Informácie

Odstránenie počiatočného metionínu vo Venuši pre FRET

Odstránenie počiatočného metionínu vo Venuši pre FRET



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pracujem na vytvorení niekoľkých reportérov FRET. Okrem miesta štiepenia (rôzne zloženie od 15-18AA), 1 AA linker, používam Venus a Cerulean.

Spočiatku som sa obával, že 18AA bude príliš dlhý, ale v skutočnosti dáva spravodlivý signál. Pre porovnanie, verím, že Försterov polomer (Ro) je 54 Á.

Teraz pracujem na ďalšej optimalizácii. Spôsobuje odstránenie počiatočného metionínu nejaké problémy pre Venušu, ak je to druhý proteín v páre FRET? Základné rozloženie je:

Cerulean - Odkaz - Štiepenie - Odkaz - Venuša

A som zvedavý, či by mi odrezanie Met z Venuše nepriblížilo 1 AA a teda o niečo lepší signál. Videl som to publikované oboma spôsobmi a bol som zvedavý, či niekto skúšal oboje alebo len teoreticky vedel, že na tom nezáleží.


Aktivovaný proteín Ras urýchľuje progresiu bunkového cyklu, aby narušil cystogenézu obličiek psov Madin-Darby*

V mnohých ľudských rakovinových bunkách je K-RAS často konštitutívne mutovaný a aktivovaný, čo kulminuje v indukcii kontinuálneho bunkového rastu, čo je charakteristický znak rakovinových buniek. Stále však nie je jasné, ako mutovaný K-RAS indukuje morfologické abnormality v rakovinových tkanivách. Na preskúmanie mechanizmu, ktorý je základom morfologických zmien vyvolaných K-RAS, sme použili auxín-dependentný proteínový expresný systém, ktorý nám umožnil rýchlo vyvolať a vyhodnotiť konštitutívne aktívny K-Ras v cystách MDCK (Madin-Darby psie obličky), model. pre polarizovanú štruktúru epitelu. Bunky nesúce konštitutívne aktívne KRasV12 gén boli morfologicky nerozoznateľné od normálnych buniek v dvojrozmernej kultúre. V géli extracelulárnej matrice však bunky exprimujúce KRasV12 nedokázali vytvoriť sférickú cystu. Keď bola indukcia KRasV12 odložená až po vytvorení cysty, niektoré bunky v stene cysty stratili polaritu a boli vytlačené do luminálneho priestoru a akumulované v ňom. S efektorovo špecifickými mutantmi KRasV12 a inhibítormi pre MEK a PI3-kinázu sme zistili, že obe osi Raf-MEK-ERK aj PI3-kinázy sú nevyhnutné a dostatočné pre tento fenotyp. Zobrazovanie živých buniek s indikátormi bunkového cyklu ukázalo, že expresia KRasV12 podporovala progresiu bunkového cyklu, čomu zabránili inhibítory MEK alebo PI3-kinázy. Z týchto výsledkov poskytujeme model, v ktorom aktívny-Ras indukuje progresiu bunkového cyklu vedúcu k apikálnej bunkovej extrúzii prostredníctvom Raf a PI3-kinázy kooperatívnym spôsobom. Tu vyvinutý systém možno použiť na skríning liekov na rôzne druhy rakoviny pochádzajúce z epitelových buniek.

Táto práca bola podporená grantmi Ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a techniky Japonska a Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research.

Podporené výskumnými štipendiami od Japonskej spoločnosti na podporu vedy pre mladých vedcov.


Nástroje s jednou molekulou, časť B: Super-rozlíšenie, sledovanie častíc, viacparametrové a silové metódy

Michael A. Thompson, . W.E. Moerner, v Metódy v enzymológii, 2010

2.4 EYFP ako fotoprepínateľný žiarič

Použitie EYFP ako fotoprepínateľného žiariča výrazne rozširuje počet biologických vzoriek okamžite dostupných na zobrazovanie v super rozlíšení. Vo väčšine hlásených PALM zobrazovaní bol fotoaktivovateľný fluorescenčný proteín vybraný z rôznych sofistikovaných konštruktov, ako sú PA-GFP, Dronpa, Kaede, tdEosFP, Dendra2, rsFastLime, PA-mCherry a rsCherryRev (Betzig a kol., 2006 Geislerová a kol., 2007 Niu a Yu, 2008 Stiel a kol., 2008 Subach a kol., 2009). Ukázalo sa však, že jednotlivé imobilizované a zjavne vybielené žlté FP (S65G, S72A, T203Y alebo S65G, S72A, T203F) sa reaktivujú fialovým svetlom pred viac ako 10 rokmi (Dickson a kol., 1997) a blízko príbuzný zosilnený žltý fluorescenčný proteín EYFP (S65G, V68L, S72A, T203Y) sa nedávno použil na zobrazovanie živých buniek PALM C. crescentus štruktúrny proteín MreB (Biteen a kol., 2008). EYFP sa široko používa na rutinné fluorescenčné proteínové fúzie v dôsledku absencie fyziologických porúch, ako je aglomerácia a nesprávna lokalizácia, a N-terminálne fúzie EYFP-MreB sa predtým ukázali ako funkčné v C. crescentus a iné baktérie, vďaka čomu je tento systém fyziologicky relevantný (Carballido-López a Errington, 2003 Figge a kol., 2004 Gitai a kol., 2004). Okrem toho zobrazovanie s jednou molekulou EYFP-MreB s excitáciou 514 nm už predtým ukázalo, že tento fluorescenčný proteín je jasný žiarič s jednou molekulou na zobrazovanie živých buniek ( Kim a kol., 2006 ).

