Informácie

Ako sú fluorochrómy konjugované s proteínmi, ako je protilátka?

Ako sú fluorochrómy konjugované s proteínmi, ako je protilátka?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ako sú fluorochrómy ako FITC konjugované s protilátkami? Sú kovalentne viazané? Ak sú kovalentne viazané, naruší nízka teplota (-20 °C alebo nižšia) kovalentné väzby a odpojí fluorochrómovú značku od proteínu?


Fluorochrómy sú kovalentne naviazané na protilátky za vzniku stabilne značených molekúl. Tento článok to popisuje veľmi podrobne, z abstraktu:

Fluorochrómy môžu byť kovalentne konjugované s protilátkami prostredníctvom reakcií s tiolovými alebo amínovými skupinami. Typicky sú fluorochrómy obsahujúce izotiokyanátové, sukcínimidylesterové alebo sulfonylchloridové reaktívne skupiny konjugované s amínmi na molekulách protilátky.

Tieto kovalentné väzby sú stabilné pri teplote miestnosti a sú tiež pri -20 °C. Je pravdepodobnejšie, že opakované cykly zmrazovania a rozmrazovania poškodzujú protilátku.


Fluorofóry a farbivá

Aj keď sa fluorescencia farbiva najčastejšie testuje v prietokovej cytometrii, cenné informácie možno určiť z hladín autofluorescencie nezafarbených buniek. Bunky sú prirodzene autofluorescenčné, najmä pri nižších vlnových dĺžkach viditeľného spektra, a rozptýlené svetlo môže poskytnúť informácie o veľkosti bunky, zrnitosti, topografii povrchu a pomere jadro: cytoplazma. Napríklad analýza bielych krviniek umožňuje identifikáciu rôznych typov leukocytov.

Avšak veľká väčšina experimentov prietokovej cytometrie zahŕňa použitie fluorochrómov. Sú to malé organické molekuly alebo proteíny, ako je alofykokyanín (APC) s fluorescenčnými vlastnosťami. Fluorochrómy sú často konjugované s primárnymi alebo sekundárnymi protilátkami na označenie cieľov alebo biomarkerov. Alternatívou k farbeniu protilátkou je použitie buniek exprimujúcich, buď stabilne alebo prechodne, proteíny záujmu fúzované s fluorescenčnými proteínmi, ako sú GFP, Venuša alebo mRFP.

Výber fluorochrómu závisí od experimentálneho nastavenia:

Ak chcete minimalizovať spektrálne prekrytie, nepoužívajte fluorochrómy s podobnými excitačnými spektrami, ak sú excitované rovnakým laserom.

Niektoré fluorochrómy dodávajú značiacim činidlám významnú molekulovú hmotnosť – to môže znížiť ich schopnosť prenikať cez bunkovú membránu a farbiť vnútrobunkové ciele.

Dbajte na správne zaobchádzanie s tandemovými farbivami – vyhnite sa cyklom zmrazovania a rozmrazovania a vystaveniu svetlu, aby ste minimalizovali oddelenie.

Ak sa použijú fluorofórové činidlá, bunky sa zafarbia a potom sa pred analýzou premyjú, aby sa odstránil nadbytok nenaviazaných farbív. stôl 1 ukazuje tipy na postupy farbenia rôznymi fluorofórovými činidlami. Na analýzu intracelulárnych proteínov pomocou protilátok je potrebná permeabilizácia.

Tabuľka 1. Typy fluorofórových činidiel bežne používaných v prietokovej cytometrii.

Činidlo Príklad Živé bunky Pevné bunky Permeabilizácia
Životaschopnosť farbív Propidium jodid Áno č č
Apoptotické markery Fluorescenčne značený anexín V Áno č č
Fluorescenčné proteíny exprimované bunkami GFP-LC3 Áno Áno Nevyžaduje sa
Fluorescenčne značené protilátky proti extracelulárnym proteínom E-kadherín (pozri obrázok 2) Áno Áno Nevyžaduje sa
Fluorescenčne značené protilátky proti intracelulárnym proteínom Laminová klimatizácia (pozri obrázok 2) Technicky náročné Áno Požadovaný

Obrázok 2. Prietoková cytometria je vhodná na analýzu extracelulárnych aj intracelulárnych cieľov.

Vľavo: 1X1066 HepG2 buniek sa zafarbilo 2 ug E-kadherínovej protilátky (20874-1-AP, červená) a kontrolnej protilátky (modrá). Fixované 90 % MeOH blokované 3 % BSA (30 minút). Alexa Fluor™ 488-konjugovaný AffiniPure kozí anti-králičí IgG(H+L) s riedením 1:1000.

Správny: 1X10A6 buniek HEK-293T sa zafarbilo 0,2 ug protilátky Lamin A/C (10298-1-AP, červená) a kontrolnej protilátky (modrá). Fixované 90 % MeOH blokované 3 % BSA (30 minút). Alexa Fluor™ 488-konjugovaný AffiniPure kozí anti-králičí IgG(H+L) s riedením 1:1000.


Sekundárne protilátky konjugované s DyLight® Fluorochrom

Fluorochrómy DyLight® vykazujú vysokú intenzitu fluorescencie, fotostabilitu a rozpustnosť vo vode a zostávajú fluorescenčné od pH 4,0 a pH 9,0. Okrem toho, rozpustnosť fluorochrómov DyLight® vo vode umožňuje dosiahnuť vysoký pomer farbiva k protilátke bez toho, aby došlo k precipitácii konjugátov.

