné zvýšenie akumulácie lykopénu v porovnaní s kontrolami prázdnych plazmidov, čo naznačuje, že transkripčná aktivita tohto promótora v testovaných podmienkach je príliš nízka na to, aby účinne podporila dráhu MEP, a teda na dosiahnutie stresových podmienok, ktoré by mohli prípadne potlačiť transkripciu. Je pravdepodobné, že použitie silnejších, ale stále reagujúcich promótorov na stres môže fungovať lepšie. The PkatA Promótor môže byť navrhnutý tak, aby zvýšil svoju transkripčnú aktivitu pri zachovaní svojich regulačných vlastností. Alternatívne by analýza transkriptómu buniek KTLYC(p424-DXS) pestovaných v prítomnosti rôznych koncentrácií IPTG mala umožniť identifikovať gény, ktoré sú vysoko exprimované, keď bunky rastú normálne, ale sú potlačené, keď je bunkový rast ohrozený spôsobom závislým od IPTG (tj keď je aktivita DXS príliš vysoká). Promótory takýchto génov by sa potom mohli použiť v syntetických operónoch na zvýšenie ponuky DXS (a IDI, DXR, nDXS atď.), a teda dostupnosti izoprenoidových prekurzorov za optimálnych rastových podmienok, ale ich reguláciu nadol, keď majú účinky potláčajúce rast. objaviť. To poskytne bunkám čas, aby upravili svoj metabolizmus a následne znovu prijali nadprodukciu izoprenoidu.

„Klasickejšie“ prístupy, ktoré sme testovali, tj použitie exogénnej dráhy MVA na produkciu IPP a DMAPP z acetyl-coA a nadmerná expresia génov dráhy MEP, nás viedli k záveru, že nemôžeme priamo extrapolovať výsledky získané s jednou baktériou. (napr E. coli) na úpravu inej baktérie (napr. P. putida). Napríklad použitie dráhy MVA zvyčajne funguje lepšie ako upregulácia DXS E. coli [32,33,34] sme však pozorovali opačné správanie v P. putida. Podobné pozorovanie bolo predtým zaznamenané u cyanobaktérií rastúcich vo fotoautotrofných podmienkach za vzniku izoprénu [35]. Prítomnosť operónu bakteriálnej dráhy MVA zlepšila akumuláciu lykopénu sedemnásobne (obr. 3), podobne ako desaťnásobné zvýšenie, o ktorom sa uvádza, že spôsobuje rovnaký operón pri produkcii monoterpénu v P. putida Bunky DSM 12264 [4]. Naproti tomu prítomnosť plazmidu obsahujúceho DXS bola schopná podporiť akumuláciu lykopénu v bunkách KTLYC 15-násobne v neprítomnosti akejkoľvek indukcie (obr. 4b). Takmer úplný nedostatok účinku nadprodukcie IDI na syntézu lykopénu, keď sa obmedzujúca úloha DXS uvoľní v r. P. putida (Obr. 4d) sa tiež líši od pozorovaného v E. coli [29].


Diskusia

Kolonizáciu koreňov ovplyvňujú abiotické aj biotické faktory v blízkosti koreňov rastlín, ktoré môžu mať škodlivé alebo naopak prospešné účinky. Pre úspešnú kolonizáciu musia baktérie rozpoznať prítomnosť rastliny, vyrovnať sa s nepriaznivým účinkom škodlivých faktorov a úspešne sa uchytiť na povrchu koreňa rastliny.

Už sme to popísali fis-nadmerná expresia zvyšuje tvorbu biofilmu aj expresiu lapA v P. putida [22,23,31]. LapA je bunkový povrchový proteín nevyhnutný pre P. putida väzba na biotické a abiotické povrchy [23,45]. teda fis- nadmerná expresia v P. putida by mala zvýšiť priľnavosť baktérií ku koreňom jačmeňa a nie oslabiť prvé štádiá kolonizácie, ako bolo opísané vyššie [31]. Predpokladali sme, že Fis by sa mohol podieľať na regulácii tolerancie ROS v P. putida a znížená adherencia fis-nadmerná expresia kmeňa F15 v prvých krokoch kolonizácie môže byť výsledkom zvýšenej citlivosti na exogénne ROS.

Skutočne, nadmerné vyjadrenie fis v P. putida znížil H2O2- tolerancia buniek a podľa očakávania pridanie ďalšieho génu katalázy katA zmierňuje citlivosť fis- nadmerná expresia kmeňa na ROS (obr. 1B). Navyše nadmerná expresia fis v P. putida zvýšilo množstvo endogénneho ROS a znížilo schopnosť kolonizovať korene jačmeňa, čo sa ešte viac znížilo, keď sa extracelulárne množstvo ROS zvýšilo doplnením kyseliny galovej (obr. 2). Súčasne kmeň divokého typu nebol citlivý na zvýšenú ROS kyselinou galovou na koreňoch jačmeňa (obr. 2C). Navrhujeme, že citlivosť na ROS na koreňoch jačmeňa môže závisieť od fyziologických podmienok bakteriálnych buniek. S najväčšou pravdepodobnosťou bol kmeň divokého typu schopný použiť kompenzačný mechanizmus na detoxikáciu exogénnych ROS emitovaných z koreňov jačmeňa a P. putida s nadmerne vyjadreným fis nebol. To vyvolalo otázku, či Fis môže ovplyvniť toleranciu ROS reguláciou transkripcie niektorých špecifických génov.