Obrázok 2.5 ukazuje fotoreaktiváciu EYFP v živých bunkách ( Biteen a kol., 2008). Obrázok 2.5A zobrazuje jeden zobrazovací rámec, v ktorom je fluorescenčný obraz prekrytý cez negatívny kontrastný obraz prenosu bieleho svetla C. crescentus bunka. Dve jednotlivé molekuly EYFP-MreB možno identifikovať v paneli A, ktorý bol získaný po počiatočnom kroku bielenia. Po ďalšom zobrazovaní svetlom 514 nm boli všetky fluorofóry vybielené, ako bolo pozorované na paneli B. Reaktivácia EYFP sa dosiahla po tomto počiatočnom kroku bielenia podaním 2-sekundovej dávky 407 nm laserového osvetlenia. Táto dĺžka impulzu, ako aj intenzita reaktivácie 10 3 – 10 4 W cm − 2 bola zvolená tak, aby sa v každej oblasti obmedzenej na difrakciu reaktivovala maximálne jedna molekula EYFP a aktivoval sa iný podsúbor molekúl EYFP v každý cyklus tohto procesu.

Obrázok 2.5. Reaktivácia fúzií EYFP-MreB v živých bunkách C. crescentus. (A) Jednotlivé akvizičné snímky 100 ms zobrazujúce izolované molekuly EYFP-MreB (a, c a e) po fotoaktivácii a bez emisie jednej molekuly (b, d, f) po odfarbení svetlom. Miesto v ľavom dolnom rohu každého obrázka je obrazový artefakt. (B) Hromadná reaktivácia vzorky 22 buniek. Sivé čiary označujú 2-sekundové impulzy svetla 407 nm. (Upravené a reprodukované so súhlasom Biteena a kol., 2008. Copyright 2008 Nature Publishing Group.)

Na obr. 2.5B je celková intenzita emisií z 22 živých C. crescentus bunky exprimujúce EYFP-MreB sa zobrazuje ako funkcia času. Po počiatočnom období bielenia boli medzi zobrazovacími cyklami aplikované záblesky aktivačnej energie 407 nm. Tieto reaktivačné cykly sa použili na výpočet kvantového výťažku fotoreaktivácie fluorofóru EYFP. Nameraný vzťah medzi časom aktivácie a percentom reaktivácie je možné vykresliť a je kvázilineárny. V meraniach EYFP-MreB v priamom prenose C. crescentus 370 fotónov absorbuje každá molekula EYFP za sekundu aktivačného impulzu. Zo sklonu grafu bol zistený kvantový výťažok reaktivácie 1,6 × 10 –6 pre EYFP ( Biteen a kol., 2009). Toto číslo je v rovnakom ráde ako aktivačný kvantový výťažok pre PA-GFP a len o 1 rád menšie ako kvantový výťažok fotoprepínania vysoko upraveného proteínu, tdEos (pozri tabuľku 2.1). EYFP je preto možné považovať za užitočný fotoprepínateľný fluorofór na zobrazovanie v super rozlíšení.


Úvod

Centralspindlin je evolučne konzervovaný, konštitutívny 2:2 heterotetramérny komplex kinezín-6 podjednotky MKLP1 a nemotorickej podjednotky CYK4. V tomto článku budeme používať termín „MKLP1“ na spoločné označenie ortológov cicavcov KIF23/MKLP1 [1], ako napr. Caenorhabditis elegans ZEN-4 a výraz „CYK4“ na označenie ortológov C. elegánov CYK-4 [2], ako je cicavčí RACGAP1/MgcRacGAP [3]. Centralspindlín hrá podstatnú úlohu v cytokinéze tým, že tvorí centrálne vretienkové a stredné mikrotubulové zväzky, prijíma a reguluje rôzne faktory v mieste delenia a ukotvuje plazmatickú membránu v medzibunkovom mostíku, zatiaľ čo dcérske bunky čakajú na abscisiu [4–11 ]. Bodová mutácia v KIF23/MKLP1 je príčinou vrodenej dyserytropoetickej anémie typu III, ktorá je charakterizovaná veľkými mnohojadrovými erytroblastmi v kostnej dreni [12]. Obidve podjednotky MKLP1 a CYK4 sú nevyhnutné pre zviazanie mikrotubulov centrálnym vretenom [3,13]. In vitro ani samotný MKLP1, ani samotný CYK4 nemôžu účinne spájať mikrotubuly. Deplécia buď komponentných alebo bodových mutácií, ktoré ovplyvňujú tvorbu heterotetraméru centrálneho vretienka, spôsobuje in vivo defekty centrálneho vretienka [2,3,14–19]. Prekvapivo, aj keď genetické skríningy v C. elegánov pre supresory takýchto komplex-narušujúcich mutácií (S15L v CYK-4 alebo D520N v ZEN-4) doteraz identifikovali 15 nezávislých bodových mutácií, všetky sa nachádzajú v obmedzených oblastiach CYK-4 12–39 a ZEN-4 477–515. Je pravdepodobné, že tieto zistenia definujú väzbové rozhrania medzi týmito podjednotkami [3,13] (zhrnuté na obrázku 1A). Tieto sú zahrnuté v minimálnych doménach CYK-4 a ZEN-4 postačujúcich na in vitro rekonštitúciu stabilného komplexu medzi nimi (CYK-4 1–120 a ZEN-4 435–555). Tieto údaje zdôrazňujú dôležitosť tvorby heterotetraméru pre zväzovanie mikrotubulov a naznačujú, že zostava tetraméru sa dosahuje prostredníctvom kompaktných domén bez rozsiahleho kontaktu, ako je dlhý zväzok so štyrmi špirálami. Zostáva však nejasné, ako CYK4 prispieva k viazaniu mikrotubulov.

(A) Schéma doménových štruktúr CYK-4 a ZEN-4 a ich fragmentov exprimovaných ako fúzne proteíny s purifikačnými značkami, ktoré boli odstránené počas purifikácie. Purpurové a azúrové vertikálne segmenty označujú zvyšky, ktorých mutácia narúša interakciu CYK-4–ZEN-4 a ktorých mutácia potláča defekt interakcie. Očakávané správanie konštruktov ZEN-4 pri dimerizácii, mikrotubulárnej väzbe (MT-väzba) a zhlukovaní sú uvedené (+ alebo –) na základe predchádzajúcich výsledkov [13,34], s výnimkou mikrotubulovej väzby Z555AN (*), ktoré je založená na výsledkoch opísaných nižšie. CC1, CC2: coiled coil predpovedaný s vysokou a nízkou tendenciou, v tomto poradí C1: C1 doména RhoGAP: Rho-rodina GTPázu aktivujúca proteínová doména Kinezín: kinezínová motorická doména ARFB: ARF6-väzbová doména [9,10], BIO: 20 aa biotinylácia tag. (B–E) Proteínové prípravky použité v tejto štúdii boli spustené na géloch SDS-PAGE a vizualizované farbením Coomassie. Všimnite si, že verzia Z601 použitá v Z601/C120, ktorej chýba biotinylačná značka, vykazovala o niečo väčšiu mobilitu ako verzie použité samostatne alebo v komplexe s C40G.