Fluorochrómy DyLight® majú absorpčné maximá v rozsahu od 350 nm do 777 nm, čím pokrývajú celé spektrum viditeľného svetla. Absorpčné aj emisné vlastnosti fluorochrómov DyLight® sú kompatibilné s excitačnými a detekčnými vlnovými dĺžkami bežných fluorescenčných prístrojov.

Náš katalóg obsahuje sekundárne protilátky konjugované s DyLight® 488, DyLight® 550, DyLight® 594 a DyLight® 650.

Obr. 1. Emisné spektrá DyLight®​ fluorochrómy dostupné v našom katalógu.

Zvýraznenie konjugátu protilátok

  • Veľký rozsah rôznych špecifík
  • ​Optimalizované pre výkon konjugátu – afinitne čistené alebo vopred adsorbované protilátky
  • Konzistentný a stabilný - stabilný 1 rok pri 4 °C, poskytuje konzistentný výkon počas trvania používania

Výhody

  • Jasná fluorescencia - intenzívna emisia poskytuje vysokú citlivosť
  • Úzke emisné spektrá – zanedbateľné prepúšťanie medzi fluorochrómovými kanálikmi uľahčuje viacfarebné zobrazovanie
  • Vysoko fotostabilný - lepšia odolnosť voči fotobieleniu
  • Úplne stabilný v pufroch s pH 4,0-9,0
  • Kompatibilita prístrojov - DyLight® je možné vizualizovať pomocou bežných nastavení lasera a filtra

Vlastnosti farbiva DyLight®

Fluorochrómy DyLight® sú vhodné pre fluorescenčnú mikroskopiu a prietokovú cytometriu.

FluorochrómFarbaEx/EmSpectraSpektrálne ekvivalentné farbivá
DyLight® 488
493/518Zobraziť grafFITC, Cy2®
DyLight® 550
562/576Zobraziť grafCy3®, TRITC
DyLight® 594
593/618Zobraziť grafTexas Red®
DyLight® 650
652/672Zobraziť grafCy5®

Tabuľka 1. Spektrálne vlastnosti DyLight®​ fluorochrómy.

ε: Molárny extinkčný koeficient pri maxime absorpcie

Pre ďalšie informácie alebo pomoc kontaktujte náš tím vedeckej podpory.

DyLight®​ je ochranná známka spoločnosti Thermo Fisher Scientific Inc. a jej dcérskych spoločností. Cy®​ a CyDye® sú ochranné známky spoločnosti GE Healthcare Limited.


Ako sú fluorochrómy konjugované s proteínmi, ako je protilátka? - Biológia

Princípy prietokovej cytometrie

Prietoková cytometria sa bežne používa na analýzu expresie bunkových intracelulárnych a povrchových molekúl, charakterizáciu a definovanie rôznych typov buniek v heterogénnej bunkovej populácii, hodnotenie čistoty izolovaných subpopulácií, ako aj analýzu veľkosti a objemu buniek.

Ako je znázornené na obrázku 1, v kroku prípravy vzorky sa bunky, ktoré sú predmetom záujmu, označia fluorochrómmi. Bunky v suspenzii sa potom vstrekujú v tenkom prúde, ktorý je hydrodynamicky centralizovaný súčasne vstrekovaným prúdom plášťa a zasiahnutý laserovými lúčmi. Rozptyl svetla je detekovaný prednými a bočnými fotodetektormi. Fluorescencia je triedená v optickej lavici s dichroickými zrkadlami a filtrami a detegovaná, zosilnená fotonásobičmi. Signály sa potom analyzujú pomocou špecifického softvéru.

Obr.1 Princípy prietokovej cytometrie. (Depince-Berger, 2016)

Fluorofóry

Fluorofóry sú fluorescenčné markery používané na detekciu expresie nukleových kyselín alebo proteínov. Funkčne prijímajú svetelnú energiu pri danej vlnovej dĺžke a opätovne ju vyžarujú pri dlhšej vlnovej dĺžke. Existujú dva hlavné druhy fluorofórov s veľkým potenciálom využitia v prietokovej cytometrii.

Jednotlivé farbivá ako fluoresceín izotiokyanát (FITC), alofykokyanín (APC) a fykoerytrín (PE) sú dostupné už mnoho rokov. Tandemové farbivá obsahujú malý fluorofór kovalentne spojený s iným fluorofórom. Keď je prvé farbivo excitované a dosiahne svoj maximálny excitovaný elektronický singletový stav, jeho energia sa prenesie na druhé farbivo. Tým sa aktivuje druhý fluorofór, ktorý potom produkuje fluorescenčnú emisiu.

Fluorescenčné proteíny, ako je zelený fluorescenčný proteín (GFP), žltý fluorescenčný proteín (YFP), červený fluorescenčný proteín (RFP) a mCherry, sa stali široko používanými na analýzu prietokovou cytometriou a triedenie buniek. Fluorescenčné proteíny sú často koexprimované alebo exprimované ako fúzia s požadovaným proteínom.