Vykonali sme transpozónovú mutagenézu na identifikáciu génov závislých od Fis, ktoré môžu regulovať toleranciu baktérií voči ROS, a identifikovali sme 19 mini-Tn5 vloženia do F15 nuoA-N operónové gény. Toto zistenie naznačuje, že regulácia tzv nuoA-N operón pomocou Fis by sa mohol podieľať na tolerancii ROS ako alternatívny mechanizmus na zníženie endogénneho ROS. Skutočne, vypustenie nuoA-N znížené endogénne ROS v fis- nadmerne exprimujúce bunky (obr. 2B) a zvýšili toleranciu na exogénne ROS (obr. 1B). Gény nuoA do nuoN kódujú NuoA-N proteíny, ktoré sa zostavujú na NADH dehydrogenázu I v cytoplazmatickej membráne [15,46,47]. Tento komplex je enzýmom dýchacieho reťazca, ktorý katalyzuje prenos dvoch elektrónov z NADH na chinóny v reakcii, ktorá je spojená s translokáciou protónov cez membránu [48].

Dve hypotézy by mohli vysvetliť, ako môže NADH dehydrogenáza I ovplyvniť množstvo endogénneho ROS: generovanie samotného ROS alebo vyčerpanie redukčného činidla NADH. Ukázalo sa, že počas transportu elektrónov môže NADH dehydrogenáza I produkovať ROS v Escherichia coli [16]. V tomto prípade môže ROS vzniknúť počas oxidácie NADH a transportu elektrónov cez kofaktor FMN [16]. Alternatívne je možné, že deplécia NADH ako redukčného činidla môže zvýšiť endogénny ROS. Napríklad prítomnosť antibiotík v rastovom médiu indukuje mnohé gény oxidačného stresu, napr. NADH peroxidáza a glutatiónreduktáza [21], a preto baktérie potrebujú NADH, aby ju mohli použiť na detoxikáciu ROS. Teda nútené vyjadrenie o nuoA-N gény podľa fis-nadmerná expresia môže spôsobiť deficit NADH, čo znemožní detoxikáciu endogénneho ROS. Bez ohľadu na to, ktorá hypotéza je pravdivá, súčet endogénnych a exogénnych ROS pre F15AnuoA-N je nižší, čo vedie k vyššej tolerancii baktérií voči exogénnym ROS a zvýšenej účinnosti kolonizácie (obrázky 1B, 2C a 2D). Navyše, na rozdiel od F15, účinnosť kolonizácie F15AnuoA-N sa zlepšila v fispozadie nadmernej expresie (obr. 2C). Zdá sa, že príloha o P. putida závisí od dvoch faktorov: detoxikácia ROS a prítomnosť hlavného adhezínu LapA, ako sme už predtým uviedli fis-nadmerná expresia zvyšuje expresiu lapA [22,23]. Zvýšené množstvo LapA na povrchu buniek by teda zvýšilo pripojenie ku koreňom, ak by baktérie boli schopné účinne detoxikovať ROS.

Identifikácia mini-Tn5 inzercie v niekoľkých ďalších génoch zodpovedných za udržiavanie redukčnej sily podporujú hypotézu vyčerpania NAD(P)H. Aj keď len pár mini-Tn5 boli vybrané inzercie do génov biosyntézy metionínu, mini-Tn5 vloženie do PP_5275 a metR-1 (PP_1063) obnovil H2O2- tolerancia na úroveň divokého typu napriek fis-nadmerná expresia (tabuľka S3). Je známe, že ROS generuje tiolový stres oxidáciou tiolových zvyškov v biomolekulách, najmä v proteínoch, vytváraním disulfidových väzieb, ktoré môžu inaktivovať enzýmy [49]. Preto baktérie potrebujú redukčnú silu na redukciu disulfidových väzieb v proteínoch a NADPH používaný pri biosyntéze metionínu je silným redukčným činidlom na detoxikáciu ROS v baktériách [50,51]. Zvýšené množstvo Fis teda môže ovplyvniť redukciu oxidovaných biomolekúl v P. putida pretože udržiava biosyntézu metionínu, ktorá by bola za prirodzených okolností znížená. Pretože korene rastlín vylučujú aminokyseliny, aby prilákali baktérie podporujúce rast rastlín [52,53], je pravdepodobnejšie, že biosyntéza aminokyselín je znížená v baktériách v blízkosti koreňov rastlín. Dôvodom downregulácie je pravdepodobne nielen šetrenie energie, ale aj zabránenie vyčerpaniu redukčných činidiel, ako je NADPH.

Okrem toho môžu ketokyseliny neutralizovať ROS spôsobom nezávislým od NADPH [54]. Napríklad nadbytok ROS zvyšuje akumuláciu alfa-ketoglutarátu, metabolitu Krebsovho cyklu, ktorý sa používa na redukciu disulfidových väzieb v Pseudomonas fluorescens [54]. Preto je možné, že vloženie mini-Tn5 v génoch biosyntézy metionínu a metabolizmu alfa-ketoglutarátu gény zmierňujú tiolový stres v fis-pozadie nadmernej expresie (tabuľka S3). Počas procesu kolonizácie by teda baktérie mohli regulovať svoj metabolizmus, aby sa vyrovnali s toxickým účinkom exogénneho ROS znížením expresie nuoA-N operón a zvýšenie redukčnej sily udržiavaním vysokého množstva NADH, NADPH a ketokyselín.

Keďže významný počet transpozónových mutantov mal inzerciu transpozónu v nuo operónové gény a štyri potenciálne miesta viažuce Fis boli predpovedané v upstream sekvencii nuoA študovali sme do hĺbky reguláciu tohto operónu pomocou Fis. Organizácia nuoA-N génov je podobný v rôznych baktériách: sú umiestnené v jednom operóne a sú spolu transkribované v E. coli, Salmonella enterica a P. fluorescenčné látky [15,55,56]. Prítomnosť podobného nuo štruktúra operónu v P. putida znamená, že nuoA-N operónové gény by mohli byť ko-transkribované P. putida tiež.