Hoci MKLP1, kinezín-6 [20], má na svojom N-konci motorickú doménu kinezínu, odlišuje sa od iných N-koncových kinezínov (N-kinezínov). V kinezínoch-1, -2, -3, -4, -5 a -7 je katalytické jadro, ktoré obsahuje vrecko viažuce ATP a povrch viažuci mikrotubuly, pripojené k vinutému vinutiu pomocou krátkej konzervovanej sekvencie. motív asi 15 aa, takzvaný „krčný linker“ [21–23]. Krčný linker sa ukotví ku katalytickému jadru spôsobom obojsmerne spojeným s nukleotidovými a mikrotubulovými väzbovými stavmi katalytického jadra. Preto hrá rozhodujúcu úlohu pri vytváraní sily jednotlivými motorickými doménami a v mechanochemickej koordinácii medzi dvoma hlavami v diméroch kinezínu chôdze. Zaujímavé je, že MKLP1 nemá rozpoznateľný krčný linker. Namiesto toho je katalytické jadro MKLP1 pripojené k špirálovej cievke prostredníctvom dlhšej „krčnej“ sekvencie 60–70 aa, ktorá obsahuje rozptýlené helixové/coil-breaking prolínové zvyšky („MKLP1“ na obrázku S1) [3]. Dôležité je, že táto oblasť krku MKLP1 obsahuje väzbové miesto CYK4. Kvôli týmto neobvyklým mechanistickým vlastnostiam je veľmi zaujímavá molekulárna štruktúra heterotetramérneho centrálneho spindlínového komplexu CYK4 a MKLP1. Hoci nedávna štúdia využívajúca elektrónovú paramagnetickú rezonančnú spektroskopiu zaznamenala zmenu v mobilite zvyškov krku ZEN-4 po väzbe CYK-4 [24], zostáva nejasné, ako to ovplyvňuje konfiguráciu dvoch motorických domén a ako to moduluje viazanie mikrotubulov komplex.

Tu sme vykonali priamu vizualizáciu dynamickej štruktúry centrálneho vretena pomocou mikroskopie atómovej sily. Naše údaje naznačujú, že väzba CYK4 na krčnú doménu diméru MKLP1 remodeluje konfiguráciu medzi dvoma motorickými doménami. Okrem toho pomocou funkčných testov in vitro demonštrujeme, že táto rekonfigurácia optimalizuje centrálny spindlinový komplex na tvorbu a akumuláciu v antiparalelných mikrotubulových zväzkoch, ktoré sú kľúčové pre cytokinézu.


2 VÝSLEDKY A DISKUSIA

Pretože MetQ má vysokú afinitu k l-metionínu, príprava apo-MetQ vyžaduje cykly rozbaľovania a opätovného skladania, aby sa odstránil naviazaný ligand. 11 Ako alternatívny prístup je možné použiť mutáciu Asn229 na Ala (N229A) vo väzbovom vrecku E. coli Zistilo sa, že MetQ podstatne znižuje afinitu k metionínu, čím značne uľahčuje prípravu formy MetQ bez substrátu. Napriek rozsiahlemu úsiliu s oboma prístupmi sa nám nepodarilo kryštalizovať formu bez substrátu E. coli MetQ. Pri skríningu štrukturálne charakterizovaných MetQ z RCSB Protein Data Bank sa nám podarilo pripraviť a kryštalizovať formu bez substrátu. N. meningitída MetQ (PDB 3IR114), obsahujúci mutáciu Asn na Ala na zvyšku 238 (N238A zodpovedajúci N229A E. coli MetQ) na prerušenie väzby substrátu. Pretože tento asparagínový zvyšok interaguje s a-amino aj a-karboxylovými skupinami 1-metionínu, dalo by sa očakávať, že mutácia na alanín významne zhorší väzbu ligandu. Štúdie izotermickej titračnej kalorimetrie (ITC) väzby ligandu na divoký typ a formy N238A N. meningitída MetQ kvantifikuje vplyv tejto mutácie na väzbu l-metionínu s disociačnou konštantou (Kd) meniace sa faktorom viac ako 105, z 0,2 nM na 78 μM je tiež narušená väzba d-metionínu, ale v menšej miere ako Kd sa mení z 3,5 na 240 μM (obrázok 1 a tabuľka 1).

Proteíny Ligandy Kd (μM) ΔH (kJ mol −1 ) Nekompetentná frakcia a Nekompetentná frakcia je frakcia MetQ, ktorá zjavne nie je schopná viazať sa na titran.
Divoký typ l-metionín 0,00020 [0,00017, 0,00034] b b V hranatých zátvorkách sú uvedené asi 68,3 % intervaly spoľahlivosti určené projekciou chybového povrchu 18.
−83 [−84, −81] 0,06 [0,049–0,067] b b V hranatých zátvorkách sú uvedené asi 68,3 % intervaly spoľahlivosti určené projekciou chybového povrchu 18.
Divoký typ d-metionín 3.5 [2.5, 4.6] −55 [−57, −53] 0,06 [0,049–0,067] b b V hranatých zátvorkách sú uvedené asi 68,3 % intervaly spoľahlivosti určené projekciou chybového povrchu 18.
N238A l-metionín 78 [69, 89] −42 [−50, −37] 0,04 [0, 0,067] b b V hranatých zátvorkách sú uvedené asi 68,3 % intervaly spoľahlivosti určené projekciou chybového povrchu 18.
N238A d-metionín 240 [190, 310] −31 [−34, −29] 0,31 [0,28–0,34] b b V hranatých zátvorkách sú uvedené asi 68,3 % intervaly spoľahlivosti určené projekciou chybového povrchu 18.
  • Skratka: ITC, izotermická titračná kalorimetria.
  • a Nekompetentná frakcia je frakcia MetQ, ktorá zjavne nie je schopná viazať sa na titran.
  • b V hranatých zátvorkách sú uvedené asi 68,3 % intervaly spoľahlivosti určené projekciou chybového povrchu 18.

