Informácie

8.7: Extrakcia DNA lícnych buniek - Biológia

8.7: Extrakcia DNA lícnych buniek - Biológia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Použitie Cytobrush

  1. Použite sterilnú cytokefku a vložte ju do úst.
  2. Prečistite si cytokefkou vnútornú stranu líca 25-krát.
  3. Krúživým pohybom premiešajte cytokefku v 100 μl suspenzie Chelex (10 % w/v).
  4. Umiestnite centrifugačnú skúmavku s Chelex a bunkovou suspenziou na 10 minút na 100 °C tepelný blok.
  5. Odstreďujte skúmavky pri maximálnej rýchlosti 5 minút.
  6. DNA je v supernatante. Vyhnite sa perličkám v spodnej časti.
  7. DNA skladujte pri -20 °C.

PCR s perličkami PCR

  1. Pridajte 22 μl zmesi primérov (vpred a vzad) ku guľôčkam.
  2. Uistite sa, že guľôčka je rozpustená.
  3. Pridajte 3 μl DNA.

8.7: Extrakcia DNA lícnych buniek - Biológia

Extrakcia DNA z lícnych buniek

upravila Roxane Bonner

Laboratórium molekulárnej systematiky a evolúcie University of Arizona

1. Intenzívne si 30 sekúnd šúchajte 15 ml Gatorade v ústach.

2. Pri švihaní si žuvajte líca, aby ste získali čo najviac buniek.

3. Pamätajte: viac buniek = viac DNA. Napľujte Gatorade späť do šálky a potom ju nalejte do novej 15 ml plastovej skúmavky.

4. Označte si skúmavku a viečko svojimi iniciálami. Nájdite si partnera a uistite sa, že každá má rovnaký objem.

5. V prípade potreby pridajte viac Gatorade, aby sa objemy vyrovnali. Umiestnite skúmavky oproti sebe do centrifúgy.

6. Skúmavky otočte 3-5 minút na maximum, aby sa bunky zhromaždili na dne skúmavky.

7. Nalejte kvapalinu do odpadovej nádoby. Opakujte kroky #1-4.

8. Nalejte Gatorade/Spit z vašej druhej ústnej vody do skúmavky s bunkami z vašej prvej ústnej vody.

9. Pridajte 2,0 ml lyzačného pufra do bunkovej pelety. Miešajte opatrným švihnutím skúmavky. VOLITEĽNÉ .

10. Pridajte 50 (l Proteinázy K (pozri učiteľ). Rýchlym pohybom skúmavky rozbite bunkovú peletu.

11. Inkubujte bunky pri 65-70 °C aspoň jednu hodinu, najlepšie cez noc. Pred pokračovaním by mal byť roztok číry a bunky by nemali byť viditeľné.

12. Pridajte 1,0 ml 5M NaCl. Dobre premiešajte a potom centrifugujte 10 minút pri vysokej rýchlosti.

13. Preneste kvapalinu do novej 15 ml skúmavky. Nenechajte veci na dne spadnúť do novej trubice. V prípade potreby použite čistú pipetu na prenesenie iba kvapaliny.

14. Pridajte 4 ml studeného 95 % etanolu do kvapaliny v novej skúmavke.

15. Dobre premiešajte jemným kývaním skúmavky dopredu a dozadu, kým nebude viditeľná DNA. Malo by to vyzerať ako jemné biele vlákna alebo vlákna.

Pokyny na extrakciu DNA z lícnych buniek:

Odpovedzte na všetky otázky celými vetami.

1. Ako sme zbierali bunkové pelety z roztoku ústnej vody?

2. Prečo majú niektorí ľudia väčšie bunkové pelety ako iní?

3. Prečo nevidíme bunkovú peletu, keď vyberieme skúmavky z vodného kúpeľa?

4. Aký bol účel každej z nasledujúcich zložiek?

  • Odstredivka
  • Lysis Buffer & Detergent
  • Vodný kúpeľ a teplo
  • Chlorid sodný (NaCl)
  • Etanol

5. Ukážte, kde sú tuky, sacharidy, bielkoviny a DNA v každej z nasledujúcich fáz.


Biológia OER

Cytobrush je malá kefka, ktorá sa tradične používa na vykonávanie pap testov. Sú sterilné a vhodné na jednorazové použitie vo vnútri úst. Kefky sa víria v roztoku guľôčok Chelex tak, aby chelatačné činidlá v roztoku neutralizovali pôsobenie dvojmocných katiónov na ochranu DNA. Umiestnenie týchto skúmaviek s bunkami a Chelex na vriaci tepelný blok je určené na sterilizáciu roztoku pre bezpečné pracovné podmienky. Alternatívou k tomuto použitiu Chelexu je vytesnenie buniek do lyzačného pufra, ktorý bunky roztrhne a ochráni DNA.