The nuoA-N operón v P. putida má pred sebou dvoch promotérov nuoA a tieto promótory sú nepriamo regulované RpoS (obr. 4). Fis sa viaže na viaceré väzbové miesta pred promótorom závislým od Fis (obr. 5 a 6) a upreguluje transkripciu (obr. 7). Tieto výsledky naznačujú, že transkripcia nuo-operón v P. putida je posilnená v prítomnosti živín, keď baktérie majú energiu na neutralizáciu ROS a downregulovaná stresom, keď dostupnosť detoxikácie ďalších ROS klesá. Naše výsledky ukázali, že dve miesta viažuce Fis ovplyvňujú transkripciu P. putida nuoA pozitívne. Proximálne väzbové miesto Fis Fis-nuo2 sa nachádza približne -70 bp od 5´ konca nuoA mRNA N-I (obr. 3). Takáto vzdialenosť je charakteristická pre aktivátory, ktoré priamo interagujú s RNA polymerázou [57]. Zdá sa, že oblasť označená ako Fis-nuo4 sa tiež podieľa na regulácii transkripcie, pravdepodobne prostredníctvom modulácie topológie DNA. Fis-nuo4 sa nachádza -290 bp od 5´ konca nuoA mRNA N-I (obr. 3) a môže aktivovať transkripciu z tejto vzdialenosti iba vytvorením DNA slučky. Preto navrhujeme, aby väzba Fis na Fis-nuo4 mohla zmeniť topológiu DNA, ktorá zvyšuje transkripciu nuoA-N operón.

Na záver, v tejto štúdii sme opísali zapojenie globálneho regulátora Fis do tolerancie ROS a kolonizácie koreňov jačmeňa. P. putida. Negatívny účinok Fis na toleranciu ROS a tým na účinnosť kolonizácie koreňov sa môže prejaviť zvýšením transkripčnej úrovne nuoA-N operónu a akumuláciu endogénneho ROS. Fis sa viaže na promótorovú oblasť nuoA-N operón a uľahčuje jeho transkripciu väzbou na miesta Fis-nuo2 a Fis-nuo4 proti smeru od promótora operónu.


Rozdielna odozva Pben propagátor Pseudomonas putida mt-2 na BenR a XylS zabraňuje metabolickým konfliktom v m-biodegradácia xylénu

Pseudomonas putida mt-2 zahŕňa dve alternatívne a potenciálne konfliktné cesty metabolizmu benzoátu, jednu meta dráha zakódovaná xyl gény plazmidu pWW0 a zvládnuté pomocou Pm promótor a XylS a jeden chromozomálne kódovaný orto dráha iniciovaná Pben a proteín BenR. Akákoľvek krížová aktivácia Pben promótor XylS by mal spôsobiť metabolický konflikt počas degradácie m-xylén, pretože 3-metylbenzoát (3 MBz) vytvorený ako medziprodukt môže byť vedený cez orto a produkujú toxické slepé metabolity. Aktivácia Pben by XylS bol prehodnotený pomocou reportérovej technológie aj dlaždíc zacielených na sekvencie záujmu okolo messengerovej RNA iniciácie oboch Pben a Pm promotérov. Analýza supersenzitívnych luxCDABE fúzie, kontrola xylX proti benA prepisy a rastové testy benR mutanty naznačili, že rozsahy prirodzenej expresie XylS za rôznych podmienok sú nedostatočné na to, aby spôsobili významnú krížovú reguláciu Pben či bunky čelia endogénnym alebo exogénnym 3 MBz. Zdá sa, že to vyplýva z povahy operátorov pre väzbu buď transkripčného faktora, ktorý v prípade Pben propagátor P. putida Zdá sa, že mt-2 sa vyvinul, aby sa vyhlo silnej interakcii s XylS.


Obsah

Ako väčšina bakteriálnych rodov, aj pseudomonáda [poznámka 1] posledný spoločný predok žil pred stovkami miliónov rokov. Pôvodne boli klasifikované na konci 19. storočia, keď ich prvýkrát identifikoval Walter Migula. Etymológia mena nebola v tom čase špecifikovaná a prvýkrát sa objavila v siedmom vydaní r Bergeyho príručka systematickej bakteriológie (hlavná autorita v bakteriálnej nomenklatúre) ako gréčtina pseudes (ψευδής) „nepravdivé“ a -monas (μονάς/μονάδος) „jedna jednotka“, čo môže znamenať falošnú jednotku, avšak Migula to možno zamýšľal ako falošnú Monas, nanoflagelated protist [7] (následne sa termín „monáda“ používal v ranej histórii mikrobiológie na označenie jednobunkových organizmov). Čoskoro boli z mnohých prirodzených výklenkov izolované ďalšie druhy zodpovedajúce Migulovmu trochu nejasnému pôvodnému popisu a v tom čase boli mnohé priradené k rodu. Mnohé kmene však boli odvtedy preklasifikované na základe novšej metodológie a použitia prístupov zahŕňajúcich štúdie konzervatívnych makromolekúl. [8]

Nedávno sekvenčná analýza 16S rRNA predefinovala taxonómiu mnohých bakteriálnych druhov. [9] V dôsledku toho rod Pseudomonas zahŕňa kmene predtým klasifikované v rodoch Chryseomonas a Flavimonas. [10] Iné kmene predtým zaradené do rodu Pseudomonas sú teraz zaradené do rodov Burkholderia a Ralstonia. [11] [12]

V roku 2020 bola dokončená fylogenomická analýza 494 Pseudomonas genómy identifikovali dva dobre definované druhy (P. aeruginosa a P. chlororaphis) a štyri širšie fylogenetické skupiny (P. fluorescens, P. stutzeri, P. syringae, P. putida) s dostatočným počtom dostupných proteómov. [13] Štyri širšie evolučné skupiny zahŕňajú viac ako jeden druh na základe definície druhu podľa úrovní priemernej nukleotidovej identity. [14] Fylogenomická analýza navyše identifikovala niekoľko kmeňov, ktoré boli nesprávne označené k nesprávnemu druhu alebo evolučnej skupine. [13] Tento problém s nesprávnou anotáciou zaznamenali aj iné analýzy. [15]