Konjugované protilátky v prietokovej cytometrii: priame verzus nepriame značenie fluoroforom

Bežne sú fluorofóry používané ako výstupy v experimente prietokovej cytometrie kovalentne viazané na protilátku. Keď sa konjugovaná protilátka používa v bunkovej analýze, svetlo emitované fluorofórom slúži ako priamy indikátor množstva protilátky prítomnej v bunke alebo na bunke. Použitím konjugátov, ktoré sa špecificky viažu na proteín, môže výskumník priamo kvantifikovať cieľ záujmu v každej bunke na základe úrovne fluorescencie emitovanej touto bunkou. Tento proces sa označuje ako priama detekcia alebo priama prietoková cytometria.

Alternatívny prístup, nepriama prietoková cytometria, využíva sekundárnu protilátku namierenú proti imunoglobulínom (Ig) z hostiteľa, v ktorom bola vytvorená primárna protilátka. Pri tomto spôsobe je sekundárna protilátka konjugovaná k fluorofóru, pričom primárna protilátka zostáva nemodifikovaná.

Obr.2 Priama a nepriama imunofluorescencia.

Priame verzus nepriame farbenie pre prietokovú cytometriu

  • Je možné priame multiplexovanie protilátok z rovnakého hostiteľa
  • Rýchlejší protokol vďaka menšiemu počtu krokov inkubácie a premývania
  • Schopnosť použiť veľa rôznych protilátok v jednom teste, čo umožňuje súčasné odčítanie veľkého počtu koncových bodov
  • Žiadna amplifikácia signálu zo sekundárnej protilátky
  • Môže zlepšiť detekciu cieľov prítomných v malom množstve, pretože poskytuje vyššiu citlivosť vďaka sekundárnej amplifikácii
  • Užitočné na počiatočnú validáciu primárnej protilátky, keď ešte nie je dostupný priamy konjugát
  • Obmedzený počet protilátok, ktoré môžu byť kombinované v experimente
  • Dvojstupňové farbenie
  • Sekundárne protilátky môžu skrížene reagovať s inými druhmi ako je cieľ
  • Nepriama prietoková cytometria môže byť preferovaná pred priamou prietokovou cytometriou, keď konjugácia primárnej protilátky môže spôsobiť stérické zmeny, ktoré ovplyvňujú špecifickosť a funkciu.
  • Nepriama prietoková cytometria môže byť tiež výhodná, keď je požadovaný zvýšený signál. Na primárnu protilátku sa môže viazať viac ako jedna sekundárna protilátka, čím sa amplifikuje signál odvodený od každej antigénnej molekuly naviazanej na primárnu protilátku.

Analýza dát

Analýza údajov prietokovej cytometrie je v podstate založená na princípe hradlovania. Brány a oblasti sú umiestnené okolo populácií buniek so spoločnými charakteristikami, zvyčajne dopredným rozptylom (FSC), bočným rozptylom (SSC) a expresiou markerov. Veľkosť a granularitu buniek možno identifikovať na základe ich FSC a SSC charakteristík. Rozlišovanie populácií buniek môže byť relatívne priame pre bunkové línie, kde je len jeden typ buniek, ale môže byť zložitejšie pre vzorky, kde je viacero typov buniek.

Úlomky a mŕtve bunky majú často nižšiu úroveň FSC a nachádzajú sa v ľavom dolnom rohu grafu hustoty. Udalosti je možné zobraziť aj ako bodový graf, kde nie sú zobrazené žiadne informácie o hustote, alebo ako obrysovú mapu na zobrazenie relatívnej intenzity rozptylových vzorov. Záleží na preferenciách používateľa, ktoré zobrazenie uprednostňuje, ale niekedy je jednoduchšie vizualizovať diskrétne populácie buniek na obrysových diagramoch.

Obr.3 Meranie FSC a SSC.

Bežné aplikácie

Najbežnejším využitím prietokovej cytometrie je identifikácia markerov na bunkách. Imunofenotypizácia môže byť jednoduchá identifikácia bunky pomocou jediného markera alebo komplexnejšia identifikácia buniek pomocou navádzacieho profilu, aktivačných stavov a uvoľňovania cytokínov, všetko v jednom paneli. V dôsledku toho sú experimentálne protokoly často kombináciou povrchového a intracelulárneho farbenia.

Jedným z najbežnejších znakov apoptózy, ktorý možno merať prietokovou cytometriou, je externalizácia fosfatidylserínu (PS), fosfolipidu nachádzajúceho sa vo vnútornej membráne zdravých buniek. Anexín V sa viaže na fosfatidyl serín, a teda anexín V značený fluorofórmi umožňuje hodnotenie apoptózy, zvyčajne v kombinácii s farbivom na životaschopnosť, ako je propidium jodid (PI), aby sa odlíšili apoptotické bunky od nekrotických buniek.

Fragmentáciu DNA, ku ktorej dochádza počas neskorých štádií apoptózy, možno tiež merať prietokovou cytometriou s použitím testu sub-G1. Malé fragmenty DNA generované počas apoptózy unikajú z buniek, čím sa znižuje celkový obsah DNA v apoptotických bunkách. Zafarbením DNA pomocou PI možno počítať hypodiploidné apoptotické bunky v sub-G1 píku PI histogramu. Okrem toho sa skorá apoptóza môže merať aj potenciomickými farbivami, ktoré hodnotia znížený mitochondriálny potenciál buniek, ako je JC-1, etylester tetrametylrodamínu (TMRE) a metylester tetrametylrodamínu (TMRM). Tieto farbivá agregujú v mitochondriách neapoptotických buniek a jasne fluoreskujú. Keď sa mitochondriálny membránový potenciál zrúti, farbivo sa rozptýli do cytoplazmy vo svojej monomérnej forme, čo vedie k zníženiu fluorescencie alebo zmene farby.