  1. Použite sterilnú cytokefku a vložte ju do úst
  2. 25-krát naneste cytokefku na vnútornú stranu líc
  3. Krúživým pohybom premiešajte cytokefou v 100 µl suspenzie Chelex (10 % w/v) alebo lyzačného pufra obsahujúceho EDTA
  4. Umiestnite centrifugačnú skúmavku s Chelex a bunkovou suspenziou na tepelný blok 100 °C na 10 minút
  5. Odstreďujte skúmavky pri maximálnej rýchlosti 5 minút
  6. DNA je v supernatante. (vyhnite sa korálkam v spodnej časti)
  7. Skladujte DNA pri -20 °C

2. Precipitácia DNA

Po rozpade bunkových a jadrových membrán je potrebné odstrániť molekuly lipidov. Laboratórny technik pridáva vysoko koncentrovaný soľný roztok. To spôsobí, že sa detergent a iné bunkové zvyšky, ako sú proteíny, vyzrážajú. Vyzrážať znamená vytvoriť pevnú látku, ktorá sa oddelí od roztoku.

DNA zostáva rozpustená v kvapalnom roztoku. Z bunkového odpadu ho možno odstrániť pomocou odstreďovanie. Pri odstreďovaní sa kvapalný roztok otáča vysokou rýchlosťou, takže zrazenina sa zhromaždí ako peleta na dne skúmavky. DNA, ktorá je stále rozpustená v kvapaline, sa môže presunúť do novej skúmavky. Alternatívne môže byť zrazenina odfiltrovaná z roztoku. Týmto spôsobom zostane tekutina obsahujúca DNA.

DNA v jadre je obalená okolo proteínov tzv históny. To pomáha usporiadať DNA do chromozómov. Na odstránenie histónových proteínov a proteáza možno pridať. Proteáza je enzým, ktorý rozkladá proteíny.


Extrakcia DNA z lícnych buniek

Extrakcia DNA z lícnych buniek
Gene Smith
29. februára 2013
ÚVOD
DNA, kyselina deoxyribonukleová, je genetickým materiálom každého živého organizmu a nachádza sa v jadre eukaryotických buniek. DNA sa často nazýva „plán života“, pretože obsahuje informácie potrebné na uskutočnenie všetkých živých procesov bunky (1). Účelom tohto laboratória bolo extrahovať DNA z ľudských lícnych buniek. Izolovaná DNA by sa mohla použiť na mapovanie alebo sekvenovanie, PCR, vyšetrovanie miesta činu alebo iné následné aplikácie (2). MATERIÁLY A METÓDY

Na extrakciu DNA z lícnych buniek sa do označenej 15 ml skúmavky pridali 3 ml vody. Vnútorná výstelka líca sa potom žuvala približne 30 sekúnd. 3 ml vody sa použili na vyplachovanie úst počas 30 sekúnd, potom sa voda a lícne bunky vytlačili späť do 15 ml skúmavky. Pomocou plastovej prenosovej pipety sa do skúmavky obsahujúcej vodu s lícnymi bunkami pridali 2 ml lyzačného pufra. Skúmavka sa potom uzatvorila a 5-krát jemne prevrátila, aby sa bunky lýzovali. Do vzorky sa pridalo päť kvapiek roztoku proteázy a soli. Skúmavka bola uzavretá a 5-krát obrátená. Vzorka bola inkubovaná vo vodnom kúpeli pri 50 °C počas 10 minút. Po inkubácii sa pomaly pridalo 10 ml studeného etanolu, pričom sa skúmavka držala pod uhlom 45°. Skúmavka bola umiestnená vzpriamene pri teplote miestnosti na päť minút, potom bola vzorka 5-krát prevrátená. Protokol extrakcie DNA a všetky materiály a činidlá poskytla spoločnosť Bio-Rad(2). VÝSLEDKY

Počas experimentu sa uskutočnilo množstvo pozorovaní. Voda obsahujúca lícne bunky mala biely alebo zakalený vzhľad. Po pridaní lyzačného pufra a proteázy sa roztok vyčíril. Po pridaní studeného etanolu bola viditeľná biela zrazenina. DISKUSIA

Extrakcia DNA z buniek je pomerne priamy a jednoduchý proces. Bežne sa vykonáva v laboratóriách a má množstvo následných aplikácií.