V roku 2000 bola kompletná sekvencia genómu a Pseudomonas druhov bola stanovená novšie, bola určená sekvencia iných kmeňov, vrátane P. aeruginosa kmene PAO1 (2000), P. putida KT2440 (2002), P. protegens Pf-5 (2005), P. syringae pathovar paradajka DC3000 (2003), P. syringae pathovar syringae B728a (2005), P. syringae pathovar phaseolica 1448A (2005), P. fluorescens Pf0-1 a P. entomophila L48. [8]

Do roku 2016 viac ako 400 kmeňov Pseudomonas boli zoradené. [16] Sekvenovanie genómov stoviek kmeňov odhalilo veľmi odlišné druhy v rámci rodu. V skutočnosti mnohé genómy Pseudomonas zdieľajú len 50-60% svojich génov, napr. P. aeruginosa a P. putida zdieľajú iba 2971 proteínov z 5350 (resp

Do roku 2020 bude dokončených viac ako 500 Pseudomonas genómy boli dostupné v Genebank. Fylogenomická analýza použila 494 úplných proteómov a identifikovala 297 základných ortológov, ktoré zdieľali všetky kmene. [13] This set of core orthologues at the genus level was enriched for proteins involved in metabolism, translation, and transcription and was utilized for generating a phylogenomic tree of the entire genus, to delineate the relationships among the Pseudomonas major evolutionary groups. [13] In addition, group-specific core proteins were identified for most evolutionary groups, meaning that they were present in all members of the specific group, but absent in other Pseudomonády. For example, several P. aeruginosa-specific core proteins were identified that are known to play an important role in this species' pathogenicity, such as CntL, CntM, PlcB, Acp1, MucE, SrfA, Tse1, Tsi2, Tse3, a EsrC. [13]

Members of the genus display these defining characteristics: [17]

Other characteristics that tend to be associated with Pseudomonas species (with some exceptions) include secretion of pyoverdine, a fluorescent yellow-green siderophore [18] under iron-limiting conditions. Certain Pseudomonas species may also produce additional types of siderophore, such as pyocyanin by Pseudomonas aeruginosa [19] and thioquinolobactin by Pseudomonas fluorescens,. [20] Pseudomonas species also typically give a positive result to the oxidase test, the absence of gas formation from glucose, glucose is oxidised in oxidation/fermentation test using Hugh and Leifson O/F test, beta hemolytic (on blood agar), indole negative, methyl red negative, Voges–Proskauer test negative, and citrate positive.

Pseudomonas may be the most common nucleator of ice crystals in clouds, thereby being of utmost importance to the formation of snow and rain around the world. [21]

Biofilm formation Edit

All species and strains of Pseudomonas have historically been classified as strict aerobes. Exceptions to this classification have recently been discovered in Pseudomonas biofilmy. [22] A significant number of cells can produce exopolysaccharides associated with biofilm formation. Secretion of exopolysaccharides such as alginate makes it difficult for pseudomonads to be phagocytosed by mammalian white blood cells. [23] Exopolysaccharide production also contributes to surface-colonising biofilms that are difficult to remove from food preparation surfaces. Growth of pseudomonads on spoiling foods can generate a "fruity" odor.

Antibiotická rezistencia Edit

Väčšina Pseudomonas spp. are naturally resistant to penicillin and the majority of related beta-lactam antibiotics, but a number are sensitive to piperacillin, imipenem, ticarcillin, or ciprofloxacin. [23] Aminoglycosides such as tobramycin, gentamicin, and amikacin are other choices for therapy.

This ability to thrive in harsh conditions is a result of their hardy cell walls that contain porins. Their resistance to most antibiotics is attributed to efflux pumps, which pump out some antibiotics before they are able to act.

Pseudomonas aeruginosa is increasingly recognized as an emerging opportunistic pathogen of clinical relevance. One of its most worrying characteristics is its low antibiotic susceptibility. [24] This low susceptibility is attributable to a concerted action of multidrug efflux pumps with chromosomally encoded antibiotic resistance genes (e.g., mexAB-oprM, mexXY, etc., [25] ) and the low permeability of the bacterial cellular envelopes. Besides intrinsic resistance, P. aeruginosa easily develops acquired resistance either by mutation in chromosomally encoded genes or by the horizontal gene transfer of antibiotic resistance determinants. Development of multidrug resistance by P. aeruginosa isolates requires several different genetic events that include acquisition of different mutations and/or horizontal transfer of antibiotic resistance genes. Hypermutation favours the selection of mutation-driven antibiotic resistance in P. aeruginosa strains producing chronic infections, whereas the clustering of several different antibiotic resistance genes in integrons favours the concerted acquisition of antibiotic resistance determinants. Some recent studies have shown phenotypic resistance associated to biofilm formation or to the emergence of small-colony-variants, which may be important in the response of P. aeruginosa populations to antibiotic treatment. [8]

Sensitivity to gallium Edit

Although gallium has no natural function in biology, gallium ions interact with cellular processes in a manner similar to iron(III). When gallium ions are mistakenly taken up in place of iron(III) by bacteria such as Pseudomonas, the ions interfere with respiration, and the bacteria die. This happens because iron is redox-active, allowing the transfer of electrons during respiration, while gallium is redox-inactive. [26] [27]

Animal pathogens Edit

Infectious species include P. aeruginosa, P. oryzihabitans, a P. plecoglossicida. P. aeruginosa flourishes in hospital environments, and is a particular problem in this environment, since it is the second-most common infection in hospitalized patients (nosocomial infections) [ potrebná citácia ] . This pathogenesis may in part be due to the proteins secreted by P. aeruginosa. The bacterium possesses a wide range of secretion systems, which export numerous proteins relevant to the pathogenesis of clinical strains. [28] Intriguingly, several genes involved in the pathogenesis of P.aeruginosa, ako napr CntL, CntM, PlcB, Acp1, MucE, SrfA, Tse1, Tsi2, Tse3, a EsrC are core group-specific, [13] meaning that they are shared by the vast majority of P. aeruginosa strains, but they are not present in other Pseudomonády.