Bunkovú proliferáciu je možné merať prietokovou cytometriou pomocou niekoľkých metód. Jedným prístupom je farbenie protilátkou proti proliferačnému markeru, ako je Ki67 alebo MCM2. Okrem toho môžete svoje bunky inkubovať s BrdU, ktorý sa inkorporuje do DNA počas S-fázy bunkového cyklu. Inkorporovaný BrdU možno detegovať pomocou fluorescenčne značených anti-BrdU protilátok. Pri kombinácii s DNA farbením, ako je PI, možno určiť relatívny podiel buniek v S-fáze.

Iné aplikácie

  • Oxidačný výbuch monocytov
  • Oxidačný výbuch neutrofilov
  • Fagocytóza monocytov
  • Neutrofilná fagocytóza
  • Mikrobiologická analýza
  • Obchodovanie s bunkami
  • Bunková cytotoxicita a cytotoxicita sprostredkovaná protilátkami alebo komplementom
  • Triedenie na základe morfológie (FSC alebo SSC) a/alebo fluorescenčných charakteristík

Sekcie súvisiace s prietokovou cytometriou

Creative Biolabs predstavuje prezentáciu, ktorá bude neoceniteľná pre začiatočníkov v prietokovej cytometrii a bude slúžiť ako prehľad faktov pre tých z vás, ktorí majú záujem učiť ostatných o výhodách tejto výkonnej aplikácie. Aby sme vám pomohli pri učení, zaviedli sme nasledujúce sekcie, ktoré si môžete pozrieť. Pri každom experimentálnom prístupe je uvedený protokol a sprievodca riešením problémov. Podrobnosti nájdete v príslušnej časti.


Konjugované protilátky na enzýmy, fluorochrómy a ďalšie

Konjugované protilátky sú užitočným výskumným nástrojom v rôznych aplikáciách, od Western blotu po prietokovú cytometriu. My v Novus Biologicals ponúkame mnoho primárnych protilátok konjugovaných s enzýmami, ako je HRP, fluorochrómy, ako je FITC, a iné vrátane biotínu a cyanínových farbív.

Naše protilátkové laboratórium je vždy zaneprázdnené projektmi konjugácie protilátok na mieru. Minulý týždeň laboratórium vykonalo množstvo konjugácií, vrátane protilátky LDL receptora k biotínu, HMGB1 protilátky k HRP, aktínovej protilátky k DyLight 488 a CD133 protilátky k DyLight 549.

Keď sa ho pýtali na rozdiel medzi konjugáciou protilátky s HRP, biotínom a farbivami DyLight, jeden z laboratórnych technikov Novus, David Kuroki, vysvetlil len jeden z rozdielov:

"Dialýza sa používa na odstránenie primárnych amínov a akéhokoľvek azidu sodného, ​​ktorý môže byť prítomný. Pre HRP a Biotín je dialyzačným pufrom PBS, pH 7,4. Pre DyLight fluores je dialyzačným pufrom 50 mM boritan sodný, pH 8,5. rozdiel v inkubačných časoch, 30 minút pre biotín, 1 hodinu pre fluór DyLight a 3 hodiny pre HRP."

Kuroki tiež spomenul, že konjugácie protilátok môžu trvať od 3 do 6 hodín, v závislosti od konkrétneho konjugátu. Najprv sa protilátka kvantifikuje pre referenčný bod a potom sa dialyzuje do vhodného pufra. Potom sa protilátka koncentruje, ak je to potrebné, a potom sa znova kvantifikuje, aby sa určila účinnosť regenerácie. Po dokončení týchto krokov sa uskutoční skutočná konjugácia.

Prezrite si konjugované protilátky, ktoré ponúkame, tak, že navštívite našu stránku primárnych protilátok a použijete filter konjugátov na spodnej ľavej strane obrazovky. Navyše jednoducho označte akúkoľvek protilátku iba za 30 sekúnd pomocou našich súprav na označovanie protilátok Lightning-Link.


Ako sú fluorochrómy konjugované s proteínmi, ako je protilátka? - Biológia

Imunohistochémia (IHC)

Imunohistochémia (IHC) je výkonná technika, ktorá využíva špecifickú väzbu medzi antigénom a protilátkou na detekciu a lokalizáciu špecifických antigénov v bunkách a tkanive, často vizualizovaných svetelnou mikroskopiou. IHC sa široko používa v klinickej diagnostike v anatomickej patológii s príchodom metód získavania antigénu, ktoré umožňujú, aby sa pohodlne uskutočňovalo na tkanive zaliateho vo formalíne fixovanom v parafíne (FFPE) a automatizované metódy na spracovanie veľkých objemov s reprodukovateľnosťou. Okrem toho sa IHC často používa na pomoc pri klasifikácii novotvarov, určovaní miesta pôvodu metastatického nádoru a detekcii malých ložísk nádorových buniek nenápadných pri rutinnom farbení hematoxylínom a eozínom (H&E). Okrem toho sa IHC čoraz viac používa na poskytovanie prediktívnych a prognostických informácií.