Čo potrebujete na extrakciu DNA:

Čo robíte:

1. Vytvorte soľný roztok v kadičke pridaním dvoch laboratórnych odmeriek soli do približne 25 ml destilovanej vody. Miešajte, kým sa soľ úplne nerozpustí.

2. Nalejte slanú vodu do papierového pohára.

3. Bez prehĺtania vypite sústo roztoku z papierového pohára a švihnite ním tam a späť po dobu najmenej 30 sekúnd, pričom si občas poškrabte zuby po vnútornej strane líc. Najlepšie je to urobiť s čistými ústami, t. j. nie hneď po obede.

4. Vypľujte roztok ústnej vody späť do pohára. Potom pohár ohnite do akejsi hubičky a nalejte vymytý roztok do skúmavky, kým nezaplní asi pol palca spodku skúmavky.

5. Opatrne pridajte dve kvapky tekutého mydla.

6. Nakloňte skúmavku približne o 45 stupňov, pomocou pipety (alebo kvapkadla na fľaštičku s alkoholom) pridajte 20 kvapiek vychladeného alkoholu tak, aby skĺzol po skúmavke bez narušenia roztoku. Keďže je menej hustý, alkohol bude sedieť na povrchu ústnej vody a mydlového roztoku.

7. Pevne nasaďte uzáver na skúmavku a veľmi pomaly a jemne ju trikrát nakloňte hore dnom a potom pravou stranou nahor. Robte to opatrne, aby ste neurobili bubliny.

8. Skúmavku nechajte jednu minútu nerušene sedieť vo vzpriamenej polohe. V tomto bode by ste mali začať vidieť medzi roztokom a alkoholom mliečnu bielu niť, prípadne popretkávanú bublinkami. To je vaša DNA! Po niekoľkých minútach by mala byť DNA suspendovaná v alkoholovej vrstve.

9. Ak si to želáte, vložte špajľu alebo miešaciu tyčinku do skúmavky a jemne okolo nej obtočte DNA.

10. Aby ste to ušetrili, opatrne ho zoškrabte do malej fľaštičky s niekoľkými kvapkami alkoholu. Uložené v mrazničke si môžete zachovať svoju DNA takmer neobmedzene!


Krok 1. Rozbitie buniek, aby sa uvoľnila DNA

Bunky vo vzorke sú od seba oddelené, často fyzikálnymi prostriedkami, ako je mletie alebo vortexovanie, a vložené do roztoku obsahujúceho soľ. Pozitívne nabité sodné ióny v soli pomáhajú chrániť negatívne nabité fosfátové skupiny, ktoré prebiehajú pozdĺž kostry DNA.

Potom sa pridá čistiaci prostriedok. Detergent rozkladá lipidy v bunkovej membráne a jadrách. DNA sa uvoľňuje, keď sú tieto membrány narušené.

Krok 2. Oddelenie DNA od proteínov a iných bunkových zvyškov

Na získanie čistej vzorky DNA je potrebné odstrániť čo najviac bunkových zvyškov. To možno vykonať rôznymi spôsobmi. Často sa pridáva proteáza (proteínový enzým) na degradáciu proteínov spojených s DNA a iných bunkových proteínov. Alternatívne je možné časť bunkového odpadu odstrániť filtráciou vzorky.

Krok 3. Zrážanie DNA alkoholom

Nakoniec sa do vzorky DNA opatrne pridá ľadovo vychladený alkohol (buď etanol alebo izopropanol). DNA je rozpustná vo vode, ale nerozpustná v prítomnosti soli a alkoholu. Jemným miešaním alkoholovej vrstvy sterilnou pipetou sa zrazenina stane viditeľnou a možno ju vytlačiť. Ak je tam veľa DNA, môžete vidieť vláknitú bielu zrazeninu.

Krok 4. Čistenie DNA

Vzorka DNA sa teraz môže ďalej purifikovať (vyčistiť). Potom sa resuspenduje v mierne alkalickom pufri a je pripravený na použitie.

Krok 5. Potvrdenie prítomnosti a kvality DNA

Pre ďalšiu laboratórnu prácu je dôležité poznať koncentráciu a kvalitu DNA.

Na stanovenie koncentrácie a čistoty DNA vo vzorke možno použiť hodnoty optickej hustoty získané spektrofotometrom. Alternatívne je možné použiť gélovú elektroforézu na preukázanie prítomnosti DNA vo vzorke a na indikáciu jej kvality.


Pozri si video: I put my DNA under the microscope and you can too. Amateur Science 139 (Jún 2022).