Plant pathogens Edit

P. syringae is a prolific plant pathogen. It exists as over 50 different pathovars, many of which demonstrate a high degree of host-plant specificity. Numerous other Pseudomonas species can act as plant pathogens, notably all of the other members of the P. syringae subgroup, but P. syringae is the most widespread and best-studied.

Although not strictly a plant pathogen, P. tolaasii can be a major agricultural problem, as it can cause bacterial blotch of cultivated mushrooms. [29] Similarly, P. agarici can cause drippy gill in cultivated mushrooms. [30]

Since the mid-1980s, certain members of the genus Pseudomonas have been applied to cereal seeds or applied directly to soils as a way of preventing the growth or establishment of crop pathogens. This practice is generically referred to as biocontrol. The biocontrol properties of P. fluorescens a P. protegens strains (CHA0 or Pf-5 for example) are currently best-understood, although it is not clear exactly how the plant growth-promoting properties of P. fluorescens are achieved. Theories include: the bacteria might induce systemic resistance in the host plant, so it can better resist attack by a true pathogen the bacteria might outcompete other (pathogenic) soil microbes, e.g. by siderophores giving a competitive advantage at scavenging for iron the bacteria might produce compounds antagonistic to other soil microbes, such as phenazine-type antibiotics or hydrogen cyanide. Experimental evidence supports all of these theories. [31]

Other notable Pseudomonas species with biocontrol properties include P. chlororaphis, which produces a phenazine-type antibiotic active agent against certain fungal plant pathogens, [32] and the closely related species P. aurantiaca, which produces di-2,4-diacetylfluoroglucylmethane, a compound antibiotically active against Gram-positive organisms. [33]

Some members of the genus are able to metabolise chemical pollutants in the environment, and as a result, can be used for bioremediation. Notable species demonstrated as suitable for use as bioremediation agents include:

  • P. alcaligenes, which can degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. [34]
  • P. mendocina, which is able to degrade toluene. [35]
  • P. pseudoalcaligenes, which is able to use cyanide as a nitrogen source. [36]
  • P. resinovorans, which can degrade carbazole. [37]
  • P. veronii, which has been shown to degrade a variety of simple aromaticorganic compounds. [38][39]
  • P. putida, which has the ability to degrade organic solvents such as toluene. [40] At least one strain of this bacterium is able to convert morphine in aqueous solution into the stronger and somewhat expensive to manufacture drug hydromorphone (Dilaudid).
  • Strain KC of P. stutzeri, which is able to degrade carbon tetrachloride. [41]

One way of identifying and categorizing multiple bacterial organisms in a sample is to use ribotyping. [42] In ribotyping, differing lengths of chromosomal DNA are isolated from samples containing bacterial species, and digested into fragments. [42] Similar types of fragments from differing organisms are visualized and their lengths compared to each other by Southern blotting or by the much faster method of polymerase chain reaction (PCR). [42] Fragments can then be matched with sequences found on bacterial species. [42] Ribotyping is shown to be a method to isolate bacteria capable of spoilage. [43] Around 51% of Pseudomonas bacteria found in dairy processing plants are P. fluorescens, with 69% of these isolates possessing proteases, lipases, and lecithinases which contribute to degradation of milk components and subsequent spoilage. [43] Other Pseudomonas species can possess any one of the proteases, lipases, or lecithinases, or none at all. [43] Similar enzymatic activity is performed by Pseudomonas of the same ribotype, with each ribotype showing various degrees of milk spoilage and effects on flavour. [43] The number of bacteria affects the intensity of spoilage, with non-enzymatic Pseudomonas species contributing to spoilage in high number. [43]

Food spoilage is detrimental to the food industry due to production of volatile compounds from organisms metabolizing the various nutrients found in the food product. [44] Contamination results in health hazards from toxic compound production as well as unpleasant odours and flavours. [44] Electronic nose technology allows fast and continuous measurement of microbial food spoilage by sensing odours produced by these volatile compounds. [44] Electronic nose technology can thus be applied to detect traces of Pseudomonas milk spoilage and isolate the responsible Pseudomonas druhov. [45] The gas sensor consists of a nose portion made of 14 modifiable polymer sensors that can detect specific milk degradation products produced by microorganisms. [45] Sensor data is produced by changes in electric resistance of the 14 polymers when in contact with its target compound, while four sensor parameters can be adjusted to further specify the response. [45] The responses can then be pre-processed by a neural network which can then differentiate between milk spoilage microorganisms such as P. fluorescens a P. aureofaciens. [45]

Recently, 16S rRNA sequence analysis redefined the taxonomy of many bacterial species previously classified as being in the genus Pseudomonas. [9] Species removed from Pseudomonas are listed below clicking on a species will show its new classification. The term 'pseudomonad' does not apply strictly to just the genus Pseudomonas, and can be used to also include previous members such as the genera Burkholderia a Ralstonia.