Kryštalická štruktúra N238A MetQ bez substrátu bola stanovená pri rozlíšení 1,56 å (obrázok 2a, PDB 6CVA) a odhaľuje otvorenú konformáciu s prístupnou dutinou substrátu. Superpozícia jednej domény MetQ viazaného na l-metionín (PDB: 3IR1) na zodpovedajúcej doméne N238A MetQ bez substrátu odhaľuje 42° rotáciu typu pántu, ktorá oddeľuje dve domény SBP a otvára dutinu viažucu substrát (obrázok 2b). Tento pohyb závesu „pasca na muchy Venuše“ kontrastuje s pohybom pozorovaným pre vzťah medzi ligandovým MetQ a MetQ bez substrátu v komplexe MetNIQ, ktoré sú spojené 24° otočením okolo osi kolmej na rozhranie medzi dvoma lalokmi. 7 Stredná kvadratická odchýlka (rmsd) v polohách Ca medzi N238A bez substrátu a formou viazanou na l-metionín N. meningitidis MetQ je 3,7 å, zatiaľ čo zodpovedajúca rmsd medzi dvoma formami MetQ bez substrátu (N238A a konformácia MetQ v komplexe s MetNI, PDB 6CVL) je 4,4 å.

MetQ sa môže viazať na iné deriváty metionínu, vrátane d-metionínu, ale príprava týchto foriem bola komplikovaná vysokou afinitou k l-metionínu. Napríklad predchádzajúce úsilie o kryštalizáciu MetQ viazaného na d-metionín vykonal Yang a kol. 14 pestovaním auxotrofu metionínu E. coli Kmeň B384 v médiu obsahujúcom 50 mg L -1 d-metionínu. V dôsledku prítomnosti racemáz aminokyselín v E. colizískali však štruktúru viazanú na l-metionín. 14 Preto ku kryštalizácii viazaný d-metionín N. meningitída MetQ sme vyvinuli alternatívny prístup rozvinutím/opätovným zložením MetQ počas čistenia MetQ, aby sa odstránil endogénne viazaný l-metionín. Vzorka nezvinutého/znovu poskladaného MetQ sa potom pred kryštalizáciou zmiešala s 10 mM d-metionínu. Kryštalická štruktúra MetQ viazaného na d-metionín bola vyriešená pri rozlíšení 1,68 Á s jasnou hustotou d-metionínu vo väzbovej dutine (tabuľka 2, PDB 6DZX). V asymetrickej jednotke kryštálu MetQ viazaného na d-metionín je prítomných šesť molekúl. Ako kontrola sme určili aj štruktúru väzby l-metionínu N. meningitída MetQ kryštalizoval za podobných podmienok (tabuľka 2, PDB 6OJA). Superpozícia štruktúr MetQ viazaných na l- a d-metionín odhaľuje ich podobnú konformáciu, s rmsd ~0,1 å (obrázok 3a). Zatiaľ čo tieto štruktúry sú podobné predtým určenej štruktúre 3IR1, 14 rmsd ∼ 0, 4 Á, priestorové skupiny a interakcie balenia sú v týchto dvoch štúdiách odlišné.

Nie je prekvapením, že l- a d-metionín sa viažu na rovnaké miesto, pričom interagujú s rovnakým súborom konzervovaných zvyškov. Toto pozorovanie je konzistentné pre všetkých šesť molekúl MetQ prítomných v asymetrickej jednotke. α-amino a α-karboxylové skupiny l- a d-metionínu interagujú so zvyškami R156, N213 a N238 umiestnenými na jednej doméne MetQ, zatiaľ čo z druhého laloku sa zvyšky Y81, F98, H100 a Y103 zhromažďujú okolo metionín tioéterová skupina (obrázok 3b). Tieto väzbové zvyšky sú medzi rôznymi bakteriálnymi homológmi MetQ vysoko konzervované. 11-14 Zdá sa, že vodíkové väzby medzi bočným reťazcom N238 a metionínovými a-amino a a-karboxylovými skupinami významne prispievajú k väzbovej afinite, pretože mutácia tohto zvyšku na alanín oslabuje väzbu l-metionínu o viac ako 105. Napriek väzbe na rovnaké miesto na MetQ sa podrobné interakcie pre d- a l-metionín líšia, čo sa odráža v ~104-násobnom rozdiele v Kd hodnoty. Pôvod tohto rozdielu vo väzbovej afinite je ťažké identifikovať, pretože sieť vodíkových väzieb zahŕňajúca a-amino a a-karboxylové skupiny je medzi týmito dvoma štruktúrami do značnej miery nezmenená, vrátane umiestnenia molekúl vody (obrázok 3c). Krátke kontakty na metionínovú CB skupinu sú pozorované v oboch štruktúrach, s približne 3,3 å vzdialenosťami pozorovanými k Y98 CO v l-metionínovej štruktúre a k Y81 OH skupinám v d-metionínovej štruktúre. Bočné reťazce l- a d-metionínu majú odlišné rotamérne konformácie pre torzné uhly N-Cα-Cβ-Cγ Ca-Cβ-Cγ-Sδ a Cβ-Cγ-Sδ-Cε, ktoré sú približne -175°, -175 °, a -70 ° pre l-metionín a +170 °, -80 ° a -60 ° pre d-metionín, posledné hodnoty zodpovedajú -170 °, +80 ° a + 60 ° pre l - metionín. Preto, zatiaľ čo l- a d-metionín vykazujú odlišné rotaméry „ttm“ a „tpp“, tieto rotaméry sa nachádzajú v porovnateľnom množstve v proteínoch (asi 6 % každý 19 ), čo naznačuje, že konformácia torzného uhla bočného reťazca významne neprispieva k rozdiely vo väzbovej afinite (pre porovnanie, najbežnejší metionínový rotamér je „mmm“ s frekvenciou 20 %). V dôsledku toho, zatiaľ čo existujú rozdiely v detailoch väzbových interakcií medzi l- a d-metionínom k ​​NmMetQ, kvalitatívne vyhodnotenie neidentifikuje žiadny zjavný znak, ktorý by dominoval rozdielom vo väzbových afinitách pre tieto dva ligandy.