Všeobecné kroky

Kroky v IHC možno zhrnúť takto: fixácia tkaniva, vloženie a rezanie, získanie antigénu, permeabilizácia, blokovanie, inkubácia protilátky a imunofarbenie.

    Fixácia, vkladanie a rezanie tkaniva

Fixácia vzorky tkaniva je životne dôležitá na udržanie morfológie buniek a tkaniva počas IHC experimentu a skladovania. Zabraňuje autolýze a nekróze vyrezaných tkanív, zachováva antigenicitu a zvyšuje index lomu tkanivových zložiek. Použitý fixatív je ovplyvnený cieľovým antigénom, ako aj požadovanou detekčnou technikou (fluorescenčnou alebo chromogénnou). Vzorka tkaniva sa potom buď vloží do parafínu alebo sa zmrazí. Zaliatie je dôležité pre zachovanie morfológie tkaniva a poskytnutie podpory tkaniva počas rezu. Niektoré epitopy nemusia prežiť tvrdú fixáciu alebo vloženie. Tkanivo sa zvyčajne rozreže na tenké rezy alebo menšie kúsky, aby sa uľahčilo ďalšie štúdium.

Pokyny pre výber fixačného prostriedku

  • Bunky / cytologické prípravky: 4% formaldehyd
  • Tkanivové rezy: 10 % neutrálny pufrovaný formalín (NBF)

Proces fixácie vzorky môže viesť k zosieťovaniu proteínov, ktoré maskuje antigény a môže obmedziť väzbu antigén-protilátka. Získanie antigénu umožňuje protilátke prístup k cieľovému proteínu v tkanive. Maskované epitopy by sa mohli získať buď pomocou enzymatického/proteolytického získavania antigénu, alebo metód získavania antigénu indukovaného teplom. Optimálna technika získania antigénu závisí od antigénu, tkaniva, spôsobu fixácie a/alebo primárnej protilátky. Niektoré antigény vyžadujú kombináciu zahrievania a štiepenia enzýmami.

  • Pri enzymatickej metóde sa používajú proteázy, ako je proteináza K, trypsín a pepsín.
  • Metóda vyvolaná teplom využíva teplo a výber pufrov.
Pufre pre teplom indukované získavanie antigénu Enzýmová formulácia na získanie enzymatického antigénu
Citrátový pufor pH 6,0 pepsín
EDTA pufor pH 8,0 Proteináza K
Tris pufor pH 10,0 trypsín
Tris-EDTA pufor pH 9,0

Permeabilizácia je potrebná, keď protilátka potrebuje prístup do vnútra buniek, aby sa detegoval cieľový antigén, ako sú intracelulárne proteíny a cytoplazmatické epitopy transmembránových proteínov. Na permeabilizáciu sa zvyčajne používajú rozpúšťadlá alebo detergenty.

Pokyny pre rozpúšťadlá a detergenty

Rozpúšťadlá Acetón Acetónová fixácia bude tiež permeabilizovať
metanol Metanolová fixácia sa môže použiť na permeabilizáciu, ale nie je vždy účinná
Čistiace prostriedky Triton X-100 alebo NP-40 Použite 0,1 až 0,2 % v PBS len na 10 minút
Tween 20, saponín, digitonín a Leucoperm Použite 0,2 až 0,5 % na 10 až 30 minút

IHC často obsahujú jeden alebo viac blokovacích krokov na zníženie signálu pozadia a falošných poplachov. Tieto kroky zahŕňajú: blokovanie proteínov, blokovanie biotínu, blokovanie endogénnych enzýmov.

Blokovanie pomocou séra alebo činidla blokujúceho proteín zabraňuje nešpecifickej väzbe protilátok na tkanivo alebo Fc receptory. Sérum je bežné blokujúce činidlo, pretože obsahuje protilátky, ktoré sa viažu na nešpecifické miesta. Odporúča sa použiť sérum zodpovedajúce druhu sekundárnej protilátky. Proteíny, ako je BSA alebo kazeín, sa môžu tiež použiť na blokovanie nešpecifickej väzby protilátky, a preto nie je potrebné priraďovať činidlo k druhu sekundárnej protilátky.

Ak sa používa detekčný systém na báze biotínu, odporúča sa blokovať endogénny biotín. Biotín je prítomný v mnohých tkanivách, najmä v obličkách, pečeni a mozgu. Blokuje sa predinkubáciou tkaniva s avidínom, po ktorej nasleduje inkubácia s biotínom, aby sa zablokovali ďalšie biotínové väzbové miesta na molekule avidínu.

Chromogénne metódy detekcie zvyčajne používajú enzým spojený so sekundárnou protilátkou na vizualizáciu lokalizácie protilátky. Ak je enzým prirodzene prítomný v skúmanom tkanive, jeho aktivita sa musí pred krokom detekcie zablokovať. Na kontrolu aktivity endogénnej peroxidázy je možné tkanivá inkubovať so substrátom DAB pred inkubáciou primárnej protilátky. Ak tkanivá zhnednú, je prítomná endogénna peroxidáza a je potrebný krok blokovania. 10-15 minútová inkubácia v 0,3% peroxidu vodíka je zvyčajne dostatočným blokovaním. Tkanivo možno testovať na endogénnu alkalickú fosfatázu (AP) inkubáciou s BCIP/NBT. Ak je pozorovaná modrá farba, je prítomná endogénna AP a je nevyhnutná blokáda. Levamisol sa používa na blokovanie a pridáva sa s chromogénnym substrátom. Pred pridaním primárnej protilátky sa intestinálna AP blokuje slabou kyselinou.