Metódy

Mathematical modeling with piecewise-linear differential equations

Formalization of each of the regulatory components of the TOL system (Figure 1) as binary logic gates and the assembly of the complete network as a digital circuit has been described before [17]. The streamlined scheme of Figure 2c was used as a guide to the formulation of equations for each of the regulatory and metabolic steps of the network. To this end, we adopted piecewise-linear (PL) differential equations [45] for describing the circuit dynamics as described [21, 46]. The rationale of this approach is that production of metabolites in the model is determined by state equations, which define the metabolic reactions as the result of [i] the presence of substrates and [ii] the activation of a regulation function that encodes transcriptional and metabolic interactions. Under this scheme, a regulatory function accounts for the expression of a given gene and the production of the corresponding protein owing to the presence of an effector. Specific regulatory functions can thus be expressed as:

This equation indicates that the synthesis of product i is a function of the presence of the effector j. V tejto rovnici s+ is a step function, a Boolean operator that is set to a value 1 if the concentration of j (X j ) is above a particular threshold (θ j ), and to a value 0 if the concentration is below θ j . Syntéza i occurs at a rate determined by k i only when X j >θ j , and does not take place if X j <θ j . V tomto prípade, j is an activator of the synthesis of i. By the same token, the effect of a repressor can be represented using a negative step function:

which is set to a value 1 when X j <θ j , and to a value 0 when X j >θ j . On this basis, the production of a given component of the network as a result of the combined influence of different effectors can be written as, e.g.:

where the appearance of product i is regulated by the activator j and the repressor k. Such a component i is synthesized only if j is present and k is absent. This is equivalent to a logic device (a logic gate) involving an AND/NOT operator (ANDN), taking j a k as inputs and producing i as output. In this way, it is possible to model all possible transcriptional and metabolic interactions in the system as logic constructs, determining the production of particular compounds as a function of the presence or absence of some of the others [47]. Furthermore, it is possible to set different thresholds for the concentration of a particular compound when it controls different synthesis rates at different concentrations. For instance, if effector j regulates the synthesis of A and B, we can set the constraint θ j 1 <θ j 2 , to indicate that synthesis of A is regulated by a lower concentration of j than the synthesis of B. These constraints are known as threshold inequalities [21] and are described below for the TOL system. Takéto threshold inequalities are related to the effective concentration of a given molecular species (e.g., a TF) above which it is able to have a regulatory effect on a target (e.g. promoter). In the case of TF-promoter pairs, inequalities are entered in the corresponding equations by means of a threshold value (θ j ) which represents the relative affinity of the TF under consideration for one or more target promoters. The active concentration of each of the components is then determined by its production rate (expressed by k i ), and its degradation rate (g i * x i ), which is a strictly positive function, proportional to the concentration of the compound. These simple expressions of positive and negative step functions were adopted for representing all possible regulatory interactions in the system. The resulting set of equations was then implemented with the GNA (Genetic Network Analyzer) software [21]. GNA models describe the evolution of the regulatory circuit by specifying qualitative constraints on the parameters of the system. This allows the model to be reliably run even if the actual threshold concentrations and the reaction rates at stake are not known. One set of constraints thus includes such threshold inequalities. A second type of constraints consists of the so-called focal inequalities that set the possible steady-state concentrations of the components in the system with respect to their threshold values, for instance:

This inequality indicates that when component i is produced at rate k i and degraded with a rate constant g i , so that its concentration converges towards the level k i/g i [45], it exceeds the threshold θ i 1 , but not θ i 2 . This allows an estimate of the concentration of the components in reference to their threshold values, even in absence of quantitative information on the parameters of the system. The inequalities for the TOL model were set as shown in Table 1.

It is possible to follow the dynamics of the regulatory network by computing a temporal progression of so-called qualitative states, each consisting of the levels of the concentration variables with respect to their thresholds. In each qualitative state the trend of the concentration variables (increasing/decreasing/steady) determines the possible transitions to successor states. The resulting directed graph of qualitative states and transitions between qualitative states is called a state transition graph (for a more detailed description, see [21, 46]. Note that the PL equations above and the associated transition graph describe the temporal order of signal propagation in the network when the first input signal is present and the system moves toward a steady state (where the concentrations of the components stop to change). The actual time interval during which the system remains in a state before reaching the next is not contained in these qualitative models. However, the representation reliably predicts the temporal ordering of states, and thus the consecutive changes in the levels of each of the components of the network.

Using the biological assumptions for known regulatory interactions (Figure 1) and the resulting logic operations (Figure 2c), we defined four PL equations describing XylR, XylS, horný a meta production (Table 1). The sole input for the system was m-xylene, which was defined as an input variable i.e. one having a constant concentration along the simulations, [21]. For implementation of in silico mutations, we changed threshold inequalities as follows. In one case Popoludnie activation was simulated in the absence of the XylSh loop by setting the parameter θ 2 XylSh to be higher than the maximal concentration reachable upon Ps activation (No XylS hyper-expression condition, Table 1). Similarly, simulation of the Popoludnie activation event in a scenario lacking XylSa, we set the horný pathway not to produce enough concentrations of 3 MBz for creating XylSa (No XylSa condition, Table 1). Consideration of different threshold inequalities in the TOL model allowed us to simulate the specific conditions as discussed in the Results section.

Strains, chemicals and growth conditions

E. coli CC118 strain [48] was used as the host for plasmid constructions and maintenance, while P. putida mt-2 [41] was employed for the analysis of promoter activity with reporter constructs (see below). E. coli was grown in Luria-Bertani (LB) medium at 37°C. Unless indicated otherwise, P. putida was cultured in a minimal medium M9 supplemented with MgSO4 (2.0 mM), citrate or succinate (0.2%) as the only carbon source and grown at 30°C. Plasmids were conjugally transferred from E. coli do P. putida with a tripartite mating procedure [48] using E. coli HB101 (RK600) as the helper strain. When required, growth media was supplemented with kanamycin (Km, 50 μg/ml) or chloramphenicol (Cm, 30 m/ml). All chemicals and substrates, including aromatic effectors (m-xylene, o-xylene, 3-methylbenzyl alcohol and 3-methyl benzoate) were purchased from Sigma-Aldrich.