Vyššia afinita MetNI naviazaného na ATP pre MetQ bez ligandu nie je prekvapujúca vzhľadom na vysokú afinitu MetQ k l-metionínu (sú spolučistiť) a nutnosť disociovať ligand z MetQ, aby došlo k transportu.

Doteraz boli pre MetQ charakterizované tri odlišné konformačné stavy: jedna ligandová a dve formy bez ligandu. Zistenia nedávnej štúdie FRET s jednou molekulou, ktorá ilustruje konformačnú bohatosť SBP a úlohu konformačnej dynamiky pri transporte substrátu, 20 naznačujú, že možno identifikovať ďalšie konformácie MetQ, možno pre väčšie deriváty metionínu s modifikovanými aminoskupinami alebo karboxylovými skupinami, 1 -4 alebo v komplexoch s rôznymi stavmi transportéra MetNI. Táto štúdia poskytuje základ pre riešenie spojenia medzi konformáciou MetQ, afinitami MetQ pre MetNI a deriváty metionínu, čo je jadrom špecificity transportu ligandu metionínovým transportérom, dôležitým ďalším krokom je definovanie ich kinetiky. interakcie a dešifrovanie toho, ako je hydrolýza MgATP spojená s translokáciou ligandu.


Poďakovanie

Ďakujeme S. R. Adams a J. Babendure za ich pripomienky k rukopisu. Táto práca bola podporená grantom National Institutes of Health pre R.Y.T. a postdoktorandské štipendium pre A.Y.T., grant od Alliance for Cellular Signaling (pre J.Z. a R.Y.T.) a Howard Hughes Medical Institute. J.Z. je čiastočne podporovaná postdoktorandským štipendiom od La Jolla Interfaces in Science a Burroughs Wellcome Fund a R.E.C. je čiastočne podporovaná postdoktorandským štipendiom od Kanadských inštitútov pre výskum zdravia.


Obr

(a) Excitácia a (b) emisná anizotropia Cerulean v ustálenom stave. Vysoká hodnota anizotropie emisie, > 0,3, naznačuje obmedzenú flexibilitu fluorofóru v rámci proteínovej štruktúry. Rýchly pokles anizotropie excitácie je v súlade s FRET medzi aromatickými aminokyselinami a fluorescenčným proteínovým chromoforom.


Kapitola 6 - Geneticky kódované sondy na meranie intracelulárneho vápnika

Malé fluorescenčné molekuly snímajúce vápnik boli mimoriadne užitočné pri mapovaní vnútrobunkových vápnikových signálov v čase a priestore, ako to potvrdzujú kapitoly v tomto zväzku. Napriek ich širokému prijatiu a využiteľnosti trpia niektorými nevýhodami. Sú žiaduce geneticky kódované vápnikové senzory, ktoré môžu byť exprimované vo vnútri buniek transfekciou alebo transgenézou. Posledných 10 rokov sa v laboratóriu vyznačovalo rýchlym vývojom geneticky kódovaných vápnikových senzorov obrazne aj doslova, výsledkom čoho bolo 11 odlišných konfigurácií fluorescenčných proteínov a ich sprievodných modulov vápnikových senzorov. Tu je logika dizajnu a výkon tejto bohatej zbierky senzorov a ich in vitro a in vivo je popísané použitie a výkon. Geneticky kódované vápnikové senzory sa ukázali ako cenné pri meraní koncentrácie vápnika v bunkových organelách, väčšinou v jednotlivých bunkách. in vitro. Ich úspech ako kvantitatívnych senzorov vápnika v tkanivách in vitro a in vivo je kvalifikovaný, ale ukázali sa ako cenné pri zobrazovaní vzoru vápnikových signálov v tkanivách celých zvierat. Niektoré vetvy evolučného stromu vápnikových senzorov sa naďalej rýchlo vyvíjajú a neustály pokrok v optimalizácii parametrov senzorov vedie k istej nádeji, že tieto nevýhody nakoniec odstráni ďalšie genetické inžinierstvo.


Abstraktné

Deubikvitinačné enzýmy (DUB) sú proteázy, ktoré plnia kľúčové úlohy v systéme ubikvitínu (Ub) dekonjugáciou Ub z jeho cieľov a rozkladom polyUb reťazcov. Špecifickosť DUB voči jednej z polyUb reťazových väzieb do značnej miery určuje konečnú signalizačnú funkciu. Predstavujeme novú sadu diubikvitínových sond FRET, ktorá obsahuje všetkých sedem izopeptidových väzieb, na absolútnu kvantifikáciu špecificity štiepenia reťazca DUB pomocou kinetiky Michaelis–Menten. Každá sonda je vybavená párom FRET pozostávajúcim z rodamínu 110 a tetrametylrodamínu, čo umožňuje plne syntetickú prípravu sond pomocou SPPS a NCL. Naša syntetická stratégia zahŕňa zavedenie N,N′𠄋oc𠄌hránený 5‐karboxyrodamín ako vhodný stavebný blok v chémii peptidov. Hodnotu našich sond demonštrujeme kvantifikáciou väzbových špecifík panelu deviatich DUB vysokovýkonným spôsobom.