Priama vs nepriama detekcia v IHC

V metódach priamej detekcie je primárna protilátka priamo konjugovaná so značkou. Na nepriamu detekciu je primárna protilátka naviazaná na značenú sekundárnu protilátku, ktorá bola vypestovaná proti hostiteľskému druhu primárnej protilátky. Nepriame metódy môžu zahŕňať aj kroky zosilnenia na zvýšenie intenzity signálu. Voľba priamej alebo nepriamej detekcie je často predpísaná úrovňou expresie cieľového antigénu.

Obr.1 Porovnanie metód priamej a nepriamej detekcie. (Buchwalow, 2010)

  • Celkovo rýchlejšie, pretože je tu menej krokov.
  • Menšia šanca na nešpecifický signál.
  • Často dáva silnejší signál, pretože na každú primárnu protilátku sa viažu viaceré sekundárne protilátky.
  • Jednoduchá zmena typu štítku alebo metód detekcie pre nový experiment výmenou sekundárnych prvkov.
  • Šetrí čas a náklady na označovanie, najmä ak sú všetky primárne protilátky vyrobené v rovnakom druhu.
  • Poskytuje prístup k širšej škále štítkov.
  • Naviazanie značky na primárnu protilátku môže ovplyvniť schopnosť protilátky viazať sa na cieľový proteín.
  • Označenie každej primárnej protilátky zvyšuje čas a náklady.
  • Viac nešpecifický signál môže vzniknúť z väzby sekundárnej protilátky na iné proteíny na blote.
  • Ďalšie kroky inkubácie a premývania zvyšujú čas experimentu.

Chromogénna detekcia verzus fluorescenčná detekcia v IHC

  • Jednoduchšie multiplexovanie: Viac farieb a užšie emisné spektrá ako chromogénne farbivá.
  • Lepšia spoločná lokalizácia cieľa: Fluorescenčné farbivá umožňujú samostatnú identifikáciu spoločne lokalizovaných cieľov.
  • Vyšší dynamický rozsah: Jednoduchšia vizualizácia vzácnych a vysoko početných cieľov na tej istej snímke.
  • Menej krokov: Žiadny krok pre pridávanie substrátu.
  • Nižšia citlivosť: Protilátky konjugované s enzýmom sa môžu amplifikovať cez nepriama detekcia na zvýšenie citlivosti.
  • Náchylné na fotobielenie: Vystavenie svetlu môže časom zmenšiť fluorescenčný signál.
  • Väčšia citlivosť: Zosilnenie signálu cez nepriama chromogénna detekcia zvyšuje silu signálu.
  • Dlhotrvajúci signál: Chromogénne škvrny sú odolnejšie voči fotobieleniu ako fluorochrómy.
  • Obtiažna spoločná lokalizácia cieľa: Ťažko rozlíšiť zmiešanú farbu od jednej farby, keď sa ciele spoločne lokalizujú.
  • Užší dynamický rozsah: Je ťažké si predstaviť vzácne a veľmi hojné ciele na tej istej snímke.
  • Obtiažne multiplexovanie: Menej farieb a širšie emisné spektrá ako fluorescenčné farbivá.

Súhrn metód zosilnenia signálu

  • Vyššia citlivosť ako tradičná nepriama detekcia.
  • Menšia veľkosť komplexu v porovnaní s ABC uľahčuje väčšiu penetráciu tkaniva.
  • Väčšia citlivosť ako ABC a LSAB.
  • Menej krokov ako ABC a LSAB.

IHC je komplexný experiment s viacerými parametrami, ktoré je potrebné zvážiť a optimalizovať. Naše riešenie problémov s imunohistochémiou (IHC) ilustruje možné zdroje bežných problémov a ako s nimi bojovať. Podrobnosti nájdete v nasledujúcej príslušnej časti.


Fluorofóry pre prietokovú cytometriu

Nie všetky fluorofóry sú vhodné pre každú aplikáciu založenú na protilátkach. Napríklad, aj keď je PE svetlý, ľahko sa vybieli, a preto nie je vhodný na fluorescenčné zobrazovanie.

Vzhľadom na zväčšenie veľkosti panelov prietokovej cytometrie konvenčná prietoková cytometria vyžaduje jasné fluorofóry, ktoré majú špecifickú vlnovú dĺžku excitácie a emisie z jedného lasera. Spektrálna prietoková cytometria však vyžaduje jedinečné spektrálne profily, aby sa umožnilo rozmiešanie v paneloch. Tieto fluorofóry musia byť v paneli navzájom kompatibilné a ideálne by mali byť fotostabilné a po fixácii by nemali vykazovať stratu fluorescencie.

Navštívte našu stránku Fluorofóry prietokovej cytometrie, kde nájdete podrobnejšie informácie o fluorofóroch kompatibilných s prietokovou cytometriou, vrátane našich nových vlastných farbív StarBright Dyes.