Construction of reporter gene fusions

The TOL promoters Pu, Ps a Popoludnie were separately cloned in pSEVA226, a Km R broad host range vector (RK2 origin of replication) bearing a promoterless luxCDABE [49] operon downstream of the multiple cloning site of pUC (Silva-Rocha a kol., in preparation). To this end, each of the promoters of interest was amplified from P. putida mt-2 DNA through PCR reactions with Pfu DNA polymerase (Promega) using primer pairs PUF (5'-GCG GAA TTC TTG ATC AAA TC GA CA GG TG GT TAT G-3') and PUR (5'-GCG CGG ATC CGT CTC GTA TAG CTA GCA ACC GCC-3') for Pu, PSF (5'-GGC CGA ATT CAT TCC ATC TGC CAC TTT AG-3') and PSR (5'-CGG CCG GAT CCC GGT TCT CTT ATT TTA ATG TGG-3') for Ps, and PMF (5'-CGG CCG AAT TCG GTT TGA TAG GGA TAA GTC C-3') and PMR (5'-CGG CCG GAT CCT CTG TTG CAT AAA GCC TAA-3') for Popoludnie. These primers introduced in each case EcoRI a BamHI sequences in equivalent sites of the 5' and 3' regions of each promoter (underlined in the primer sequence). PCR products were purified, digested with EcoRI a BamHI (NewEngland BIolabs), ligated to pSEVA226 cleaved with the same enzymes and transformed in chemically competent E. coli CC118 cells. The resulting clones were named pSEVA226-Pu, pSEVA226-Ps and pSEVA226-Popoludnie. Sequence fidelity of the cloned promoters was verified in all cases by DNA sequencing.

Promoter activity quantification and data processing

The activity of the TOL promoters in response to inducers was examined with different procedures depending on the nature of the specific chemical tested. In case of soluble inducers (3MBA and 3 MBz), overnight grown P. putida cells harboring the reporter plasmid under examination were diluted 1:20 in fresh minimal media with the inducer of interest at a final concentration of 1 mM. 200 μl aliquots (with four replicates) of the thereby diluted cells were placed in 96-well Microplates (Optilux™, BD Falcon) and incubated in a Wallac Víctor II 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) at 30°C, the optical density at 600 nm (OD600) and the bioluminescence being recorded every 30 min. Promoter activity was quantified by normalizing bioluminescence in respect to cell density (i.e. bioluminescence/OD600). For testing volatile inducers (m-xylene and o-xylene), single colonies of P. putida clones bearing the reporter plasmids indicated were patched on M9/citrate agar plates, grown overnight an exposed to saturating vapors of a 1 M inducer solution in DMSO. Non-disruptive monitoring of promoter output was carried out with a VersaDoc™ Imaging System (BioRad) and the results processed with the ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). In either case, graphic representations of promoter activities were generated with MATLAB software (MathWorks).


Diskusia

SQ is one of the most abundant organosulfur compounds in the biosphere, following glutathione, Cys, and Met, and the global production of SQ is estimated at 10 gigatons per year (2, 22). Although the biosynthesis of SQ and SQDG in plants, algae, cyanobacteria, and archaea has been studied in considerable detail (e.g., 23, 24), much less is known about the degradation reactions and the recycling of the carbon and sulfur bound in SQ and SQDG. The lipid can easily be hydrolyzed by plant acyl-hydrolases, which liberate SQ-glycerol (1), and glucosidases can liberate SQ in the next step (25) however, it is still unclear whether higher plants are capable of splitting the carbon/sulfur bond in SQ at significant rates. Indeed, inorganic sulfate is the predominant source of sulfur for growth of plants and algae, for example, and plant growth can become sulfur/sulfate-limited, for example, in soils that are sulfur-deficient due to intensive agriculture and to the effective measures to reduce sulfur emissions to the atmosphere in recent years (26, 27) phytoplankton growth in freshwater environments can also become sulfate/sulfur-limited (28). The recycling of the sulfur bound in SQ is catalyzed by heterotrophic bacteria, which can easily be enriched from soil (5, 7 ⇓ –9), and involves the degradation intermediates DHPS and SL, but no release of sulfate, if SQ-utilizing bacteria are grown in pure culture (10 ⇓ –12). Later work demonstrated that SQ can be degraded completely by two-member bacterial communities, that is, by a primary degrader with transient release of SL or DHPS and a secondary degrader with release of sulfate (11, 12). Pathways for the degradation of DHPS and SL, including desulfonation, have been described (13, 15, 29) where, briefly, DHPS is oxidized to SL and the SL is mineralized via one of three known pathways and desulfonative enzymes [i.e., SL sulfolyase (SuyAB EC 4.4.1.24), sulfoacetaldehyde acetyltransferase (Xsc EC 2.3.3.15), cysteate sulfolyase (CuyA EC 4.4.1.25)]. However, details on the pathways, enzymes, and genes for the conversion of SQ to DHPS and SL were missing. A first pathway, sulfoglycolysis leading to DHPS, was found in E. coli K-12, and this pathway seems to be widespread in Enterobacteria (12). A second pathway, leading to SL, in a typical soil and freshwater bacterium, an isolate of P. putida, has been revealed in this study.

Strain SQ1 is able to access half of the carbon atoms of SQ for its heterotrophic aerobic growth through abstraction of a nonsulfonated C3-unit in the form of pyruvate, whereas the C3-organosulfonate half of the substrate is not dissimilated but excreted in the form of SL (Fig. 1 A a B). Four organosulfonate intermediates were detected (SGL, SG, KDSG, and SLA), and five corresponding enzymes were identified [NAD + -dependent SQ dehydrogenase, SGL lactonase, SG dehydratase, KDSG aldolase, and NAD(P) + -dependent SLA dehydrogenase]. Hence, this primary degradation pathway for SQ in P. putida SQ1 follows a catabolic route that resembles an Entner–Doudoroff pathway for SQ (Fig. 1 A a B), as was obviously suspected previously (10).