Ubikvitín (Ub), proteín so 76 aminokyselinami, je posttranslačný modifikátor, ktorý je rozhodujúci pre širokú škálu bunkových procesov vrátane degradácie proteínov, prenosu a signalizácie.1 Ub je vo všeobecnosti pripojený k amín v bočnom reťazci lyzínového zvyšku v cieľovom proteíne, čím sa vytvorí izopeptidová väzba. Cieľové proteíny sú často modifikované reťazcom polyUb, v ktorom sú viaceré moduly Ub postupne spojené na N  konci (lineárny polyUb) alebo na ktoromkoľvek zo siedmich vnútorných lyzínových zvyškov (polyUb spojený s izopeptidom‐: K6, K11, K27, K29, K33 , K48 a K63). Typ polyUb reťazca do značnej miery určuje jeho signalizačnú funkciu.1

Ubikvitinácia je sprostredkovaná spoločným pôsobením troch enzýmov, E1 (aktivačný), E2 (konjugačný) a E3 (ligáza), ktorých konkrétna kombinácia poskytuje špecifickosť pre proteínový cieľ alebo topológiu polyUb reťazca. Odstránenie Ub z jeho cieľov a demontáž polyUb reťazcov sú katalyzované deubikvitinačnými enzýmami (DUB). Bolo identifikovaných asi 100 ľudských DUB2, niektoré vykazujú špecifickosť väzby Ub. Pôsobenie DUB môže zachrániť proteíny pred proteazomálnou degradáciou a zmeniť signalizačné funkcie Ub prostredníctvom remodelácie reťazca väzbovo špecifickým spôsobom.1 Syntéza diubikvitínu (diUb) umožnila študovať spracovanie pomocou DUB.3 Aby sa určila špecifickosť, DUB možno inkubovať buď s natívnou molekulou diUb4 alebo so sondou5 danej väzby založenou na aktivite diUb. Súčasné metódy však neumožňujú rýchlu a absolútnu kvantifikáciu špecificity väzby DUB a okrem toho nemôžu túto špecificitu rozdeliť na väzbovú afinitu a rýchlosť katalytického obratu (K m a k katv Michaelis–Menten kinetike).

Aplikácia FRET párov sa ukázala ako užitočná pri štúdiu aktivity DUB, konformácie reťazca Ub a proteínov interagujúcich s Ub‐.6 Aby sme preskúmali špecificitu štiepenia reťazca naprieč všetkými izopeptidovými väzbami, vyvinuli sme úplnú chemickú syntézu všetkých siedmich diUb FRET párov. Tieto páry nesú nový pár farbív vhodný pre FRET a kompatibilný so syntézou peptidov na pevnej fáze (SPPS). Rozhodli sme sa K m a k kat hodnoty väzobne‐špecifických DUB, ktoré sa používajú pri analýze obmedzenia reťazca Ub,7 s cieľom získať prehľad o ich katalytickom pôsobení.

V teste založenom na FRET‐ (obrázok  1) sa činidlá skladajú z dvoch modulov Ub, z ktorých jeden je vybavený donorovým fluorofórom a druhý akceptorom, ktoré sú špecificky spojené natívnou izopeptidovou väzbou ku každému zo siedmich lyzínových zvyškov. Usúdili sme, že najlepšou pozíciou na pripojenie fluorofóru by bol N koniec oboch modulov Ub, pretože vzdialenosť medzi N koncami sa pohybuje od 30 do 50 Å, na základe dostupných kryštalografických údajov (tabuľka S1 Informácie), ideálna vzdialenosť pre FRET. Pretože fluorofóry musia byť kompatibilné so všetkými syntetickými krokmi (pozri nižšie), vyvinuli sme nový pár FRET s použitím 5‐karboxyrodamínu110 (Rho) ako donoru a 5‐karboxytetrametylrodamínu (TAMRA) ako akceptora. Fluoresceín, bežnejšie používaný donor FRET, bol pôvodne skúšaný, ale ukázal sa ako nekompatibilný s krokom odsírenia v konečnom kroku syntézy (pozri nižšie), a preto bol nahradený Rho. Po pridaní DUB sa dvojica diUb FRET štiepi, čo vedie k strate signálu FRET a tým k zvýšeniu donorovej emisie.

Princíp testu štiepenia diUb na báze FRET‐. Po štiepení páru diUb FRET pomocou DUB sa signál FRET stratí.

Veľkým problémom pri použití Rho (ale aj TAMRA) v SPPS (schéma  1 𠂚) je to, že keď je Rho pripojený k amínu v globálne bočnom reťazci chránenom peptide, 1‐karboxylová skupina Rho je v otvorenej konformacii a moze reagovat po dalsom predlzeni peptidoveho retazca (schma  1 𠂚, 12). Okrem toho je kopulácia Rho vo všeobecnosti obtiažna kvôli zlej rozpustnosti a vnútornej reaktivite anilínových skupín. Preto sme sa pripravili N,N′𠄋oc𠄌hránené Rho. Keď sa táto molekula spojí s peptidom, dvojitá ochrana Boc uzamkne 1‐karboxylát v uzavretej laktónovej forme, čím sa stane nereaktívnym (schéma  1 𠂚, 34). Na prípravu sme upravili metódu, ktorú opísali Grimm a Lavis8 N,N′𠄋oc𠄌hránené Rho 10 (SchĂma  1 ). 5‐Karboxyfluoresceín (5) sa premenil v štyroch krokoch na ditriflát 8. Buchwald–Hartwigova kopulácia s BocNH2 malo za následok vznik N,N′𠄋oc𠄌hránené Rho (9). Použitie etylesterovej ochrany 5‐karboxylátu umožnilo selektívne uvoľnenie 5‐karboxylátu bez ovplyvnenia Boc skupín, čo malo za následok 10. Na rozdiel od nechráneného Rho, 10 je veľmi rozpustný v organických rozpúšťadlách, možno ho ľahko spájať za štandardných podmienok spájania peptidov a možno ho pripraviť v multi‐gramovom meradle.