Platforma vývoja protilátok IVD

Creative Biolabs ponúka kompletnú zákaznícku protilátkovú službu pokrývajúcu každý krok monoklonálneho a polyklonálneho vývoja. Vyrábame a overujeme protilátky proti množstvu biomarkerových proteínov. Oblasti výskumu zahŕňajú rakovinu, apoptózu, neurobiológiu, imunológiu, kardiovaskulárne choroby a infekčné choroby. Poskytujeme služby vývoja protilátok na mieru vrátane:

  • Návrh, syntéza a konjugácia vhodných peptidov na vytvorenie protilátok s očakávanou afinitou a špecifickosťou.
  • Monoklonálne protilátky môžu byť generované u myši, potkana, škrečka alebo iného druhu, aby sa splnili naše konkrétne požiadavky na hostiteľa.
  • Služby polyklonálnych protilátok umožňujú produkciu protilátok zo širokej škály hostiteľských druhov.
  • Páry protilátok mAb-mAb, mAb-pAb a pAb-pAb pre test ELISA.
  • Pre vlastný vývoj protilátok sú dostupné technológie hybridómu aj fágového displeja.
  • Rekombinantné protilátky s úplnou dĺžkou (prepínanie druhov a izotypov) a čiastočnou dĺžkou (scFv, Fab, F(ab)2, BsAb).
  • Klonovanie a sekvenovanie variabilnej oblasti protilátky, humanizácia protilátky a optimalizácia protilátky.
  • Kompletná služba purifikácie peptidov a protilátok pomocou tradičnej aj vlastnej afinitnej metodológie.

Vedci z Creative Biolabs sú expertmi na konjugáciu protilátka/proteín. Či už hľadáte iný konjugát našej protilátky alebo potrebujete vlastnú konjugáciu vlastnej protilátky, môžeme vám poskytnúť cenovo dostupnú, vysokokvalitnú službu konjugácie protilátok na mieru s neprekonateľnou rýchlou dobou obratu. Funkcie našich služieb konjugácie protilátok/proteínov/peptidov zahŕňajú:

  • Vlastná konjugácia vášho peptidu, protilátky alebo iných proteínov na haptény, nosiče, značky a efektorové enzýmy.
  • Široký výber konjugátov a značiek, ako sú konjugáty proteín-proteín, konjugáty častíc, biotín, fluorochrómy a špeciálne značky.
  • Zahŕňa označovanie, čistenie a charakterizáciu konečného produktu.
  • Komplexné poradenstvo o možnostiach označovania a návrhu reakcie.

Ako vedúci vývojári vysokokvalitných imunotestov, Creative Biolabs má dlhoročné skúsenosti s používaním protilátok pri vývoji testov a imunodiagnostických súprav. Dokážeme vyrobiť diagnostické testy vo formátoch ELISA, laterálny prietok, latexové guľôčky, western blot, imunohistochémia a prietoková cytometria. Vďaka kombinovaným odborným znalostiam v oblasti proteínovej chémie, imunológie a molekulárnej biológie vám náš vedecký tím môže pomôcť s každým krokom procesu vývoja, od návrhu až po overenie.

Typický pracovný postup pre vývoj IVD imunoanalýzy v Creative Biolabs možno rozdeliť do troch fáz: stanovenie rozsahu projektu, vývoj analýzy a výroba a výroba.

Vlastnosti služieb vývoja protilátok IVD

  • Kvalita podporovaná skúsenými tímami technickej a zákazníckej podpory, ako aj najmodernejšími zariadeniami.
  • Špecializuje sa na vývoj protilátok a súpravy IVD s dokončením mnohých projektov súvisiacich s IVD.
  • Rýchla dodacia lehota a konkurencieschopné ceny.
  • Rýchle a ekonomické poskytovanie vlastných testov pre akékoľvek biomarkery a uvádzanie nových produktov IVD na trh.

Pre viac informácií o ktorejkoľvek z týchto služieb nás neváhajte kontaktovať.


    U ktorých druhov sa vyvinula primárna protilátka?
    Sekundárne protilátky sú namierené proti druhu primárnej protilátky. Preto budete potrebovať sekundárnu protilátku, ktorá sa pestuje v inom druhu, ako je hostiteľský druh primárnej protilátky. Napríklad, ak je vaša primárna protilátka vytvorená u myši, budete potrebovať sekundárnu protilátku proti myšiam vytvorenú u kozy, králika atď.

Aká je trieda (izotyp) a/alebo podtrieda primárnej protilátky?
Táto otázka je predovšetkým dôležitá pri práci s monoklonálnymi protilátkami. Polyklonálne protilátky sú však typicky imunoglobulíny triedy IgG. Z tohto dôvodu budú sekundárne protilátky hlavne anti-IgG protilátka.

Monoklonálne protilátky sa najčastejšie vyvíjajú u myší a príležitostne u potkanov, škrečkov alebo králikov. Napríklad, ak je primárnou monoklonálnou protilátkou myšací IgM, niekto by chcel sekundárnu protilátku, ktorá reaguje s myšacím IgM (anti-myší IgM).