It is striking that the enzymes that catalyze the analogous reactions in either the SQ or GP Entner–Doudoroff pathway in P. putida SQ1 are encoded and regulated in different gene clusters (operons), as is the case with sulfoglycolysis and classical glycolysis in E. coli K-12 (12). It is even more surprising that most of these enzymes belong to different enzyme families. Only SG dehydratase and PG dehydratase belong to the same protein family [dihydroxy-acid/6-phosphogluconate dehydratases Cluster of Orthologous Groups (COG) 0129]. SQ dehydrogenase (0090) belongs to the NAD(P) + -dependent short-chain alcohol dehydrogenase family (COG1028), and thus to a different family than typical GP 1-dehydrogenases (COG0364). Further, the SGL lactonase (0091) is a sugar lactone hydrolase family protein (COG3386), whereas PGL lactonase is an archetypal glucosamine-6-phosphate isomerase/6-phosphogluconolactonase family protein (COG0363). The KDSG aldolase (0100) is a 2-keto-3-deoxyrhamnonate aldolase family protein (COG3836), and is most similar to 2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acid/4-hydroxy-2-oxovalerate aldolases of aromatic-ring cleavage pathways, whereas the KDPG aldolase is an archetypal KDPG/4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase family protein (COG0800). These phylogenetic differences are reflected in the observed substrate specificities of the enzymes of the SQ pathway, as far as tested in this study. It remains unclear which factors are responsible for the enzymes’ specificity for 6-deoxy-6-sulfo- (monoanionic) over 6-phospho-substituted (dianionic) substrate analogs, and thus for their recruitment into the pathway, but these questions can now be addressed.

The newly identified SQ degradation gene cluster of P. putida SQ1 also contains other genes that are likely to be involved in SQ utilization. Gene 0097 is predicted to encode a sulfite/small organosulfonate exporter (TauE PF01925) (30, 31), and this gene was cotranscribed during growth with SQ (Fig. 3C). Hence, gene 0097 most likely encodes for an inducible SL exporter. Gene 0094 is predicted to encode an alpha-glucosidase (COG1501 family 31 glycosyl hydrolase), and this gene was also cotranscribed (Fig. 3C) and highly coexpressed (Fig. 3 A a B), specifically during growth with SQ. Hence, we predict that gene 0094 encodes for hydrolysis of SQ-glyceride (e.g., for utilization of the whole sulfolipid SQDG as a growth substrate). Further, gene 0092 was cotranscribed (Fig. 3C) and is predicted to encode an aldose epimerase (COG2017), most likely for catalysis of the equilibrium of alpha- and beta-anomers of SQ such function would imply that the SQ Entner–Doudoroff pathway is anomer-specific. Finally, SQ transport might be encoded by the cotranscribed (Fig. 3C) predicted sodium/solute symporter (SSS) family transporter gene (0094) or by the predicted galactonate major facilitator superfamily (MFS) transporter gene (0098) the outer membrane porin (OMP) gene (0093) may be involved in degradation of SQDG.

Thirty genome sequences of P. putida strains are available for genome-wide comparisons within the IMG search platform (as of April 2015), and in three of these genomes, syntenic SQ gene clusters were found, as illustrated in Fig. 5 (in P. putida strains H8234, OUS82, and SJ3). Putative SQ-degradation gene clusters with homologs for the core genes identified in P. putida SQ1 were found in other gamma-Proteobacteria, and in beta- and alpha-Proteobacteria, but as differently assembled (nonsyntenic) gene clusters, as illustrated in Fig. 5. For some of these clusters, a corresponding SLA dehydrogenase candidate gene (indicated in red in Fig. 5) was not found however, the predicted SL exporter (TauE gene 0097 in strain SQ1) and alpha-glucosidase gene (0094) appeared to be conserved in most of these candidate SQ-gene clusters (indicated in gray in Fig. 5). Such gene clusters were found in genomes of species of (gamma-Proteobacteria) Vibrio, Aeromonas, and Enterobacteria (Serratia, Plesiomonas, Hafnia, Leminorella, a Edwardsiella) of (beta-Proteobacteria) Burkholderia, Janthinobacterium, a Herbaspirillum and of (alpha-Proteobacteria) Rhizobium, Ensifer, Microvirga, Salinarimonas, a Acidocella (obr. 5). Interestingly, some of these strains are isolated gut symbionts (e.g., the Enterobacteria strains Hafnia alvei ATCC51873, Leminorella grimontii DSM5078, Serratia sp. Ag2) and/or potential pathogens (e.g., Vibrio, Plesiomonas, Halomonas), whereas other strains represent typical marine- or saline-associated bacteria (e.g., Halomonas, Salinarimonas) and typical freshwater-, soil-, and plant rhizosphere-associated bacteria (e.g., Rhizobium, Ensifer, Herbaspirillum, Microvirga). Whether these isolated strains are indeed able to use SQ for growth, and whether utilization of SQ is indeed a relevant trait in the habitats from which these strains originated, needs to be addressed.

Illustration of the SQ-degradation gene cluster in P. putida SQ1 with its five identified core genes (A) and of homologous, predicted SQ-degradation gene clusters found in genomes of other P. putida, other gamma-Proteobacteria (B), and in beta- and alpha-Proteobacteria (C a D, respectively). Homologous gene clusters in bacterial genomes were retrieved from the Joint Genome Institute’s IMG database by the Gene Cassette Search tool and the Gene Neighborhood viewer. Shown are gene clusters that contain gene homologs for at least four of the five core enzymes of the SQ Entner–Doudoroff pathway (genes are indicated by color coding). Also, candidate genes for SL export and for a predicted SQ-glyceride (SQG) alpha-glucosidase (main text) were frequently found to be conserved within these homolog clusters (gene symbols in gray). Note that other candidate genes in the clusters are not specified in this figure (gene symbols in white) for example, more variable genes were predicted for outer membrane porins, other transporters, or regulation (Fig. 1C).