Sedem párov diUb FRET 17𠂚g boli skonštruované natívnou chemickou ligáciou (NCL) medzi Rho‐Ub‐tioesterom 14 a TAMRA‐Ub obsahujúce γ‐thioLys stavebný blok3, 9 16 (SchĂma  2 ). Jednotlivé moduly Ub boli syntetizované lineárnym SPPS na hyperlabilnej tritylovej živici.3 DiBoc𠄌hránené Rho (10) bol spojený s Ub1� (11) na živici 12, ktorá bola následne odštiepená zo živice za mierne kyslých podmienok bez ovplyvnenia schémy globálnej ochrany. Metyl𠄃‐(glycyltio)‐propionát sa kopuloval na uvoľnený C‐koncový karboxylát za vzniku 13. Globálna deprotekcia v silne kyslých podmienkach, po ktorej nasledovala katiónová výmena a čistenie RP‐HPLC poskytlo Rho‐Ub‐tioester 14. Je potrebné poznamenať, že skupiny Boc na Rho sú súčasne odstránené počas globálnej deprotekcie, čím sa obnovia jej fluorescenčné vlastnosti. Moduly TAMRA‐Ub obsahujúce γ‐thioLys na každej z príslušných pozícií lyzínu (16𠂚g) boli pripravené kopuláciou 5‐karboxy izoméru TAMRA na Ub1� polypeptidy 15𠂚g, po ktorej nasleduje globálna deprotekcia a purifikácia (obrázok S1 v podporných informáciách). Metionín𠄁 bol nahradený izostérnym norleucínom, aby sa zabránilo oxidácii tioéterovej skupiny. NCL reakcie medzi 14 a 16𠂚g, nasledovalo odsírenie za radikálových podmienok, čistenie pomocou RP‐HPLC a gélová filtrácia poskytli konečných sedem diUb FRET párov 17𠂚g v dobrom výťažku a čistote.

Čistoty z 17𠂚g boli potvrdené LCMS analýzou (obrázok  2 𠂚, B a podporné informácie) a gélovou analýzou (obrázok  2 𠂜). Upon excitation at 466 nm, the emission spectra of the diUb FRET pairs and Rho‐Ub and TAMRA‐Ub revealed that all seven molecules show a clear FRET signal (Figure  2 𠂝). We performed fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to determine FRET efficiencies of all the FRET pairs (Figure  2 𠂞, Table S3) these were found to be 0.45𠄰.60, depending on the linkage, thus demonstrating efficient FRET in all these molecules.

Characterization of diUb FRET pairs 17𠂚g. A)𠁚nalytical HPLC and B) MS of Lys6‐linked diUb FRET pair 17𠂚. C) SDS‐PAGE analysis. D)𠁞mission spectra recorded at λ napr=466 nm. E)𠁟RET efficiencies (E) determined by FLIM.

DUB‐mediated cleavage of our new diUb FRET pairs was first assessed by incubation with USP7 and OTUD2, two well‐studied DUBs from the two largest DUB families and for which cleavage of unlabeled diUbs has been reported. Reactions were analyzed by SDS‐PAGE (Figures S2 and S3) which showed that the diUb selectivity of both DUBs was in good agreement with reported data.4a,4b We then incubated OTUD2 with Lys11‐ and Lys27‐linked diUb FRET pairs (17𠂛 a 17𠂜, respectively) and the corresponding unlabeled diUbs. We also included a 1:1 mixture of the FRET pair and the unlabeled diUb for both linkages. SDS‐PAGE analysis (Figures  3 𠂚, S4 and S5) showed that both the FRET pair and the unlabeled diUb substrates were equally processed, thus we concluded that the attached fluorophores do not affect DUB activity.

A) SDS‐PAGE analysis of Lys11‐linked diUb cleavage. OTUD2 was incubated with unlabeled diUb, FRET pair 17𠂛, or a 1:1 mixture samples were taken after 10, 30, 60, and 180 min. B) Michaelis–Menten kinetics of TRABID for Lys29‐, Lys33‐ and Lys63‐linked diUb, as determined by the FRET assay.

We next applied our FRET reagents for the quantification of diUb linkage‐specificity for nine DUBs derived from three different DUB families each was shown to display a distinct specificity (Table  1 ).4b We incubated the DUBs with all diUb FRET pairs at a fixed concentration (0.5 μ m, to keep initial fluorescence constant for all samples) with an increasing concentration of the unlabeled diUb (0� μ m ). The enzyme concentration was chosen such that the reaction proceeded linearly for at least 20 min (Supporting Information). The total amount of processed diUb was then determined by monitoring the increase in donor fluorescence over time from this the rates of initial velocity were calculated and fitted to the Michaelis–Menten equation (Figure  3 𠂛 and Supporting Information), from which K m a k kat were determined.

Stôl 1

Kinetic characterization of DUBs that are used in Ub chain restriction analysis7 for the diUb FRET pairs 17𠂚g. [a]

DUBLinkage K m [μ m ] k kat [s 𢄡 ] k kat/K m [ m 𢄡  s 𢄡 ]
AMSHLys63 45.40.002759
AMSH* [b] Lys632.40.1770�
CezanneLys1119.41.578�
OTUB1Lys48n.d.
OTUB1* [b] Lys48 38.60.6617�
OTUD1Lys63n.d.4020
OTUD3Lys6n.d.
Lys11 52.40.0085162
Lys63 57.90.0061105
TRABIDLys29 40.10.0531317
Lys3319.60.0281431
Lys63 54.00.034627
OTUD2Lys11 87.94.450�
Lys27n.d.
Lys29n.d.
vOTULys63.60.87242�
Lys113.40.2263�
Lys488.41.0119�
Lys631.40.09166�
USP21Lys62.10.1260�
Lys111.40.08762�
Lys332.10.1360�
Lys481.70.06739�
Lys632.70.1660�

[a] Values in italics were obtained by extrapolation beyond the highest substrate concentration. [b]�tivated versions of AMSH and OTUB1 were created by fusing them to their activators (STAM and UBE2D2, respectively).11

Table  1 shows the data for all combinations of DUB and diUb substrate for which activity could be measured. Overall, the individual diUb linkage types cleaved by each DUB were consistent with published qualitative data.4 As expected from earlier findings, the unspecific DUB USP21 showed similar activity towards most linkages.4a The virus�rived DUB vOTU, which is also considered to be unspecific, showed some interesting results: the catalytic efficiency (k kat/K m ) for Lys6 was two times higher than for Lys48, and four times higher than for Lys11 and Lys63 diUbs this can largely be attributed to differences in k kat radšej než K m . Another interesting result was for AMSH. In agreement with earlier findings, this DUB had absolute specificity for Lys63 diUb,4c although the overall efficiency was rather low. Remarkably, the recently reported fusion of AMSH with its natural activator STAM211 resulted in a more than 1000𠄏old increase in catalytic efficiency, which can be attributed to increases in both affinity and catalytic turnover. Taken together, these data show that our quantitative assessment of the DUB linkage specificity is in accordance with reported data and that new insights can be obtained from the kinetic parameters.