Ak je primárna monoklonálna protilátka jednou z myších podtried IgG, mala by sa na ňu naviazať takmer každá sekundárna protilátka proti myšaciemu IgG. Ak nie je známa podtrieda primárnej protilátky, potom sa môžu použiť sekundárne protilátky proti myšaciemu IgG F(ab), pretože rozpoznávajú väčšinu podtried myších imunoglobulínov.

Existuje mnoho tried a podtried ľudských a myších IgG(ov). Výber sekundárneho môže byť zložitý. Avšak jedným spoločným faktorom medzi týmito IgG(ami) sú ľahké reťazce (kappa a lambda). Inými slovami, IgG, IgM, IgA, IgD a IgE majú všetky ľahké reťazce kapa alebo lambda. Ťažký reťazec je však špecifický pre triedu.

Súhrn tried a podtried imunoglobulínov:
Triedy imunoglobulínov: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
Podtriedy ľudského imunoglobulínu: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 a IgA2
Podtriedy myších imunoglobulínov: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3
Svetelné reťaze: Kappa, Lambda
Ťažké reťazce: IgG (gama), IgM (mu), IgA (alfa), IgD (delta), IgE (epsilon)

Ďalšie informácie o reaktivite protilátok:
Polyvalentný: reagovať so všetkými triedami
Anti-Fc a špecifické pre ťažké reťazce: reagujú len s ťažkými reťazcami, preto sú špecifické pre triedu.
Anti-Fab a špecifické pre celú molekulu: reagovať s ťažkými a ľahkými reťazcami. Vďaka reaktivite ľahkého reťazca môžu reagovať so všetkými triedami.
Špecifické pre ľahký reťazec (kappa, lambda).: reagovať so všetkými triedami, pretože všetky triedy používajú rovnaké ľahké reťazce kappa alebo lambda.

Používam afinitne purifikovanú protilátku alebo IgG frakciu?
Väčšina ľudí preferuje afinitne izolované sekundárne protilátky, pretože poskytujú najnižšie množstvo nešpecifickej väzby. V určitých prípadoch sa však môžu zvážiť frakcie IgG, t.j. keď je požadovaný antigén zriedkavý alebo je prítomný v malom množstve. V týchto situáciách sú potrebné protilátky s vysokou afinitou. Napríklad počas afinitnej izolácie môžu byť niektoré protilátky s veľmi vysokou afinitou odstránené, pretože sa viažu tak pevne na afinitnú matricu, že nie je možné ich eluovať.

Aký druh označenia si vyberiem?
Štítok je veľmi závislý od aplikácie. For immunoblotting and ELISA, enzyme-labeled secondary antibodies are the most popular. Peroxidase is economical and a more stable enzyme, in general, than alkaline phosphatase. It has also become very popular for use in chemiluminescent detection systems. Alkaline phosphatase, on the other hand, is considered more sensitive than peroxidase particularly when colorimetric detection is used.

For cell or tissue staining, alkaline phosphatase, peroxidase, or secondary antibodies conjugated to a fluorochrome may be used. Common fluorochromes are FITC, phycoerythrin, CF™ Dyes, Atto Dyes, and Quantum Red. Associated applications are immunocytochemistry/immunofluorescence, flow cytometry, or immunohistochemistry.

To generate increased amplification, a two-step biotin/avidin system may be used. Biotin binds with very high affinity to avidin, resulting in an essentially irreversible interaction. A biotinylated secondary antibody is applied first, then avidin, ExtrAvidin, or streptavidin conjugated to an enzyme or fluorochrome binds to multiple sites on the biotinylated secondary antibody, thus amplifying the signal and resulting in greater sensitivity than that achieved with an antibody-enzyme or antibody-fluorochrome conjugate alone.

When should I use a pre-adsorbed secondary antibody?
Using pre-adsorbed antibodies will reduce non-specific background when working with tissues and cells. The process involves passing the secondary antibody over immobilized serum proteins from potentially cross reactive species. Therefore, if you are working with human tissues, choose a secondary antibody that has been adsorbed with human serum or human IgG.

When is a F(ab) or F(ab')2 fragment antibody necessary?
If working with tissues or cells that have Fc receptors, choose a F(ab) or F(ab')2 fragment when possible to eliminate non-specific binding. In more detail, F(ab')2 antibody fragments are used in assay systems where the presence of the Fc region may cause problems. Samples such as lymph nodes, spleen, and peripheral blood preparations contain cells with Fc receptors (macrophages, B lymphocytes, and natural killer cells), which could bind the Fc region of intact antibodies, causing high background staining. Use of F(ab')2 fragments ensures that any antibody binding observed is not due to Fc receptors.


Be prepared to validate on your own

Even the best characterized antibody that is beloved by the scientific literature and has enriched many a publication isn’t guaranteed to perform in your settings and your hands flawlessly. And you would limit your resources severely if you only consider antibodies validated exactly for your needs. You should always plan to validate an antibody on your own to some extent. Include the appropriate controls in your experiment to analyze the specificity of an antibody in your precise circumstances. A useful guide for very thorough antibody validation has been compiled by Bordeaux and colleagues. An increasing number of journals not only requires detailed information on the antibodies used in a study (such as name, clone, supplier, catalogue and even lot number), but is also encouraging proof of validation. It is in the interest of us all that scientific data generated with the help of antibodies is reliable and reproducible, but ultimately it is the researcher’s responsibility to use proven experimental tools.