In summary, the set of all seven isopeptide‐linked diUb FRET pairs allows absolute quantification of DUB linkage specificity. Our synthetic strategy, which includes a convenient N,N′𠄋oc‐protected Rho building block, allows efficient preparation of these reagents in large quantities. The assay requires low amounts of material, can easily be automated, and can be used in high‐throughput small‐molecule screening or for the assessment of (di)Ub binding domains.6c Overall, we believe that our diUb FRET probes will be of great value in ongoing efforts to crack the ubiquitin code and that the FRET pair presented here will facilitate FRET‐pair synthesis in general.


Zhrnutie autora

There is abundant evidence that insufficient energy, or energy failure, contributes to the pathophysiology of many inherited and degenerative diseases, cancer, and aging. However, we understand little about how cellular energy levels are regulated. To begin to address this gap, we developed a screening approach that uses a fluorescent biosensor to measure relative levels of ATP in individual cells and used this approach to identify those genes that are most essential to maintaining energy levels. We screened approximately 2,200 genes and found that mitochondrial ribosomal proteins are particularly critical in maintaining energy levels and enabling cell growth. We also used this approach to identify genetic targets that could be amenable to an energy-based therapy via supplementation with the mitochondrial cofactor coenzyme Q10 (CoQ10). These included CoQ10 biosynthetic genes associated with human disease as well as a subset of genes not previously linked to CoQ10 biosynthesis. Our screening paradigm thus reveals mechanisms by which cellular energy levels are controlled. It can also be used to identify genetic defects that will be responsive to energy-based therapies. Application of this approach may additionally enable powerful screens for other key metabolites to further advance a genome-scale understanding of the regulation of metabolism.

Citácia: Mendelsohn BA, Bennett NK, Darch MA, Yu K, Nguyen MK, Pucciarelli D, et al. (2018) A high-throughput screen of real-time ATP levels in individual cells reveals mechanisms of energy failure. PLoS Biol 16(8): e2004624. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004624

Akademický redaktor: Rong Tian, University of Washington, United States of America

Prijaté: October 30, 2017 Prijatý: July 26, 2018 Publikovaný: August 27, 2018

autorské práva: © 2018 Mendelsohn et al. Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný za podmienok licencie Creative Commons Attribution License, ktorá umožňuje neobmedzené používanie, distribúciu a reprodukciu na akomkoľvek médiu za predpokladu, že je uvedený pôvodný autor a zdroj.

Dostupnosť údajov: Všetky relevantné údaje sú v dokumente a jeho súboroch s podpornými informáciami. Specifically, S1 Table contains screen data for all genes in all conditions.

Financovanie: Joan and David Traitel Family Trust. KN, BAM, NKB, MAD, KY, MKN, and MN. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu. Betty Brown’s Family. KN, BAM, NKB, MAD, KY, MKN, and MN. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu. Hagar Family Foundation. JLN and DP. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu. Burroughs Wellcome Fund Medical Scientist Career Award. KN, BAM, MAD, and KY. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu. Pediatric Scientist Development Program (grant number K12-HD000850). BAM. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu. NIH (grant number R01 NS091902, 5P30 NS069496, U54CA196519, R01 DA036858, U01 CA168370, DP2 GM119139, RR018928, S10-RR028962, K99/R00 CA204602). R01 NS091902: KN, 5P30 NS069496: KN, BAM, NKB, MAD, KY, MKN, and MN, U54CA196519: JLN, R01 DA036858: LG, MAH, and MK, U01 CA168370: LG, MAH, and MK, DP2 GM119139: MK, S10-RR028962: Gladstone flow cytometry core: LG, K99/R00 CA204602. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu. St. Baldrick’s Scholar Award. JLN and DP. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu. Howard Hughes Medical Institute. LG, MH, and MK. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu. CFAR grant (grant number P30-AI-027763). Gladstone flow cytometry core. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu. James B. Pendelton Charitable Trust. Gladstone flow cytometry core. Donor nemal žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu.

Konkurenčné záujmy: Autori vyhlásili, že neexistujú žiadne konkurenčné záujmy.

skratky: 2DG, 2-deoxyglucose ATPbasal, ATP levels under basal conditions ATPgly, ATP levels under glycolytic conditions ATPresp, ATP levels under respiratory conditons CFP, cyan fluorescent protein CoQ10, coenzyme Q10 COS, CV-1 (simian) in origin, and carrying the SV40 genetic material CRISPRi, clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference dCas9, dead CRISPR-associated protein 9 ECAR, extracellular acidification rate FACS, fluorescence-activated cell sorting FBS, fetal bovine serum FCCP, carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone FRET, fluorescence resonance energy transfer GROWTHbazálny, growth under basal conditions GROWTHglyc, growth under glycolytic conditions GROWTHresp, growth under respiratory conditions HGNC, HUGO Gene Nomenclature Committee HPLC, high-performance liquid chromatography KRAB, Kruppel-associated box MELAS, mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes MICOS, mitochondrial contact site and cristae organizing system mVenus, monomeric Venus NDUFS4, NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit S4 OCR, oxygen consumption rate PVDF, polyvinylidene fluoride qRT-PCR, quantitative real-time reverse transcription PCR RNAi, RNA interference ROS, reactive oxygen species sgRNA, single guide RNA shRNA, short hairpin RNA TCA, tricarboxylic acid Tom20, translocase of outer membrane 20 kDa subunit


Informácie o autorovi

Matthew Y. Tang and Marta Vranas: These authors contributed equally to this work

Afiliácie

Department of Neurology and Neurosurgery, McGill Parkinson Program, Neurodegenerative Diseases Group, Montreal Neurological Institute, McGill University, Montréal, Québec, Canada H3A 2B4

Matthew Y. Tang, Andrea I. Krahn, Shayal Pundlik & Edward A. Fon

Department of Pharmacology and Therapeutics, Groupe de Recherche Axé sur la Structure des Protéines, McGill University, Montréal, Québec, Canada H3G 1Y6


Pozri si video: REMOÇÃO DE PRÉ MOLAR INCLUSO COM O PIEZOSURGERY (August 2022).